EA041947B1 - METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HIGH MOLECULAR VWF IN CELL CULTURE - Google Patents
METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HIGH MOLECULAR VWF IN CELL CULTURE Download PDFInfo
- Publication number
- EA041947B1 EA041947B1 EA202090220 EA041947B1 EA 041947 B1 EA041947 B1 EA 041947B1 EA 202090220 EA202090220 EA 202090220 EA 041947 B1 EA041947 B1 EA 041947B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- var
- rvwf
- cell culture
- copper
- concentration
- Prior art date
Links
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США, №The present application claims priority under U.S. Provisional Application No.
61/362635, поданной 8 июля 2010 г., описание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.61/362635, filed July 8, 2010, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.
Область техникиTechnical field
Рекомбинантная экспрессия терапевтических белков в культуре клеток (в частности, крупномасштабных культурах клеток), включая культуры эукариотических клеток, и, конкретнее, культуры клеток млекопитающих, требует применения специальных культуральных сред, обеспечивающих питательные вещества для эффективного роста клеток. В составы сред для клеточных культур часто входят различные добавки, включая эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), животные белки и/или гидролизаты белков крупного рогатого скота, а также белковые гидролизаты, полученные из растений или дрожжей. Одна из проблем, связанных с такими культурами, состоит в том, что количество получаемого белка, а также общая и удельная активность указанного белка, часто варьируют в разных культурах клеток, даже в случае, когда состав среды для культуры клеток неизменен. Эта вариабельность особенно очевидна в случае крупномасштабных производственных процессов с применением объемов клеточных культур от 10 л до более чем 20000 л. Вариабельность для разных культур клеток особенно часто наблюдают для сред для клеточных культур, содержащих гидролизаты, что приводит к уменьшению продукции общего продуцируемого количества белка, а также уменьшению общей и удельной активности.Recombinant expression of therapeutic proteins in cell culture (in particular, large scale cell cultures), including eukaryotic cell cultures, and more specifically mammalian cell cultures, requires the use of special culture media that provide nutrients for efficient cell growth. Cell culture media formulations often include various additives, including fetal bovine serum (FBS), animal proteins and/or bovine protein hydrolysates, and protein hydrolysates derived from plants or yeasts. One of the problems associated with such cultures is that the amount of protein produced, as well as the total and specific activity of said protein, often vary between cell cultures, even when the composition of the cell culture medium is unchanged. This variability is especially evident in the case of large-scale production processes using cell culture volumes from 10 L to more than 20,000 L. Variability between cell cultures is especially often observed for cell culture media containing hydrolysates, which leads to a decrease in the production of the total amount of protein produced, as well as a decrease in total and specific activity.
Одной из возможных причин вариабельности, наблюдаемой в разных культурах клеток, является то, что загрязняющие примеси в добавках, таких как гидролизаты, варьируют от партии к партии. Как правило, сыворотка или полученные из сыворотки вещества, такие как, например, альбумин, трансферрин или инсулин, могут содержать нежелательные агенты, которые могут загрязнять культуры клеток и получаемые из них биологические продукты. Кроме того, получаемые из сыворотки крови человека добавки должны быть проверены на все известные вирусы, включая вирусы гепатита и ВИЧ, которые могут передаваться через сыворотку крови. Более того, бычья сыворотка и получаемые из нее продукты несут риск заражения КГЭ. Помимо этого, все полученные из сыворотки продукты могут быть загрязнены неизвестными веществами. При применении для культуры клеток сыворотки или белковых добавок, полученных от человека или животных, возникают многочисленные проблемы (например, варьирующие качество и свойства составов из разных партий и риск загрязнения микоплазмой, вирусами или КГЭ), в частности, если указанные клетки применяют для производства лекарственных средств или вакцин для введения человеку. Поэтому было предпринято множество попыток получения эффективной системы хозяина и условий культивирования, для которых не требуется сыворотка или другие белковые вещества животного происхождения.One possible reason for the variability observed across cell cultures is that contaminants in additives such as hydrolysates vary from batch to batch. In general, serum or serum-derived substances, such as, for example, albumin, transferrin or insulin, may contain undesirable agents that may contaminate cell cultures and biological products derived therefrom. In addition, supplements derived from human serum must be tested for all known viruses, including hepatitis and HIV viruses, which can be transmitted through blood serum. Moreover, bovine serum and products derived from it carry the risk of TGE contamination. In addition, all whey-derived products may be contaminated with unknown substances. Numerous problems (e.g., varying quality and properties of formulations from different batches and the risk of contamination with mycoplasma, viruses, or CGE) arise when human or animal-derived sera or protein supplements are used for cell culture, in particular when these cells are used for the production of drugs. agents or vaccines for human administration. Therefore, many attempts have been made to obtain an efficient host system and culture conditions that do not require serum or other protein substances of animal origin.
Такие бессывороточные среды разрабатывались на основе белковых экстрактов, получаемых из растений или дрожжей. Например, известно, что гидролизаты сои подходят для процессов ферментации и могут усиливать рост многих микроорганизмов со сложными питательными потребностями, дрожжей и грибов. В WO 96/26266 указано, что папаиновые гидролизаты соевой муки являются источником углеводов и азота, и многие ее компоненты могут применяться для тканевых культур. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) описывают эффекты стимуляции роста и продуктивности определенных пептидных фракций гидролизатов сои и пшеницы.Such serum-free media have been developed from protein extracts obtained from plants or yeasts. For example, soy hydrolysates are known to be suitable for fermentation processes and can enhance the growth of many nutrient complex microorganisms, yeasts and fungi. WO 96/26266 states that papain hydrolysates of soy flour are a source of carbohydrates and nitrogen, and many of its components can be used for tissue culture. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) describe the growth and productivity promoting effects of certain peptide fractions of soybean and wheat hydrolysates.
В WO 96/15231 описана бессывороточная среда, состоящая из синтетической минимальной питательной среды и дрожжевого экстракта, для размножения клеток позвоночных животных и процесса воспроизводства вирусов. Состав среды, состоящей из основной среды для культур клеток, содержащей пептид риса, экстракт дрожжей и их ферментативный гидролизат, и/или растительные липиды для роста животных клеток, описан в WO 98/15614. Содержащая очищенный соевый гидролизат среда для культивирования рекомбинантных клеток описана в WO 01/23527. В WO 00/03000 описана среда, которая содержит соевый гидролизат и дрожжевой экстракт, но также требует и присутствия рекомбинантных форм животных белков, таких как факторы роста.WO 96/15231 describes a serum-free medium, consisting of a synthetic minimal nutrient medium and a yeast extract, for the propagation of vertebrate cells and the process of reproduction of viruses. The composition of a medium consisting of a basic cell culture medium containing rice peptide, yeast extract and enzymatic hydrolysate thereof, and/or plant lipids for animal cell growth is described in WO 98/15614. A recombinant cell culture medium containing purified soy hydrolysate is described in WO 01/23527. WO 00/03000 describes a medium that contains soy hydrolyzate and yeast extract, but also requires the presence of recombinant forms of animal proteins such as growth factors.
В ЕР-А-0481791 описана культуральная среда с заданным биохимическим составом для культивирования сконструированных клеток СНО, не содержащая белков, липидов и углеводов, выделенных из животных источников, содержащая также рекомбинантный инсулин или аналог инсулина, 1% к 0,025% (масса/объем) пептона расщепленной папаином сои, и путресцин. В WO 98/08934 описана бессывороточная культура эукариотических клеток, содержащая гидролизованные соевые пептиды (1-1000 мг/л), от 0,01 до 1 мг/л путресцина и разнообразные компоненты животного происхождения, включая альбумин, фетуин, различные гормоны и другие белки. В этом контексте следует отметить, что, как известно, путресцин входит также в стандартные среды, например, в среду DMEM/Хэма F12 в концентрации 0,08 мг/л.EP-A-0481791 describes a biochemically formulated culture medium for culturing engineered CHO cells, free of proteins, lipids and carbohydrates isolated from animal sources, also containing recombinant insulin or an insulin analogue, 1% to 0.025% (w/v) peptone of soybean digested with papain, and putrescine. WO 98/08934 describes a serum-free culture of eukaryotic cells containing hydrolyzed soy peptides (1-1000 mg/l), 0.01 to 1 mg/l putrescine, and various components of animal origin, including albumin, fetuin, various hormones and other proteins. . In this context, it should be noted that putrescine is also known to be included in standard media, for example DMEM/Ham F12 at a concentration of 0.08 mg/l.
Растительные и/или дрожжевые гидролизаты, однако, представляют собой неопределенные смеси олигопептидов и других неизвестных компонентов и загрязнителей. При этом свойства коммерчески доступных партий гидролизатов существенно варьируют. В результате выход рекомбинантных белков или вирусных продуктов значительно различается (разница составляет до троекратной) в зависимости от партии используемого гидролизата (разброс от партии к партии). Этот недостаток влияет на пролиферацию клеток, а также экспрессию белков в каждой клетке. В US 2007/0212770 описаны различные неVegetable and/or yeast hydrolysates, however, are undefined mixtures of oligopeptides and other unknown components and contaminants. At the same time, the properties of commercially available batches of hydrolysates vary significantly. As a result, the yield of recombinant proteins or viral products varies considerably (up to a factor of three) depending on the batch of hydrolyzate used (batch-to-batch variation). This deficiency affects cell proliferation as well as protein expression in each cell. US 2007/0212770 describes various non
- 1 041947 содержащие животных белков и олигопептидов, культуральные среды с заданным химическим составом, подходящие для крупномасштабного производства рекомбинантных белковых биофармацевтических средств.- 1 041947 containing animal proteins and oligopeptides, chemically defined culture media suitable for large-scale production of recombinant protein biopharmaceuticals.
Гемостаз включает взаимодействие различных путей гемостатических реакций, в итоге приводящих к образованию тромба. Тромбы представляют собой отложения компонентов крови на поверхности стенок сосудов, состоящие в основном из агрегированных тромбоцитов крови и нерастворимого перекрестно-сшитого фибрина. Образование фибрина происходит в результате сдерживания протеолиза фибриногена под действием тромбина, фермента свертывания. Тромбин представляет собой конечный продукт каскада свертывания, последовательной активации зимогена на поверхности активированных тромбоцитов и лейкоцитов, и различных клеток сосудов (для ознакомления см. K. G. Mann et al., Blood, 1990, Vol. 76, pp. 1-16).Hemostasis involves the interaction of various pathways of hemostatic reactions, ultimately leading to the formation of a thrombus. Thrombi are deposits of blood components on the surface of vessel walls, consisting mainly of aggregated blood platelets and insoluble cross-linked fibrin. Fibrin formation occurs as a result of inhibition of proteolysis of fibrinogen by the action of thrombin, a coagulation enzyme. Thrombin is the end product of a cascade of coagulation, sequential zymogen activation on the surface of activated platelets and leukocytes, and various vascular cells (for reference, see K. G. Mann et al., Blood, 1990, Vol. 76, pp. 1-16).
Важной функцией каскада свертывания является активация фактора X комплексом активированного фактора IX (Фактора IXa) и активированного фактора VIII (Фактора VIIIa). Дефицит или дисфункция компонентов этого комплекса связаны с заболеванием крови, известным как гемофилия (J. E. Sadler & Е. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia В, and von Willebrand's Disease (Гемофилия А, гемофилия В и болезнь Виллебранда), в G. Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of blood diseases (Молекулярные основы заболеваний крови). W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). Гемофилия А связана с дефицитом активности фактора VIII, в то время как гемофилия В связана с дефицитом фактора IX. Современное лечение представляет собой заместительную терапию с применением фармацевтических препаратов, содержащих нормальный фактор свертывания. Из указанных тромбопатий гемофилия А встречается чаще, поражая примерно одного человека из 10000. Заместительная терапия у пациентов с гемофилией А включает повторяющееся введение препаратов, содержащих нормальный фактор VIII, путем внутривенной инфузии. Интервал между инфузиями представляет собой функцию от снижения активности фактора VIII в кровотоке. Полупериод активности фактора VIII после инфузии различен у разных индивидуумов, варьируя от 10 до 30 ч. Таким образом, профилактическая терапия требует инфузии каждые 2-3 дня. Это является тяжелым бременем для пациентов с гемофилией, в частности, в случаях, когда венозный доступ затруднен в результате местной карбонизации после частых проколов иглой для внутривенных инфузии.An important function of the coagulation cascade is the activation of factor X by a complex of activated factor IX (Factor IXa) and activated factor VIII (Factor VIIIa). Deficiency or dysfunction of the components of this complex is associated with the blood disease known as hemophilia (J. E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B, and von Willebrand's Disease), in G. Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of blood diseases (W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). Hemophilia A is associated with a deficiency in factor VIII activity, while hemophilia B is associated with a deficiency in factor IX. The current treatment is replacement therapy using pharmaceutical preparations containing a normal coagulation factor. Of these thrombopathies, hemophilia A is the most common, affecting about one in 10,000 people. Replacement therapy in patients with hemophilia A involves repeated administration of drugs containing normal factor VIII by intravenous infusion. The interval between infusions is a function of the decrease in the activity of factor VIII in the bloodstream. The half-life of factor VIII activity after infusion varies between individuals, ranging from 10 to 30 hours. Thus, prophylactic therapy requires infusion every 2-3 days. This is a heavy burden for patients with hemophilia, in particular in cases where venous access is difficult as a result of local carbonation after frequent punctures with an intravenous infusion needle.
Снижение частоты инфузии за счет применения фактора VIII с продленным периодом полужизни было бы очень благоприятно. В данной области техники хорошо известно, что время полураспада неактивированного гетеродимера фактора VIII сильно зависит от присутствия фактора фон Виллебранда, проявляющего высокое сродство к фактору VIII (но не к фактору VIIIa) и служащего белкомпереносчиком (J. E. Sadler and E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia В and von Willebrand's disease, в G. Stamatoynnopoulos et al. (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). Известно, что пациенты, страдающие от болезни Виллебранда типа 3, не имеющие детектируемого уровня фактора фон Виллебранда в кровотоке, страдают также от вторичного дефицита фактора VIII. Кроме того, период полураспада введенного внутривенно фактора VIII у таких пациентов составляет от 2 до 4 ч, что заметно меньше 10-30 ч, наблюдаемых у пациентов с гемофилией А. Из полученных результатов следует, что фактору VIII свойственна тенденция к быстрому выведению из кровотока, и что этот процесс до некоторой степени подавляется комплексообразованием с его естественным переносчиком - фактором фон Виллебранда.Reducing the frequency of infusion through the use of factor VIII with an extended half-life would be very beneficial. It is well known in the art that the half-life of an unactivated factor VIII heterodimer is highly dependent on the presence of von Willebrand factor, which exhibits high affinity for factor VIII (but not factor VIIIa) and serves as a carrier protein (J. E. Sadler and E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand's disease, in G. Stamatoynnopoulos et al (Eds.): The molecular basis of blood diseases, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). It is known that patients suffering from von Willebrand disease type 3 who do not have a detectable level of von Willebrand factor in the bloodstream also suffer from secondary deficiency of factor VIII. In addition, the half-life of intravenously administered factor VIII in these patients is 2 to 4 hours, which is markedly less than the 10 to 30 hours observed in patients with hemophilia A. It follows from these results that factor VIII tends to be rapidly eliminated from the bloodstream, and that this process is inhibited to some extent by complexation with its natural carrier, the von Willebrand factor.
Фактор фон Виллебранда (vWF) представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде ряда мультимеров, размер которых варьирует, как правило, от приблизительно 500 до 20000 кДа (или 240 димеров vWF). Димерные и мультимерные формы vWF составлены 250 кДа полипептидными субъединицами, связанными друг с другом дисульфидными связями. vWF опосредует первичную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда; только мультимеры большего размера проявляют также гемостатическую активность. Мультимеризованный VWF связывается с поверхностным гликопротеином тромбоцитов Gp1ba посредством взаимодействия в домене A1 VWF, содействуя адгезии тромбоцитов. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы vWF, а те формы vWF, которые имеют низкие молекулярные массы (низкомолекулярный vWF), возникают за счет протеолитического расщепления. Мультимеры с большими молекулярными массами накапливаются в тельцах Вейбеля-Палада эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции.Von Willebrand factor (vWF) is a glycoprotein circulating in plasma as a series of multimers that typically range in size from about 500 to 20,000 kDa (or 240 vWF dimers). The dimeric and multimeric forms of vWF are composed of 250 kDa polypeptide subunits linked to each other by disulfide bonds. vWF mediates the primary adhesion of platelets to the subendothelium of the injured vessel wall; only larger multimers also exhibit haemostatic activity. The multimerized VWF binds to the platelet surface glycoprotein Gp1ba through an interaction in the A1 domain of the VWF, promoting platelet adhesion. It is assumed that endothelial cells secrete large polymeric forms of vWF, and those forms of vWF that have low molecular weights (low molecular weight vWF) arise due to proteolytic cleavage. Multimers with large molecular weights accumulate in the Weibel-Palade bodies of endothelial cells and are released upon stimulation.
Снижение связывающей активности FVIII благодаря сниженным уровням белка vWF или уменьшению связывающей способности FVIII приводит к одному из трех типов болезни Виллебранда. Дополнительно или альтернативно, определенные типы болезни Виллебранда характеризуются повышением или снижением уровня Gp1bα-опосредованного связывания тромбоцитов, а именно типы 2А, 2В и 2М (обобщенные данные см. у Castaman et al., Disorders of Hemostasis 88(1):94-108 (2003)). Соответственно, модулирование взаимодействия vWF как с FVIII, так и с Gp1ba представляет собой целесообразную стратегию для лечения как гемофилии, так и болезни Виллебранда.Decreased FVIII binding activity due to reduced vWF protein levels or reduced FVIII binding capacity results in one of three types of von Willebrand disease. Additionally or alternatively, certain types of von Willebrand disease are characterized by increased or decreased levels of Gp1bα-mediated platelet binding, namely types 2A, 2B and 2M (for a summary, see Castaman et al., Disorders of Hemostasis 88(1):94-108 ( 2003)). Accordingly, modulating the interaction of vWF with both FVIII and Gp1ba represents a viable strategy for the treatment of both hemophilia and von Willebrand disease.
Учитывая биологическую важность vWF, существует постоянная необходимость в совершенствовании техники способов получения vWF для терапевтического применения. Общеизвестно, что vWF мо- 2 041947 жет быть выделен из эндогенных источников, таких как плазма крови человека. Выделенный vWF обладает таким преимуществом, как высокая удельная активность в отношении выполнения его биологической функции и может, таким образом, эффективно применяться в качестве терапевтического белка для лечения соответствующих заболеваний, таких как болезнь Виллебранда. Как правило, vWF плазмы обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей приблизительно 100 мЕ/мкг, однако выделение из плазмы крови человека имеет недостатки, так как, например, такая плазма может содержать различные вирусы, такие как ВИЧ и/или вирусы гепатита, которые могут переноситься пациенту. Кроме того, плазма представляет собой ограниченный ресурс и, таким образом, дефицит плазмы может приводить к проблематичности получения достаточного количества vWF для лечения. Соответственно, рекомбинантные способы получения vWF обладают преимуществами, разрешая некоторые проблемы, связанные с зависимостью от плазмы в качестве источника vWF. Для рекомбинантного получения была клонирована полноразмерная кДНК vWF; указанный прополипептид соответствует аминокислотным остаткам 23-764 полноразмерного препро-vWF (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77 90).Given the biological importance of vWF, there is a continuing need for improved techniques for producing vWF for therapeutic use. It is well known that vWF can be isolated from endogenous sources such as human plasma. The isolated vWF has the advantage of high specific activity with respect to its biological function and can thus be effectively used as a therapeutic protein for the treatment of related diseases such as von Willebrand's disease. Plasma vWF typically has a specific ristocetin activity of approximately 100 mU/μg, however, isolation from human plasma has disadvantages as, for example, such plasma may contain various viruses such as HIV and/or hepatitis viruses that can be transmitted patient. In addition, plasma is a limited resource and thus plasma deficiency can make it difficult to obtain enough vWF for treatment. Accordingly, recombinant methods for producing vWF are advantageous in overcoming some of the problems associated with reliance on plasma as a source of vWF. For recombinant production was cloned full-length cDNA vWF; said propolypeptide corresponds to amino acid residues 23-764 of full-length prepro-vWF (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77-90).
К сожалению, vWF представляет собой молекулу, подвергающуюся сложным посттрансляционным модификациям. Кроме того, мультимеризация димеров vWF в большие и ультрабольшие мультимеры в аппарате Гольджи представляет собой сложную задачу при экспрессии в клетках млекопитающих. Так, экспрессия высокомолекулярного vWF в культуре клеток, например, эндотелиальных клетках человека (первичных), зависит от специфического накопления ультрабольших молекул vWF в тельцах ВейбеляПалада. Такие культуры клеток не подходят для получения терапевтических белков. Описаны и другие способы культивирования клеток; известно, что условия культивирования клеток могут влиять на продуцирование vWF различным образом. Например, показано, что высокие концентрации аммония (NH4 +) нарушают посттрансляционную модификацию. Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264(23): 13497-13503, 1989) показали, что уровень аммония 25 мМ приводили к снижению мультимеризации vWF в эндотелиальных клетках, что также негативно влияет на удельную ристоцетиновую активность рекомбинантного vWF.Unfortunately, vWF is a molecule subject to complex post-translational modifications. In addition, multimerization of vWF dimers into large and ultra-large multimers in the Golgi apparatus is a challenge when expressed in mammalian cells. Thus, the expression of high molecular weight vWF in cell culture, for example, human endothelial cells (primary), depends on the specific accumulation of ultra-large vWF molecules in Weibel Palade bodies. Such cell cultures are not suitable for the production of therapeutic proteins. Other cell culture methods have also been described; it is known that cell culture conditions can affect the production of vWF in various ways. For example, high concentrations of ammonium (NH 4 + ) have been shown to disrupt post-translational modification. Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264(23): 13497-13503, 1989) showed that ammonium levels of 25 mM led to a decrease in vWF multimerization in endothelial cells, which also negatively affected the specific ristocetin activity of recombinant vWF.
Снижение мультимеризации, как правило, связано со снижением активности, в частности, удельной ристоцетиновой активности, рекомбинантного vWF.The decrease in multimerization is usually associated with a decrease in the activity, in particular, the specific ristocetin activity, of recombinant vWF.
До сих пор трудно предсказать, какие параметры могут положительно или отрицательно влиять на продуцирование того или иного белка, в особенности - сложных гликопротеинов, таких как фактор VIII и vWF. Например, показано, что определенные компоненты среды для клеточной культуры влияют на продуцирование фактора VIII. Согласно описанию в патенте США №5804420 добавление полиола, меди и других следовых металлов может положительно влиять на выход фактора VIII. Также, согласно описанию в WO 2009/086309, показано, что применение меди в процессе культивирования клеток повышает выработку фактора VIII. У Mignot et al. (1989) описано также осуществление экспрессии vWF в рекомбинантных клетках СНО. Однако ни в одном из указанных примеров не содержится информации относительно удельной активности vWF или уровня его мультимеризации.It is still difficult to predict which parameters can positively or negatively affect the production of a particular protein, especially complex glycoproteins such as factor VIII and vWF. For example, certain components of the cell culture medium have been shown to affect the production of factor VIII. According to the description in US patent No. 5804420 the addition of polyol, copper and other trace metals can positively affect the yield of factor VIII. Also, as described in WO 2009/086309, it is shown that the use of copper in the process of culturing cells increases the production of factor VIII. Mignot et al. (1989) also describes how vWF expression occurs in recombinant CHO cells. However, none of these examples contain information regarding the specific activity of vWF or its level of multimerization.
Белки ADAMTS (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина I типа) представляют собой семейство металлопротеиназ, содержащих ряд консервативных доменов, включая цинкзависимый каталитический домен, цистеин-богатый домен, дезинтегрин-подобный домен и по меньшей мере один, а в большинстве случаев множество повторов тромбоспондина типа I (для ознакомления см. Nicholson et al., ВМС Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). Указанные белки, эволюционно родственные семействам металлопротеиназ ADAM и ММР (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31), являются секретируемыми ферментами, для которых установлена связь с рядом заболеваний и состояний, включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), соединительнотканные расстройства, раковые заболевания, воспаление (Nicholson et al.) и тяжелую плазмодийную тропическую малярию (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349). Из-за этих связей ферменты ADAMTS были признаны потенциальными мишенями для терапии ряда патологий (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31). Соответственно, существует потребность в способах получения больших количеств белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, не содержащих загрязнителей, таких как вирусы, КГЭ и патогены типа бактерий Mycoplasma.The ADAMTS (disintegrin and metalloproteinase with type I thrombospondin motifs) proteins are a family of metalloproteinases containing a number of conserved domains, including a zinc-dependent catalytic domain, a cysteine-rich domain, a disintegrin-like domain, and at least one, and in most cases many, thrombospondin type repeats. I (for reference, see Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). These proteins, evolutionarily related to the ADAM and MMP families of metalloproteinases (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31), are secreted enzymes that have been associated with a number of diseases and conditions, including thrombotic thrombocytopenic purpura ( TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), connective tissue disorders, cancers, inflammation (Nicholson et al.), and severe Plasmodium malaria (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349). Because of these links, ADAMTS enzymes have been recognized as potential targets for therapy in a number of pathologies (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31). Accordingly, there is a need for methods for producing large amounts of ADAMTS proteins that are highly specific and free from contaminants such as viruses, CGEs, and pathogens such as Mycoplasma bacteria.
Один из представителей семейства ADAMTS, ADAMTS13, расщепляет фактор фон Виллебранда (vWF) между остатками Tyr 1605 и Met 1606; эта функция отвечает за разложение больших мультимеров vWF in vivo. Установлена связь потери активности ADAMTS 13 с некоторыми состояниями, такими как ТТП (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), острое и хроническое воспаление (Chauhan et al, J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74), и, совсем недавно, с тяжелой плазмодийной тропической малярией (Larkin et al, PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349).One member of the ADAMTS family, ADAMTS13, cleaves von Willebrand factor (vWF) between Tyr 1605 and Met 1606 residues; this function is responsible for the degradation of large vWF multimers in vivo. Loss of ADAMTS 13 activity has been associated with several conditions such as TTP (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), acute and chronic inflammation (Chauhan et al, J Exp Med. 2008 Sep 1; 205(9):2065-74), and more recently severe Plasmodium tropic malaria (Larkin et al, PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349).
Протеаза ADAMTS 13 представляет собой гликозилированный белок массой 190 кДа, синтезируемый преимущественно в печени (Levy et al, Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al, Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al, J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; и Gerritsen et al, Blood. 2001; 98:1654-1661). В значительной степени кА и в случае с мультимерами rVWF высшего порядка, рекомбинантная экспрессия больших ADAMTS 13 в культурах клеток млекопитающих сопряжена с множеством трудностей.The ADAMTS 13 protease is a 190 kDa glycosylated protein synthesized predominantly in the liver (Levy et al, Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al, Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al, J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo) 2001; 130:475-480; and Gerritsen et al., Blood. 2001; 98:1654-1661). To a large extent, and in the case of higher order rVWF multimers, recombinant expression of large ADAMTS 13 in mammalian cell cultures is fraught with many difficulties.
Таким образом, существует необходимость в условиях культивирования клеток, в частности, услоThus, there is a need for cell culture conditions, in particular
- 3 041947 виях культивирования при крупномасштабном производстве, обеспечивающих стабильный общий выход белка и/или стабильную общую и удельную активность продуцируемых белков в различных культурах клеток. Стабильность в культурах при крупномасштабных производственных процессах важна для производства терапевтических белков. Существует также необходимость в условиях культивирования клеток для крупномасштабного производства rVWF с уровнями мультимеризации и удельной ристоцетиновой активностью, сравнимыми или превышающими таковые VWF, присутствующего в нормальной плазме человека. Сходным образом, так как белки ADAMTS вовлечены в ряд заболеваний и состояний, в данной области техники существует потребность в способах крупномасштабного производства рекомбинантных белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, которые подходят для получения фармацевтических средств и для фармацевтического введения. Настоящее изобретение удовлетворяет указанные и другие потребности данной области техники в получении рекомбинантного фактора фон Виллебранда и рекомбинантного ADAMTS 13.- 3 041947 ways of cultivation in large-scale production, providing a stable overall protein yield and/or a stable total and specific activity of the produced proteins in various cell cultures. Stability in cultures in large scale manufacturing processes is important for the production of therapeutic proteins. There is also a need for cell culture conditions for the large scale production of rVWF with levels of multimerization and specific ristocetin activity comparable to or greater than those of VWF present in normal human plasma. Similarly, since ADAMTS proteins are implicated in a number of diseases and conditions, there is a need in the art for methods for the large-scale production of high specific activity recombinant ADAMTS proteins that are suitable for pharmaceutical preparation and for pharmaceutical administration. The present invention satisfies these and other needs in the art for the production of recombinant von Willebrand factor and recombinant ADAMTS 13.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Согласно определенным аспектам настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что введение добавок в среды для клеточных культур, применяемые для экспрессии рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF) и рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), приводит к значительному повышению экспрессии белков и ферментативной активности.In certain aspects, the present invention is based on the surprising discovery that the addition of additives to cell culture media used to express recombinant von Willebrand factor (rVWF) and recombinant ADAMTS13 (rA13) results in a significant increase in protein expression and enzymatic activity.
Согласносвоему первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF ; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF.According to its first aspect, the present invention provides a method for preparing a recombinant von Willebrand factor (rVWF) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 2.4 µg/L; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rVWF protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rVWF is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein said separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 30 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап добавления в указанную основную среду для клеточных культур гидролизата перед культивированием указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, said method further comprises the step of adding a hydrolyzate to said basic cell culture medium prior to culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный гидролизат представляет собой растительный гидролизат. Согласно конкретному варианту реализации указанный гидролизат представляет собой соевый гидролизат.According to one embodiment of the methods proposed above, said hydrolyzate is a vegetable hydrolyzate. In a specific embodiment, said hydrolyzate is a soy hydrolyzate.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основная среда для клеточных культур представляют собой не содержащую животных белков культуральную среду.According to one embodiment of the methods proposed above, the basic cell culture medium is an animal protein-free culture medium.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.According to one embodiment of the methods proposed above, the basic cell culture media are protein-free culture media.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанные основные среды для клеточных культур представляет собой культуральные среды с заданным химическим составом.According to one embodiment of the methods proposed above, said basic cell culture media are chemically defined culture media.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the basic medium for cell cultures with the addition of copper is at least 4 μg/l of copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет от 2,4 до 20 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the basic medium for cell cultures with the addition of copper is from 2.4 to 20 μg/l of copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинации.In one embodiment of the methods proposed above, copper is added to basic cell culture media as a copper salt, copper chelate, or a combination thereof.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.In one embodiment of the above methods, said copper salt is selected from the group consisting of copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, and copper oxide.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.According to one embodiment of the methods proposed above, said one or more cells is a mammalian cell. In a specific embodiment, said mammalian cells are CHO cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, culturing said one or more cells includes batch culturing said cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.According to one embodiment of the methods proposed above, culturing said one or more cells comprises continuously culturing said cells. According to a specific implementation variant, continuous cell culture is performed in a chemostatic mode. According to another specific embodiment, continuous cell culture is performed in perfusion mode.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.In one embodiment of the methods proposed above, said one or more cells are cultured in at least 100 L of supplemented basic cell culture medium.
