CN109415426B

CN109415426B - 具有降低的唾液酸残基的乙酰化率的糖蛋白

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Publication number: CN109415426B
Application number: CN201780041807.1A
Authority: CN
Inventors: U·克朗泰勒; C·托雷拉
Original assignee: Hexal AG
Current assignee: Hexal AG
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: KR20190026840A; EP3484910A1; AU2017297767A1; CA3026863A1; JP2019532618A; WO2018011302A1; BR112019000549A2; JP2022050633A; JP7432628B2; EP3484910B1; CN109415426A; KR20230048469A; US20220119471A1; US20190177385A1; ZA201808275B; AU2017297767B2; EP3484910C0

Abstract

本发明涉及生产与促红细胞生成素受体(EpoR)相互作用或作为其激动剂起作用的糖蛋白的方法或工艺，所述糖蛋白具有改变的效能，其中所述方法或工艺包含所述糖蛋白在适合的表达系统中的异源表达，并且其中提供至少一个步骤，其导致糖蛋白中唾液酸残基的乙酰化率降低(图16)。

Description

具有降低的唾液酸残基的乙酰化率的糖蛋白

本发明涉及具有降低的唾液酸残基乙酰化率的糖蛋白。

唾液酸是神经氨酸的N-或O-取代衍生物的通称，神经氨酸是具有9碳骨架的单糖。在N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)之后，最常见的种类是N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)和O-乙酰化衍生物。

唾液酸广泛分布于动物组织中，并且在较小程度上分布于其他生物体中，从植物和真菌到酵母和细菌，主要在糖蛋白中，其中它们出现在与后者结合的聚糖末端。

聚糖与蛋白质的共价结合代表了一种进化机制，通过该机制可以显著增加蛋白质组的多样性。蛋白质糖基化的多种多样机制进化的情况证明了这种蛋白质修饰的进化益处和总体相关性。这些机制的范围从非酶糖化到复杂的翻译后糖基化，即牵涉几种酶修饰的多步骤和多重-细胞室过程。

图17显示唾液酸家族。一个唾液酸分子可携带一个或几个乙酰基。N-乙酰基-神经氨酸是其中最常见的。

乙酰化唾液酸似乎牵涉许多生物现象。糖结构在蛋白质-蛋白质相互作用中发挥作用，它们可以是折叠成正确的功能性构象的先决条件。它们在发育和恶性过程中的表达显著性和可变性、也作为所谓的“癌胚抗原”的一部分启示它们参与许多生理学病理过程。并不令人惊奇地，损害聚糖部分合成或与蛋白质的连接的遗传缺陷引起多种人类疾病。这些糖结构可以进一步被修饰，从而导入额外的多样化。这种修饰的一个实例是乙酰化。它作为细胞相互作用的有效调节剂的作用将乙酰化与细胞功能的其他生物化学调节例如蛋白质磷酸化或用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和甲基化修饰分类。

唾液酸的乙酰化显然进一步增加了糖基化的多样性，即连接的糖另外被内源性地酶促修饰。唾液酸是末端聚糖的这种修饰的原型实例，而乙酰化是这种额外修饰的普遍类型。天然存在的唾液酸具有九碳骨架并且可在其所有羟基上乙酰化。这意味着它们可以在C4、C7、C8和C9位被乙酰化。每种唾液酸可以被修饰一次，但也可以是单一唾液酸的多种衍生物，从而生成几种组合模式，特别是对于携带多于一个唾液酸的糖结构。

考虑到糖基化对蛋白质功能的明显重要性和显而易见的显著修饰空间，大量努力通过靶向修饰其聚糖结构来优化蛋白质的治疗性质。最近，这种新一代生物制药的前两个例子获得了上市许可：莫加木珠单抗(mogamulizumab)

和阿托珠单抗

然而，糖基化的靶向修饰不限于单克隆抗体。达依泊汀α

是一个实例，其中球状蛋白的特征也得到改善，在这种情况下，通过添加两个唾液酸化的碳水化合物链导致延长的效能，即降低的治疗频率。

然而，虽然这些方法中的一些集中于血清半衰期和其他因素的改善，但似乎在狭义上的效能改变尚未成为潜在定性修饰的焦点。对于红细胞生成刺激剂(ESA)尤其如此，其用于增加血液的气体(氧气/二氧化碳)运输能力。

与ESA疗法相关的一个主要风险是死亡率增加。作为最突出的风险，心血管事件发生在血红蛋白(Hb)的高度增加时，这被讨论是由ESA诱发的红细胞(RBC)增加引起的。

本发明的一个目的在于提供一种用于改变治疗糖蛋白效能的新方法。

本发明的另一个目的在于提供一种用于修饰红细胞生成刺激剂以增加其效能的新方法。

本发明的另一个目的在于提供一种用于修饰红细胞生成刺激剂的具有降低的副作用风险和/或死亡率的新方法。

利用本发明的独立权利要求的方法和方式实现这些目的。从属权利要求涉及优选的实施例。

发明概述

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的装置的特定组成部分或所述方法的处理步骤，照此这些装置和方法可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和/或复数指示物，除非上下文另有明确说明。此外，应理解，在给出由数值界定的参数范围的情况下，范围被认为包括这些限制值。