- 4 041947- 4 041947
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 2.5x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 2.0x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 1.5x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из части культурального супернатанта.In one embodiment of the methods proposed above, the step of separating at least a portion of said culture supernatant comprises filtration or centrifugation to remove cells from a portion of the culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг rVWF. Согласно конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг rVWF. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the methods proposed above, the separated supernatant has a specific rVWF ristocetin cofactor activity of at least 40 IU/µg rVWF. In a specific embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more specific embodiment, the separated supernatant has a specific rVWF ristocetin cofactor activity of at least 60 IU/µg rVWF. In a more specific embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF. In yet another more specific embodiment, the separated supernatant has a specific rVWF ristocetin cofactor activity of at least 80 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов по меньшей мере 10% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров.In one embodiment of the above methods, at least 10% of the rVWF in said supernatant is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In a specific embodiment, at least 15% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 20% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 25% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 30% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный супернатант содержит высокомолекулярные мультимеры VWF из 14-22 димеров.According to one embodiment of the methods proposed above, said supernatant contains high molecular weight VWF multimers of 14-22 dimers.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 10 мМ.According to one embodiment of the methods proposed above, the content of NH4+ in said culture supernatant is maintained at a concentration below 10 mM.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.According to one embodiment of the methods proposed above, the content of NH4+ in said culture supernatant is maintained at a concentration below 4 mM.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов rVWF коэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации указанный способ дополнительно включает этап очистки rVWF от по меньшей мере 50% rFVIII, присутствующего в отделенном супернатанте. Согласно одному из вариантов реализации отношение rVWF к rFVIII после этапа очистки составляет по меньшей мере 10:1.According to one embodiment of the methods proposed above, rVWF is co-expressed with recombinant factor VIII (rFVIII). In a specific embodiment, said method further comprises the step of purifying the rVWF from at least 50% of the rFVIII present in the separated supernatant. In one embodiment, the ratio of rVWF to rFVIII after the purification step is at least 10:1.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения rVWF.According to one embodiment of the methods proposed above, said method further comprises the step of enriching rVWF.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает композицию рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF), полученную описанным в настоящем изобретении способом.According to a second aspect, the present invention provides a recombinant von Willebrand factor (rVWF) composition obtained by the method described in the present invention.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанная композиция также содержит рекомбинантный фактор VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации отношение rVWF к rFVIII составляет по меньшей мере 10:1.In one embodiment of the compositions described above, said composition also contains recombinant factor VIII (rFVIII). In a specific embodiment, the ratio of rVWF to rFVIII is at least 10:1.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.In one embodiment of the compositions described above, said composition is in a form for pharmaceutical administration. According to a specific implementation variant of the specified composition receive in the form for intravenous administration.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящем изобретении способом.According to a third aspect, the present invention provides a cell culture supernatant containing recombinant von Willebrand factor (rVWF), characterized in that said supernatant is obtained by the method described in the present invention.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), при этом по меньшей мере 10% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF в указанном супернатан- 5 041947 те присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов указанный супернатант получают согласно описанному в настоящем изобретении способу.According to a fourth aspect, the present invention provides a cell culture supernatant containing recombinant von Willebrand factor (rVWF), wherein at least 10% of the rVWF in said supernatant is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In a specific embodiment, at least 15% of the rVWF in said supernatant is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 20% of the rVWF in said supernatant is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 25% of the rVWF in said supernatant is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 30% of the rVWF in said supernatant is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. According to another specific implementation of the above supernatants, the specified supernatant is obtained according to the method described in the present invention.
Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,4 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,5 ME ристоцетинкофакторной активности на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,6 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,7 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящем изобретении способу.According to a fifth aspect, the present invention provides a cell culture supernatant containing recombinant von Willebrand factor (rVWF), characterized in that said supernatant contains at least 0.4 IU of ristocetin cofactor activity per ml. In a specific embodiment, said supernatant contains at least 0.5 IU of ristocetin cofactor activity per ml. In another specific embodiment, said supernatant contains at least 0.6 IU of ristocetin cofactor activity per ml. In another specific embodiment, said supernatant contains at least 0.7 IU of ristocetin cofactor activity per ml. According to another specific implementation of the above supernatants, the supernatant is obtained according to the method described in the present invention.
Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (А13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 1,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.According to a sixth aspect, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (A13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 1.0 µg/L; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие животных белков культуральные среды.According to one embodiment of the methods proposed above, the basic cell culture media are animal protein-free culture media.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.According to one embodiment of the methods proposed above, the basic cell culture media are protein-free culture media.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой культуральные среды с заданным химическим составом.According to one embodiment of the methods proposed above, the basic media for cell cultures are culture media with a given chemical composition.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 1 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the supplemented basic cell culture medium is at least 1 μg/l of copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 2 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the supplemented basic cell culture medium is at least 2 μg/l of copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the supplemented basic cell culture medium is at least 4 μg/l of copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 1 мкг/л до 6 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the supplemented basic cell culture medium is from 1 μg/l to 6 μg/l copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 2 мкг/л до 4 мкг/л меди.According to one embodiment of the methods proposed above, the final concentration of copper in the supplemented basic cell culture medium is from 2 μg/l to 4 μg/l copper.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинаций. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.In one embodiment of the methods proposed above, copper is added to basic cell culture media as a copper salt, copper chelate, or combinations thereof. In a particular embodiment, said copper salt is selected from the group consisting of copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, and copper oxide.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.According to one embodiment of the methods proposed above, said one or more cells is a mammalian cell. In a specific embodiment, said mammalian cells are CHO cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, culturing said one or more cells includes batch culturing said cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.According to one embodiment of the methods proposed above, culturing said one or more cells comprises continuously culturing said cells. According to a specific embodiment, said continuous cell culture is carried out in a chemostatic mode. According to another specific embodiment, said continuous cell culture is performed in perfusion mode.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.In one embodiment of the methods proposed above, said one or more cells are cultured in at least 100 L of supplemented basic cell culture medium.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 4,0x106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 4.0x106 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток под- 6 041947 держивают на уровне менее чем 3,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 3.5 x 10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 3,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 3.0x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 2.5x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 2.0x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.According to one embodiment of the methods proposed above, the cell density is maintained at a level of less than 1.5x10 6 cells/ml during the stage of culturing said one or more cells.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из указанной части культурального супернатанта.In one embodiment of the methods proposed above, the step of separating at least a portion of said culture supernatant comprises filtration or centrifugation to remove cells from said portion of the culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment of the methods proposed above, the separated culture supernatant contains at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment of the above methods, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-VWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.According to one embodiment of the methods proposed above, the separated supernatant has a specific FRETS-VWF73 rA13 activity of at least 800 IU/μg.
Согласно предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-VWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 1200 мЕ/мкг.In a preferred embodiment of the methods described above, the separated supernatant has a FRETS-VWF73 specific rA13 activity of at least 1200 IU/μg.
Согласно более предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-VWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.In a more preferred embodiment of the methods described above, the separated supernatant has a FRETS-VWF73 specific rA13 activity of at least 1600 IU/μg.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 10 мМ.According to one embodiment of the methods proposed above, the content of NH 4 + in said culture supernatant is kept below 10 mM.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 5 мМ.According to one embodiment of the methods proposed above, the content of NH 4 + in said culture supernatant is kept below 5 mM.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.According to one embodiment of the methods proposed above, the content of NH 4 + in said culture supernatant is maintained at a concentration below 4 mM.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения rA13.According to one embodiment of the methods proposed above, said method further comprises the step of enriching rA13.
Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящем изобретении способом.According to a seventh aspect, the present invention provides a cell culture supernatant containing recombinant ADAMTS13 (rA13), characterized in that said supernatant is obtained by the method described in the present invention.
Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 5 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности FRETSVWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 7 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 9 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящем изобретении способу.According to an eighth aspect, the present invention provides a cell culture supernatant containing recombinant von Willebrand factor (rVWF), characterized in that said supernatant contains at least 5 units of FRETS-VWF73 activity per ml. In a specific embodiment, said supernatant contains at least 6 units of FRETSVWF73 activity per ml. In another specific embodiment, said supernatant contains at least 7 units of FRETS-VWF73 activity per ml. In another specific embodiment, said supernatant contains at least 8 units of FRETS-VWF73 activity per ml. In another specific embodiment, said supernatant contains at least 9 units of FRETS-VWF73 activity per ml. In another specific embodiment, said supernatant contains at least 10 units of FRETS-VWF73 activity per ml. According to another specific implementation of the above supernatants, the supernatant is obtained according to the method described in the present invention.
Согласно девятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), при этом указанный супернатант содержит по меньшей мере 2 мкг rA13 на мл. Согласно конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг rA13 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг rA13 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг rA13 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг rA13 на мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в на- 7 041947 стоящем изобретении способу.According to a ninth aspect, the present invention provides a cell culture supernatant containing recombinant von Willebrand factor (rVWF), said supernatant containing at least 2 μg of rA13 per ml. In a specific embodiment, the supernatant contains at least 3 μg of rA13 per ml. In another specific embodiment, the supernatant contains at least 4 μg of rA13 per ml. In another specific embodiment, the supernatant contains at least 5 μg of rA13 per ml. In another specific embodiment, the supernatant contains at least 6 μg of rA13 per ml. In yet another specific embodiment of the supernatants described above, the supernatant is obtained according to the method described in the present invention.
Согласно десятому аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), полученная согласно любому из вышеописанных способов.According to a tenth aspect, the present invention provides a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition prepared according to any of the methods described above.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.In one embodiment of the compositions described above, said composition is in a form for pharmaceutical administration. According to a specific implementation variant of the specified composition receive in the form for intravenous administration.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1. (1А) Электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1 %) rVWF, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди, согласно описанию в примере 2. Отметим, что день культивирования 3 эквивалентен дню периодической культуры 1 из табл.7 и табл.8. (1В) Относительное содержание мультимеров VWF, содержащих от 1 до 10 димеров (зона № 1) и более чем 10 димеров (зона № 2) согласно оценке зон, приведенных на фиг. 1 А, количественно определяли денситометрическим анализом.Fig. 1. (1A) Low resolution (1%) agarose gel electrophoresis of rVWF expressed in mammalian cell cultures in the presence of low (1.0 μg/L) and high (4.3 μg/L) copper concentrations as described in the example. 2. Note that culture day 3 is equivalent to batch culture day 1 from Table 7 and Table 8. (1B) Relative content of VWF multimers containing 1 to 10 dimers (Zone #1) and more than 10 dimers (Zone #2) as assessed by the zones shown in FIG. 1 A was quantified by densitometric analysis.
Фиг. 2. (2А) Интервальный график средней удельной активности rVWF в супернатантах клеточных культур rVWF, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди. (2В) Интервальный график средней концентрации NH4 +, обнаруживаемой в супернатантах клеточных культур rVWF, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди.Fig. 2. (2A) Interval plot of mean rVWF specific activity in rVWF cell culture supernatants grown at high and low cell densities in the presence of high or low levels of copper. (2B) Interval plot of mean NH 4 + concentration found in supernatants of rVWF cell cultures grown at high and low cell densities in the presence of high or low levels of copper.
Фиг. 3. Супернатанты культур клеток, экспрессирующих рекомбинантный ADAMTS13 в присутствии возрастающих уровней меди, исследовали с применением анализа ДСН-ПААГ. После ДСН-ПААГ rA13 визуализировали с помощью (3А) окрашивания серебром и (3В) анти-А13 вестерн-блоттинга.Fig. 3. Supernatants of cell cultures expressing recombinant ADAMTS13 in the presence of increasing levels of copper were examined using SDS-PAGE analysis. After SDS-PAGE, rA13 was visualized by (3A) silver staining and (3B) anti-A13 Western blotting.
Фиг. 4. График зависимости объемной продуктивности (Р Frets) от концентрации меди, показывающий экстраполированный (сплошная линия) эффект оптимальной концентрации меди на выработку rA13.Fig. 4. Plot of volumetric productivity (P Frets) versus copper concentration showing the extrapolated (solid line) effect of optimal copper concentration on rA13 production.
Фиг. 5А-К. Ступенчатые диаграммы при непрерывном суспензионном (хемостатическом) культивировании клеток, экспрессирующих rA13 на протяжении времени культивирования 8 недель, сравнивающие эффекты основных уровней меди (0,66 мкг/л) с таковыми в культурах, дополненных до конечной концентрации меди 2 мкг/л. Каждый столбец представляет среднее значение за неделю хемостатической культуры. Легенда относится к конкретным неделям, для которых представлены данные.Fig. 5A-K. Step charts from continuous suspension (chemostatic) culture of cells expressing rA13 over a culture time of 8 weeks, comparing the effects of baseline copper levels (0.66 µg/L) with those in cultures supplemented to a final copper concentration of 2 µg/L. Each bar represents the weekly average of hemostatic culture. The legend refers to the specific weeks for which data is presented.
Фиг. 6. (6А) Электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1%) rVWF, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди при высокой и низкой плотности клеток согласно описанию в примере 3. Следует отметить, что дни культивирования 8 и 17 (CST8 и CST17) эквивалентны дню 8 и дню 17 в табл. 10-13. (6В) Относительное содержание мультимеров VWF, содержащих от 1 до 10 димеров и более чем 10 димеров согласно оценке зон, приведенных на фиг. 6А, количественно определяли денситометрическим анализом.Fig. 6. (6A) Low resolution (1%) agarose gel electrophoresis of rVWF expressed in mammalian cell cultures in the presence of low (1.0 μg/L) and high (4.3 μg/L) copper concentrations at high and low density. cells as described in example 3. It should be noted that the days of cultivation 8 and 17 (CST8 and CST17) are equivalent to day 8 and day 17 in the table. 10-13. (6B) Relative content of VWF multimers containing 1 to 10 dimers and more than 10 dimers according to the evaluation of the zones shown in FIG. 6A was quantified by densitometric analysis.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
I. Введение.I. Introduction.
Рекомбинантный vWF (rVWF) и рекомбинантный ADAMTS13 (rA13) могут быть получены посредством экспрессии в крупномасштабных культурах клеток млекопитающих. Однако активность указанных белков при получении с применением стандартных условий культивирования клеток часто варьирует от культуры к культуре клеток, даже в тех случаях, когда общий состав сред неизменен; удельная активность рекомбинантных белков часто отличается от таковой vWF и rA13, полученных из плазмы крови. Кроме того, rVWF, экспрессируемый в культурах клеток млекопитающих, склонен образовывать белковые составы с низким (менее 10%) процентным содержанием мультимеров высшего порядка (мультимеры высшего порядка включают молекулы, содержащие более чем 10 димеров VWF). Эти недостатки стандартных способов получения rVWF и rA13 представляют особенные сложности при создании культур для крупномасштабного производства (т.е. от 10 до более чем 20000-литровых культур).Recombinant vWF (rVWF) and recombinant ADAMTS13 (rA13) can be produced by expression in large scale mammalian cell cultures. However, the activity of these proteins when obtained using standard cell culture conditions often varies from culture to cell culture, even in cases where the overall composition of the media is unchanged; the specific activity of recombinant proteins often differs from that of vWF and rA13 obtained from blood plasma. In addition, rVWF expressed in mammalian cell culture tends to form protein compounds with a low (less than 10%) percentage of higher order multimers (higher order multimers include molecules containing more than 10 VWF dimers). These shortcomings of standard methods for producing rVWF and rA13 present particular challenges when creating cultures for large scale production (ie 10 to over 20,000 liter cultures).
Одним из потенциальных источников вариабельности, часто наблюдаемой в разных партиях клеточной культур, является присутствие загрязнителей в компонентах сред для клеточных культур. Указанные загрязнители могут присутствовать в различном количестве в разных партиях, что приводит к варьирующим результатам при получении rVWF и rA13. После изучения различных загрязнителей, обнаруживаемых в различных добавках для клеточных культуральных сред, авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие гидролизатов приводит к варьированию концентраций меди в таких культуральных средах. Дальнейшие исследования дали неожиданный результат: добавление меди в культуральные среды до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л, стабильно увеличивало общую и удельную активность rVWF и rA13 и/или также могло приводить к увеличению общего выхода белка. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы и композиции для высокопродуктивного получения rVWF и белков rA13 с высокой удельной активностью.One potential source of variability often observed across batches of cell cultures is the presence of contaminants in components of cell culture media. These contaminants may be present in varying amounts in different batches, leading to varying results in the production of rVWF and rA13. After examining various contaminants found in various cell culture media supplements, the present inventors found that the presence of hydrolysates results in varying copper concentrations in such culture media. Further studies yielded an unexpected result: adding copper to the culture media to obtain a total copper concentration of at least about 1 µg/l to about 20 µg/l stably increased the total and specific activity of rVWF and rA13 and/or could also lead to increase in overall protein yield. Thus, in accordance with the present invention, methods and compositions are provided for the highly productive production of rVWF and rA13 proteins with high specific activity.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток и композиции для получения больших количеств rVWF и rA13, обладающих активностью, сравнимой или превышающей активность, проявляемую происходящим из плазмы vWFIn one aspect, the present invention provides cell culture methods and compositions for producing large amounts of rVWF and rA13 having an activity comparable to or greater than that of plasma-derived vWF.
- 8 041947 (pdVWF) или происходящим из плазмы ADAMTS13 (pdA13). Согласно дальнейшим аспектам белки rVWF и rA13, получаемые согласно настоящему изобретению, демонстрируют стабильно более высокую активность по сравнению с белками, получаемыми с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящем изобретении. Удачным образом, согласно определенным вариантам реализации описанных в настоящем изобретении способов и композиций, белки rVWF и rA13, полученные согласно настоящему изобретению, проявляют стабильно более высокую удельную активность (т.е. Е/мг белка) по сравнению с белками, полученными с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящем изобретении. Сходным образом, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы получения rVWF и rA13 дают больший выход активности на объем культуры (т.е. Е/л/день), по сравнению со стандартными способами культивирования клеток с применением сред без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящем изобретении.- 8 041947 (pdVWF) or plasma-derived ADAMTS13 (pdA13). In further aspects, the rVWF and rA13 proteins produced according to the present invention exhibit consistently higher activity than proteins produced using standard cell culture methods in media without the addition of copper or other additives detailed in the present invention. Advantageously, in certain embodiments of the methods and compositions described herein, the rVWF and rA13 proteins prepared according to the present invention exhibit consistently higher specific activity (i.e., U/mg protein) compared to proteins prepared using standard methods for culturing cells in media without the addition of copper or other additives, as described in detail in the present invention. Similarly, the methods of producing rVWF and rA13 according to the present invention give a greater yield of activity per culture volume (i.e., U/L/day) compared to standard cell culture methods using media without the addition of copper or other additives, described in detail in the present invention.
Согласно еще одному аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации общая концентрация меди составляет приблизительно 1,5-4,5 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь до получения приблизительно 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8; 3; 3,2; 3,4; 3,6; 3,8; 4; 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20 мкг/л меди или более. Основные среды для клеточных культур как правило, содержат следовые концентрации меди менее 1 мкг/л.In yet another aspect, the present invention provides methods for cell culture, wherein copper is added to the base cell culture medium to achieve a total concentration of at least about 1 μg/L. In other embodiments, copper is added to the base cell culture medium to achieve a total concentration of at least about 2 µg/L. In other embodiments, copper is added to the base cell culture medium to obtain a total concentration of at least about 1 µg/L to about 20 µg/L. In some embodiments, the total copper concentration is about 1.5-4.5 µg/L. In certain embodiments, copper is added to the cell culture medium to obtain approximately 1; 1.2; 1.4; 1.6; 1.8; 2.0; 2.2; 2.4; 2.6; 2.8; 3; 3.2; 3.4; 3.6; 3.8; 4; 4.2; 4.4; 4.6; 4.8; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0; 9.5; 10; eleven; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20 µg/l copper or more. Basic cell culture media typically contain trace copper concentrations of less than 1 µg/L.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л меди для продуцирования rVWF. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,5-15; 2,0-10; 2,58; 3,0-6; 4,0-5,0 мкг/л меди для продуцирования rVWF. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат.According to some embodiments of the present invention, cell culture methods are provided wherein from about 1.0 to about 20 µg/L copper is added to the basic cell culture medium to produce rVWF. In further embodiments, approximately 1.5-15; 2.0-10; 2.58; 3.0-6; 4.0-5.0 µg/L copper for rVWF production. According to further embodiments, said basic cell culture medium may, in addition to the added copper, also contain one or more hydrolysates.
Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,5 до приблизительно 4 мкг/л меди для продуцирования rA13. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,6-3,8; 1,7-3,6; 1,8-3,4; 1,9-3,2; 2,0-3,0; 2,1-2,8; 2,2-2,6; 2,3-2,4 мкг/л меди для продуцирования rA13. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры включает, помимо меди и/или одного или более гидролизата, от приблизительно 1,0 до приблизительно 30 мкМ цинка. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры также содержит, помимо меди и/или одного или более гидролизата и/или цинка, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5,0 мМ кальция.In other embodiments, the present invention provides methods for culturing cells in which about 1.5 to about 4 µg/L copper is added to the basic cell culture medium to produce rA13. In further embodiments, approximately 1.6-3.8; 1.7-3.6; 1.8-3.4; 1.9-3.2; 2.0-3.0; 2.1-2.8; 2.2-2.6; 2.3-2.4 µg/l copper for rA13 production. According to further embodiments, said basic cell culture medium may, in addition to the added copper, also contain one or more hydrolysates. In further embodiments, said basic cell culture medium comprises, in addition to copper and/or one or more hydrolyzate, from about 1.0 to about 30 μM zinc. In further embodiments, said basic cell culture medium also contains, in addition to copper and/or one or more hydrolysates and/or zinc, about 0.5 to about 5.0 mM calcium.
Согласно дальнейшему аспекту и в соответствии со всеми вышеизложенными, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым уровни аммония в растворе культуры клеток являются низкими (менее 10 мМ). Согласно определенным вариантам реализации в способах культивирования клеток согласно настоящему изобретению применяют среды для клеточных культур, содержащие более 1, 2, 3, 4 или 5 мкг/л меди в комбинации с низкими уровнями аммония.In a further aspect, and in accordance with all of the foregoing, the present invention provides cell culture methods wherein ammonium levels in the cell culture solution are low (less than 10 mM). In certain embodiments, cell culture methods of the present invention use cell culture media containing greater than 1, 2, 3, 4, or 5 μg/L copper in combination with low levels of ammonium.
Одним из преимуществ способов и композиций согласно настоящему изобретению является то, что они подходят для крупномасштабного культивирования клеток. Объем указанных крупномасштабных культур клеток составляет по меньшей мере 10 л, 50 л, 100 л, 150 л, 200 л, 250 л, 500 л, 750 л, 1000 л, 1500 л, 2000 л, 5000 л, 10000 л или 20000 л.One advantage of the methods and compositions of the present invention is that they are suitable for large scale cell culture. The volume of said large-scale cell cultures is at least 10 L, 50 L, 100 L, 150 L, 200 L, 250 L, 500 L, 750 L, 1000 L, 1500 L, 2000 L, 5000 L, 10000 L or 20000 L .
Согласно определенным аспектам способы согласно настоящему изобретению не обязательно приводят к получению большего суммарного количества рекомбинантного белка, однако получаемый рекомбинантный белок (rVWF или rA13) демонстрирует более высокую общую и удельную активность, чем обнаруживаемая у белков, полученных с применением стандартных клеточных культур, в частности, по сравнению с белками, полученными в таких культурах клеток, где среда для клеточной культуры не содержит дополнительных добавок меди. Согласно дальнейшим аспектам белки rVWF и rA13, полученные из клеток, культивируемых в средах с добавлением меди, демонстрируют стабильно повышенную активность на литр культуры клеток по сравнению с клетками, культивируемыми в основных средах для клеточных культур без добавления меди. Согласно дальнейшим аспектам добавление в среды меди со- 9 041947 гласно настоящему изобретению приводит к повышению выхода белка, увеличению числа клеток в культуре и/или повышению общей активности на литр культуры по сравнению со средами без добавления меди.In certain aspects, the methods of the present invention do not necessarily result in a greater total amount of recombinant protein, however, the resulting recombinant protein (rVWF or rA13) exhibits a higher total and specific activity than that found in proteins obtained using standard cell cultures, in particular, compared to proteins obtained in cell cultures where the cell culture medium does not contain additional copper supplements. In further aspects, rVWF and rA13 proteins derived from cells cultured in copper supplemented media show consistently increased activity per liter of cell culture compared to cells cultured in basic cell culture media without copper supplementation. According to further aspects, the addition of copper to media according to the present invention results in increased protein yield, increased number of cells in culture, and/or increased total activity per liter of culture compared to media without copper addition.
Дальнейшие преимущества способов и композиций согласно настоящему изобретению заключаются в получении популяции белков с высоким процентным содержанием (более 10%) высокомультимеризованного rVWF.Further advantages of the methods and compositions of the present invention lie in the production of a protein population with a high percentage (greater than 10%) of highly multimerized rVWF.
Хотя значительная часть обсуждения белков ADAMTS в настоящем изобретении относится к ADAMTS 13 (А13), необходимо понимать, что, так как все белки ADAMTS имеют общую структуру центрального домена и общие структурно-функциональные связи, способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, применимы для получения любых белков ADAMTS, не ограничиваясь rA13.Although much of the discussion of ADAMTS proteins in the present invention relates to ADAMTS 13 (A13), it should be understood that since all ADAMTS proteins share a common central domain structure and common structural-functional relationships, the methods and compositions described in the present invention are applicable to obtaining any ADAMTS proteins, not limited to rA13.
ОпределенияDefinitions
Используемый в настоящем изобретении термин рекомбинантный vWF включает vWF полученный с применением технологии рекомбинантной ДНК. Согласно определенным вариантам реализации белки vWF согласно настоящему изобретению могут содержать конструкцию, полученную, например, согласно WO 1986/06096, опубликованной 23 окт. 1986 г., и заявке на патент США сер. № 07/559509, поданной 23 июля 1990г. от имени Ginsburg et al., включенных в настоящее изобретение посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного vWF. vWF согласно настоящему изобретению может включать все потенциальные формы, в том числе мономерные и мультимерные формы. Необходимо также понимать, что настоящее изобретение охватывает применение комбинаций разных формы vWF. Например, vWF согласно настоящему изобретению может включать разные мультимеры, разные производные; как активные биологически производные, так и не активные биологические производные.As used herein, the term recombinant vWF includes vWF produced using recombinant DNA technology. In certain embodiments, the vWF proteins of the present invention may comprise a construct derived, for example, from WO 1986/06096 published 23 Oct. 1986 and US Patent Application Ser. No. 07/559509 filed July 23, 1990 on behalf of Ginsburg et al. incorporated herein by reference in relation to methods for producing recombinant vWF. vWF according to the present invention may include all potential forms, including monomeric and multimeric forms. It should also be understood that the present invention encompasses the use of combinations of different forms of vWF. For example, vWF according to the present invention may include different multimers, different derivatives; both active biological derivatives and inactive biological derivatives.
Термин рекомбинантный при использовании, например, в отношении клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора, означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы введением гетерологичной(ного) нуклеиновой кислоты или белка, либо изменением нативной (нативного) нуклеиновой кислоты или белка, или что указанная клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не обнаруживаемые в нативных (нерекомбинантных) формах указанных клеток или экспрессируют нативные гены, которые в противном случае экспрессируются аномально, экспрессируются недостаточно или не экспрессируются вообще.The term recombinant, when used, for example, in relation to a cell or nucleic acid, protein or vector, means that the specified cell, nucleic acid, protein or vector is modified by introducing a heterologous nucleic acid or protein, or by changing the native (native) nucleic acid or protein, or that said cell is derived from a cell thus modified. Thus, for example, recombinant cells express genes not found in native (non-recombinant) forms of said cells, or express native genes that are otherwise abnormally, underexpressed, or not expressed at all.
В контексте настоящего изобретения рекомбинантный vWF охватывает любые члены семейства vWF, например, от млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи; и их биологически активные производные. Согласно предпочтительному варианту реализации рекомбинантный VWF представляет собой VWF человека. Мутантные и вариантные белки vWF, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков vWF. Кроме того, vWF согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. vWF, описанные в настоящем изобретении, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.In the context of the present invention, recombinant vWF encompasses any members of the vWF family, for example, from mammals such as primates, humans, monkeys, rabbits, pigs, rodents, mice, rats, hamsters, gerbils, canines, felines; and their biologically active derivatives. In a preferred embodiment, the recombinant VWF is a human VWF. Mutant and variant vWF proteins having activity are also included, as are functional fragments and hybrids of vWF proteins. In addition, the vWFs of the present invention may also contain labels to facilitate purification or detection, or both. The vWFs described in the present invention may also be modified with a therapeutic agent or an agent suitable for in vitro or in vivo imaging.
Термины высокомультимерный vWF, высокомолекулярный vWF и HMW VWF могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к ковалентно связанным мультимерам vWF, содержащим более чем 10 димеров VWF. Согласно определенным вариантам реализации HMW VWF содержит по меньшей мере 11 димеров VWF, или по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или более димеров VWF.The terms high multimeric vWF, high molecular weight vWF, and HMW VWF may be used interchangeably and refer to covalently linked vWF multimers containing more than 10 VWF dimers. In certain embodiments, the HMW VWF contains at least 11 VWF dimers, or at least 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or more VWF dimers.
Используемый в настоящем изобретении термин белок ADAMTS относится к полипептиду - дезинтегрину и металлопротеиназе из семейства металлопротеиназ с мотивами тромбоспондина I типа. Члены указанного семейства включают белки человека ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (Nm_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (Nm_030955),As used herein, the term ADAMTS protein refers to a disintegrin and metalloproteinase polypeptide from the family of metalloproteinases with type I thrombospondin motifs. Members of this family include human proteins ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (Nm_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7), (NM_0142727) NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (Nm_030955),
ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155;ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155;
NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (Nm_139057),NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (Nm_139057),
ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) и ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). Белки ADAMTS включают и полноразмерные белки, и неполные полипептиды, которые проявляют по меньшей мере частичную биологическую активность, например, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более, от активности, демонстрируемой полноразмерным белком, в частности, протеазной активности, демонстрируемой полноразмерным белком. В определенных случаях белок ADAMTS подвергается посттрансляционной модификации in vivo или in vitro, например, ферментативным или химическим путем. Понятно, что белки ADAMTS согласно настоящему изобретению включают изоформы альтернативного сплайсинга, консервативно модифицированные белки, идентичные по существу белки, гомологи и т.п.ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) and ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). ADAMTS proteins include both full-length proteins and partial polypeptides that exhibit at least partial biological activity, e.g., at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 % or more of the activity shown by the full length protein, in particular the protease activity shown by the full length protein. In certain cases, the ADAMTS protein undergoes post-translational modification in vivo or in vitro, for example, by enzymatic or chemical means. It is understood that the ADAMTS proteins of the present invention include alternative splicing isoforms, conservatively modified proteins, substantially identical proteins, homologues, and the like.
В контексте настоящего изобретения термин белок ADAMTS охватывает любые члены семействаIn the context of the present invention, the term ADAMTS protein encompasses any members of the family
- 10 041947- 10 041947
ADAMTS, происходящие, например, из млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи, и их биологически активные производные. Мутантные и вариантные белки ADAMTS, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков ADAMTS. Кроме того, белки ADAMTS согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. Белки ADAMTS, описанные в настоящем изобретении, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.ADAMTS derived, for example, from mammals such as primates, humans, monkeys, rabbits, pigs, rodents, mice, rats, hamsters, gerbils, canines, felines, and biologically active derivatives thereof. Mutant and variant ADAMTS proteins having activity are also included, as are functional fragments and fusions of ADAMTS proteins. In addition, the ADAMTS proteins of the present invention may also contain labels to facilitate purification or identification, or both. The ADAMTS proteins described in the present invention may also be modified with a therapeutic agent or an agent suitable for in vitro or in vivo imaging.
Используемый в настоящем изобретении термин белок ADAMTS 13 относится к любому белку или полипептиду, обладающему активностью ADAMTS 13, в частности, способностью расщеплять пептидную связь между остатками Tyr-842 и Met-843 в VWF. Согласно типовому варианту реализации белок ADAMTS 13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620594 (изоформа 1 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75- 1427 NP_620594 (изоформа 1 ADAMTS13, зрелый полипептид). Согласно другому варианту реализации белок ADAMTS13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620596 (изоформа 2 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1371 NP_620594 (изоформа 2 ADAMTS13, зрелый полипептид). Согласно еще одному из вариантов реализации ADAMTS13 белки включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620595 (изоформа 3 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1340 NP_620595 (изоформа 1 ADAMTS13, зрелый полипептид). Используемый в настоящем изобретении термин белок ADAMTS13 включает природные варианты, обладающие vWF-расщепляющей активностью, и искусственные конструкции, обладающие vWF-расщепляющей активностью. Согласно применению в настоящем описании ADAMTS13 охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, сохраняющие некоторую степень основной активности. Примеры мутаций ADAMTS13, обнаруживаемые в популяциях человека, включают без ограничений R7W, V88m, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, Р618А, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, А1033Т, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, для многих из которых показана связь с тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП). Белки ADAMTS13 также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации. Например, показано, что ADAMTS13 модифицируется N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) по остаткам 614, 667 и 1354, и предсказано, что остатки 142, 146, 552, 579, 707, 828 и 1235 могут также модифицироваться таким образом.As used herein, the term ADAMTS 13 protein refers to any protein or polypeptide having ADAMTS 13 activity, in particular the ability to cleave the peptide bond between Tyr-842 and Met-843 residues in VWF. In an exemplary embodiment, an ADAMTS 13 protein refers to a polypeptide containing an amino acid sequence substantially similar to that of NP_620594 (ADAMTS13 isoform 1, preproprotein) or amino acids 75-1427 of NP_620594 (ADAMTS13 isoform 1, mature polypeptide). In another embodiment, an ADAMTS13 protein refers to a polypeptide containing an amino acid sequence substantially similar to that of NP_620596 (ADAMTS13 isoform 2, preproprotein) or amino acids 75-1371 of NP_620594 (ADAMTS13 isoform 2, mature polypeptide). In another embodiment, ADAMTS13 proteins include polypeptides containing an amino acid sequence substantially similar to that of NP_620595 (ADAMTS13 isoform 3, preproprotein) or NP_620595 amino acids 75-1340 (ADAMTS13 isoform 1, mature polypeptide). As used herein, the term ADAMTS13 protein includes natural variants having vWF-cleaving activity and artificial constructs having vWF-cleaving activity. As used herein, ADAMTS13 encompasses any natural variants, alternative sequences, isoforms, or mutant proteins that retain some degree of basic activity. Examples of ADAMTS13 mutations found in human populations include, without limitation, R7W, V88m, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R6725H, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, many of which have been shown to be associated with thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). ADAMTS13 proteins also include polypeptides containing post-translational modifications. For example, ADAMTS13 has been shown to be modified by N-acetylglucosamine (GlcNAc) at residues 614, 667, and 1354, and it is predicted that residues 142, 146, 552, 579, 707, 828, and 1235 may also be modified in this manner.
Протеолитически активный рекомбинантный ADAMTS13 может быть получен посредством осуществления экспрессии в культурах клеток млекопитающих, согласно описанию у Plaimauer et al., (2002, Blood. 15;100(10):3626-32) и в US 2005/0266528, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Способы экспрессии рекомбинантного ADAMTS13 в культуре клеток описаны у Plaimauer В, Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):2433 и в US 2011/0086413, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.Proteolytically active recombinant ADAMTS13 can be obtained by performing expression in mammalian cell cultures as described in Plaimauer et al. the present invention by reference in its entirety for any purpose. Methods for expressing recombinant ADAMTS13 in cell culture are described in Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):2433 and US 2011/0086413, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety for any purpose.
Используемый в настоящем изобретении термин биологически активное производное при использовании в контексте белка ADAMTS охватывает также полипептиды, полученные с применением технологии рекомбинантной ДНК, что может включать любые известные в данной области техники способы (i) получения рекомбинантной ДНК посредством методов генной инженерии, например, посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем трансфекции, т.е. электропорацией или микроинъекцией, (iii) культивирования указанных трансформированных клеток, например, в непрерывном или периодическом режиме, (iv) экспрессии белка ADAMTS, например, конститутивного или индуцируемого, и (v) выделения указанного белка ADAMTS, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток, (vi) получения существенно очищенного рекомбинантного белка ADAMTS, например, с помощью ионообменной хроматографии-, эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и т.п. Термин биологически активное производное включает также гибридные молекулы, такие как, например, белок ADAMTS или его функциональный фрагмент, скомбинированный с вторым полипептидом, например, доменом Fc иммуноглобулина или альбуминовым доменом, для улучшения биологических/фармакологических параметров, таких как, например, период полужизни белка ADAMTS в кровотоке млекопитающего, в частности, человека.As used herein, the term biologically active derivative, when used in the context of the ADAMTS protein, also encompasses polypeptides produced using recombinant DNA technology, which may include any methods known in the art to (i) obtain recombinant DNA through genetic engineering techniques, for example, by reverse engineering. transcription of RNA and/or amplification of DNA, (ii) introduction of recombinant DNA into prokaryotic or eukaryotic cells by transfection, i.e. by electroporation or microinjection, (iii) culturing said transformed cells, e.g., continuously or batchwise, (iv) expressing said ADAMTS protein, e.g. constitutive or inducible, and (v) isolating said ADAMTS protein, e.g. transformed cells, (vi) obtaining a substantially purified recombinant ADAMTS protein, for example, using ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and the like. The term biologically active derivative also includes hybrid molecules, such as, for example, the ADAMTS protein or a functional fragment thereof, combined with a second polypeptide, for example, an immunoglobulin Fc domain or an albumin domain, to improve biological/pharmacological parameters, such as, for example, the half-life of the protein. ADAMTS in the bloodstream of a mammal, in particular a human.
Термины выделенный, очищенный или биологически чистый относятся к веществу, практически или по существу не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в естественном состоянии. Чистоту и гомогенность, как правило, определяют с применением техник аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Согласно одному из вариантов реализации rVWF представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Согласно другому варианту реализации rA13 представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Термин очищенный согласно некоторым ваThe terms isolated, purified, or biologically pure refer to a substance that is substantially or essentially free of the components normally associated with it in its natural state. Purity and homogeneity are typically determined using analytical chemistry techniques such as polyacrylamide gel electrophoresis or high performance liquid chromatography. In one embodiment, rVWF is the predominant component in the substantially purified formulation. In another embodiment, rA13 is the predominant component in a substantially purified formulation. The term cleared according to some
- 11 041947 риантам реализации означает, что нуклеиновая кислота или белок дают по существу одну полосу в электрофоретическом геле. Согласно другим вариантам реализации это означает, что чистота указанной(ого) нуклеиновой кислоты или белка составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно - по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Чистота или очистка согласно другим вариантам реализации означает удаление по меньшей мере одного загрязнителя из подвергаемой очищению композиции. В этом смысле очистка не подразумевает, что очищенное соединение будет гомогенным, например, чистым на 100%.- 11 041947 implementation options means that the nucleic acid or protein gives essentially one band in the electrophoretic gel. In other embodiments, this means that the purity of said nucleic acid or protein is at least 50%, more preferably at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more. Purity or purification, in other embodiments, means the removal of at least one contaminant from the composition to be purified. In this sense, purification does not imply that the purified compound will be homogeneous, eg 100% pure.
Биологическая активность vWF может быть измерена посредством известных методов анализа in vitro. Например, ристоцетин-кофакторный анализ основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии vWF. Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации vWF и может быть измерена турбодиметрическим методом, например, с применением агрегометра (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). В настоящем изобретении удельную ристоцетинкофакторную активность vWF согласно настоящему изобретению выражают в мЕ/мкг vWF согласно оценке с применением методов анализа in vitro.The biological activity of vWF can be measured by known in vitro assay methods. For example, the ristocetin cofactor assay is based on agglutination of fresh or formalin-fixed platelets induced by the antibiotic ristocetin in the presence of vWF. The degree of platelet agglutination depends on the concentration of vWF and can be measured by a turbodimetric method, for example, using an aggregometer (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). In the present invention, the specific ristocetin cofactor activity of vWF according to the present invention is expressed in mU/µg of vWF as assessed using in vitro assay methods.
Используемый в настоящем изобретении термин одна единица активности ADAMTS означает уровень активности в 1 мл смешанной нормальной плазмы человека, независимо от того, какой метод анализа применяют. Например, в том случае, если белок ADAMTS представляет собой ADAMTS 13, одна единица активности ADAMTS 13 FRETS-VWF73 представляет собой уровень активности, необходимый для расщепления такого же количества субстрата FRETS-VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100), которое расщепляется одним мл смешанной нормальной плазмы человека. Удобно, что активность ADAMTS 13 может быть определена методами функционального анализа, такими как функциональный анализ с применением модифицированных пептидов фактора фон Виллебранда в качестве субстрата ADAMTS 13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9): 1534-41). Предпочтительный способ определения активности рекомбинантного ADAMTS13 человека описан у Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) (Анализ протеазы, расщепляющей фактор фон Виллебранда (vWF), основанный на понижении коллаген-связывающей способности деградированного vWF: инструмент для диагностики тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП)). Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389). Согласно одному из вариантов реализации, чтобы считаться белком ADAMTS13 согласно приведенному выше определению, полипептид или белок должен обладать по меньшей мере 1% vWF-расщепляющей активности нативного ADAMTS13. Согласно другим вариантам реализации белок ADAMTS13 обладает по меньшей мере 10% активности нативного ADAMTS13. Согласно другим вариантам реализации белок ADAMTS13 обладает по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% активности нативного ADAMTS13. Количество белка ADAMTS13 также может быть определено измерением антигена ADAMTS13, например, с применением метода ИФА (ELISA), описанного у Rieger et al, (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212- 20). В данной области техники общепризнано, что 1 мл смешанной нормальной плазмы человека содержит 1 мкг ADAMTS13. Таким образом, согласно общепринятому в данной области техники правилу 1 мкг полученного из плазмы ADAMTS13 обладает одной единицей активности ADAMTS13.Used in the present invention, the term one unit of ADAMTS activity means the level of activity in 1 ml of mixed normal human plasma, regardless of which method of analysis is used. For example, if the ADAMTS protein is ADAMTS 13, one unit of ADAMTS 13 FRETS-VWF73 activity is the level of activity required to cleave the same amount of FRETS-VWF73 substrate (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100), which is cleaved with one ml of mixed normal human plasma. Conveniently, the activity of ADAMTS 13 can be determined by functional assay methods such as functional assay using modified von Willebrand factor peptides as a substrate of ADAMTS 13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9):1534-41) . A preferred method for determining recombinant human ADAMTS13 activity is described in Gerritsen et al. Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) -binding capacity of degraded vWF: a diagnostic tool for thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) Thromb Haemost 1999;82:1386-1389). In one embodiment, to be considered an ADAMTS13 protein as defined above, a polypeptide or protein must have at least 1% of the vWF-cleaving activity of native ADAMTS13. In other embodiments, the ADAMTS13 protein has at least 10% of the activity of native ADAMTS13. In other embodiments, the ADAMTS13 protein has at least 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100% of native ADAMTS13 activity. The amount of ADAMTS13 protein can also be determined by measuring the ADAMTS13 antigen, for example using the ELISA method described in Rieger et al, (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20). It is generally accepted in the art that 1 ml of mixed normal human plasma contains 1 μg of ADAMTS13. Thus, according to the generally accepted rule in the art, 1 μg of plasma-derived ADAMTS13 has one unit of ADAMTS13 activity.
Термины раствор культуры клеток, среда или среды для клеточной культуры и супернатант культуры клеток относятся к аспектам процессов культивирования клеток, как правило, общеизвестным в данной области техники. В контексте настоящего изобретения раствор культуры клеток может включать среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток. Указанные среды для клеточных культур вводят в раствор культуры клеток извне, необязательно вместе с добавками, для обеспечения питательных веществ и других компонентов для культивирования клеток, экспрессирующих rVWF или rA13. Термин супернатант культуры клеток относится к раствору культуры клеток, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для клеточной культуры, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или экскретируемые клетками во время культивирования, но не сами клетки. Таким образом, согласно одному контексту супернатант культуры клеток может относиться к жидкой фазе раствора культуры клеток (т.е. к раствору культуры клеток, исключая клетки). Например, концентрация аммония культурального супернатанта, как правило, относится к концентрации аммония в растворе культуры клеток. Согласно другим контекстам супернатант культуры клеток относится к раствору культуры клеток, из которого указанные клетки были извлечены (т.е. отделенному супернатанту культуры клеток).The terms cell culture solution, cell culture medium or media, and cell culture supernatant refer to aspects of cell culture processes generally known in the art. In the context of the present invention, the cell culture solution may include cell culture media and cell culture supernatant. These cell culture media are added externally to the cell culture solution, optionally together with additives, to provide nutrients and other components for culturing cells expressing rVWF or rA13. The term cell culture supernatant refers to a cell culture solution containing nutrients and other components from the cell culture medium, as well as products released, metabolized and/or excreted by the cells during culture, but not the cells themselves. Thus, in one context, a cell culture supernatant can refer to the liquid phase of a cell culture solution (ie, a cell culture solution, excluding cells). For example, the ammonium concentration of the culture supernatant generally refers to the ammonium concentration in the cell culture solution. In other contexts, cell culture supernatant refers to the cell culture solution from which said cells were recovered (ie, separated cell culture supernatant).
Используемые в настоящем изобретении термины витамин В3, никотинамид, ниацинамид, ниацин и никотиновая кислота могут использоваться взаимозаменяемо, относясь к любому члену семейства витаминов В3. Соответственно, любой член указанного семейства может быть использован для добавления в среду, применяемую в способах согласно настоящему изобретению.As used herein, the terms vitamin B3, nicotinamide, niacinamide, niacin, and nicotinic acid may be used interchangeably to refer to any member of the vitamin B3 family. Accordingly, any member of this family can be used to add to the environment used in the methods according to the present invention.
Используемый в настоящем изобретении термин среда с заданным химическим составом или среды с заданным химическим составом относится к синтетической ростовой среде, все компоненты которой идентифицированы и их концентрации известны. Среды с заданным химическим составом неAs used in the present invention, the term chemically defined medium or chemically defined medium refers to a synthetic growth medium in which all components are identified and their concentrations are known. Media with a given chemical composition are not
- 12 041947 содержат бактериальных, дрожжевых, животных или растительных экстрактов, хотя они могут включать или не включать отдельные компоненты растительного или животного происхождения (например, белки, полипептиды, и т.п.). Неограничивающие примеры коммерчески доступных сред с заданным химическим составом включают различные модифицированные по Дульбекко среды Игла (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), питательную смесь Хэма (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), их комбинации, и т.п. Способы получения культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например, в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.- 12 041947 contain bacterial, yeast, animal or plant extracts, although they may or may not include individual components of plant or animal origin (eg proteins, polypeptides, etc.). Non-limiting examples of commercially available chemically formulated media include various Dulbecco's modified Eagle's media (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), Ham's formula (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), combinations thereof, and etc. Methods for preparing chemically defined culture media are known in the art, for example, in US Pat. invention by reference in its entirety for any purpose.
Используемый в настоящем изобретении термин не содержащая олигопептидов культуральная среда или не содержащие олигопептидов культуральные среды относится к не содержащей белков среде, которая не содержит олигопептиды, такие как, например, олигопептиды, полученные из белкового гидролизата. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда не содержит олигопептиды, состоящие из двадцати или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пятнадцати или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие десять или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие семь или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пять или более аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие три или более аминокислоты. Согласно дальнейшему варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие две или более аминокислоты. Способы получения не содержащих олигопептидов культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США №6171825 и № 6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.As used herein, the term oligopeptide-free culture medium or oligopeptide-free culture media refers to a protein-free medium that does not contain oligopeptides, such as, for example, oligopeptides derived from a protein hydrolysate. In one embodiment, said medium does not contain oligopeptides of twenty or more amino acids. According to one implementation variant of the present invention, the specified environment does not contain oligopeptides containing fifteen or more amino acids. According to another embodiment of the present invention, said medium does not contain oligopeptides containing ten or more amino acids. According to one implementation variant of the specified environment does not contain oligopeptides containing seven or more amino acids. According to another implementation variant of the specified environment does not contain oligopeptides containing five or more amino acids. According to another implementation variant of the specified environment does not contain oligopeptides containing three or more amino acids. According to a further embodiment of the present invention, said medium does not contain oligopeptides containing two or more amino acids. Methods for preparing oligopeptide-free culture media are known in the art, for example, in US Pat. by reference in its entirety for any purpose.
Используемый в настоящем изобретении термин бессывороточная культуральная среда или бессывороточная культуральные среды относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки. Несмотря на то, что зачастую бессывороточные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, в бессывороточные среды могут быть добавлены отдельные животные или растительные белки или белковые фракции. Способы получения бессывороточных культуральных сред известны в данной области техники, например, в патентах США №6171825 и № 6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.Used in the present invention, the term serum-free culture medium or serum-free culture media refers to the culture medium without the addition of animal serum. While serum-free media are often chemically defined media, individual animal or plant proteins or protein fractions can be added to serum-free media. Methods for obtaining serum-free culture media are known in the art, for example, in US patents No. 6171825 and No. 6936441, WO 2007/077217, and US published applications No. links in their entirety for any purpose.
Используемый в настоящем изобретении термин не содержащая животных белков культуральная среда или не содержащие животных белков культуральные среды относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки, белка или фракции белка. Хотя зачастую не содержащие животных белков культуральные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, не содержащие животных белков культуральные среды могут содержать растительные или дрожжевые гидролизаты. Способы получения не содержащих животных белков культуральных сред известны в данной области техники, например, в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.As used herein, the term animal protein-free culture medium or animal protein-free culture media refers to a culture medium without the addition of animal serum, protein, or protein fraction. Although animal protein-free culture media are often chemically defined, animal protein-free culture media may contain vegetable or yeast hydrolysates. Methods for preparing animal protein-free culture media are known in the art, for example, in US Pat. the present invention by reference in its entirety for any purpose.
Используемый в настоящем изобретении термины основная (базовая)среда для клеточной культуры или основные (базовые) среды для клеточных культур относятся к культуральной среде с заданным химическим составом, не содержащей олигопептидов культуральной среде, бессывороточной культуральной среде или не содержащей животных белков культуральной среде, в которую не был добавлен гидролизат, например, растительный или дрожжевой гидролизат. Основные среды общеизвестны в данной области техники, например, DMEM, Хэма F12, DMEM/Хэма F12, среда 199, McCoy или RPMI. Указанная основная среда может включать ряд ингредиентов, в том числе аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, обеспечивающем культивирование клетки; такие количества общеизвестны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например, бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому напряжению или ингибиторы протеазы. При необходимости, могут быть добавлены неионогенные ПАВ, такие как сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.As used herein, the terms base cell culture medium or base cell culture media refer to a chemically defined culture medium, an oligopeptide-free culture medium, a serum-free culture medium, or an animal protein-free culture medium in which no hydrolysate has been added, such as a vegetable or yeast hydrolysate. Base media are well known in the art, such as DMEM, Ham F12, DMEM/Ham F12, Medium 199, McCoy, or RPMI. Said base medium may include a number of ingredients, including amino acids, vitamins, organic and inorganic salts, and carbohydrate sources. Each ingredient may be present in an amount sufficient to culture the cell; such amounts are well known to those skilled in the art. Said medium may include excipients such as buffering agents such as sodium bicarbonate, antioxidants, stabilizers to counteract mechanical stress, or protease inhibitors. If necessary, non-ionic surfactants such as copolymers and/or mixtures of polyethylene glycols and polypropylene glycols can be added.
II. Среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток.II. Cell culture media and cell culture supernatant.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения rVWF и/или rA13, обладающих повышенной активностью по сравнению с rVWF и rA13, полученных с применением основных сред для клеточных культур. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения rVWF и/или rA13, в которых в основные среды для клеточных культур добавляют одно или более дополнительное вещество. СогласноIn one aspect, the present invention relates to cell culture media for producing rVWF and/or rA13 having increased activity relative to rVWF and rA13 produced using basic cell culture media. In one aspect, the present invention relates to cell culture media for producing rVWF and/or rA13, wherein one or more additional substances are added to the basic cell culture media. According to
- 13 041947 конкретным вариантам реализации и приведенному ниже более подробному описанию условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению включают основные среды для клеточных культур, в которые добавлена медь до концентрации по меньшей мере 1,0 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации применяемые среды для клеточных культур и супернатанты, полученные с помощью процессов согласно настоящему изобретению, также содержат низкие уровни (менее 10 мМ) аммония. Согласно конкретному варианту реализации условиями культивирования клеток, применяемыми для экспрессии rVWF и/или rA13, управляют таким образом, чтобы поддерживать в супернатанте культуры клеток низкий уровень аммония, т.е. менее чем 10 мМ и, предпочтительно, менее чем 5 мМ.- 13 041947 specific implementation options and the following more detailed description of the conditions of culturing cells according to the present invention include basic cell culture media, which are added with copper to a concentration of at least 1.0 µg/l. In further embodiments, the cell culture media used and the supernatants produced by the processes of the present invention also contain low levels (less than 10 mM) of ammonium. In a specific embodiment, the cell culture conditions used to express rVWF and/or rA13 are controlled to maintain a low ammonium level in the cell culture supernatant, i. less than 10 mm and preferably less than 5 mm.
Культуральная среда согласно настоящему изобретению могут быть основаны на подходящих основных средах, общеизвестных в данной области техники, таких как DMEM, Хэма F12, DMEM/Хэма F12, среда 199, McCoy или RPMI. Основная среда может включать ряд ингредиентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, содействующем культивированию клетки; такие количества, как правило, известны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например, бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому стрессу, или ингибиторы протеазы. При необходимости может быть добавлено неионогенное ПАВ, например, сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.Culture media of the present invention may be based on suitable base media commonly known in the art such as DMEM, Ham F12, DMEM/Ham F12, 199 medium, McCoy or RPMI. The base medium may include a number of ingredients including amino acids, vitamins, organic and inorganic salts, and carbohydrate sources. Each ingredient may be present in an amount to promote cell culture; such amounts are generally known to those skilled in the art. Said medium may include excipients such as buffering agents such as sodium bicarbonate, antioxidants, stabilizers to counteract mechanical stress, or protease inhibitors. If necessary, a non-ionic surfactant can be added, for example copolymers and/or mixtures of polyethylene glycols and polypropylene glycols.
Как правило, основные среды содержат менее чем 1 мкг/л меди - например, среда DMEM/Хэма F12 содержит медь в концентрации приблизительно 0,3 мкг/л. Такие концентрации меди не обеспечивают достаточного количества ионов меди для поддержания продуцирования белков rVWF и rA13 согласно настоящему изобретению, которые проявляют высокую удельную активность.Typically, basic media contain less than 1 µg/L copper - for example, DMEM/Ham F12 contains copper at a concentration of approximately 0.3 µg/L. These copper concentrations do not provide enough copper ions to support the production of the rVWF and rA13 proteins of the present invention, which exhibit high specific activity.
Медь может быть введена в среды для клеточных культур согласно настоящему изобретению с помощью различных способов, например, введением добавки в среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка в культуральную среду может содержать гидролизат, который можно применять для повышения концентрации меди в указанной среде. Гидролизаты могут включать любой гидролизат из общеизвестных в данной области техники, таких как растительные гидролизаты, соевые гидролизаты и гидролизат пшеничной клейковины. Согласно определенным вариантам реализации добавление гидролизата может способствовать повышенной концентрации меди, от приблизительно 0,2 до приблизительно 10 мкг/л Cu2+. Согласно некоторым вариантам реализации количество меди, обеспеченное гидролизатом, может зависеть от количества меди в указанном гидролизате, а также количества добавленного гидролизата. Содержание меди в гидролизате может быть определено элементным анализом, например, адсорбционной атомной спектроскопией (GFAA: атомной абсорбцией в графитовой печи), или масс-спектрометрическими методами (например, ИСП-МС).Copper can be introduced into the cell culture media of the present invention by a variety of methods, such as adding an additive to the media. In some embodiments, said culture medium supplement may contain a hydrolyzate that can be used to increase the concentration of copper in said medium. Hydrolysates may include any hydrolysate commonly known in the art, such as vegetable hydrolysates, soy hydrolysates, and wheat gluten hydrolysates. In certain embodiments, the addition of the hydrolyzate may contribute to elevated copper concentrations of about 0.2 to about 10 µg/L Cu 2+ . In some embodiments, the amount of copper provided by the hydrolyzate may depend on the amount of copper in said hydrolyzate as well as the amount of hydrolyzate added. The copper content of the hydrolyzate can be determined by elemental analysis, eg adsorption atomic spectroscopy (GFAA: graphite furnace atomic absorption), or mass spectrometric methods (eg ICP-MS).
Согласно определенным вариантам реализации медь может вводиться в культуральные среды, сама по себе или вместе с гидролизатом, путем введения средовой добавки, включая подходящую соль меди или хелат меди. Подходящая медь соли может включать, не ограничиваясь перечисленными, сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди и оксид меди. Подходящие хелаторы меди могут включать, не ограничиваясь перечисленными, альбумин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), полиаминовые хелатирующие агенты, этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин, триэтилендиамин, тетраэтиленпентамин, аминоэтилэтаноламин, аминоэтилпиперазин, пентаэтиленгексамин, триэтилентетрамин-гидрохлорид, тетраэтиленпентамин-гидрохлорид, пентаэтиленгексамин-гидрохлорид, тетраэтилпентамин, каптоприл, пеницилламин, ^^-бис(3-аминопропил)-1,3пропандиамин, N,N,6uc (2 аминоэтил) 1,3 пропандиамин, 1,7-диокса-4,10-диазациклододекан, 1,4,8,11тетраазациклотетрадекан-5,7-дион, 1,4,7-триазациклононана тригидрохлорид, 1-окса-4,7,10триазациклододекан, 1,4,8,12-тетраазациклопентадекан и 1,4,7,10-тетраазациклододекан.In certain embodiments, copper can be added to the culture media, alone or together with the hydrolyzate, by introducing a media supplement including a suitable copper salt or copper chelate. Suitable copper salts may include, but are not limited to, copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, and copper oxide. Suitable copper chelators may include, but are not limited to, albumin, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), polyamine chelating agents, ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, triethylenediamine, tetraethylenepentamine, aminoethylethanolamine, aminoethylpiperazine, pentaethylenehexamine, triethylenetetramine hydrochloride, tetraethylenepentamine hydrochloride, pentaethylenehexamine, triethylenetetramine hydrochloride, tetraethylenepentamine hydrochloride, tetraethylpentamine, captopril, penicillamine, ^^-bis(3-aminopropyl)-1,3 propanediamine, N,N,6uc (2 aminoethyl) 1,3 propanediamine, 1,7-dioxa-4,10-diazacyclododecane, 1,4, 8,11-tetraazacyclotetradecane-5,7-dione, 1,4,7-triazacyclononane trihydrochloride, 1-oxa-4,7,10-triazacyclododecane, 1,4,8,12-tetraazacyclopentadecane and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane.
Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно конкретному варианту реализации в основные клеточные среды добавляют медь до конечной концентрации от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения конечной концентрации приблизительно 1,0-5,0; 1,2-4,0; 1,3-3,0; 1,4-2,9; 1,5-2,8; 1,6-2,7; 1,7-2,6; 1,8-2,5; 1,9-2,4; 2,0-2,3; 2,1-2,2 мкг/л меди. Согласно дальнейшим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 1,2-9,5; 1,4-9; 1,6-8,5; 1,8-8; 2,0-7,5; 2,2-7; 2,4-6,5; 2,6-6,0; 2,8-5,5; 3,0-5,0; 3,2-4,5; 3,4-4; и 2-4 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 16, 2-5, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2 мкг/л. Согласно еще одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей конIn certain embodiments, copper is added to the basic cell culture media to achieve a total copper concentration of from about 1.0 to about 20 µg/L. In a specific embodiment, copper is added to the basic cell media to a final concentration of about 1.0 to about 10 µg/L. In further embodiments, copper is added to the basic cell culture media to obtain a final concentration of approximately 1.0-5.0; 1.2-4.0; 1.3-3.0; 1.4-2.9; 1.5-2.8; 1.6-2.7; 1.7-2.6; 1.8-2.5; 1.9-2.4; 2.0-2.3; 2.1-2.2 µg/l copper. In further embodiments, the basic cell culture media used in the methods of the present invention are supplemented to obtain copper concentrations of approximately 1.2-9.5; 1.4-9; 1.6-8.5; 1.8-8; 2.0-7.5; 2.2-7; 2.4-6.5; 2.6-6.0; 2.8-5.5; 3.0-5.0; 3.2-4.5; 3.4-4; and 2-4 µg/l. In other embodiments, the basic cell culture media used in the methods of the present invention are supplemented to obtain copper concentrations of approximately 16.2-5.3-4 µg/L. In one embodiment, copper is added to the basic cell culture media to achieve a total copper concentration of at least 1 µg/L. In another embodiment, copper is added to the basic cell culture media until a total copper concentration of at least 2 µg/L is obtained. According to another embodiment, copper is added to the basic cell culture media until a total con is obtained.
- 14 041947 центрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л, или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/л меди или более. Согласно определенным вариантам реализации и более подробному описанию ниже в настоящем изобретении культуры для получения rA13 могут содержать приблизительно 2-4 мкг/л меди, тогда как культуры для получения rVWF могут содержать по меньшей мере 2 мкг/л меди.- 14 041947 concentration of copper, constituting at least 4 µg/l. In certain embodiments, copper is added to the basic cell culture media to achieve a total copper concentration of at least 1 µg/L, or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 µg/l copper or more. According to certain embodiments and more detailed description below in the present invention, cultures to produce rA13 may contain approximately 2-4 μg/l copper, while cultures to produce rVWF may contain at least 2 μg/l copper.
Вышеуказанные концентрации представляют собой относительные концентрации чистой меди в форме двухвалентного иона меди (Cu2+). Если используется производное меди, например, гидратированная соль, или соединение, содержащее медь, например, хелатор меди, указанное количество производного или хелатора добавляют таким образом, что конечная концентрация меди попадает в указанные в настоящем изобретении диапазоны. Например, 2 мкг/л CuSO4-5H2O эквивалентны концентрации меди, составляющей приблизительно 0,51 мкг/л (без сульфата и 5Н2О).The above concentrations are relative concentrations of pure copper in the form of divalent copper ion (Cu 2+ ). If a copper derivative, such as a hydrated salt, or a copper-containing compound, such as a copper chelator, is used, the specified amount of derivative or chelator is added such that the final concentration of copper falls within the ranges specified in the present invention. For example, 2 µg/L CuSO4-5H2O is equivalent to a copper concentration of approximately 0.51 µg/L (without sulfate and 5H2O).
Удачным образом, было обнаружено, что применение в процессе культивирования клеток среды для клеточной культуры, обеспечивающей низкие концентрации (NH4+) в растворе культуры клеток (т.е. в культуральном супернатанте), приводит к экспрессии рекомбинантного VWF и/или rA13 с более высокой удельной активностью. Соответственно, согласно определенным вариантам реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 5 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 4 мМ. Согласно другим вариантам реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10 мМ, 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее.Advantageously, it has been found that the use of cell culture medium providing low concentrations of (NH4+) in the cell culture solution (i.e., culture supernatant) during cell culture results in the expression of recombinant VWF and/or rA13 with a higher specific activity. Accordingly, according to certain implementation options, the concentration of NH4+ in the specified supernatant is not more than 10 mm. In a preferred embodiment, the concentration of NH4+ in said supernatant is not more than 5 mM. In a preferred embodiment, the concentration of NH4+ in said supernatant is not more than 4 mM. In other embodiments, the concentration of NH4+ in said supernatant is not more than 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less.
Соответственно, согласно определенным вариантам реализации способы и композиции, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, основаны на применении основных сред для клеточных культур с добавлением меди (например, до конечной концентрации, составляющей меньшей мере 2 мкг/л) для применения в процессе, который приводит к концентрации NH4+ в супернатанте, составляющей не более 10 мМ. Согласно другим вариантам реализации основную среду для клеточной культуры дополняют для получения конечных концентраций меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1.Accordingly, in certain embodiments, the methods and compositions of the present invention rely on the use of basic cell culture media supplemented with copper (e.g., to a final concentration of at least 2 µg/L) for use in a process that results in to the concentration of NH4+ in the supernatant, which is not more than 10 mM. In other embodiments, the basic cell culture medium is supplemented to obtain final concentrations of copper and ammonium according to any of the options 1-440 shown in Table 1.
Таблица 1Table 1
Типовые варианты концентраций меди и аммония в культуральных средах и супернатанте, подходящих для экспрессии рекомбинантных белков согласно настоящему описаниюExemplary variants of copper and ammonium concentrations in culture media and supernatant suitable for the expression of recombinant proteins according to the present description
- 15 041947- 15 041947
*Н.О. = не определено *НБЧ= не более чем *ПММ = по меньшей мере*BUT. = not defined *NBN= not more than *MMP = at least
- 16 041947- 16 041947
Согласно некоторым вариантам реализации добавление в среды меди согласно настоящему изобретению производится путем дополнения основных сред, не содержащих животных белков и/или сред с заданным химическим составом. Способы получения не содержащих животных белков и культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217, и в опубликованных заявках на патент США №№2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Согласно одному из вариантов реализации основная культуральная среда, применяемая в способах, описанных в настоящем изобретении, представляет собой не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду. Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда может быть средой с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанные культуральные среды могут содержать по меньшей мере один полиамин в концентрации от приблизительно 0,5 мг/л до приблизительно 10 мг/л.In some embodiments, addition of copper to the media of the present invention is accomplished by supplementing basic media that do not contain animal proteins and/or media with a given chemical composition. Methods for preparing animal protein-free and chemically defined culture media are known in the art, for example, in US Pat. , the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety for any purpose. In one embodiment, the base culture medium used in the methods described herein is an animal protein-free or oligopeptide-free medium. In certain embodiments, said culture medium may be a chemically defined medium. In certain embodiments, said culture media may contain at least one polyamine at a concentration of from about 0.5 mg/L to about 10 mg/L.
Согласно дальнейшим вариантам реализации и в дополнение к любым описанным выше согласно настоящему изобретению предложены культуральные среды, для получения которых в основную среду добавляют медь и по меньшей мере что-либо одно из кальция, цинка и/или витамина В3. Согласно определенным вариантам реализации указанная среда может не содержать животных белков, не содержать олигопептидов или представлять собой среду с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанная не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду получают согласно описанию в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №№2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей; оба источника включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей; и добавлением дополнительной меди и необязательно одного или более из кальция, цинка и витамина В3. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда с заданным химическим составом может быть сходной со смесью (1:1) модифицированной по Дульбекко среды Игла и среды Хэма F12 (DMEM/Хэма F12), куда добавлена дополнительная медь и необязательно кальций, цинк и/или витамин В3 для увеличения удельной активности rVWF или rA13, экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной среде. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда не содержит животных компонентов. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит белок, например, животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. Согласно другому варианту реализации указанная культура содержит добавленные экзогенные рекомбинантные белки. Согласно другому варианту реализации указанные белки получены от сертифицированного свободного от патогенов животного.In further embodiments, and in addition to any described above, the present invention provides culture media for which copper and at least one of calcium, zinc, and/or vitamin B3 are added to the base medium. In certain embodiments, said medium may be free of animal proteins, free of oligopeptides, or be a chemically defined medium. In certain embodiments, said animal protein-free or oligopeptide-free medium is prepared as described in US Pat. to the present invention by reference in its entirety for any purpose; both sources are incorporated into the present invention by reference in their entirety for any purpose; and adding additional copper and optionally one or more of calcium, zinc and vitamin B3. In a specific embodiment, the chemically defined culture medium may be similar to a 1:1 mixture of Dulbecco's Modified Eagle's Medium and Ham F12 (DMEM/Ham F12) supplemented with additional copper and optionally calcium, zinc and/or vitamin B3 to increase the specific activity of rVWF or rA13 expressed in cells cultured in said medium. In other embodiments, said culture medium does not contain animal components. In another embodiment, said culture medium contains a protein, for example animal protein from serum, such as fetal calf serum. In another embodiment, said culture contains added exogenous recombinant proteins. In another embodiment, said proteins are obtained from a certified pathogen-free animal.
Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин принадлежит группе из орнитина, путресцина, спермина или спермидина или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина.In certain embodiments, said culture medium contains at least one polyamine at a concentration of exactly or about 0.5 to 30 mg/L. In another embodiment, said culture medium contains at least one polyamine at a concentration of exactly or about 0.5 to 10 mg/L. In one embodiment, said culture medium contains at least one polyamine at a concentration of exactly or about 2 to 8 mg/L. In certain embodiments, said polyamine belongs to the group of ornithine, putrescine, spermine or spermidine, or the like. In a preferred embodiment, the polyamine is putrescine. In a specific embodiment, said culture medium contains exactly or about 2 to 8 mg/l putrescine.
Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 мг/л до 10 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 мг/л до 8 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин входит в группу из орнитина, путресцина, спермина или спермидина, или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.In one embodiment, said culture medium contains at least one polyamine at a concentration of exactly or about 0.5 to 30 mg/l, and a combination of copper and ammonium according to any one of options 1-440 shown in Table 1. In another embodiment, said culture medium contains at least one polyamine at a concentration of exactly or about 0.5 mg/L to 10 mg/L, and a combination of copper and ammonium according to any one of options 1-440 shown in Table 1. 1. According to one embodiment, said culture medium contains at least one polyamine at a concentration of exactly or about 2 mg/L to 8 mg/L, and a combination of copper and ammonium according to any of the options 1-440 shown in Table . 1. In certain embodiments, said polyamine is in the group of ornithine, putrescine, spermine, or spermidine, or the like. In a preferred embodiment, said polyamine is putrescine. According to a specific implementation variant of the specified culture medium contains exactly or approximately from 2 to 8 mg/l putrescine and a combination of copper and ammonium according to any of the options 1-440 shown in table. 1.
Согласно дальнейшим аспектам помимо меди применяемые согласно настоящему изобретению среды для клеточных культур также могут содержат что-либо одно или более из: дополнительного кальция, цинка, одного или более витамина, и любых их комбинаций.In further aspects, in addition to copper, the cell culture media used in accordance with the present invention may also contain any one or more of additional calcium, zinc, one or more vitamins, and any combinations thereof.
Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль кальция; неограничивающие примеры приемлемых солей включают CaCl2, CaFPO32Н2О, CaI2,Generally, any calcium salt may be used to add to the media of the present invention; non-limiting examples of acceptable salts include CaCl 2 , CaFPO 3 2H 2 O, CaI 2 ,
- 17 041947- 17 041947
CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (С6Н5О7)2Са3-2Н2О и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль кальция.CaBr2, (C 2 H 3 O 2 ) 2 Ca, (CHO2) 2Ca, (C 6 H 7 O 6 ) 2 Ca, (C 6 H 5 O 7 ) 2 Ca3-2H2O, etc. In certain embodiments, a pharmaceutically acceptable calcium salt is used to add to the culture media of the present invention.
Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль цинка; неограничивающие примеры приемлемых солей включают ZnSO4-7H2O, ZnSO3-2H2O, (С6Н5О7^п3-2ЩО, ZnBr2, ZnBr2-2H2O, ZnCh, Zn ЩОз)2-6Н2О, ZnfHPO^W, (C^O^Zn^O и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль цинка. Согласно другим вариантам реализации цинк-содержащий пептидный или белковый препарат, например, инсулин, может применяться для добавления в описываемую в настоящем изобретении культуру.Generally, any zinc salt can be used to add to the media of the present invention; non-limiting examples of acceptable salts include ZnSO 4 -7H 2 O, ZnSO 3 -2H2O, (C6H 5 O7^n 3 -2NHO, ZnBr2, ZnBr 2 -2H 2 O, ZnCh, Zn SHO3) 2 -6H 2 O, ZnfHPO^W , (C^O^Zn^O, etc. In certain embodiments, a pharmaceutically acceptable zinc salt is used to add to the culture media of the present invention. In other embodiments, a zinc-containing peptide or protein preparation, such as insulin, may be used for addition to the culture described in the present invention.
Согласно дальнейшим аспектам основные клеточные среды с добавлением меди и одного или более из описанных выше дополнительных веществ можно также применять в культурах с низкими уровнями аммония в супернатанте. Согласно определенным вариантам реализации дополненные среды для клеточных культур для применения согласно настоящему изобретения дают уровни аммония в растворе культуры клеток менее 10 мМ. Согласно дальнейшим вариантам реализации дополненную среду для клеточных культур согласно настоящему изобретению применяют при уровнях аммония в культуре клеток, составляющих приблизительно 0,5-9,5; 1,0-9,0; 1,5-8,5; 2,0-8,0; 2,5-7,5; 3,0-7,0; 3,5-6,5; 4,0-6,0; 4,5-5,5 мМ.According to further aspects, basic cell media supplemented with copper and one or more of the additional substances described above can also be used in cultures with low levels of ammonium in the supernatant. In certain embodiments, the supplemented cell culture media for use in accordance with the present invention results in ammonium levels in the cell culture solution of less than 10 mM. In further embodiments, the supplemented cell culture medium of the present invention is used at cell culture ammonium levels of about 0.5-9.5; 1.0-9.0; 1.5-8.5; 2.0-8.0; 2.5-7.5; 3.0-7.0; 3.5-6.5; 4.0-6.0; 4.5-5.5 mM.
Согласно одному из вариантов реализации указанные концентрации меди и аммония в среде для клеточных культур и супернатанте культуры клеток поддерживают на протяжении длительного периода времени в течение процесса производства. Согласно конкретному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония в культуре клеток поддерживают на протяжении процесса производства, т.е. в течение времени, пока rVWF или rA13 экспрессируют и выделяют из крупномасштабной культуры клеток. Согласно определенным вариантам реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в культуральном растворе на уровне согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в течение всего периода такого производственного процесса.In one embodiment, the specified concentrations of copper and ammonium in the cell culture medium and cell culture supernatant are maintained for an extended period of time during the manufacturing process. In a specific embodiment, said concentrations of copper and ammonium in cell culture are maintained throughout the manufacturing process, i.e. during the time that rVWF or rA13 is expressed and isolated from large scale cell culture. According to certain implementation options, the indicated concentrations of copper and ammonium are maintained in the culture solution at a level according to any of the options 1-440 shown in Table 1. In a preferred embodiment, said concentrations of copper and ammonium are maintained throughout the duration of such a manufacturing process.
Согласно некоторым вариантам реализации культуральная среда, предложенная согласно настоящему изобретению, может быть представлена жидкой, сухой или порошковой формой. Указанная среда может быть предварительно разделена на аликвоты, содержащие количества, подходящие для однократного применения, либо большие количества, подходящие для более чем одной клеточной культуры. Как правило, среда согласно настоящему изобретению представлена в стерильном виде.In some embodiments, the culture medium of the present invention may be in liquid, dry, or powder form. Said medium may be pre-divided into aliquots containing amounts suitable for single use or larger amounts suitable for more than one cell culture. As a rule, the environment according to the present invention is presented in a sterile form.
Ниже обсуждаются характерные особенности сред для клеточных культур, подходящих для получения rVWF или rA13. Несмотря на то, что они описаны применительно либо к rVWF, либо к RA13, необходимо понимать, что любые приведенные ниже описания, относящиеся к rVWF, подходят и для RA13, и наоборот.The characteristics of cell culture media suitable for the production of rVWF or rA13 are discussed below. While they are described in relation to either rVWF or RA13, it should be understood that any descriptions below that refer to rVWF apply to RA13 and vice versa.
А. Среды для клеточных культур для получения рекомбинантного VWF.A. Cell culture media for obtaining recombinant VWF.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к раствору культуры клеток для получения рекомбинантных vWF, более конкретно - высокомолекулярных vWF, обладающих высокой удельной активностью, которые описаны ниже в настоящем изобретении. Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение предлагает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, содержащий среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные vWF, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающие удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.According to one aspect, the present invention relates to a cell culture solution for producing recombinant vWFs, more specifically high specific activity high molecular weight vWFs, as described hereinafter. In one embodiment, the present invention provides a cell culture solution for producing high molecular weight recombinant vWF comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 µg/L and a plurality of cells expressing high multimeric vWF containing from about 14 up to about 22 dimers and having a specific ristocetin cofactor activity of at least about 30 IU/µg.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно описанию выше. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мереIn one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In a preferred embodiment, said cell culture contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In other embodiments, said cell culture contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. In other embodiments, said cell culture contains a concentration of copper and ammonium according to any of the options 1-440 shown in Table 1. In certain embodiments, the ammonium concentration in the cell culture is maintained for an extended period at a concentration level as described above. For example, in one embodiment, the ammonium concentration is kept low for at least 3 days, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In a specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 5 mM for at least 14 days. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least
- 18 041947 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF).- 18 041947 days. According to another embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time that the specified culture is used to produce rVWF).
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения среды для клеточных культур могут содержать медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, согласно другому варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 3 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 15 мкг/л, и согласно дальнейшему варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 20 мкг/л.In one embodiment, the cell culture media may contain copper at a concentration of at least about 2.4 µg/L, in another embodiment, at least about 3 µg/L, in another embodiment, at least about 4 µg/L, in another embodiment at least about 8 µg/L, in another embodiment at least about 10 µg/L, in another embodiment at least about 15 µg/L , and in a further embodiment, at least about 20 µg/l.
Согласно другим вариантам реализации концентрация меди в среде для клеточных культур согласно настоящему изобретению может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг г/л, согласно другому варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг г/л до приблизительно 15 мкг г/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг г/л до приблизительно 10 мкг г/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг г/л до приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 6 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 15 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 8 мкг/л, и согласно дальнейшему варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 6 мкг г/л.In other embodiments, the concentration of copper in the cell culture medium of the present invention may range from about 2.4 µg/L to about 20 µg g/L, in another embodiment, from about 2.4 µg g/L to about 15 µg g/l, according to another embodiment, from about 2.4 µg g/l to about 10 µg g/l, according to another implementation variant, from about 2.4 µg g/l to about 8 µg/l, according to in another embodiment, from about 2.4 µg/L to about 6 µg/L, in another embodiment, from about 2.4 µg/L to about 4 µg/L, in another embodiment, from about 4 µg/L to about 20 µg/L, in another embodiment, from about 4 µg/L to about 15 µg/L, in another embodiment, from about 4 µg/L to about 10 µg/L, according to still one varia ntu implementation - from about 4 µg/l to about 8 µg/l, and according to a further implementation variant - from about 4 µg/l to about 6 µg g/l.
Согласно настоящему изобретению также предложены наборы для экспрессии или получения rVWF; указанные наборы содержат культуральную среду, подходящую для экспрессии rVWF, обладающего высокой удельной активностью.The present invention also provides kits for expression or production of rVWF; these kits contain a culture medium suitable for the expression of rVWF, which has a high specific activity.
В. Среды для клеточных культур для получения ADAMTS13 (А13).B. Cell culture media for the production of ADAMTS13 (A13).
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает культуральные среды, подходящие для экспрессии белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью. Удачным образом, было обнаружено, что добавление в культуральную среду меди значительно повышает активность рекомбинантных ферментов ADAMTS (например, rADAMTS13), экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной дополненной среде, в то время как указанные ферменты экспрессируются на уровнях, равных или превышающих таковые для клеток, культивируемых в среде без добавок.According to one aspect, the present invention provides culture media suitable for the expression of high specific activity ADAMTS proteins. Successfully, it was found that the addition of copper to the culture medium significantly increases the activity of recombinant ADAMTS enzymes (for example, rADAMTS13) expressed in cells cultured in this supplemented medium, while these enzymes are expressed at levels equal to or greater than those for cells cultivated in a medium without additives.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает среды для клеточных культур с добавлением меди для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS 13 с высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди, составляющей от приблизительно 2 до приблизительно 4 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди приблизительно 1-3, 2-3, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды содержат медь в концентрации по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит от 2 мкг/л до 20 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 1 мкг/л до 6 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 2 мкг/л до 5 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 3 мкг/л до 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди, или по меньшей мере 2 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 11 мкг/л, 12 мкг/л, 13 мкг/л, 14 мкг/л, 15 мкг/л, 16 мкг/л, 17 мкг/л, 18 мкг/л, 19 мкг/л, 20 мкг/л, либо более высокие концентрации меди.In one aspect, the present invention provides copper-supplemented cell culture media for the expression of recombinant ADAMTS 13 protein with high specific activity. In one embodiment, these media are supplemented to obtain a total copper concentration of about 2 to about 4 µg/L. In further embodiments, these media are supplemented to obtain a total copper concentration of approximately 1-3, 2-3, 3-4 µg/l. In one embodiment, these media contain copper at a concentration of at least 1 µg/l. According to another implementation variant of the specified environment contains at least 2 μg/l of copper. According to another implementation variant of the specified environment contains at least 4 μg/l of copper. According to other variants of implementation of the specified environment contains from 2 μg/l to 20 μg/l of copper. According to another implementation variant of the specified environment contains from 1 μg/l to 6 μg/l of copper. According to another implementation variant of the specified environment contains from 2 μg/l to 5 μg/l of copper. According to another implementation variant of the specified environment contains from 3 μg/l to 4 μg/l of copper. In other embodiments, said medium contains at least 1 µg/l copper, or at least 2 µg/l, 3 µg/l, 4 µg/l, 5 µg/l, 6 µg/l, 7 µg/l, 8 mcg/l, 9 mcg/l, 10 mcg/l, 11 mcg/l, 12 mcg/l, 13 mcg/l, 14 mcg/l, 15 mcg/l, 16 mcg/l, 17 mcg/l, 18 µg/l, 19 µg/l, 20 µg/l, or higher concentrations of copper.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно приведенному выше описанию. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. СогласноIn one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. In other embodiments, the cell culture solution contains a concentration of copper and ammonium according to any of the options 1-440 shown in Table. 1. In certain embodiments, the ammonium concentration in the cell culture is maintained for an extended period at a concentration level as described above. For example, in one embodiment, the ammonium concentration is kept low for at least 3 days, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. According to
- 19 041947 конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).- 19 041947 specific embodiment, the concentration of ammonium in cell culture is maintained at a level not exceeding 5 mm for at least 14 days. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 14 days. According to another embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time that the specified culture is used to produce rA13).
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или более цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2.In one embodiment, a culture medium is prepared to express a recombinant ADAMTS protein (eg, rADAMTS13) containing at least 1 μg/L copper and at least 2 μM zinc. In other embodiments, said medium contains at least 2 µg/l copper or at least 4 µg/l copper. In another embodiment, when copper is added to the media, said culture media also contains at least exactly or about 5 μM zinc. In one embodiment, said culture medium also contains exactly or about 2 μM to 12 μM zinc. In another embodiment, said culture medium also contains exactly or about 5 μM to 12 μM zinc. In other embodiments, said culture medium may also contain at least exactly or about 2 µM, or at least exactly or about 3 µM, 4 µM, 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM, 9 µM, 10 µM, 11 µM, 12 µM, 13 µM, 14 µM, 15 µM, 20 µM, 25 µM, 30 µM or more zinc. In one embodiment, said culture medium contains copper and zinc at concentrations according to any one of the options 441-880 shown in Table 2.
Таблица 2table 2
Типовые варианты реализации концентраций меди и цинка в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13Exemplary embodiments of copper and zinc concentrations in culture media suitable for expression of recombinant ADAMTS13 protein
- 20 041947- 20 041947
*ПММ = по меньшей мере*PMM = at least
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализацииIn one embodiment, the cell culture solution also contains a low concentration of ammonium. In one embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of less than 10 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 6 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 6 mM for at least 7 days. In another preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. According to specific implementation
- 21 041947 концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).- 21 041947 the ammonium concentration is maintained at a level not exceeding 5 mm for at least 7 days. In another preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less, and copper and zinc in concentrations according to any of the options 441-880 given in table.2. According to another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time that the specified culture is used to produce rA13).
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ, или более, кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3.In one embodiment, a recombinant ADAMTS protein (eg, rADAMTS13) expression culture medium is prepared containing at least 1 μg/L copper and at least exactly or about 0.5 mM calcium. In other embodiments, said medium contains at least 2 µg/l copper or at least 4 µg/l copper. In another embodiment, when copper is added to the media, said culture medium also contains at least 1.5 mM calcium. In one embodiment, said culture medium contains exactly or about 0.5 mM to 1.5 mM calcium. In other embodiments, said culture medium may contain at least exactly or about 0.5 mM, or at least exactly or about 0.6 mM; 0.7 mM; 0.8 mM; 0.9 mM; 1.0 mM; 1.1 mm; 1.2 mm; 1.3 mm; 1.4 mm; 1.5 mm; 1.6 mM; 1.7 mM; 1.8 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.25 mM; 2.5 mm; 2.75 mM; 3.0 mM; 3.5 mm; 4.0 mM; 4.5 mm; 5.0 mM or more calcium. In one embodiment, said culture medium contains copper and calcium at a concentration according to any one of the options 881-1320 shown in Table 3.
Таблица 3Table 3
Типовые варианты реализации концентраций меди и кальция в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13Exemplary embodiments of copper and calcium concentrations in culture media suitable for expression of recombinant ADAMTS13 protein
- 22 041947- 22 041947
*ПММ = по меньшей мере*PMM = at least
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне, не превышающем 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 8811320, приведенных в табл.3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианIn one embodiment, the cell culture solution also contains a low concentration of ammonium. In one embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of less than 10 mM, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 1. 3. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at a level not exceeding 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, said cell culture medium contains ammonium at a concentration not exceeding 6 mM, and copper and calcium at concentrations according to any of the 8811320 options shown in Table 3. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 6 mM for at least 7 days. In another preferred embodiment, said cell culture medium contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 1. 3. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. According to another preferred embodiment
- 23 041947 ту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).- 23 041947 In this embodiment, said cell culture medium contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 3. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, said cell culture medium contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less, and copper and calcium in concentrations according to any of the options 881-1320 shown in table. 3. According to another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time during which the specified culture is used to obtain rA13).
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и кальций. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 мМ и 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.In one embodiment, copper, zinc, and calcium are added to the cell culture medium. In a specific embodiment, the culture medium contains calcium at a concentration of at least 0.5 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. According to another specific implementation variant of the culture medium contains calcium at a concentration of at least 1.5 mm, and copper and zinc in concentrations according to any of the options 441-880, are given in table. 2. In another specific embodiment, said culture medium contains calcium at a concentration between 0.5 mM and 1.5 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In other embodiments, the culture medium contains calcium at a concentration of at least 0.6 mM; 0.7 mM; 0.8 mM; 0.9 mM; 1.0 mM; 1.1 mm; 1.2 mm; 1.3 mm; 1.4 mm; 1.5 mm; 1.6 mM; 1.7 mM; 1.8 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.25 mM; 2.5 mm; 2.75 mM; 3.0 mM; 3.5 mm; 4.0 mM; 4.5 mm; 5.0 mm or more, and copper and zinc in concentrations according to any of the options 441-880, are given in table. 2.
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамин В3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 мг/л до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мг/л, 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4.In one embodiment, a culture medium is prepared for expression of a recombinant ADAMTS protein (eg, rADAMTS13) containing at least 1 μg/l copper and at least 2 mg/l nicotinamide (vitamin B3). In other embodiments, said medium contains at least 2 µg/l copper or at least 4 µg/l copper. In another embodiment, when copper is added to the media, said culture medium also contains at least 7 mg/L nicotinamide (vitamin B3). In one embodiment, said culture medium contains exactly or about 2 mg/l to 10 mg/l nicotinamide (vitamin B3). In other embodiments, said culture medium may contain at least exactly or about 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, or higher concentrations of nicotinamide (vitamin B3). According to one of the options for implementing the specified culture medium contains copper and nicotinamide in concentrations according to any of the options 1321-1760 shown in table. 4.
- 24 041947- 24 041947
Таблица 4Table 4
Типовые варианты реализации концентраций меди и никотинамида в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13Exemplary embodiments of copper and nicotinamide concentrations in culture media suitable for expression of recombinant ADAMTS13 protein
- 25 041947- 25 041947
*ПММ = по меньшей мере*PMM = at least
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).In one embodiment, the cell culture solution also contains a low concentration of ammonium. In one embodiment, said culture medium contains ammonium at a concentration of less than 10 mM, and copper and nicotinamide at concentrations according to any of the options 1321-1760 shown in Table 4. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 6 mM, and copper and nicotinamide at concentrations according to any of the options 1321-1760 shown in Table 4. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 6 mM for at least 7 days. In another preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM, and copper and nicotinamide at concentrations according to any of the options 1321-1760 shown in Table 4. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. In another preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM, and copper and nicotinamide at concentrations according to any of the options 1321-1760 shown in Table 4. In a specific embodiment, the ammonium concentration is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less, and copper and nicotinamide in concentrations according to any of the options 1321-1760 shown in table.4. According to another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time that the specified culture is used to produce rA13).
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441- 880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2.In one embodiment, copper, zinc, and nicotinamide are added to the cell culture medium. In a specific embodiment, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/mL, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In another specific embodiment, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 7 mg/ml mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. According to another specific embodiment, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of 2 mg/ml and 10 mg/ml, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In other embodiments, the culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg /ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml or more, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 given in table 2.
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, кальций и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотиIn one embodiment, copper, calcium, and nicotinamide are added to the cell culture medium. In a specific embodiment, the culture medium contains nicotine
- 26 041947 намид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл до 10 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3.- 26 041947 namid at a concentration of at least 2 mg/ml, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in table. 3. According to another specific embodiment, the culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 7 mg/ml mM, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 3. In another specific embodiment, the culture medium contains nicotinamide at a concentration of 2 mg/ml to 10 mg/ml, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 3. In other embodiments, the culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg /ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml or more, and copper and calcium in concentrations according to any of the options 881-1320 given in table 3.
III. Способы получения факторов крови с высокой удельной активностью А. Способы культивирования клеток.III. Methods for obtaining blood factors with high specific activity A. Methods for cell cultivation.
Настоящее изобретение обеспечивает способы крупномасштабного производства рекомбинантных белков (таких как rVWF и rA13). Согласно определенным вариантам реализации в таких способах крупномасштабного производства применяют реакторы с мешалкой/перемешиванием для получения указанных терапевтических рекомбинантных белков.The present invention provides methods for the large scale production of recombinant proteins (such as rVWF and rA13). In certain embodiments, such large-scale production methods use agitated/stirred reactors to produce said therapeutic recombinant proteins.
Согласно определенным вариантам реализации способы согласно настоящему изобретению могут включать применение систем культивирования клеток в периодическом или непрерывном режиме. Например, в случае использования периодических культур клеток к ним может применяться режим однократного периодического культивирования, подпитываемого культивирования или повторного периодического культивирования. Сходным образом, к непрерывным культурам клеток может применяться, например, перфузионный, турбидостатический или хемостатический режим. Периодическое и непрерывное культивирование клеток может проводиться в условиях суспензионной или адгезионной культуры. В условиях суспензионного культивирования клетки свободно суспендированы и распределены в культуральной среде. Альтернативно, в условиях адгезионного культивирования, клетки связаны с твердой фазой, например, микроносителем, пористым микроносителем, дисковым носителем, керамическим картриджем, полым волокном, плоской пластиной, гель-матрицей и т.п.In certain embodiments, the methods of the present invention may include the use of cell culture systems in a batch or continuous mode. For example, if batch cell cultures are used, they may be subjected to a single batch, fed-batch, or repeated batch mode. Similarly, for continuous cell cultures, for example, a perfusion, turbidostatic, or chemostatic regimen may be applied. Batch and continuous cell culture can be carried out under suspension or adhesive culture conditions. Under suspension culture conditions, the cells are freely suspended and distributed in the culture medium. Alternatively, under adherent culture conditions, the cells are bound to a solid phase such as a microcarrier, a porous microcarrier, a disk carrier, a ceramic cartridge, a hollow fiber, a flat plate, a gel matrix, and the like.
Периодическая культура представляет собой, как правило, крупномасштабную культуру клеток, в которой клеточный инокулят культивируют до максимальной плотности в реакторе или ферментере, и собирают и обрабатывают, как при однократном периодическом культивировании. Подпитываемая культура представляет собой, как правило, периодическую культуру, получающую либо свежие питательные вещества (например, ограничивающие рост субстраты), либо добавки (например, предшественники продуктов). Питательный раствор, как правило, является высококонцентрированным, чтобы избежать разбавления в биореакторе. В повторно-периодической культуре клетки помещают в культуральную среду и выращивают до требуемой плотности клеток. Затем, чтобы избежать наступления фазы спада и гибели клеток, культуру разбавляют полной ростовой средой до того, как клетки достигают максимальной концентрации. Количество и частота разведений широко варьирует и зависит от характеристик роста клеточной линии и удобства процесса культивирования. Указанный процесс может повторяться столько раз, сколько потребуется и, если клетки и среда не отбрасываются при пересеве, объем культуры будет увеличиваться ступенчато, по мере каждого следующего разведения. Вопрос увеличивающегося объема может быть решен использованием реактора, имеющего достаточный размер для разбавлений внутри указанного сосуда, либо распределением разбавленной культуры по нескольким сосудам. Принцип указанного типа культивирования состоит в поддержании клеток в экспоненциальной фазе роста. Серийно пересеваемая культура характеризуется тем, что объем указанной культуры всегда постепенно возрастает, может быть несколько сборов, клетки продолжают расти и указанный процесс может продолжаться так долго, как это необходимо. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный белок ADAMTS (например, rADAMTS13) может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный VWF может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры.Batch culture is generally a large scale cell culture in which the cell inoculum is cultured to maximum density in a reactor or fermenter and harvested and processed as in single batch culture. The fed culture is typically a batch culture receiving either fresh nutrients (eg, growth-limiting substrates) or supplements (eg, product precursors). The nutrient solution is usually highly concentrated to avoid dilution in the bioreactor. In repeated batch culture, cells are placed in culture medium and grown to the desired cell density. The culture is then diluted with complete growth medium before the cells reach maximum concentration to avoid the onset of a decay phase and cell death. The number and frequency of dilutions varies widely and depends on the growth characteristics of the cell line and the convenience of the culture process. This process can be repeated as many times as needed and, if the cells and medium are not discarded at subculture, the culture volume will be increased stepwise with each successive dilution. The issue of increasing volume can be resolved by using a reactor having sufficient size for dilutions within said vessel, or by spreading the diluted culture over several vessels. The principle of this type of cultivation is to maintain cells in an exponential growth phase. Serially subcultured culture is characterized by the fact that the volume of said culture always increases gradually, there may be several fees, the cells continue to grow and this process can continue for as long as necessary. In certain embodiments, the recombinant ADAMTS protein (eg, rADAMTS13) can be isolated after collection of the batch culture supernatant. In other embodiments, the recombinant VWF may be isolated after collection of the batch culture supernatant.
Непрерывная культура может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, где, как правило, поддерживается постоянный объем культуры за счет сопутствующего удаления отработанной среды. Согласно хемостатическому и турбидостатическому методам извлеченная среда содержит клетки. Таким образом, клетки, остающиеся в сосуде для культивирования клеток, должны расти для поддержания стационарного состояния. Согласно хемостатическому способу скоростью роста, как правило, управляют посредством контроля степени разбавления, т.е. скорости добавления свежей среды. Скорость роста клеток в культуре может поддерживаться, например, на субмаксимальном уровне, изменением степени разбавления. Напротив, при турбидостатическом способе степень разбавления устанавливают таким образом, чтобы обеспечить максимальную скорость роста, которой могут достигнуть клетки при заданных технологических условиях, таких как рН и температура. Согласно определенным вариантам реализации rVWF или rA13 выделяют после сбора супернатанта непрерывной культуры. Типовой способ непрерывного культивирования клеток описан в WO/2011/012725 (Grillberger et al.), содержание которой включено в настоящее изобретениеA continuous culture may be a suspension culture continuously fed with fresh media, where the culture volume is generally maintained at a constant volume by concomitant removal of spent media. According to chemostatic and turbidostatic methods, the extracted medium contains cells. Thus, the cells remaining in the cell culture vessel must grow to maintain a steady state. According to the chemostatic method, the growth rate is generally controlled by controlling the degree of dilution, i.e. rate of addition of fresh medium. The growth rate of cells in culture can be maintained, for example, at a submaximal level, by changing the degree of dilution. In contrast, in the turbidostatic method, the dilution rate is set to provide the maximum growth rate that cells can achieve under given process conditions such as pH and temperature. In certain embodiments, rVWF or rA13 is isolated after collection of the continuous culture supernatant. An exemplary continuous cell culture method is described in WO/2011/012725 (Grillberger et al.), the content of which is incorporated into the present invention.
- 27 041947 посредством ссылки во всей полноте для любых целей.- 27 041947 by reference in its entirety for any purpose.
При перфузионном культивировании извлеченная среда бедна клетками, которые остаются в культуральном сосуде, например, за счет применения способов фильтрации или центрифугирования, приводящих к повторному внесению клеток в культуру. Однако, как правило, используемые для фильтрации задерживают не 100% клеток, и таким образом часть их удаляется при извлечении среды. Очень высокие скорости роста для культивирования в режиме перфузии не критичны, так как большая часть клеток остается в культуральном сосуде. Согласно определенным вариантам реализации rVWF или rA13 выделяют после сбора супернатанта перфузионной культуры.In perfusion culture, the extracted medium is poor in cells, which remain in the culture vessel, for example, due to the use of filtration or centrifugation methods, resulting in the re-introduction of cells into culture. However, as a rule, those used for filtration do not retain 100% of the cells, and thus some of them are removed when the medium is removed. Very high growth rates for cultivation in perfusion mode are not critical, since most of the cells remain in the culture vessel. In certain embodiments, rVWF or rA13 is isolated after collection of the perfusion culture supernatant.
Реакционная система с баком-мешалкой может применяться для периодического и непрерывного культивирования клеток в суспензионном или адгезионном режимах. Как правило, указанная реакционная система с баком-мешалкой может эксплуатироваться так, как любой стандартный реактор с мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например, Rushton, гидравлический, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.The stirred tank reaction system can be used for batch and continuous cell culture in suspension or adhesive modes. In general, said stirred tank reaction system can be operated as any standard stirred tank reactor with any type of agitation, such as Rushton, hydraulic, pitched blade, or propeller type.
Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высоких удельных значений площадей поверхности относительно объема культуры для достижения высоких плотностей клеток и экспрессии белка. Один из способов обеспечения таких условий роста заключается в применении микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Принцип роста клеток на микроносителях впервые был описан у van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)); он обеспечивает прикрепление клеток к поверхности небольших твердых частиц, взвешенных в ростовой среде. Указанные способы обеспечивают высокое соотношение поверхность-объем и таким образом обеспечивают эффективную утилизацию питательных веществ. Кроме того, при экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях повышение соотношения поверхность-объем обеспечивает более высокие уровни секреции и таким образом более высокий выход белка в супернатанте культуры. Наконец, указанные способы позволяют легко увеличивать масштаб эукариотических экспрессионных культур.In certain embodiments, cell culture methods of the present invention may include the use of a microcarrier. In some embodiments, cell culture according to embodiments of the invention may be carried out in large bioreactors under conditions suitable for obtaining high specific surface areas relative to culture volume to achieve high cell densities and protein expression. One way to achieve such growth conditions is to use cell culture microcarriers in agitated bioreactors. The principle of growing cells on microcarriers was first described by van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)); it provides attachment of cells to the surface of small solid particles suspended in the growth medium. These methods provide a high surface-to-volume ratio and thus ensure efficient utilization of nutrients. In addition, when secreted proteins are expressed in eukaryotic cell lines, increasing the surface-volume ratio results in higher levels of secretion and thus higher protein yield in the culture supernatant. Finally, these methods make it easy to scale up eukaryotic expression cultures.
Клетки, экспрессирующие vWF и/или rA13, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Указанный микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранный из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина, целлюлозы и других, согласно описанию у Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно доращивать клетки до некоторой биомассы на сферических микроносителях, и пересевать указанные клетки при достижении ими конечной для ферментера биомассы, перед получением экспрессированного белка, на пористый микроноситель, или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, и Cytodex™ 3 (GE Healthcare) и крупнопористые микроносители такие как Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).Cells expressing vWF and/or rA13 can be associated with the spherical or porous microcarrier during cell culture growth. Said microcarrier may be a microcarrier selected from the group of microcarriers based on dextran, collagen, plastic, gelatin, cellulose and others as described by Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). It is also possible to grow cells to a certain biomass on spherical microcarriers, and subculture these cells, when they reach the final biomass for the fermenter, before obtaining the expressed protein, onto a porous microcarrier, or vice versa. Suitable spherical microcarriers may include smooth surface microcarriers such as Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, and Cytodex™ 3 (GE Healthcare) and large pore microcarriers such as Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 and Cytoline™ 2 (GE healthcare).
Согласно приведенному выше описанию настоящее изобретение включает среды для клеточных культур, содержащие повышенную концентрацию меди. Понятно, что все варианты реализации изобретения и концентрации, описанные выше в разделе Среды для клеточных культур, применимы к способам согласно настоящему изобретению, описываемых в настоящем изобретении.As described above, the present invention includes cell culture media containing an elevated concentration of copper. It is understood that all embodiments of the invention and the concentrations described above in the section Media for cell cultures, applicable to the methods according to the present invention described in the present invention.
Согласно определенным вариантам реализации указанная культура может поддерживаться в течение по меньшей мере приблизительно 7 дней, или по меньшей мере приблизительно 14 дней, 21 дня, 28 дней, или по меньшей мере приблизительно 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, или по меньшей мере приблизительно 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев, или дольше. Плотность клеток, которая поддерживается в культуре клеток для получения рекомбинантного белка vWF или рекомбинантного белка rA13, зависит от условий культивирования и среды, применяемых для экспрессии белка. Специалист в данной области техники легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культивирования клеток с получением rVWF или rA13. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток в указанной культуре поддерживают на уровне от приблизительно 0,5x106 до 4х107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 1,0x107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 4,0x106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 4,0x106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток может поддерживаться на уровне концентрации от приблизительно 2,0x106 до приблизительно 4,0x106 клеток/мл, или от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 2,5x106 клеток/мл, или от приблизительно 1,5x106 до приблизительно 3,5x106 клеток/мл, или в любом сходном диапазоне, в течение длительного периода времени.In certain embodiments, said culture may be maintained for at least about 7 days, or at least about 14 days, 21 days, 28 days, or at least about 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks. , or at least about 2 months, or 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 months, or longer. The cell density that is maintained in a cell culture to produce a recombinant vWF protein or a recombinant rA13 protein depends on the culture conditions and the medium used to express the protein. One skilled in the art will readily be able to determine the optimal cell density for cell culture to produce rVWF or rA13. In one embodiment, the cell density in said culture is maintained at about 0.5x106 to 4x10 7 cells/mL for an extended period of time. In other embodiments, the cell density is maintained at a concentration of about 1.0x106 to about 1.0x107 cells/mL for an extended period of time. In other embodiments, the cell density is maintained at a concentration of about 1.0x106 to about 4.0x106 cells/mL for an extended period of time. In other embodiments, the cell density is maintained at a concentration of about 1.0x106 to about 4.0x106 cells/mL for an extended period of time. In other embodiments, the cell density may be maintained at a concentration of about 2.0x106 to about 4.0x106 cells/ml, or about 1.0x106 to about 2.5x106 cells/ml, or about 1.5x106 to about 3. 5x106 cells/ml, or in any similar range, for an extended period of time.
- 28 041947- 28 041947
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящем изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной согласно настоящему изобретению, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.In one embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 7 days. In a specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 14 days. In a more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 21 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 28 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 5 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 6 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 7 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 8 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 10 6 cells/mL for at least 9 weeks.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.In one embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 7 days. In a specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 14 days. In a more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/ml for at least 21 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 28 days. In another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 5 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 6 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 7 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 8 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.5 x 10 6 cells/mL for at least 9 weeks.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне конценIn one embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 7 days. In a specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 14 days. In a more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 21 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration level.
- 29 041947 трации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.- 29 041947 tration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/ml for at least 28 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 5 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 6 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 7 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 8 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 3.0 x 10 6 cells/mL for at least 9 weeks.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.In one embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 7 days. In a specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 14 days. In a more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/ml for at least 21 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 28 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 5 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 6 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 7 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 8 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for at least 9 weeks.
Согласно другому варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клетокIn another embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 7 days. In a specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 14 days. In a more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 21 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 28 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 5 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 6 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 7 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density
- 30 041947 непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель.- 30 041947 continuous cell culture proposed in accordance with the present invention is maintained at a concentration level not exceeding 2.0x10 6 cells/ml for at least 8 weeks.
Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 2.0 x 10 6 cells/mL for at least 9 weeks.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.In one embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 7 days. In a specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 14 days. In a more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/ml for at least 21 days. In another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 28 days. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 5 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 6 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 7 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 8 weeks. In yet another more specific embodiment, the cell density of the continuous cell culture of the present invention is maintained at a concentration not exceeding 1.5 x 10 6 cells/mL for at least 9 weeks.
Ниже приведены характерные детали способов получения rVWF и rA13. Следует понимать, что, хотя условия представлены конкретно для rVWF или rA13, указанные условия для rVWF могут применяться для получения rA13 и наоборот.Below are the specific details of the methods for obtaining rVWF and rA13. It should be understood that although the conditions are presented specifically for rVWF or rA13, the specified conditions for rVWF can be used to obtain rA13 and vice versa.
В. Способы получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF.B. Methods for producing high molecular weight recombinant vWF.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения vWF в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония. Используемый в настоящем изобретении термины культура клеток (клеточная культура) и раствор культуры клеток применяют взаимозаменяемо.According to another aspect, the present invention also relates to methods for producing vWF under cell culture conditions, including a cell culture medium containing an increased concentration of copper. In certain embodiments, said culture also contains a low concentration of ammonium. Used in the present invention, the terms cell culture (cell culture) and cell culture solution are used interchangeably.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, включающий: а) обеспечение культуры клеток; b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительною мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно дальнейшим вариантам реализации мультимерные rVWF, получаемый с применением способов согласно настоящему изобретению, содержат приблизительно 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 димеров. Согласно дальнейшим вариантам реализации rVWF, получаемый согласно настоящему изобретению, обладает удельной активностью по меньшей мере приблизительно 20; 22,5; 25; 27,5; 30; 32,5; 35; 37,5; 40; 42,5; 45; 47,5; 50; 52,5; 55; 57,5; 60; 62,5; 65; 67,5; 70; 72,5; 75; 77,5; 80 или более мЕ/мкг. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для получения rVWF поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 2,0х106 клеток/мл, 1,5х106 клеток/мл, 1,0х106 клеток/мл, 0,5х106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают в диапазоне от 1,5х106 клеток/мл иIn one embodiment, the present invention provides a method for producing high molecular weight recombinant vWF, comprising: a) providing a cell culture; b) introducing a nucleic acid sequence encoding vWF; c) selecting cells carrying said nucleic acid sequence; and d) effecting vWF expression in said cells under cell culture conditions comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 μg/L and a cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than about 1 mM, wherein said vWF is a high multimeric vWF containing from about 14 to about 22 dimers and having a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/µg. In further embodiments, the multimeric rVWF produced using the methods of the present invention contains approximately 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 dimers. According to further implementation options rVWF obtained according to the present invention has a specific activity of at least about 20; 22.5; 25; 27.5; thirty; 32.5; 35; 37.5; 40; 42.5; 45; 47.5; 50; 52.5; 55; 57.5; 60; 62.5; 65; 67.5; 70; 72.5; 75; 77.5; 80 or more IU / mcg. In a specific embodiment, the cell density in the continuous cell culture to produce rVWF is maintained at a concentration not exceeding 2.5 x 10 6 cells/mL for an extended period. In other specific embodiments, cell density is maintained at or below 2.0 x 10 6 cells/ml, 1.5 x 10 6 cells/ml, 1.0 x 10 6 cells/ml, 0.5 x 10 6 cells/ml, or less. According to one embodiment, the cell density is maintained in the range of 1.5x10 6 cells/ml and
2,5х106 клеток/мл.2.5x10 6 cells/ml.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ полученияIn one embodiment, the present invention provides a method for making
- 31 041947 композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF ; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрация аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 5 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 4 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.- 31 041947 compositions of recombinant von Willebrand factor (rVWF); said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 2.0 µg/L; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rVWF protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rVWF is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein said separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 30 IU/µg rVWF. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration not exceeding 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration not exceeding 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at an ammonium concentration not exceeding 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time that the specified culture is used to produce rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 2.4 µg/L. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the concentration of ammonium in the cell culture solution is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time during which the specified culture is used to obtain rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реалиAccording to one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 3 µg/L. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another version of reality
- 32 041947 зации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.- 32 041947 the concentration of ammonium in the cell culture solution is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time during which the specified culture is used to obtain rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации среды для клеточных культур содержат аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 4 µg/l. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture media contain ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the concentration of ammonium in the cell culture solution is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time during which the specified culture is used to obtain rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей приблизительно 4,3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.In one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of approximately 4.3 µg/L. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the concentration of ammonium in the cell culture solution is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time during which the specified culture is used to obtain rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 2 мкг/л до 20 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно ещеAccording to one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of 2 µg/L to 20 µg/L. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to more
- 33 041947 одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.- 33 041947 one embodiment, the concentration of ammonium in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie during the entire time during which the specified culture is used to obtain rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 3 мкг/л до 10 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of 3 µg/L to 10 µg/L. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture solution is maintained at an ammonium concentration of no more than 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the concentration of ammonium in the cell culture solution is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time during which the specified culture is used to obtain rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 4 мкг/л до 7,5 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, copper is added to the basic cell culture media to a final copper concentration of 4 µg/L to 7.5 µg/L. In one embodiment, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 10 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (ie, during the entire time that the specified culture is used to produce rVWF). In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем концентрацию NH4 + в указанном супернатанте поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 7 дней, и при этом указанный отделенный супернатант также обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию меди и концентрацию NH4 + в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.In one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant von Willebrand factor (rVWF) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper to the basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rVWF protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rVWF is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein the NH 4 + concentration in said supernatant is maintained at a low level for at least 7 days, wherein said separated supernatant also has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 30 IU/µg rVWF. According to a specific embodiment, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in the cell culture solution is maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in table.1. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a specific rVWF ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a specific rVWF ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
- 34 041947- 34 041947
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the copper concentration and the NH 4 + concentration in the cell culture are maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 14 days. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in cell culture is maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 21 days. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in cell culture is maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in table 1 for at least 28 days. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in the cell culture is maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 5 weeks. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in the cell culture is maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 6 weeks. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the copper concentration and the NH 4 + concentration in the cell culture are maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 7 weeks. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in cell culture are maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 8 weeks. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 9 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the concentration of copper and the concentration of NH 4 + in the cell culture is maintained at the concentration level according to any of the options 1-440 shown in Table 1 for at least 9 weeks. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF ; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким обраIn one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant von Willebrand factor (rVWF) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 2.0 µg/l; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rVWF protein; (d) culturing said one or more cells in copper-supplemented cell culture medium such that
- 35 041947 зом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; (е) мониторинга концентрации аммония в указанном культуральном супернатанте; и (f) отделения по меньшей мере части культурального супернатанта, причем указанный культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 10 мМ, не используют для получения композиции rVWF, и при этом указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 3-8 мкг/л или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.- 35 041947 Zom, which is the expression and excretion of rVWF from cells into the culture supernatant; (e) monitoring the concentration of ammonium in said culture supernatant; and (f) separating at least a portion of the culture supernatant, wherein said culture supernatant containing ammonium at a concentration of more than 10 mM is not used to prepare the rVWF composition, and wherein said separated supernatant has a rVWF specific ristocetin-cofactor activity of at least least 30 IU/mcg rVWF. In certain embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is at least 2.4 µg/L, 3 µg/L, 4 µg/L, 5 µg/L, 6 µg/L, 7 µg/L, 8 µg /l, 9 mcg/l, 10 mcg/l, 15 mcg/l, 20 mcg/l or more. In other embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is 2-20 µg/L, 2-10 µg/L, 3-8 µg/L, or 4-6 µg/L. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 6 мМ, не используют для получения композиции rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 38 мкг/л, или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the culture supernatant containing ammonium at a concentration greater than 6 mM is not used to prepare the rVWF composition. In certain embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is at least 2.4 µg/L, 3 µg/L, 4 µg/L, 5 µg/L, 6 µg/L, 7 µg/L, 8 µg /l, 9 mcg/l, 10 mcg/l, 15 mcg/l, 20 mcg/l or more. In other embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is 2-20 µg/L, 2-10 µg/L, 38 µg/L, or 4-6 µg/L. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 5 мМ, не используют для получения композиции rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 38 мкг/л, или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the culture supernatant containing ammonium at a concentration greater than 5 mM is not used to prepare the rVWF composition. In certain embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is at least 2.4 µg/L, 3 µg/L, 4 µg/L, 5 µg/L, 6 µg/L, 7 µg/L, 8 µg /l, 9 mcg/l, 10 mcg/l, 15 mcg/l, 20 mcg/l or more. In other embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is 2-20 µg/L, 2-10 µg/L, 38 µg/L, or 4-6 µg/L. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 4 мМ, не используют для получения композиции rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 38 мкг/л, или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.According to one embodiment of the method described above, the culture supernatant containing more than 4 mM ammonium is not used to prepare the rVWF composition. In certain embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is at least 2.4 µg/L, 3 µg/L, 4 µg/L, 5 µg/L, 6 µg/L, 7 µg/L, 8 µg /l, 9 µg/l, 10 µg/l, 15 µg/l, 20 µg/l or more. In other embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is 2-20 µg/L, 2-10 µg/L, 38 µg/L, or 4-6 µg/L. In a preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/µg rVWF. In a more preferred embodiment, the separated supernatant has a rVWF specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/µg rVWF.
Рекомбинантный vWF может быть получен посредством осуществления экспрессии в подходящей эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых, например, клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки, например, клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. Согласно одному из вариантов реализации можно осуществлять экспрессию указанного vWF в дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО, BHK или HEK. Как правило, для экспрессии vWF согласно настоящему изобретению применяют клетки млекопитающих, например, клетки СНО из непрерывной клеточной линии.Recombinant vWF can be obtained by carrying out the expression in a suitable eukaryotic host system. Examples of eukaryotic cells include, without limitation, mammalian cells such as CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, and HepG2; insect cells, eg SF9 cells, SF21 cells, S2 cells and High Five cells; and yeast cells, for example Saccharomyces or Schizosaccharomyces cells. In one embodiment, said vWF can be expressed in yeast cells, insect cells, avian cells, mammalian cells, and the like. For example, in a human cell line, a hamster cell line, or a mouse cell line. In one particular embodiment, said cell line is a CHO, BHK, or HEK cell line. Typically, mammalian cells, such as CHO cells from a continuous cell line, are used to express vWF according to the present invention.
Согласно определенным вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую vWF, может представлять собой вектор. Указанный вектор может доставляться вирусом или может представлять собой плазмиду. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный белок, может представлять собой конкретный ген или его биологически функциональную часть. Согласно одному из вариантов реализации указанный белок представляетIn certain embodiments, the nucleic acid sequence containing the vWF encoding sequence may be a vector. Said vector may be delivered by a virus or may be a plasmid. The nucleic acid sequence encoding said protein may be a specific gene or a biologically functional part thereof. In one embodiment, said protein is
- 36 041947 собой по меньшей мере биологически активную часть vWF.- 36 041947 is at least the biologically active part of the vWF.
Для экспрессии указанного vWF могут применяться разнообразные векторы; они могут быть выбраны из эукариотических экспрессионных векторов. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES, рМЕТ, с применением таких промоторов, как АОХ1, GAP, GAL1, AUG1, и т.п.; (ii) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, рАс5, pIB, pMIB, рВАС и т.п, с применением таких промоторов, как РН, р10, МТ, Ас5, OpIE2, gp64, polh и т.п, и (iii) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, ркДНК3, pBPV и т.п, и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п, с применением таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин. Типовой вектор для экспрессии rVWF описан у Kaufman et al. (Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3): 1233-42); содержание указанного источника включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.A variety of vectors can be used to express said vWF; they may be selected from eukaryotic expression vectors. Examples of eukaryotic expression vectors include: (i) yeast expression vectors such as pAO, pPIC, pYES, pMET using promoters such as AOX1, GAP, GAL1, AUG1, and the like; (ii) vectors for expression in insect cells such as pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC and the like using promoters such as PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh and the like, and (iii) vectors for expression in mammalian cells such as pSVL, pCMV, pRc/RSV, rcDNA3, pBPV and the like, and vectors derived from viral systems such as vaccinia virus, adeno-associated viruses, herpesviruses, retroviruses, etc. .p using promoters such as CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV and β-actin. An exemplary vector for rVWF expression is described in Kaufman et al. (Mol Cell Biol. 1989 Mar; 9(3): 1233-42); the contents of said source are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанная последовательность нуклеиновой кислоты также содержит другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как промоторные последовательности, энхансеры, ТАТА-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-А-последовательности, последовательности процессинга белков, маркеры отбора и т.п., которые общеизвестны специалистам в данной области техники.According to some embodiments of the present invention, said nucleic acid sequence also contains other sequences suitable for controlled protein expression, such as promoter sequences, enhancers, TATA boxes, transcription initiation sites, polylinkers, restriction sites, poly A sequences, processing sequences proteins, selection markers, and the like, which are well known to those skilled in the art.
Помимо сред для клеточных культур, содержащих повышенную концентрацию меди, условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ на протяжении всего подготовительного процесса (upstream-процесса) в системах культивирования. Согласно одному из вариантов реализации условия культивирования клеток включают концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ, согласно другому варианту реализации менее чем приблизительно 20 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 15 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 10 мМ, и согласно дальнейшему варианту реализации менее чем приблизительно 5 мМ.In addition to cell culture media containing elevated concentrations of copper, the cell culture conditions of the present invention may include an ammonium concentration of less than about 25 mM throughout the upstream process in the culture systems. In one embodiment, cell culture conditions include an ammonium concentration of less than about 25 mM, in another embodiment less than about 20 mM, in another embodiment less than about 15 mM, in another embodiment less than about 10 mM, and in a further embodiment, less than about 5 mM.
Согласно некоторым вариантам реализации концентрации аммония согласно настоящему изобретению поддерживают на постоянном уровне на протяжении всего подготовительного процесса в системе культивирования клеток. Клетки, применяемые согласно настоящему изобретению, могут культивироваться, например, способами, модифицированными относительно стандартных периодического культивирования и непрерывного культивирования, общеизвестных в данной области техники. При этом такие стандартные техники могут приводить к образованию высоких концентраций аммония в конце культивирования. В способах согласно настоящему изобретению эта проблема преодолена за счет применения систем производства, которые могут обеспечить постоянное поступление культуральной среды с помощью таких техник, как, например, перфузионное или хемостатическое культивирование. После культивирования клеток-хозяев vWF может быть выделен из отработанной среды с применением стандартных методик, таких как ультрафильтрация или центрифугирование. При необходимости vWF может быть очищен, например, ионообменной и/или эксклюзионной хроматографией и т.п.In some embodiments, the ammonium concentrations of the present invention are maintained at a constant level throughout the preparatory process in the cell culture system. The cells used in accordance with the present invention may be cultured, for example, by methods modified from standard batch culture and continuous culture well known in the art. However, such standard techniques can lead to the formation of high concentrations of ammonium at the end of cultivation. The methods of the present invention overcome this problem by employing production systems that can provide a constant supply of culture medium using techniques such as, for example, perfusion or chemostatic culture. After culturing host cells, vWF can be isolated from spent media using standard techniques such as ultrafiltration or centrifugation. If necessary, the vWF can be purified, for example, by ion exchange and/or size exclusion chromatography and the like.
Непрерывная культура (например, перфузионная или хемостатическая культура) может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, при этом объем культуры, как правило, неизменен. Сходным образом, непрерывная ферментация может подразумевать процесс, при котором клетки или микроорганизмы в культуре поддерживают в экспоненциальной фазе роста за счет постоянного добавления свежей среды, точно компенсируемом удалением суспензии клеток из биореактора. Кроме того, реакционная система с баком-мешалкой может применяться для суспензионного, перфузионного, хемостатического культивирования и/или культивирования на микроносителях. Как правило, в качестве указанной реакционной системы с бакоммешалкой может работать любой стандартный реактор с баком-мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например, типа Rushton, гидравлическим, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.A continuous culture (eg, perfusion or chemostatic culture) may be a suspension culture that continuously receives nutrients from the influx of fresh medium, while the culture volume is usually unchanged. Similarly, continuous fermentation may refer to a process in which the cells or microorganisms in culture are maintained in an exponential growth phase by the constant addition of fresh medium, exactly compensated by the removal of the cell suspension from the bioreactor. In addition, the stirred tank reaction system can be used for suspension, perfusion, chemostatic and/or microcarrier cultures. Generally, any standard stirred tank reactor with any type of agitator, such as Rushton type, hydraulic, inclined blade, or propeller type, can operate as said stirred tank reaction system.
С. Способы получения рекомбинантного ADAMTS13 (А13).C. Methods for producing recombinant ADAMTS13 (A13).
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения rA13 в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония.According to another aspect, the present invention also relates to methods for producing rA13 under cell culture conditions, comprising a cell culture medium containing an elevated concentration of copper. In certain embodiments, said culture also contains a low concentration of ammonium.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основIn one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper to the basic cell culture media to a final copper concentration of at least 1.0 µg/L; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented bases are present in the separated culture supernatant.
- 37 041947 ных сред для клеточных культур в день (т.е. 1500 единиц FRETS-VWF73 активности в день на литр культуры клеток; Р FRETS). Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 1-6 мкг/л, 2-5 мкг/л, 2-4 мкг/л или 3-4 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение объемной продуктивности FRETS-VWF73 (Р FRETS). Например, согласно определенным вариантам реализации выделяют по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для продуцирования rA13 поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0x106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 3,5x106 клеток/мл, 3,0x106 клеток/мл, 2,5x106 клеток/мл, 2,0x106 клеток/мл, 1,5x106 клеток/мл, 1,0x106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают на уровне от 3,0x106 клеток/мл до 4,0x106 клеток/мл.- 37041947 cell culture media per day (i.e. 1500 units of FRETS-VWF73 activity per day per liter of cell culture; P FRETS). In certain embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is at least 2 µg/l, 3 µg/l, 4 µg/l, 5 µg/l, 6 µg/l or more. In other embodiments, the final concentration of copper in the supplemented basic culture media is 1-6 µg/L, 2-5 µg/L, 2-4 µg/L, or 3-4 µg/L. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In certain embodiments, these methods provide a sustained increase in FRETS-VWF73 (P FRETS) volumetric productivity. For example, in certain embodiments, at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media are isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 , 63, 70 or more days. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media are isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 , 70 or more days. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media are isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In the most preferred embodiment, at least 3000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media are isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a specific embodiment, the cell density in the continuous cell culture for rA13 production is maintained at a concentration not exceeding 4.0 x 106 cells/mL for an extended period. In other specific embodiments, cell density is maintained at or below 3.5x106 cells/mL, 3.0x106 cells/mL, 2.5x106 cells/mL, 2.0x106 cells/mL, 1.5x106 cells/mL, 1.0x106 cells/ml or less. In one embodiment, cell density is maintained at 3.0x106 cells/mL to 4.0x106 cells/mL.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта (FRETS). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение продуктивности FRETS. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 8 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 10 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.In one embodiment of the methods described above, the separated supernatant contains at least 4 units of FRETS-VWF73 activity per ml of supernatant (FRETS). In a preferred embodiment, the separated supernatant contains at least 6 units of FRETS-VWF73 activity per ml of supernatant. In a more preferred embodiment, the separated supernatant contains at least 8 units of FRETS-VWF73 activity per ml of supernatant. In the most preferred embodiment, the separated supernatant contains at least 10 units of FRETS-VWF73 activity per ml of supernatant. In certain embodiments, these methods provide a sustained increase in FRETS productivity. For example, in certain embodiments, a supernatant having at least 4 units of FRETS-VWF73 activity per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 , 70 or more days. In a preferred embodiment, a supernatant having at least 6 units of FRETS-VWF73 activity per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a more preferred embodiment, a supernatant having at least 8 units of FRETS-VWF73 activity per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In the most preferred embodiment, a supernatant having at least 10 units of FRETS-VWF73 activity per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры в день (т.е. q Frets). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение удельной продуктивности FRETS-VWF73 на клетку (q Frets). Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение поIn one embodiment of the methods described above, cell culture produces at least 800 IU FRETS-VWF73 activity per 10 6 culture cells per day (ie, q Frets). In a preferred embodiment, cell culture produces at least 1 U FRETS-VWF73 activity per 10 6 culture cells per day. In a more preferred embodiment, cell culture produces at least 1.2 U FRETS-VWF73 activity per 10 6 culture cells per day. In a most preferred embodiment, cell culture produces at least 1.4 U FRETS-VWF73 activity per 10 6 culture cells per day. In certain embodiments, these methods provide a sustained increase in FRETS-VWF73 specific productivity per cell (q Frets). For example, in certain embodiments, cell culture produces at least 800 IU FRETS-VWF73 activity per 10 6 culture cells daily for up to
- 38 041947 меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.- 38 041947 at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a preferred embodiment, cell culture yields at least 1 U FRETS-VWF73 activity per 106 culture cells daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a more preferred embodiment, cell culture yields at least 1.2 U FRETS-VWF73 activity per 106 culture cells daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 , 63, 70 or more days. In the most preferred embodiment, cell culture yields at least 1.4 U FRETS-VWF73 activity per 106 cell culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 , 63, 70 or more days.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры в день (Р ELISA). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки rA13. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.In one embodiment of the methods described above, cell culture produces at least 1 mg of rA13 as measured by ELISA per liter of culture per day (P ELISA). In a preferred embodiment, cell culture produces at least 1.5 mg of rA13 as measured by ELISA per liter of culture per day. In a more preferred embodiment, cell culture yields at least 2 mg of rA13 as measured by ELISA per liter of culture per day. In certain embodiments, these methods provide a sustained increase in rA13 production. For example, in certain embodiments, cell culture produces at least 1 mg of rA13, as measured by ELISA, per liter of culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a preferred embodiment, cell culture yields at least 1.5 mg of rA13 as measured by ELISA per liter of culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a more preferred embodiment, cell culture yields at least 2 mg rA13, as measured by ELISA, per liter of culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 , 63, 70 or more days.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 106 клеток культуры в день (т.е. q ELISA). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 106 клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 106 клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки согласно q ELISA. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.In one embodiment of the methods described above, cell culture produces at least 0.5 μg of rA13 as measured by ELISA per 10 6 culture cells per day (ie, q ELISA). In a preferred embodiment, cell culture produces at least 0.7 μg of rA13, as measured by ELISA, per 10 6 culture cells per day. In a more preferred embodiment, cell culture yields at least 0.9 μg of rA13 as measured by ELISA per 10 6 culture cells per day. According to certain implementation options, these methods provide a stable increase in production according to q ELISA. For example, in certain embodiments, cell culture produces at least 0.5 μg of rA13, as measured by ELISA, per 10 6 cell culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a preferred embodiment, cell culture produces at least 0.7 μg of rA13, as measured by ELISA, per 10 6 cell culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a more preferred embodiment, cell culture produces at least 0.9 μg of rA13, as measured by ELISA, per 10 6 cell culture daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42 , 49, 56, 63, 70 or more days.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки rA13. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 3 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 5 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.In one embodiment of the methods described above, the separated supernatant contains at least 3 μg of rA13, as determined by ELISA analysis, per ml of supernatant. In a preferred embodiment, the separated supernatant contains at least 4 μg of rA13, as determined by ELISA analysis, per ml of supernatant. In a more preferred embodiment, the separated supernatant contains at least 5 μg of rA13, as determined by ELISA analysis, per ml of supernatant. According to the most preferred implementation variant of the separated supernatant contains at least 6 μg of rA13, according to ELISA analysis, per ml of supernatant. In certain embodiments, these methods provide a sustained increase in rA13 production. For example, in certain embodiments, a supernatant having at least 3 μg of rA13 per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In a preferred embodiment, a supernatant having at least 4 μg of rA13 per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days . In a more preferred embodiment, a supernatant having at least 5 μg of rA13 per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days. In the most preferred embodiment, a supernatant having at least 6 μg of rA13 per ml is isolated daily for at least 7 days, or at least 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 or more days.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение поIn one embodiment of the methods described above, the cell culture solution also contains ammonium at a concentration of less than 10 mM. According to another specific implementation variant, the concentration of ammonium in the cell culture is maintained at a level not exceeding 10 mm for
- 39 041947 меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т. е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13). Согласно конкретному варианту реализации культуральный раствор содержит медь и аммоний в концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.- 39 041947 at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 5 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 5 mM for at least 7 days. In a preferred embodiment, the cell culture solution contains ammonium at a concentration not exceeding 4 mM. In another specific embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at or below 4 mM for at least 7 days. In other embodiments, the cell culture solution contains ammonium at a concentration of not more than 10 mM, or not more than 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, or less. According to another embodiment, the ammonium concentration in the cell culture is maintained at a low level throughout the process (i.e., during the entire time that the specified culture is used to produce rA13). According to a specific implementation variant of the culture solution contains copper and ammonium in a concentration according to any of the options 1-440 shown in table. 1.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и цинка; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинк. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно одному варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или более, цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper and zinc to basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. According to one embodiment, said culture medium contains at least 1 μg/L copper and at least 2 μM zinc. In other embodiments, said medium contains at least 2 µg/l copper or at least 4 µg/l copper. In one embodiment, when copper is added to the media, said culture media also contains at least exactly or about 5 μM zinc. In one embodiment, said culture medium also contains exactly or about 2 μM to 12 μM zinc. In another embodiment, said culture medium also contains exactly or about 5 μM to 12 μM zinc. In other embodiments, said culture medium may also contain at least exactly or about 2 µM, or at least exactly or about 3 µM, 4 µM, 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM, 9 µM, 10 µM, 11 µM, 12 µM, 13 µM, 14 µM, 15 µM, 20 µM, 25 µM, 30 µM or more zinc. In one embodiment, said culture medium contains copper and zinc at concentrations according to any one of the options 441-880 shown in Table 2. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и кальция; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ или более, кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приIn one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper and calcium to the basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. According to one embodiment, said culture medium contains at least 1 μg/L copper and at least 0.5 mM calcium. In other embodiments, said medium contains at least 2 µg/l copper or at least 4 µg/l copper. In another embodiment, when copper is added to the media, said culture medium also contains at least 1.5 mM calcium. In one embodiment, said culture medium contains exactly or about 0.5 mM to 1.5 mM calcium. In other embodiments, said culture medium may contain at least exactly or about 0.5 mM, or at least exactly or about 0.6 mM; 0.7 mM; 0.8 mM; 0.9 mM; 1.0 mM; 1.1 mm; 1.2 mm; 1.3 mm; 1.4 mm; 1.5 mm; 1.6 mM; 1.7 mM; 1.8 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.25 mM; 2.5 mm; 2.75 mM; 3.0 mM; 3.5 mm; 4.0 mM; 4.5 mm; 5.0 mM or more, calcium. According to one embodiment, said culture medium contains copper and calcium at a concentration according to any of the options 881-1320, with
- 40 041947 веденных в табл.3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.- 40 041947 entered in Table 3. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и кальция; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 мМ и 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper, zinc and calcium to basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In one embodiment, the culture medium contains calcium at a concentration of at least 0.5 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In another specific embodiment, the culture medium contains calcium at a concentration of at least 1.5 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. According to another specific embodiment, said culture medium contains calcium at a concentration between 0.5 mM and 1.5 mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In other embodiments, the culture medium contains calcium at a concentration of at least 0.6 mM; 0.7 mM; 0.8 mM; 0.9 mM; 1.0 mM; 1.1 mm; 1.2 mm; 1.3 mm; 1.4 mm; 1.5 mm; 1.6 mM; 1.7 mM; 1.8 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.25 mM; 2.5 mm; 2.75 mM; 3.0 mM; 3.5 mm; 4.0 mM; 4.5 mm; 5.0 mm or more, and copper and zinc in concentrations according to any of the options 441-880 shown in table.2. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 мг/л до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мг/л, 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper and nicotinamide to the basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. According to one embodiment, said culture medium contains at least 1 μg/l copper and at least 2 mg/l nicotinamide (vitamin B3). In other embodiments, said medium contains at least 2 µg/l copper or at least 4 µg/l copper. In another embodiment, when copper is added to the media, said culture medium also contains at least 7 mg/l of nicotinamide (vitamin B3). In one embodiment, said culture medium contains exactly or about 2 mg/l to 10 mg/l nicotinamide (vitamin B3). In other embodiments, said culture medium may contain at least exactly or about 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, or higher concentrations of nicotinamide (vitamin B3). In one embodiment, said culture medium contains copper and nicotinamide at concentrations according to any one of the options 1321-1760 shown in Table 4. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
- 41 041947- 41 041947
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper, zinc, and nicotinamide to basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In one embodiment, said cell culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/mL, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In another specific embodiment, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 7 mg/ml mM, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. According to another specific embodiment, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of 2 mg/ml and 10 mg/ml, and copper and zinc at concentrations according to any of the options 441-880 shown in Table 2. In other embodiments, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml or more, and copper and zinc at concentrations according to any one of options 441-880, given in table.2. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, кальция и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.In one embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant ADAMTS13 (rA13) composition; said method includes the steps of: (a) providing basic cell culture media; (b) adding copper, calcium, and nicotinamide to basic cell culture media; (c) providing one or more cells containing a nucleic acid encoding a rA13 protein; (d) culturing said one or more cells in a copper-supplemented cell culture medium such that rA13 is expressed and excreted from the cells into the culture supernatant; and (e) separating at least a portion of said culture supernatant, wherein at least 1500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In one embodiment, the cell culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/ml, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 3. According to another specific embodiment, the culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 7 mg/ml mM, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 3. According to another specific embodiment, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of 2 mg/ml and 10 mg/ml, and copper and calcium at concentrations according to any of the options 881-1320 shown in Table 3. In other embodiments, said culture medium contains nicotinamide at a concentration of at least 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg / ml, 10 mg / ml, 11 mg / ml, 12 mg / ml, 13 mg / ml, 14 mg / ml, 15 mg / ml or more, and copper and calcium in concentrations according to any of the options 881-1320, given in table.3. In a preferred embodiment, at least 2000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In a more preferred embodiment, at least 2500 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant. In the most preferred embodiment, at least 3,000 units of FRETS-VWF73 activity per liter of supplemented basic cell culture media per day are present in the separated culture supernatant.
Рекомбинантные белки ADAMTS могут быть получены посредством осуществления экспрессии в любой подходящей прокариотической или эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, COS, HEK 293, BHK, SKHep, и HepG2; клетки насекомых, например SF9 клетки, SF21 клетки, S2 клетки, и High Five клетки; и дрожжевые клетки, например, клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. Согласно одному из вариантов реализации указанные белки ADAMTS можно экспрессировать в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реаRecombinant ADAMTS proteins can be generated by expression in any suitable prokaryotic or eukaryotic host system. Examples of eukaryotic cells include, without limitation, mammalian cells such as CHO, COS, HEK 293, BHK, SKHep, and HepG2; insect cells, such as SF9 cells, SF21 cells, S2 cells, and High Five cells; and yeast cells, for example Saccharomyces or Schizosaccharomyces cells. In one embodiment, said ADAMTS proteins can be expressed in bacterial cells, yeast cells, insect cells, avian cells, mammalian cells, and the like. For example, in a human cell line, a hamster cell line, or a mouse cell line. According to one of the specific options
- 42 041947 лизации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО, BHK или HEK. Согласно предпочтительному варианту реализации клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО. Согласно конкретному варианту реализации клоны СНО, способные к стабильной экспрессии rA13, получают ко-трансфекцией клетки СНО кодирующими последовательностями rA13 и дигидрофолатредуктазы (например, мышиного гена dhfr) и отбором при росте в присутствии возрастающих уровней метотрексата.- 42 041947 lysing said cell line is a CHO, BHK or HEK cell line. In a preferred embodiment, the cell line is a CHO cell line. In a specific embodiment, CHO clones capable of stable expression of rA13 are generated by co-transfection of CHO cells with coding sequences for rA13 and dihydrofolate reductase (eg, the mouse dhfr gene) and growth selection in the presence of increasing levels of methotrexate.
Согласно одному из вариантов реализации указанные клетки могут представлять собой любые клетки млекопитающих, пригодные для культивирования, предпочтительно в ходе производственного процесса (т.е. по меньшей мере в 10 л, предпочтительно по меньшей мере в 100 л), для получения требуемого белка ADAMTS, такого как ADAMTS13. Примеры включают линию клеток почки обезьяны CV1 трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); линию эмбриональных клеток почек человека (клетки 293 или 293 субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al, J. Gen Virol, 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR, такие как субклон DUKX-B11 (СНО, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крыс Буффало (BRL 3А, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562, ATCC CCL51 ); клетки TRI (Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2). Предпочтительно, клеточная линия представляет собой линию клеток грызунов, в частности, линию клеток хомяка, такую как СНО или BHK.In one embodiment, said cells may be any mammalian cell suitable for culture, preferably during the manufacturing process (i.e. at least 10 L, preferably at least 100 L), to obtain the desired ADAMTS protein, such as ADAMTS13. Examples include the CV1 monkey kidney cell line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human kidney embryonic cell line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al, J. Gen Virol, 36:59 (1977)); newborn hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary/-DHFR cells such as subclone DUKX-B11 (CHO, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HeLa, ATCC CCL 2); dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumors (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 cells; FS4 cells; and a human hepatoma line (Hep G2). Preferably, the cell line is a rodent cell line, in particular a hamster cell line such as CHO or BHK.
Значительное число векторов может применяться для экспрессии белка ADAMTS (например, ADAMTS 13) и может быть выбрано из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Согласно определенным вариантам реализации плазмидный вектор предназначен для применения в экспрессии белка ADAMTS (например, ADAMTS 13). Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и управляющие последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, применяют в соединении с указанными хозяевами. Указанный вектор может нести сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором.A significant number of vectors can be used to express the ADAMTS protein (eg, ADAMTS 13) and can be selected from eukaryotic and prokaryotic expression vectors. In certain embodiments, the plasmid vector is for use in the expression of an ADAMTS protein (eg, ADAMTS 13). Typically, plasmid vectors containing replicon and control sequences derived from species compatible with the host cell are used in conjunction with said hosts. Said vector may carry a replication site as well as marker sequences capable of providing phenotypic selection in transformed cells. The plasmid contains a nucleotide sequence encoding an ADAMTS protein (eg ADAMTS 13) operably linked to one or more control sequences, eg a promoter.
Предпочтительный способ получения стабильных клонов клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный белок ADAMTS, следующий. Дефицитную по DHFR клеточную линию СНО DUKX-B11 трансфицируют DHFR-экспрессионным вектором, чтобы обеспечить экспрессию соответствующего рекомбинантного белка. Типовой способ описан у Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12), содержание которого включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Отбор проводят культивированием в не содержащих гипоксантин/тимидин (НТ) средах; амплификации соответствующей области, кодирующей экспрессию рекомбинантного белка ADAMTS и DHFR гена, достигают размножением клеток в возрастающих концентрациях метотрексата. При необходимости клеточные линии СНО могут быть адаптированы для роста в не содержащей сыворотки и/или белков среде, по существу согласно описанию в US 6100061 (Reiter et al., lmmuno Aktiengesellschaft).A preferred method for obtaining stable clones of CHO cells expressing recombinant ADAMTS protein is as follows. The DHFR-deficient CHO cell line DUKX-B11 was transfected with a DHFR expression vector to allow expression of the corresponding recombinant protein. An exemplary method is described in Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12), the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety for any purpose. The selection is carried out by cultivation in not containing hypoxanthine/thymidine (HT) environments; amplification of the corresponding region encoding the expression of the recombinant ADAMTS protein and the DHFR gene is achieved by cell expansion in increasing concentrations of methotrexate. If necessary, CHO cell lines can be adapted to grow in a serum-free and/or protein-free medium essentially as described in US 6,100,061 (Reiter et al., lmmuno Aktiengesellschaft).
Согласно другому предпочтительному варианту реализации стабильные HEK293 клетки получают, трансфицируя их конструкцией, содержащей селектируемый маркер устойчивости к гигромицину, и отбирая трансформанты по устойчивости к антибиотику.In another preferred embodiment, stable HEK293 cells are generated by transfecting them with a construct containing a selectable hygromycin resistance marker and selecting transformants for antibiotic resistance.
Способность определенных вирусов инфицировать клетки или проникать в клетки посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза, встраиваться в геном клетки-хозяина и стабильно и эффективно экспрессировать вирусные гены, делает их привлекательными кандидатами для переноса чужеродных нуклеиновых кислот в клетки (например, клетки млекопитающих). Соответственно, согласно определенным вариантам реализации вирусный вектор применяют для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS 13) в клетку-хозяина для экспрессии. Указанный вирусный вектор должен содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором. Как вариант, указанный вирусный вектор может не содержать контрольную последовательность, вместо этого используя контрольную последовательность клеткихозяина для управления экспрессией белка ADAMTS. Неограничивающие примеры вирусных векторов, которые могут применяться для доставки нуклеиновой кислоты, включают аденовирусные векторы, AAV-векторы и ретровирусные векторы.The ability of certain viruses to infect cells or enter cells via receptor-mediated endocytosis, integrate into the host cell genome, and stably and efficiently express viral genes makes them attractive candidates for the transfer of foreign nucleic acids into cells (eg, mammalian cells). Accordingly, in certain embodiments, a viral vector is used to introduce a nucleotide sequence encoding an ADAMTS protein (eg, ADAMTS 13) into a host cell for expression. Said viral vector must contain a nucleotide sequence encoding an ADAMTS protein (eg ADAMTS 13) operably linked to one or more control sequences, eg a promoter. Alternatively, said viral vector may not contain a control sequence, instead using a host cell control sequence to direct expression of the ADAMTS protein. Non-limiting examples of viral vectors that can be used to deliver the nucleic acid include adenoviral vectors, AAV vectors, and retroviral vectors.
Согласно одному из вариантов реализации аденовирусный экспрессионный вектор включают конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для осуществления упаковки указанной конструкции и гарантированной экспрессии клонированной в нее конструкции ADAMTS.In one embodiment, the adenoviral expression vector includes constructs containing adenoviral sequences sufficient to package said construct and ensure expression of an ADAMTS construct cloned therein.
- 43 041947- 43 041947
Аденовирусные векторы позволяют вводить чужеродные последовательности размером до 7 т.п.н.Adenovirus vectors allow the introduction of foreign sequences up to 7 kb.
(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2): 53 5-546, 1992)).(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2): 53 5-546, 1992)).
Согласно другому варианту реализации аденоассоциированный вирус (AAV) может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), в клетку-хозяина для экспрессии. AAV-системы описывались ранее и, как правило, общеизвестны в данной области техники (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Natlmmun, 13(2-3): 141-64, 1994; Muzyczka, Curr TopMicrobiol Immunol, 158:97-129, 1992). Детали получения и применения rAAV-векторов описаны, например, в патентах США №5139941 и №4797368, включенных в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте и для любых целей.In another embodiment, an adeno-associated virus (AAV) can be used to introduce a nucleotide sequence encoding an ADAMTS protein (eg, ADAMTS 13) into a host cell for expression. AAV systems have been described previously and are generally well known in the art (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094 -6098, 1992; Curiel, Natlmmun, 13(2-3): 141-64, 1994; Muzyczka, Curr TopMicrobiol Immunol, 158:97-129, 1992). Details of the preparation and use of rAAV vectors are described, for example, in US Pat.
Согласно одному из вариантов реализации ретровирусный экспрессионный вектор может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), в клетку-хозяина для экспрессии. Указанные системы были описаны ранее и в целом общеизвестны в данной области техники (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, в: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, в: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). Согласно конкретному варианту реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор (см., например, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al, NatBiotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer etal, J Virol, 71(9):6641-6649, 1997; патенты США №6013516 и №5994136).In one embodiment, a retroviral expression vector can be used to introduce a nucleotide sequence encoding an ADAMTS protein (eg, ADAMTS 13) into a host cell for expression. These systems have been described previously and are generally well known in the art (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, in: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt , eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, in: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). In a specific embodiment, the retroviral vector is a lentiviral vector (see, e.g., Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al, NatBiotechnol, 15(9):871-875, 1997 ; Blomer et al, J Virol, 71(9):6641-6649, 1997; US Pat. Nos. 6,013,516 and 5,994,136).
Неограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как pRSET, pET, pBAD и т.п, при этом промоторы, применяемые в прокариотических экспрессионных векторах, включают lac, trc, trp, recA, araBAD и т.п. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с применением таких промоторов, как AOX1, GAP, GAL1, AUG1, и т.п.; (ii) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, рАс5, pIB, pMIB, рВАС и т.п, с применением таких промоторов, как РН, p10, MT, Ас5, OpIE2, gp64, polh и т.п, и (iii) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, ркДНК3, pBPV и т.п, и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п, с применением таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актина. Типовой вектор для экспрессии rA13 описан у Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12); содержание указанного источника включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.Non-limiting examples of prokaryotic expression vectors include plasmids such as pRSET, pET, pBAD, and the like, while promoters useful in prokaryotic expression vectors include lac, trc, trp, recA, araBAD, and the like. Examples of eukaryotic expression vectors include: (i) yeast expression vectors such as pAO, pPIC, pYES, pMET using promoters such as AOX1, GAP, GAL1, AUG1, and the like; (ii) vectors for expression in insect cells such as pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC and the like using promoters such as PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh and the like, and (iii) vectors for expression in mammalian cells such as pSVL, pCMV, pRc/RSV, rcDNA3, pBPV and the like, and vectors derived from viral systems such as vaccinia virus, adeno-associated viruses, herpesviruses, retroviruses, etc. .p using promoters such as CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV and β-actin. An exemplary vector for the expression of rA13 is described in Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12); the contents of said source are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes.
Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Настоящее изобретение обеспечивает, наряду с прочими аспектами, способы крупномасштабной экспрессии белка ADAMTS. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высокого отношения поверхности к объему в культуре для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является применение микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Согласно другому варианту реализации указанные ростовые потребности удовлетворяются посредством применения суспензионной культуры клеток.In certain embodiments, cell culture methods of the present invention may include the use of a microcarrier. The present invention provides, among other aspects, methods for large scale expression of the ADAMTS protein. In some embodiments, cell culture according to embodiments of the invention may be carried out in large bioreactors under conditions suitable to obtain a high surface to volume ratio in culture to achieve high cell density and protein expression. One way to provide such growth conditions is the use of microcarriers for culturing cells in bioreactors with a stirrer. According to another implementation variant of these growth requirements are met through the use of suspension cell culture.
IV. Конкретные варианты реализациию.IV. specific implementation options.
А. Рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF).A. Recombinant von Willebrand factor (rVWF).
Рекомбинантный vWF можно экспрессировать в клетках млекопитающих, но удельная активность vWF может широко варьировать в зависимости от условий культивирования клеток; не было показано, что она сравнима или равна таковой vWF, выделенного из плазмы крови. Настоящее изобретение основано частично на неожиданном открытии, что среды для клеточных культур, содержащие по меньшей мере 2,4 мкг/л меди, обеспечивают благоприятный эффект, способствую экспрессии высокомолекулярного vWF, имеющего высокую удельную активность. В частности, высокомолекулярный рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению может включать высокомультимерную форму, содержащую от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающую удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Процессы культивирования клеток согласно настоящему изобретению также позволяют поддерживать низкие уровни NH4 + (например, менее чем 10 мМ) во время подготовительного процесса в системах культивирования клеток, уменьшая таким образом пагубные эффекты на посттрансляционные модификации. Предполагается, что согласно настоящему изобретению впервые предложены условия клеточных культур, включающие среду с подходящей концентрацией меди в комбинации с подходящими уровнями аммония в супернатанте, для экспрессии высокомультимерных vWF с высокой удельной активностью.Recombinant vWF can be expressed in mammalian cells, but the specific activity of vWF can vary widely depending on cell culture conditions; it has not been shown to be comparable or equal to that of vWF isolated from plasma. The present invention is based in part on the unexpected discovery that cell culture media containing at least 2.4 µg/l of copper provide the beneficial effect of promoting the expression of high molecular weight vWF having a high specific activity. In particular, the high molecular weight recombinant vWF of the present invention may include a high multimeric form containing from about 14 to about 22 dimers and having a specific ristocetin activity of at least about 30 mU/µg. The cell culture processes of the present invention also allow low levels of NH 4 + (eg, less than 10 mM) to be maintained during the preparatory process in cell culture systems, thus reducing detrimental effects on post-translational modifications. It is believed that the present invention provides for the first time cell culture conditions comprising a medium with a suitable concentration of copper in combination with suitable levels of ammonium in the supernatant for the expression of high multimeric vWFs with high specific activity.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для кле- 44 041947 точной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH4 +). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью.According to one aspect, the present invention relates to cell culture conditions for producing recombinant high molecular weight vWF with high specific activity. The cell culture conditions of the present invention may include, for example, cell culture medium with elevated copper concentration and/or cell culture supernatant with low concentration of ammonium (NH 4 + ). The present invention also provides methods for culturing cells under cell culture conditions to express high molecular weight vWF with high specific activity.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF; указанный раствор культуры клеток содержит: среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок vWF, причем указанный белок vWF обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.In one aspect, the present invention provides a cell culture solution for producing a high molecular weight recombinant vWF protein; said cell culture solution contains: cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 μg/L; cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than 10 mM; and a plurality of cells expressing a highly multimeric vWF protein, said vWF protein having a specific ristocetin activity of at least about 30 mU/µg.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток раствор культуры клеток содержит средовую добавку, содержащую медь.In one specific embodiment of the cell cultures described above, the cell culture solution contains a copper supplement.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит гидролизат, необязательно соевый гидролизат.According to one specific embodiment of the cell cultures described above, said medium supplement contains a hydrolysate, optionally a soy hydrolysate.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит соль меди, хелат меди или их комбинации.According to one specific embodiment of the cell cultures described above, said medium supplement contains a copper salt, a copper chelate, or combinations thereof.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.In one specific embodiment of the cell cultures described above, said copper salt is selected from the group consisting of copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, and copper oxide.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.In one specific embodiment of the cell cultures described above, the copper concentration is at least about 4 µg/L.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л.In one specific embodiment of the cell cultures described above, the copper concentration is from about 2.4 µg/L to about 20 µg/L.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток белок vWF содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.In one specific embodiment of the cell cultures described above, the vWF protein contains from about 14 to about 22 dimers.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF; указанный способ включает этапы: а) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок vWF; b) экспрессии белка vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный белок vWF представляет собой высокомультимерный белок vWF и имеет удельную ристоцетиновую активность, составляющую по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.According to one aspect, the present invention provides a method for producing a high molecular weight recombinant vWF protein; said method includes the steps of: a) providing a culture of cells containing a nucleic acid encoding a recombinant vWF protein; b) expressing the vWF protein in said cells under cell culture conditions comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 μg/L and a cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than about 10 mM, wherein said vWF protein is a highly multimeric vWF protein and has a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/μg.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.According to one specific embodiment of the methods described above, said cells are mammalian cells.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки взяты из непрерывной клеточной линии.According to one specific embodiment of the methods described above, said cells are taken from a continuous cell line.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки СНО.In one specific embodiment of the methods described above, said cells are CHO cells.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.In one specific embodiment of the methods described above, the copper concentration is at least about 4 µg/L.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет от приблизительно от 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л.In one specific embodiment of the methods described above, the copper concentration is from about 2.4 µg/L to about 20 µg/L.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.In one specific embodiment of the methods described above, the recombinant vWF protein has a specific ristocetin cofactor activity of at least about 50 IU/µg.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.In one specific embodiment of the methods described above, the recombinant vWF protein has a specific ristocetin cofactor activity of about 30 IU/µg to about 100 IU/µg.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF содержит приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.In one specific embodiment of the methods described above, the recombinant vWF protein contains about 14 to about 22 dimers.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает высокомолекулярный рекомбинантный белок vWF, получаемый при помощи процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок vWF; и b) экспрессии белка vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный белок vWF представляет собой высокомультимерный белок vWF и обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.According to one aspect, the present invention provides a high molecular weight recombinant vWF protein obtained by a process comprising the steps of: a) providing a culture of cells containing a nucleic acid encoding a recombinant vWF protein; and b) expressing the vWF protein in said cells under cell culture conditions comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least 2.4 μg/L and a cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than 10 mM, wherein said the vWF protein is a highly multimeric vWF protein and has a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/µg.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rVWF рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.In one specific embodiment of the rVWF compositions described above, the recombinant vWF protein has a specific ristocetin cofactor activity of at least about 50 IU/μg.
- 45 041947- 45 041947
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rVWF рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.In one specific embodiment of the rVWF compositions described above, the recombinant vWF protein has a specific ristocetin cofactor activity of about 30 IU/µg to about 100 IU/µg.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rVWF рекомбинантный белок vWF содержит приблизительно от 14 до приблизительно 22 димеров.In one specific embodiment of the rVWF compositions described above, the recombinant vWF protein contains from about 14 to about 22 dimers.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF, при этом указанный раствор культуры клеток включает среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок vWF, причем указанный белок vWF содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладает удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.In one aspect, the present invention provides a cell culture solution for producing a high molecular weight recombinant vWF protein, said cell culture solution comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 µg/L; cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than 10 mM; and a plurality of cells expressing a highly multimeric vWF protein, wherein said vWF protein contains from about 14 to about 22 dimers and has a specific ristocetin activity of at least about 30 mU/μg.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного vWF, находящегося в высокомультимерной форме с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH4 +). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью.In one aspect, the present invention relates to cell culture conditions for producing recombinant high molecular weight vWF in a high multimeric form with high specific activity. Cell culture conditions according to the present invention may include, for example, a cell culture medium with a high concentration of copper and a cell culture supernatant with a low concentration of ammonium (NH 4 + ). The present invention also provides methods for culturing cells under cell culture conditions to express high molecular weight vWF with high specific activity.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение включает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, содержащего среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные vWF, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров, и обладающие удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному из вариантов реализации описанных выше растворов культур клеток по меньшей мере 10% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или а соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно определенным вариантам реализации клетки могут быть взяты из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетинкофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.According to one aspect, the present invention includes a cell culture solution for producing high molecular weight recombinant vWF comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 µg/L; cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than 10 mM; and a plurality of cells expressing high multimeric vWFs containing from about 14 to about 22 dimers and having a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/µg. In one embodiment of the cell culture solutions described above, at least 10% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In a specific embodiment, at least 15% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 20% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 25% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 30% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In certain embodiments, the copper concentration may be at least about 4 μg/l, or the copper concentration may vary from about 2.4 μg/l to about 20 μg/l. In some embodiments, the cell culture media comprise a media supplement containing copper. In certain embodiments, said media additive may contain a hydrolyzate or a copper salt, a copper chelate, or combinations thereof. In some embodiments, said copper salt may include copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, or copper oxide. In certain embodiments, the cells may be from a continuous cell line and may include mammalian cells such as CHO cells. In some embodiments, said recombinant vWF has a specific ristocetin cofactor activity of at least about 50 mU/µg, or a specific ristocetin cofactor activity can vary from about 30 mU/µg to about 100 mU/µg.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение включает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, включающий а) обеспечение культуры клеток; b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и, d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительной до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации супернатанта культуры клеток, описанной выше, по меньшей мере 10% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации поAccording to another aspect, the present invention includes a method for obtaining high molecular weight recombinant vWF, including a) providing a cell culture; b) introducing a nucleic acid sequence encoding vWF; c) selecting cells carrying said nucleic acid sequence; and d) effecting vWF expression in said cells under cell culture conditions comprising cell culture medium containing copper at a concentration of at least about 2.4 μg/L and cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than about 10 mM wherein said vWF is a high multimeric vWF containing from about to about 22 dimers and having a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/µg. In one embodiment of the cell culture supernatant described above, at least 10% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In a specific embodiment, at least 15% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 20% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 25% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. According to another particular implementation of
- 46 041947 меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки, которые могут быть взяты из непрерывной клеточной линии, могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди.- 46 041947 at least 30% of rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In some embodiments, cells that may be from a continuous cell line may include mammalian cells such as CHO cells. In certain embodiments, the copper concentration may be at least about 4 μg/l, or the copper concentration may vary from about 2.4 μg/l to about 20 μg/l. In some embodiments, the cell culture media comprise a copper-containing media supplement. In certain embodiments, said media additive may contain a copper hydrolyzate or salt, a copper chelate, or combinations thereof. In some embodiments, said copper salt may include copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, or copper oxide.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.In some embodiments, said recombinant vWF has a specific ristocetin cofactor activity of at least about 50 mU/µg, or the specific ristocetin cofactor activity can range from about 30 mU/µg to about 100 mU/µg.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение охватывает высокомолекулярный рекомбинантный vWF, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток; b) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации описанного выше супернатанта культуры клеток по меньшей мере 10% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки могут быть из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо указанная удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.According to another aspect, the present invention encompasses a high molecular weight recombinant vWF obtained by a process comprising the steps of: a) providing a cell culture; b) introducing a nucleic acid sequence encoding vWF; c) selecting cells carrying said nucleic acid sequence; and d) expressing vWF in said cells under cell culture conditions comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least 2.4 μg/L and a cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than 10 mM, said vWF is a highly multimeric vWF containing from about 14 to about 22 dimers and having a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/μg. In one embodiment of the cell culture supernatant described above, at least 10% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In a specific embodiment, at least 15% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 20% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 25% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 30% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In some embodiments, the cells may be from a continuous cell line and may include mammalian cells such as CHO cells. In certain embodiments, the copper concentration may be at least about 4 μg/l, or the copper concentration may vary from about 2.4 μg/l to about 20 μg/l. In some embodiments, the cell culture media comprise a media supplement containing copper. In certain embodiments, said media additive may contain a copper hydrolyzate or salt, a copper chelate, or combinations thereof. In some embodiments, said copper salt may include copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, or copper oxide. In some embodiments, said recombinant vWF has a specific ristocetin cofactor activity of at least about 50 mU/µg, or said specific ristocetin cofactor activity can range from about 30 mU/µg to about 100 mU/µg.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), обладающий удельной ристоцетинкофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг. согласно еще более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг.In one aspect, the present invention provides a composition comprising a recombinant von Willebrand factor (rVWF) having a specific ristocetin cofactor activity of at least 30 IU/μg. In a preferred embodiment, said composition has a specific ristocetin cofactor activity of at least 40 IU/μg. In a more preferred embodiment, said composition has a specific ristocetin cofactor activity of at least 50 IU/μg. In a more preferred embodiment, said composition has a specific ristocetin cofactor activity of at least 60 IU/µg. In a more preferred embodiment, said composition has a specific ristocetin cofactor activity of at least 70 IU/μg. in an even more preferred embodiment, said composition has a specific ristocetin cofactor activity of at least 80 IU/µg.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций по меньшей мере 10% rVWF в указанной композиции присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Со- 47 041947 гласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров.In one embodiment of the above compositions, at least 10% of the rVWF in said composition is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In a specific embodiment, at least 15% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 20% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. In another specific embodiment, at least 25% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers. According to another specific embodiment, at least 30% of the rVWF is present as a high molecular weight VWF multimer of more than 10 dimers.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток СНО.According to one embodiment of the compositions described above, said composition contains a culture supernatant. In one specific embodiment, said culture supernatant is a mammalian cell culture supernatant. In a more specific embodiment, said mammalian cell culture supernatant is a CHO cell supernatant.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, rVWF экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 2,4 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2,4 мкг/л до 20 мкг/л меди. Согласно одному из вариантов реализации медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.According to one embodiment of the above compositions, rVWF is expressed in a cell culture containing at least 2.4 μg/l of copper. According to a specific implementation variant of the specified cell culture contains at least 4 μg/l of copper. According to a more specific implementation variant of the specified culture contains from 2.4 µg/l to 20 µg/l copper. In one embodiment, the copper is in the form of a copper salt, a copper chelate, or a combination thereof. In a particular embodiment, said copper salt is selected from the group consisting of copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate, and copper oxide.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.According to one embodiment of the above compositions, said cell culture is a batch culture.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.According to one embodiment of the above compositions, said cell culture is a continuous culture. According to a specific implementation variant of the specified continuous cultivation is performed in chemostatic mode. According to another specific implementation variant of the specified continuous cultivation is performed in perfusion mode.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4+ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.According to one embodiment of the above compositions, the NH4+ level in said culture is maintained below 4 mM.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл.According to one embodiment of the above compositions, the cell density in culture is maintained at a level of less than 2.5x10 6 cells/ml.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл.According to one embodiment of the above compositions, the cell density in culture is maintained at a level of less than 2.0 x 10 6 cells/ml.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную культуру поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл.According to one embodiment of the above compositions, said culture is maintained at a level of less than 1.5 x 10 6 cells/ml.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, rVWF коэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации большую часть коэкспрессируемого rFVIII удаляют. Согласно более конкретному варианту реализации отношение rVWF к rFVIII в указанной композиции составляет по меньшей мере 10:1.According to one embodiment of the above compositions, rVWF is co-expressed with recombinant factor VIII (rFVIII). In a specific embodiment, most of the co-expressed rFVIII is removed. In a more specific embodiment, the ratio of rVWF to rFVIII in said composition is at least 10:1.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.According to one embodiment of the above compositions, said composition is in a form for pharmaceutical administration. According to a specific implementation variant of the specified composition receive in the form for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.According to one embodiment of the above compositions, said composition is lyophilized.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение включает высокомолекулярный рекомбинантный vWF, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток; b) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Очевидно, что здесь могут применяться все варианты реализации и концентрации, описанные в разделах Среды для клеточных культур и Способы получения рекомбинантного vWF выше.According to another aspect, the present invention includes a high molecular weight recombinant vWF obtained through a process comprising the steps of: a) providing a cell culture; b) introducing a nucleic acid sequence encoding vWF; c) selecting cells carrying said nucleic acid sequence; and d) expressing vWF in said cells under cell culture conditions comprising a cell culture medium containing copper at a concentration of at least 2.4 μg/L and a cell culture supernatant containing ammonium at a concentration of less than 10 mM, wherein said vWF is a high multimeric vWF containing from about 14 to about 22 dimers and having a specific ristocetin activity of at least about 30 IU/µg. Obviously, all embodiments and concentrations described in the Cell Culture Media and Methods for Producing Recombinant vWF sections above can be used here.
Рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению может включать высокомолекулярный рекомбинантный белок vWF, обладающий высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации vWF согласно настоящему изобретению представляет собой высокомультимерную форму vWF. Согласно некоторым вариантам реализации указанная высокомультимерная форма vWF содержит по меньшей мере до приблизительно 14 димеров, а согласно другим вариантам реализации - по меньшей мере до приблизительно 22 димера. Согласно другим вариантам реализации высокомультимерная форма vWF может варьировать от приблизительно 10 до приблизительно 20 димеров, или от приблизительно 15 до приблизительно 25 димеров, или от приблизительно 20 до приблизительно 40 димеров. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный vWF сопоставим с vWF плазмы.The recombinant vWF of the present invention may include a high molecular weight recombinant vWF protein having a high specific activity. In one embodiment, the vWF of the present invention is a high multimeric form of vWF. In some embodiments, said high multimeric form of vWF contains at least up to about 14 dimers, and in other embodiments, at least up to about 22 dimers. In other embodiments, the high multimeric form of vWF may range from about 10 to about 20 dimers, or from about 15 to about 25 dimers, or from about 20 to about 40 dimers. In certain embodiments, recombinant vWF is comparable to plasma vWF.
Согласно приведенному в настоящем изобретении описанию в соответствии с настоящим изобретением получен неожиданный результат, состоящий в том, что повышенная концентрация меди в культуре клеток среды позволяет получать высокомолекулярный vWF с высокой удельной активностью. Среды для клеточных культур, содержащие медь в концентрации, например, выше, чем приблизительноAccording to the description given in the present invention, in accordance with the present invention, an unexpected result is obtained, namely, that an increased concentration of copper in the cell culture medium allows the production of high molecular weight vWF with high specific activity. Cell culture media containing copper at concentrations greater than, for example,
- 48 041947- 48 041947
2,4 мкг/л, могут повышать выход рекомбинантного мультимерного vWF по сравнению с не содержащими медь средами. Согласно определенным вариантам реализации процент мультимерного vWF (т.е. rVWF, содержащего по меньшей мере 2 димера) может быть выше, чем приблизительно 50%, или выше, чем приблизительно 75%, или выше, чем приблизительно 90%. Уровень мультимеризации vWF может быть проанализирован с применением стандартных техник, таких как, например, in электрофорез в агарозе в невосстанавливающих условиях.2.4 µg/L may increase the yield of recombinant multimeric vWF compared to copper-free media. In certain embodiments, the percentage of multimeric vWF (ie, rVWF containing at least 2 dimers) may be higher than about 50%, or higher than about 75%, or higher than about 90%. The level of vWF multimerization can be analyzed using standard techniques such as, for example, in agarose electrophoresis under non-reducing conditions.
Согласно настоящему изобретению рекомбинантный vWF, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать высокой удельной активностью, например, высокой удельной ристоцетин-кофакторной активностью. Согласно одному из вариантов реализации рекомбинантный vWF, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг, а согласно другому варианту реализации - по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно другим вариантам реализации удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг или от приблизительно 50 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.According to the present invention, recombinant vWF obtained using the methods of the present invention may have a high specific activity, for example, a high specific ristocetin cofactor activity. In one embodiment, the recombinant vWF produced using the methods of the present invention may have a specific ristocetin cofactor activity of at least 30 mU/µg, and in another embodiment, at least 50 mU/µg. In other embodiments, the specific ristocetin cofactor activity may range from about 30 IU/µg to about 100 IU/µg, or from about 50 IU/µg to about 100 IU/µg.
В. Рекомбинантный ADAMTS13 (rA13).B. Recombinant ADAMTS13 (rA13).
Белки ADAMTS (т.е. ADAMTS-1-ADAMTS-20) представляют собой семейство секретируемых цинковых металлопротеиназ, имеющих общую модулярную доменную организацию (для ознакомления см. Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1; 11:544-69). Все белки ADAMTS имеют общее строение центрального домена, состоящего из сигнального пептида, за которым следует продомен, цинк-зависимый металлопротеиназный каталитический домен, дезинтегрин-подобный домен, повтор тромбоспондина типа I, цистеин-богатый домен и спейсерный домен (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):314937). Помимо этого, все они, кроме ADAMTS-4, содержат по меньшей мере еще один домен повтора тромбоспондина типа I, и многие из белков ADAMTS содержат один или более дополнительный вспомогательный домен. В частности, сообщалось, что все белки ADAMTS, по всей видимости, содержат по меньшей мере один кальций-связывающий сайт и по меньшей мере один цинк-связывающий сайт, расположенные внутри металлопротеиназного каталитического домена (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pp 881-888).The ADAMTS proteins (i.e., ADAMTS-1-ADAMTS-20) are a family of secreted zinc metalloproteinases that share a common modular domain organization (for reference, see Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1; 11:544-69). All ADAMTS proteins share a common structure of a central domain consisting of a signal peptide followed by a prodomain, a zinc-dependent metalloproteinase catalytic domain, a disintegrin-like domain, a type I thrombospondin repeat, a cysteine-rich domain, and a spacer domain (Apte S.S., J Biol Chem 2009 Nov 13;284(46):314937). In addition, all except ADAMTS-4 contain at least one more type I thrombospondin repeat domain, and many of the ADAMTS proteins contain one or more additional accessory domains. In particular, it has been reported that all ADAMTS proteins appear to contain at least one calcium binding site and at least one zinc binding site located within the metalloproteinase catalytic domain (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4(3), pp. 881-888).
Описана биологическая роль белков ADAMTS при различных заболеваниях и состояниях, включая антиангиогенез, интерстициальный фиброз почек, перестройку костной ткани, фолликулогенез в яичниках, атеросклероз, развитие мочеполовой системы и рост/ремоделирование опухолей (ADAMTS-1); синдром Элерса-Данлоса типа 7С и бычий дерматоспараксис (ADAMTS-2); артрит, атеросклероз и тендинопатия (ADAMTS-4); артрит и глиобластома (ADAMTS-5); артрит (ADAMTS-7); антиангиогенез, злокачественные новообразования мозга, артрит и атеросклероз (ADAMTS-8); артрит (ADAMTS-9, -12); тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ADAMTS-13); и антитромбоз/инсульт (ADAMTS 18) (для ознакомления см. Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131).The biological role of ADAMTS proteins in various diseases and conditions has been described, including anti-angiogenesis, renal interstitial fibrosis, bone remodeling, ovarian folliculogenesis, atherosclerosis, genitourinary development, and tumor growth/remodeling (ADAMTS-1); Ehlers-Danlos syndrome type 7C and bovine dermatosparaxis (ADAMTS-2); arthritis, atherosclerosis and tendinopathy (ADAMTS-4); arthritis and glioblastoma (ADAMTS-5); arthritis (ADAMTS-7); antiangiogenesis, malignant neoplasms of the brain, arthritis and atherosclerosis (ADAMTS-8); arthritis (ADAMTS-9, -12); thrombotic thrombocytopenic purpura (ADAMTS-13); and antithrombosis/stroke (ADAMTS 18) (for review, see Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131).
Рекомбинантный ADAMTS 13 (A13) экспрессировали в клетках млекопитающих и прежде, однако удельная активность широко варьирует в зависимости от условий культивирования клеток. Было обнаружено, что многие коммерчески доступные культуральные среды непригодны для экспрессии rA13 с высокой удельной активностью, выражаемой как отношение активности, измеренной посредством анализа FRETS-VWF73, к содержанию антигена, согласно оценке с применением ELISA. Согласно одному аспекту способы, предложенные согласно настоящему изобретению, основаны на нескольких полезных открытиях, позволяющих осуществлять экспрессию в культуре клеток белка rA13, обладающего повышенными уровнями общей и удельной активности.Recombinant ADAMTS 13 (A13) has been expressed in mammalian cells before, but specific activity varies widely depending on cell culture conditions. Many commercially available culture media have been found to be unsuitable for expressing rA13 with high specific activity expressed as the ratio of activity measured by the FRETS-VWF73 assay to antigen content as assessed using ELISA. In one aspect, the methods of the present invention are based on several useful discoveries that allow expression in cell culture of the protein rA13, which has increased levels of total and specific activity.
Соответственно, благодаря общим структурно-функциональным связям семейства ADAMTS секретируемых металлопротеиназ, предлагаемые согласно настоящему изобретению способы позволяют экспрессировать в культуре клеток и выделять из клеточной среды все белки ADAMTS.Accordingly, due to the common structural-functional relationships of the ADAMTS family of secreted metalloproteinases, the methods of the present invention allow all ADAMTS proteins to be expressed in cell culture and isolated from the cellular environment.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный ADAMTS 13 (rA13), обладающий удельной FRETS-VWF активностью, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.In one aspect, the present invention provides a composition comprising recombinant ADAMTS 13 (rA13) having a specific FRETS-VWF activity of at least 1600 IU/μg.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанный rA13 обладает удельной FRETS-VWF активностью, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.According to one embodiment of the above compositions, said rA13 has a specific FRETS-VWF activity of at least 800 IU/μg.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно конкретному варианту реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток СНО.According to one embodiment of the compositions described above, said composition contains a culture supernatant. In a particular embodiment, said culture supernatant is a mammalian cell culture supernatant. In a more specific embodiment, said mammalian cell culture supernatant is a CHO cell supernatant.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанный rA13 экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 1 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2 до 20 мкг/л меди.In one embodiment of the compositions described above, said rA13 is expressed in a cell culture containing at least 1 μg/L of copper. According to a specific implementation variant of the specified cell culture contains at least 2 μg/l of copper. According to a more specific implementation variant of the specified culture contains from 2 to 20 μg/l of copper.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная сольIn one embodiment of the compositions described above, the copper is in the form of a copper salt, a copper chelate, or a combination thereof. In a particular embodiment, said salt
- 49 041947 меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрата меди и оксида меди.- 49 041947 copper is selected from the group consisting of copper sulfate, copper acetate, copper carbonate, copper chloride, copper hydroxide, copper nitrate and copper oxide.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.According to one embodiment of the above compositions, said cell culture is a batch culture.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.According to one embodiment of the above compositions, said cell culture is a continuous culture. According to a specific implementation variant, continuous cultivation is performed in a chemostatic mode. According to another specific implementation variant, continuous cultivation is performed in perfusion mode.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4 + в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 5 мМ.According to one embodiment of the above compositions, the level of NH 4 + in said culture is maintained at a concentration below 5 mM.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4 + в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.According to one embodiment of the above compositions, the level of NH 4 + in said culture is maintained at a concentration below 4 mM.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 4,0х106 клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 3,0х106 клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл.According to one embodiment of the compositions described above, the cell density in culture is maintained at a level of less than 4.0x10 6 cells/ml. In a specific embodiment, the cell density in the culture is maintained at less than 3.0 x 10 6 cells/mL. In a specific embodiment, the cell density in the culture is maintained at less than 2.0 x 10 6 cells/mL. In a more specific embodiment, cell density in culture is maintained at less than 1.5 x 10 6 cells/mL.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.According to one embodiment of the above compositions, said composition is in a form for pharmaceutical administration. According to a specific implementation variant of the specified composition receive in the form for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.According to one embodiment of the above compositions, said composition is lyophilized.
V. Составы.V. Compositions.
Согласно одному аспекту составы, содержащие рекомбинантные терапевтические белки rVWF или rA13 согласно настоящему изобретению, лиофилизируют перед введением. Лиофилизация проводится с применением общеизвестных в данной области техники методик и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:2439 (1996)].In one aspect, formulations containing the recombinant rVWF or rA13 therapeutic proteins of the present invention are lyophilized prior to administration. Lyophilization is carried out using techniques well known in the art and must be optimized for the formulation being developed [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) and Chang et al., Pharm Res. 13:2439 (1996)].
Способы получения фармацевтических составов может включать один или более следующий этап: добавление стабилизирующего агента согласно описанию в настоящем изобретении к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из объемообразующего агента, регулирующего осмолярность агента и ПАВ, каждый из которых соответствует приведенному в настоящем изобретении описанию, к указанной смеси перед лиофилизацией. Лиофилизированный состав состоит, согласно одному аспекту, по меньшей мере из чего-либо одного или более из: буфера, объемообразующего агента и стабилизатора. Согласно этому аспекту оценивают полезность поверхностноактивного вещества и используют его в случаях, когда слипание на этапе процесса лиофилизации или восстановления представляет собой проблему. Для поддержания стабильности рН состава во время лиофилизации вводят подходящий буферизирующий агент.Methods for preparing pharmaceutical compositions may include one or more of the following steps: adding a stabilizing agent as described in the present invention to said mixture prior to lyophilization, adding at least one agent selected from a bulking agent, an osmolarity regulating agent, and a surfactant, each of which is as given in the present invention description, to the specified mixture before lyophilization. The lyophilized formulation consists, in one aspect, of at least one or more of a buffer, a bulking agent, and a stabilizer. According to this aspect, the usefulness of the surfactant is evaluated and used in cases where sticking during the lyophilization or reconstitution process step is a problem. A suitable buffering agent is added to maintain the pH stability of the formulation during lyophilization.
Стандартный способ восстановления лиофилизированного материала заключается в повторном добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (WFI) (как правило, эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя при получении фармацевтиков для парентерального введения иногда применяют разбавленные растворы антибактериальных агентов [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предложены способы получения восстановленных композиций рекомбинантного VWF, включающие этап добавления разбавителя к лиофилизированной композиции рекомбинантного VWF согласно настоящему изобретению.The standard way to reconstitute lyophilized material is to re-add a volume of pure water or sterile water for injection (WFI) (generally equivalent to the volume removed during lyophilization), although dilute solutions of antibacterial agents are sometimes used in the preparation of parenteral pharmaceuticals [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Accordingly, methods are provided for preparing reconstituted recombinant VWF compositions comprising the step of adding a diluent to a lyophilized recombinant VWF composition of the present invention.
Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Различные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многодозового применения или вода с подходящим количеством поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для получения водных суспензий). Согласно различным аспектам такие вспомогательные вещества представляют собой суспендирующие агенты, например, и без ограничения, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой встречающиеся в природе фосфатиды, например, и без ограничения, лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, и без ограничения, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, и без ограничения, гептадекаэтил-еноксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такими как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, и без ограничения, такими как полиэтиленсорбитанмоноолеат. Согласно различнымThe lyophilized material may be reconstituted as an aqueous solution. Various aqueous vehicles, for example, sterile water for injection, water with preservatives for multi-dose use, or water with a suitable amount of surfactants (for example, an aqueous suspension that contains the active compound in admixture with excipients suitable for the preparation of aqueous suspensions). In various aspects, such excipients are suspending agents, for example, and without limitation, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, gum tragacanth, and gum arabic; dispersing or wetting agents are naturally occurring phosphatides, for example, and without limitation, lecithin, or alkylene oxide condensates with fatty acids, for example, and without limitation, polyoxyethylene stearate, or ethylene oxide condensates with long chain aliphatic alcohols, for example, and without limitation, heptadecaethyl -enoxycetanol, or condensates of ethylene oxide with partial esters derived from fatty acids and hexitol, such as polyoxyethylene sorbitan monooleate, or condensates of ethylene oxide with partial esters derived from fatty acids and hexitan anhydrides, for example, and without limitation, such as polyethylene sorbitan monooleate. According to different
- 50 041947 аспектам указанные водные суспензии также содержат один или более консервант, например, и без ограничения, этил, или н-пропил, п-гидроксибензоат.- 50 041947 aspects, these aqueous suspensions also contain one or more preservatives, for example, and without limitation, ethyl or n-propyl, p-hydroxybenzoate.
Для введения композиций человеку или экспериментальным животным, согласно одному аспекту, указанные композиции содержат один или более фармацевтически приемлемый носитель. Выражения фармацевтически или фармакологически приемлемый относятся к молекулярным субстанциям и композициям, которые стабильны, подавляют разложение белков, например, агрегацию и продукты расщепления, и, кроме того, не вызывают аллергических или другие нежелательных реакций при введении с применением путей, общеизвестных в данной области техники, согласно приведенному ниже описанию. Фармацевтически приемлемые носители включают любые и все из клинически полезных растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и т.п, включая агенты, описанные выше.For administration of the compositions to humans or experimental animals, in one aspect, said compositions comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers. The terms pharmaceutically or pharmacologically acceptable refer to molecular entities and compositions that are stable, inhibit protein degradation such as aggregation and cleavage products, and furthermore do not cause allergic or other undesirable reactions when administered using routes well known in the art, according to the description below. Pharmaceutically acceptable carriers include any and all of the clinically useful diluents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like, including those described above.
Указанные фармацевтические составы вводят внутривенно, перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляции, вагинально, ректально или путем внутричерепной инъекции. Используемый в настоящем изобретении термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или инфузионные техники. Также включено введение путем внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретный участок. Как правило, композиции по существу не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.These pharmaceutical compositions are administered intravenously, orally, topically, transdermally, parenterally, by inhalation, vaginally, rectally or by intracranial injection. As used herein, the term parenteral includes subcutaneous injections, intravenous, intramuscular, intracisternal injections, or infusion techniques. Also included is administration by intravenous, intradermal, intramuscular, intramammary, intraperitoneal, intrathecal, retrobulbar, intrapulmonary injection and/or surgical implantation at a specific site. As a rule, the compositions are essentially free of pyrogens, as well as other impurities that may be harmful to the recipient.
Однократное или многократное введение указанных композиций выполняют с применением дозировок и схем, выбранных лечащим врачом. Подходящая для предотвращения или лечения заболевания дозировка зависит от типа заболевания, лечение которого проводят, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли лекарственное средство с профилактической или терапевтической целью, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на лекарственное средство, и на основании выбора лечащего врача.Single or multiple administration of these compositions is performed using dosages and regimens selected by the attending physician. The appropriate dosage for preventing or treating a disease depends on the type of disease being treated, the severity and course of the disease, whether the drug is being administered prophylactically or therapeutically, on prior therapy, the patient's medical history and drug response, and based on choice of physician.
Согласно одному аспекту составы согласно настоящему изобретению вводят сначала в виде болюса, а затем следует непрерывная инфузия для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. В другом примере соединение согласно настоящему изобретению вводят в виде однократной дозы. Специалисты в данной области техники смогут легко оптимизировать эффективные дозировки и схемы введения в соответствии с надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием пациента. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальный фармацевтический состав определяет специалист в данной области техники в зависимости от пути введения и требуемой дозировки. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), стр. 1435-1712, включенные в настоящее изобретение посредством ссылки. Такие составы влияют на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo введенных агентов. В зависимости от путь введения подходящую дозу вычисляют в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размером органа. Подходящие дозировки могут быть уточнены посредством стандартных способов определения уровней дозы в крови в сочетании с подходящими данными о зависимости доза-эффект. Окончательный режим дозирования определяет лечащий врач с учетом различных факторов, модифицирующих действие лекарственных средств, например, удельной активности лекарственного средства, тяжести поражения и отклика пациента, возраста, состояния, массы тела, пола и рациона питания пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и других клинических факторов. Например, типичная доза рекомбинантного vWF согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 50 Е/кг, что равно 500 мкг/кг. По мере проведения исследований появляется дополнительная информация относительно подходящих уровней дозировок и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.In one aspect, the formulations of the present invention are administered first as a bolus followed by a continuous infusion to maintain therapeutic circulating drug product levels. In another example, a compound of the present invention is administered as a single dose. Those skilled in the art will readily be able to optimize effective dosages and administration schedules in accordance with good medical practice and the clinical condition of the patient. The frequency of dosing depends on the pharmacokinetic parameters of the agents and the route of administration. The optimal pharmaceutical composition is determined by a person skilled in the art depending on the route of administration and the desired dosage. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), pp. 1435-1712, incorporated herein by reference. Such formulations affect the physical condition, stability, in vivo release rate, and in vivo clearance rate of the administered agents. Depending on the route of administration, a suitable dose is calculated according to body weight, body surface area or organ size. Appropriate dosages can be ascertained by standard methods of determining blood dose levels in conjunction with appropriate dose-response data. The final dosing regimen is determined by the attending physician, taking into account various factors that modify the effect of drugs, for example, the specific activity of the drug, the severity of the lesion and the response of the patient, the age, condition, body weight, sex and diet of the patient, the severity of any infection, the time of administration, and others. clinical factors. For example, a typical dose of recombinant vWF according to the present invention is approximately 50 U/kg, which is equal to 500 μg/kg. As research progresses, additional information is emerging regarding appropriate dosage levels and duration of treatment for various diseases and conditions.
VI. Способы лечения.VI. Methods of treatment.
Настоящее изобретение также охватывает способы лечения пациента, нуждающегося в rVWF или rA13, полученных согласно способам, описанным в настоящем изобретении. Такие способы лечения могут включать введение фармацевтических составов, содержащих рекомбинантный rA13 или высокомолекулярный рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению.The present invention also encompasses methods of treating a patient in need of rVWF or rA13 obtained according to the methods described in the present invention. Such methods of treatment may include the introduction of pharmaceutical compositions containing recombinant rA13 or high molecular weight recombinant vWF according to the present invention.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способы терапевтического или профилактического лечения, включающие введение композиции rVWF или rA13, предложенной в настоящем изобретении. Как правило, для терапевтического применения составы вводят пациенту с заболеванием или состоянием, связанным с дисфункцией ADAMTS13 или VWF, или нуждающемуся в этом по иной причинам, в терапевтически эффективной дозе. Составы и количества, эффективные для указанного применения, зависят от тяжести указанного заболевания или состояния, и от общего состояния здоровья пациента. В зависимости от дозировки и частоты, требуемых и переносимых пациентом, может осуществляться однократное или многократное введение указанных составов.According to another aspect, the present invention provides methods of therapeutic or prophylactic treatment, comprising the introduction of the composition of rVWF or rA13 proposed in the present invention. Typically, for therapeutic use, the formulations are administered to a patient with a disease or condition associated with dysfunction of ADAMTS13 or VWF, or otherwise in need thereof, at a therapeutically effective dose. Formulations and amounts effective for said use will depend upon the severity of said disease or condition, and upon the general health of the patient. Depending on the dosage and frequency required and tolerated by the patient, a single or multiple administration of these formulations may be carried out.
Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с дисфункцией ADAMTS13 или VWF. Согласно дальнейшему варианту реализации фармацевтические составы, содерIn one embodiment, the present invention provides methods for treating or preventing diseases or conditions associated with ADAMTS13 or VWF dysfunction. According to a further embodiment, pharmaceutical formulations containing
- 51 041947 жащие рекомбинантный vWF, могут вводиться для лечения заболеваний, связанных с vWF, таких как болезнь Виллебранда или гемофилия. Согласно другому варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, включающие введение композиции rA13, предложенной в настоящем изобретении. Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способы разрушения одного или более тромба у нуждающегося в этом пациента. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения инфаркта у нуждающегося в этом пациента. Как правило, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы включают введение композиции rADAMTS13 согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом пациенту.- 51 041947 harvesting recombinant vWF, can be administered to treat diseases associated with vWF, such as von Willebrand's disease or hemophilia. In another embodiment, the present invention provides methods for treating or preventing diseases or conditions associated with the formation and/or presence of one or more thrombi, comprising administering an rA13 composition of the present invention. In another embodiment, the present invention provides methods for disrupting one or more thrombi in a patient in need thereof. In other embodiments, the present invention provides methods for treating or preventing a heart attack in a patient in need thereof. Generally, the methods of the present invention comprise administering a rADAMTS13 composition of the present invention to a patient in need thereof.
Неограничивающими примерами расстройств, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, являются наследственная тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП), приобретенная ТТП, артериальный тромбоз, острый инфаркт миокарда (ОИМ), инсульт, сепсис и диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС).Non-limiting examples of disorders associated with the formation and/or presence of one or more thrombi are hereditary thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), acquired TTP, arterial thrombosis, acute myocardial infarction (AMI), stroke, sepsis, and disseminated intravascular coagulation (DIC).
Неограничивающие примеры расстройств, связанных с инфарктом, включают без ограничения инфаркт миокарда (сердечный приступ), эмболию легких, цереброваскулярные нарушения, такие как инсульт, окклюзионная болезнь периферических артерий (например, гангрена), антифосфолипидный синдром, сепсис, гигантоклеточный артериит (ГКА), грыжа и заворот кишок.Non-limiting examples of disorders associated with a heart attack include, but are not limited to, myocardial infarction (heart attack), pulmonary embolism, cerebrovascular disorders such as stroke, peripheral arterial occlusive disease (eg, gangrene), antiphospholipid syndrome, sepsis, giant cell arteritis (GCA), hernia and volvulus.
VII. Примеры.VII. Examples.
Настоящее изобретение будет также проиллюстрировано следующими примерами, не ограничиваясь ими.The present invention will also be illustrated by the following examples, without being limited to them.
Пример 1.Example 1
Эксперименты с непрерывной культурой клеток проводили с применением культуры рекомбинантной клеточной линии СНО, экспрессирующей vWF. Основная среда представляла собой DMEM/F12, содержащую приблизительно 0,3 мкг/л Cu2+. В указанную среду был добавлен соевый гидролизат и сульфат меди (CuSO4-5H2O) с получением конечной концентрации меди в среде выше, чем по меньшей мере 2,4 мкг/л.Continuous cell culture experiments were performed using a culture of a recombinant CHO cell line expressing vWF. The main medium was DMEM/F12 containing approximately 0.3 μg/l Cu 2+ . Soy hydrolyzate and copper sulfate (CuSO 4 -5H 2 O) were added to this medium to produce a final copper concentration in the medium greater than at least 2.4 µg/l.
Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие vWF, культивировали в непрерывной клеточной культуре таким образом, что уровни аммония (NH4 +) находились на уровне концентрации менее чем приблизительно 10 мМ. Было обнаружено, что системы производства, обеспечивающие непрерывное поступление среды (например, перфузионные или хемостатические культуры) предпочтительны, так как стандартные техники периодических или подпитываемых культур приводят к высоким концентрациям NH4 + в конце культивирования. В конце культивирования выделяли высокомультимерный vWF и измеряли удельную ристоцетин-кофакторную активность vWF.Recombinant CHO cells expressing vWF were cultured in continuous cell culture such that ammonium (NH 4 + ) levels were at a concentration level of less than about 10 mM. It has been found that continuous media production systems (eg, perfusion or chemostatic cultures) are preferred because standard batch or fed-batch culture techniques result in high NH 4 + concentrations at the end of culture. At the end of cultivation, the highly multimeric vWF was isolated and the specific ristocetin-cofactor activity of vWF was measured.
Пример 2.Example 2
Рекомбинантный фактор VIII (rFVIII) и фактор фон Виллебранда (rVWF) коэкспрессировали в периодических культурах клеток GD8/6 для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность VWF. Вкратце, клетки GD8/6 культивировали в непрерывном режиме в среде BAV-SP, состоящей из порошка модифицированной основной среды DMEM/F12 (табл. 5) и дополнительных добавок, также содержащих 4 г/л соевого гидролизата, см. табл. 6, с добавлением или без добавления дополнительной меди. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность rVWF использовали основные BAV-SP среды. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что добавляло еще 0,7 мкг/л меди, как было установлено экспериментально, с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в среды BAV-SP, используемые для периодических культур, также добавляли дополнительно 3,3 мкг/л Cu2+, что давало конечную концентрацию меди 4,3 мкг/л, для определения действия высоких концентраций меди на экспрессию и активность VWF.Recombinant factor VIII (rFVIII) and von Willebrand factor (rVWF) were co-expressed in batch GD8/6 cell cultures to determine the effect of culture medium composition on VWF expression and activity. Briefly, GD8/6 cells were cultured continuously in BAV-SP medium, consisting of a powder of modified DMEM/F12 basic medium (Table 5) and additional supplements also containing 4 g/l soy hydrolysate, see Table. 6, with or without the addition of additional copper. Basic BAV-SP media were used to study the effect of low copper concentrations on rVWF expression and activity. These basic media contained 0.3 µg/l copper and added soy hydrolyzate, which added an additional 0.7 µg/l copper, which was experimentally determined to give a final copper concentration of 1.0 µg/l. For comparison, BAV-SP media used for batch cultures were also supplemented with an additional 3.3 μg/l Cu 2+ , resulting in a final copper concentration of 4.3 μg/l, to determine the effect of high copper concentrations on VWF expression and activity.
- 52 041947- 52 041947
Таблица 5Table 5
Состав культуральных сред BAV-SPComposition of culture media BAV-SP
- 53 041947- 53 041947
Таблица 6Table 6
Состав добавки для BAV-SPAdditive composition for BAV-SP
Клетки GD8/6, экспрессирующие rVWF, культивировали либо в среде с низким содержанием меди (табл. 7), либо в среде с высоким содержанием меди (табл. 8) в течение 7 дней. Через 2 дня культуры пересевали для проведения периодического культивирования на протяжении 5 дней. Образцы указанного культур ального супернатанта ежедневно исследовали на содержание rVWF (vWF ELISA), общую (ристоцетин) и удельную (удельную активность) с применением ристоцетин-кофакторного анализа. Различные параметры культивирования, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрация аммония также отслеживали ежедневно (кроме дней периодического культивирования 3 и 4).GD8/6 cells expressing rVWF were cultured in either low copper medium (Table 7) or high copper medium (Table 8) for 7 days. After 2 days, the cultures were subcultured to carry out periodic cultivation for 5 days. Samples of this culture supernatant were tested daily for rVWF content (vWF ELISA), total (ristocetin) and specific (specific activity) using ristocetin cofactor analysis. Various culture parameters including cell count, cell viability and ammonium concentration were also monitored daily (except for batch culture days 3 and 4).
Неожиданно было обнаружено, что культуры клеток, росшие при высоких концентрациях меди, давали супернатанты, имеющие значительно более высокую общую и удельную rVWF-активность (ср. результаты в табл.7 и табл. 8). Например, на 4 день периодического культивирования культура клеток, росшая при высоких концентрациях меди, имела 1,52 ME rVWF активности/мл, по сравнению с 0,2 ME rVWF активности/мл для культуры с низким содержанием меди, несмотря на тот факт, что культура с низким содержанием меди клеток давала почти в два раза большее количество rVWF по сравнению с культурой клеток с высоким содержанием меди. Кроме того, удельная активность супернатанта, полученного из культуры с высоким содержанием меди, была более чем в 13 раз выше, чем у супернатанта культуры с низким содержанием меди (831 мЕ/10 мкг rVWF к 62 мЕ/10 мкг rVWF).Surprisingly, it was found that cell cultures grown at high concentrations of copper produced supernatants having significantly higher total and specific rVWF activity (cf. results in Table 7 and Table 8). For example, on day 4 of batch culture, a cell culture grown at high concentrations of copper had 1.52 IU rVWF activity/mL compared to 0.2 IU rVWF activity/mL for a low copper culture, despite the fact that the low copper cell culture yielded almost twice as much rVWF as the high copper cell culture. In addition, the specific activity of the supernatant derived from the high copper culture was more than 13 times higher than that of the low copper culture supernatant (831 IU/10 µg rVWF to 62 IU/10 µg rVWF).
Как видно из табл. 7 и 8, общая и удельная ристоцетин-кофакторная активность культуры с высоким содержанием меди была в два раза выше таковой культуры с низким содержанием меди, на 1 день периодического культивирования. Кроме того, в отличие от последующего увеличения активности, наблюдаемого в культуре с высоким содержанием меди, в культуре клеток с низким содержанием меди не было отмечено увеличения ристоцетин-кофакторной активности после 1 дня периодического культивирования. В соответствии с этим результатом анализ мультимерного статуса rVWF электрофорезом в агарозном геле показал, что в супернатанте культуры клеток с низким содержанием меди в 1-й день периодического культивирования присутствовала низкая относительно концентрации низкомолекулярных видов rVWF концентрация высокомолекулярного rVWF, и также что указанная относительная концентрация снижалась с течением времени (фиг. 1А и 1В). Напротив, добавление в культуральную среду Cu2+ стабильно приводило к образованию антигена с ристоцетин-кофакторной (RiCoF) активностью на протяжении четвертого дня. В соответствии с этим, уменьшения количества стабильных высокомолекулярных мультимеров rVWF в течение дня 4 периодической культуры не происходило (фиг. 1А и 1В). Результаты денситометрии агарозного электрофоретического геля, приведенные на фиг. 1В, показали, что при условии низкого уровня меди культура способна продуцировать только популяцию rVWF, более чем 10% rVWF которой (т.е. 16,3%) представлено молекулами из более чем 10 димеров, в течение одного дня периодического культивирования (т.е. образец дня 3 в 2 полосе агарозного геля на фиг. 1 А); примечательно, что эта популяция опускалась до всего лишь 4% на день 5 периодического культивирования (образец дня 7 в полосе 6). Напротив, в условиях высокого содержания меди относительное количество мультимеров VWF, состоящих из более чем 10 димеров, стабильно составляет около 30% на протяжении дня 4 в периодической культуре (день 3-день 6 в полосах 7-10; 28-31,4%).As can be seen from Table. 7 and 8, the total and specific ristocetin-cofactor activity of the high copper culture was twice that of the low copper culture on day 1 of batch culture. In addition, in contrast to the subsequent increase in activity observed in the high copper culture, no increase in ristocetin cofactor activity was noted in the low copper culture after 1 day of batch culture. Consistent with this result, analysis of the multimeric status of rVWF by agarose gel electrophoresis showed that in the cell culture supernatant with low copper content on day 1 of batch culture, there was a low concentration of high molecular weight rVWF relative to the concentration of low molecular weight rVWF species, and also that the indicated relative concentration decreased from over time (FIGS. 1A and 1B). On the contrary, the addition of Cu 2+ to the culture medium stably led to the formation of an antigen with ristocetin-cofactor (RiCoF) activity throughout the fourth day. Consistently, there was no decrease in stable high molecular weight rVWF multimers during batch day 4 (FIGS. 1A and 1B). The results of agarose electrophoretic gel densitometry shown in FIG. 1B showed that, under conditions of low copper levels, the culture was only able to produce a population of rVWF with more than 10% of the rVWF (i.e., 16.3%) represented by more than 10 dimer molecules during one day of batch culture (i.e., e. sample day 3 in lane 2 of the agarose gel in Fig. 1A); notably, this population dropped to as little as 4% on day 5 of batch culture (day 7 sample in lane 6). In contrast, under conditions of high copper content, the relative amount of VWF multimers consisting of more than 10 dimers is stable at about 30% throughout day 4 in batch culture (day 3-day 6 in lanes 7-10; 28-31.4%) .
Примечательно, что начиная с 5-го дня периодического культивирования культуры с высоким содержанием меди, когда уровни NH4+ превышали 100 мг/л (выше, чем приблизительно 5,0 мМ), экспрессия дополнительного антигена (18,3-35,4 мкг/л; ср. дни периодического культивирования 4 и 5 в табл.8) не приводила к сопутствующему увеличению RiCoF-активности в супернатанте. В соответствии с этим результатом уровень высокомолекулярных мультимеров rVWF на 5 день периодического культивирования (7 день культивирования) снижался относительно концентрации низкомолекулярных мультимеров rVWF. Также только на 5 день периодического культивирования (образец дня 7 культуры в полосе 11) относительное количество vWF, состоящего из более чем 10 димеров, снижается до 21,4%.Notably, starting on day 5 of the high copper batch culture, when NH4 + levels exceeded 100 mg/l (higher than about 5.0 mM), additional antigen expression (18.3-35.4 µg/ l; cf. batch culture days 4 and 5 in Table 8) did not lead to a concomitant increase in RiCoF activity in the supernatant. Consistent with this result, the level of high molecular weight rVWF multimers on day 5 of batch culture (day 7 of culture) decreased relative to the concentration of low molecular weight rVWF multimers. Also, only on day 5 of batch culture (sample of day 7 culture in lane 11) the relative amount of vWF consisting of more than 10 dimers is reduced to 21.4%.
В совокупности приведенные выше данные показывают, что дополнительная концентрация меди в культурах клеток, экспрессирующих rVWF, существенно увеличивает общую и удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, а также стабильную выработку высокомолекулярных мультимеров rVWF. Кроме того, эти данные выявляют корреляцию между высокими концентрациями NH4+ в культуре клеток и снижением ристоцетин-кофакторной активности rVWF и выработки высокомолекулярного мультимерного rVWF.Taken together, the above data show that the additional concentration of copper in cultures of cells expressing rVWF significantly increases the total and specific rVWF ristocetin cofactor activity, as well as stable production of high molecular weight rVWF multimers. In addition, these data reveal a correlation between high concentrations of NH4 + in cell culture and a decrease in the ristocetin-cofactor activity of rVWF and the production of high molecular weight multimeric rVWF.
- 54 041947- 54 041947
Таблица 7Table 7
Экспрессия rVWF в культурах клеток млекопитающих при периодическом режиме культивирования с применением сред BAV-SP с низкой концентрацией меди (1,0 мкг/л)Expression of rVWF in mammalian cell cultures in batch mode using BAV-SP media with low copper concentration (1.0 µg/L)
Таблица 8Table 8
Экспрессия rVWF в культурах клеток млекопитающих, культивируемых в периодическом режиме с применением BAV-SP сред с высокой концентрацией меди (4,3 мкг/л)Expression of rVWF in mammalian cell cultures cultured in a batch mode using BAV-SP media with a high concentration of copper (4.3 μg/l)
Пример 3.Example 3
Рекомбинантный фактор VIII (rFVIII) и фактор фон Виллебранда (rVWF) коэкспрессировали в непрерывных культурах клеток GD8/6, эксплуатируемых в хемостатических условиях, для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность VWF. Вкратце, клетки GD8/6 культивировали в среде BAV-SP, содержащей 4 г/л соевого гидролизата с добавлением и без добавления меди согласно описанию в примере 2. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность rVWF применяли основные среды BAV-SP. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что давало дополнительные 0,7 мкг/л меди с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в периодических культурах применяли среды BAV-SP также с добавлением дополнительных 3,3 мкг/л Cu2+, с получением конечной концентрации меди 4,3 мкг/л, для определения эффекта высоких концентраций меди на экспрессию и активность VWF. Культуры, растущие в присутствии высоких и низких концентраций меди, культивировали как при высокой (2,8х106 клеток/мл), так и при низкой (прибл. 1,4х10Е06 клеток/мл) плотности клеток.Recombinant factor VIII (rFVIII) and von Willebrand factor (rVWF) were co-expressed in continuous cultures of GD8/6 cells operated under chemostatic conditions to determine the effect of culture medium composition on VWF expression and activity. Briefly, GD8/6 cells were cultured in BAV-SP medium containing 4 g/L soy hydrolyzate with and without copper addition as described in Example 2. BAV-SP basic media were used to investigate the effect of low copper concentrations on rVWF expression and activity. These basic media contained 0.3 µg/l copper and added soy hydrolyzate, which gave an additional 0.7 µg/l copper to give a final copper concentration of 1.0 µg/l. For comparison, BAV-SP media, also supplemented with an additional 3.3 µg/L Cu 2+ , was used in batch cultures to give a final copper concentration of 4.3 µg/L, to determine the effect of high copper concentrations on VWF expression and activity. Cultures growing in the presence of high and low concentrations of copper were cultured at both high (2.8 x 106 cells/ml) and low (approx. 1.4 x 10E06 cells/ml) cell densities.
Как и ранее, образцы указанного культурального супернатанта исследовали на rVWF содержание (vWF ELISA), общую (ристоцетиновую) и удельную (удельную активность) активность посредством ристоцетин-кофакторного анализа. Также отслеживали различные параметры культуры, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрацию аммония. Данные получали на основании фазы стационарного состояния недель 2 и 3 хемостатической культуры (табл. 9-13).As before, samples of said culture supernatant were tested for rVWF content (vWF ELISA), total (ristocetin) and specific (specific activity) activity by ristocetin cofactor analysis. Various culture parameters were also monitored, including cell count, cell viability, and ammonium concentration. Data were obtained based on the steady state phase of weeks 2 and 3 of the chemostatic culture (Tables 9-13).
Таблица 9Table 9
Средние данные по экспрессии rVWF в хемостатической культуре клеток на протяжении недель 2 и 3Mean of rVWF expression in chemostatic cell culture over weeks 2 and 3
- 55 041947- 55 041947
Таблица 10Table 10
Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3Expression of rVWF in chemostatic cell culture under high cell count and low copper conditions during weeks 2 and 3
Таблица 11Table 11
Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и высоких уровней меди на протяжении недель 2 и 3Expression of rVWF in chemostatic cell culture under conditions of high cell numbers and high copper levels during weeks 2 and 3
Таблица 12Table 12
Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3Expression of rVWF in chemostatic cell culture under low cell count, low copper conditions during weeks 2 and 3
- 56 041947- 56 041947
Таблица 13Table 13
Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, высокого уровня меди на протяжении недель 2 и 3Expression of rVWF in chemostatic cell culture under low cell count, high copper conditions during weeks 2 and 3
Как показано на фиг. 2А, супернатант, собранный из непрерывной rVWF-культуры клеток, выращенной при низкой плотности клеток и высоких концентрациях меди, имел высокую удельную активность (в среднем 600 мЕ/10 мкг), в то время как супернатанты, собранные из rVWF-культур клеток, выращенных при высокой плотности клеток в присутствии высоких или низких концентраций меди, и rVWF-культур клеток, выращенных при низкой плотности клеток в присутствии низкой концентрации меди, имели низкие удельные активности (менее чем 100 мЕ/10 мкг). В соответствии с результатами, полученными для периодических культур, как видно из фиг. 2В, непрерывные культуры клеток млекопитающих, экспрессирующие rVWF с высокой удельной активностью, содержат более низкие NH4+ концентрации, чем культуры, продуцирующие rVWF с низкой удельной активностью. Эти данные также подтверждают корреляцию между концентрацией NH4+ в культуре клеток и удельной активностью rVWF, продуцируемого указанной культурой. Примечательно, что комбинация высокой концентрации меди и низкой концентрации аммония в культуре клеток позволяла добиться значительного повышения активности rVWF.As shown in FIG. 2A, the supernatant harvested from a continuous rVWF cell culture grown at low cell density and high copper concentrations had a high specific activity (average 600 mU/10 μg), while supernatants harvested from rVWF cell cultures grown at at high cell density in the presence of high or low copper concentrations, and rVWF cell cultures grown at low cell density in the presence of low copper concentration had low specific activities (less than 100 mU/10 μg). In accordance with the results obtained for batch cultures, as seen from FIG. 2B, continuous cultures of mammalian cells expressing high specific activity rVWF contain lower NH4+ concentrations than cultures producing low specific activity rVWF. These data also confirm the correlation between the concentration of NH4+ in the cell culture and the specific activity of rVWF produced by this culture. It is noteworthy that the combination of a high concentration of copper and a low concentration of ammonium in cell culture made it possible to achieve a significant increase in rVWF activity.
В соответствии с этим результатом, анализ мультимерного статуса rVWF в хемостатических культурах с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 6) показал, что только супернатанты культур, эксплуатируемых при высоком содержании меди и низкой плотности клеток и, таким образом, низком содержании аммония, обеспечивали устойчивую экспрессию высокомультимерного vWF (приблизительно 23%-27% в дни CST 8, 17 и 24, полосы 4, 8, и 12, соответственно). Все прочие условия не обеспечивали устойчивого достижения большого количества - более чем 10% vWF, содержащего более чем 10 димеров, на протяжении длительного периода культивирования.Consistent with this result, analysis of the multimeric status of rVWF in chemostatic cultures by agarose gel electrophoresis (Fig. 6) showed that only the supernatants of cultures operated at high copper and low cell density and thus low ammonium provided sustained expression of high multimeric vWF (approximately 23%-27% on CST days 8, 17 and 24, lanes 4, 8, and 12, respectively). All other conditions did not provide a sustainable achievement of a large amount - more than 10% of vWF containing more than 10 dimers, over a long period of cultivation.
Пример 4.Example 4
Для определения эффекта концентрации меди в культуральной среде на экспрессию и удельную активность rA13 культуры клеток млекопитающих для экспрессии rA13 культивировали в течение 4 недель в условиях хемостатической непрерывной культуры в среде ADAMTS13, включающей модифицированные основные среды DMEM/F12 BESP845 и дополнительные добавки (табл. 14), содержащие медь в диапазоне концентраций от 0,66 мкг/л (без дополнительного добавления меди) и с дополнительным добавлением меди до 4 мкг/л. Как видно из табл. 15, возрастающая концентрация меди в среде для клеточных культур приводила к значительному увеличению объемной (Р) и удельной (q) продуктивности, выражаемой в виде общей активности rA13, полученного на литр культуры в день, и общей активности полученного rA13 на клетку в день, соответственно.To determine the effect of copper concentration in the culture medium on the expression and specific activity of rA13, mammalian cell cultures for rA13 expression were cultured for 4 weeks under chemostatic continuous culture conditions in ADAMTS13 medium, including modified DMEM/F12 BESP845 basic media and additional additives (Table 14) containing copper in the concentration range from 0.66 µg/l (without additional addition of copper) and with additional addition of copper up to 4 µg/l. As can be seen from Table. 15, increasing concentrations of copper in the cell culture medium resulted in a significant increase in volumetric (P) and specific (q) productivity, expressed as total activity of rA13 produced per liter of culture per day and total activity of rA13 produced per cell per day, respectively. .
- 57 041947- 57 041947
Таблица 14Table 14
Состав среды для получения ADAMTS13The composition of the environment for obtaining ADAMTS13
- 58 041947- 58 041947
Чтобы определить, влияют ли повышенные концентрации меди на сохранность экспрессируемого rA13, супернатант, собранный от гА13-культур клеток, выращенных в среде, содержащей 0,66 мкг/л, 1 мкг/л и 4 мкг/л меди, исследовали с помощью анализа ДСН-ПААГ. Как видно из фиг. 3А (окрашивание серебром) и фиг. 3В (анти-А13 вестерн-блоттинг), очевидных изменений в качестве продукта при гельэлектрофорезе не наблюдается. Так, экспрессия гА13 в присутствии повышенных концентраций меди не приводит к повышению уровня усеченного 170 кДа или других низкомолекулярных вариантов гА13, и к появлению дополнительных или увеличению полос, соответствующих НСР(белкам клеток-хозяев).To determine if elevated copper concentrations affect retention of rA13 expressed, supernatant harvested from rA13 cell cultures grown in media containing 0.66 µg/L, 1 µg/L, and 4 µg/L copper was examined by SDS assay. -PAAG. As can be seen from FIG. 3A (silver staining) and FIG. 3B (anti-A13 Western blot), no obvious change in gel electrophoresis product quality is observed. Thus, expression of rA13 in the presence of elevated concentrations of copper does not lead to an increase in the level of truncated 170 kDa or other low molecular weight variants of rA13, and to the appearance of additional or increased bands corresponding to HCP (host cell proteins).
При расчете оптимальной концентрации меди для активности гА13 экстраполирование данных из табл. 15 о зависимости Р Frets от концентрации меди (фиг. 4) показывает, что оптимальный эффект, очевидно, достигается при приблизительно 2 мкг/л, с негативным влиянием по консервативной оценке при более чем приблизительно 4 мкг/л.When calculating the optimal concentration of copper for the activity of rA13, extrapolation of data from Table. 15 of P Frets versus copper concentration (FIG. 4) shows that the optimal effect appears to be at about 2 µg/L, with a conservative negative effect at more than about 4 µg/L.
--
Claims (46)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/362,635 | 2010-07-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA041947B1 true EA041947B1 (en) | 2022-12-16 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11780904B2 (en) | Method of producing recombinant high molecular weight vWF in cell culture | |
EA041947B1 (en) | METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HIGH MOLECULAR VWF IN CELL CULTURE |