根据本发明的一个方面，提供了产生与促红细胞生成素受体(EpoR)相互作用或作为其激动剂的糖蛋白的方法或工艺，该糖蛋白具有改变的效能。该方法或工艺包含在适合的表达系统中异源表达所述糖蛋白，其中提供至少一个步骤或特征，其导致糖蛋白中唾液酸残基的乙酰化率降低。

关于要求保护的改变效能的比较可以使用具有相同或相似氨基酸序列的市售糖蛋白，或通过其天然宿主表达的野生型糖蛋白，或通过适合的表达系统进行，该野生型糖蛋白没有经过以影响唾液酸残基的乙酰化率的修饰。

促红细胞生成素受体(EpoR)是人类中由EPOR基因编码的蛋白质。EpoR是具有单个碳水化合物链的52kDa肽，导致在EPO应答细胞表面上发现约56-57kDa的蛋白质。EpoR作为二聚体预先存在，此时适合的配体结合改变其同二聚化状态。

EpoR的胞质结构域含有许多磷酸酪氨酸，其在由配体结合引起的构象变化时被Jak2磷酸化，并且充当各种胞内途径激活剂和Stat(例如Stat5)的停靠位点。

EpoR的主要作用是促进红系祖细胞的增殖并从细胞死亡中拯救红细胞祖细胞。然而，根据目前的证据，EpoR是否直接导致体内红细胞祖细胞的“增殖和分化”仍然是未知的。

认为EpoR参与的另一个作用在于促进红细胞分化。EpoR的PI3-K/AKT信号通路增强了GATA-1活性。一种推定在于红细胞分化主要依赖于红细胞转录因子的存在和诱导，例如GATA-1，FOG-1和EKLF。

还已知EpoR可以激活促有丝分裂信号传导途径并且可以在体外导致红白血病细胞系中的细胞增殖。EpoR表达可以延伸到远离造血干细胞区室的后面。然而，尚不清楚EpoR信号传导在早期的多能祖细胞中是否具有许可或指导作用，以产生足够的成红细胞数。

术语“改变的效能”在本文另外部分中讨论。

如本文所用，术语“唾液酸残基的乙酰化率”是指携带一个或多个乙酰基残基的指定糖蛋白的总百分比。优选地，该术语涉及这些唾液酸上的O-乙酰基残基。

如本文所用，术语“糖蛋白”是指含有与多肽侧链共价连接的寡糖链(聚糖)的蛋白质和肽。碳水化合物通过共翻译或翻译后修饰与蛋白质连接。该过程称为糖基化。

优选地，减少的乙酰化降低了O-乙酰化。这适用于本文公开的所有实施方案，其中叙述了术语乙酰化。在所有情况下，O-乙酰胺是优选的实施方案。

在一个实施方案中，导致唾液酸残基的乙酰化率降低的步骤或特征是选自如下的至少一个：

a)所述糖蛋白的聚糖中的唾液酸残基的去乙酰化，

b)所述糖蛋白的总糖基化减少，导致乙酰化唾液酸残基减少，

c)表达子细胞系的应用，其能够表达糖蛋白，该糖蛋白具有去乙酰化或非乙酰化唾液酸残基或降低的唾液酸残基乙酰化率，

d)表达子细胞系的应用，其能够表达糖蛋白，该糖蛋白是去糖基化的或具有减少的糖基化，

e)所述糖蛋白的聚糖中的唾液酸含量降低，和

f)表达子细胞系的应用，其能够表达糖蛋白，该糖蛋白具有减少的唾液酸量或缺乏唾液酸。

如本文所用，术语“表达子细胞系”涉及能够同源或异源表达糖蛋白的细胞系。

优选地，步骤/特征a)、b和e)涉及体外方法，其例如通过翻译后酶促或化学处理糖蛋白进行。

可以实现唾液酸残基的去乙酰化(步骤或特征a)，例如通过使用适合的乙酰基酯酶的翻译后处理。一个实例是唾液酸O-乙酰基酯酶(SIAE)，其在人体中由位于染色体11上的SIAE基因编码。SIAE催化从母体唾液酸的9位去除O-乙酰基酯基团。

然而，其他生物和其他表达子细胞系具有其他类型的乙酰基酯酶。唾液酸O-乙酰基酯酶在Expasy酶条目EC 3.1.1.53中公开。这些酶尤其催化以下反应：

N-乙酰基-O-乙酰神经氨酸+H(2)O＜＝＞N-乙酰神经氨酸+乙酸

因此，对于本领域技术人员常规的是，基于本文公开的教导，沉默、缺失或突变相应生物体和其他表达子细胞系中的相应乙酰基转移酶。

可以实现总糖基化的降低(步骤b)，例如通过用适合的酶，如NANase II、内切糖苷酶H、O-糖苷酶和/或肽-N-糖苷酶F(PNGase F)进行翻译后处理。Kim和Leahy(2013)中描述了方案。在Sojar H和Bahl(1987)中公开了使用三氟甲磺酸的糖蛋白去糖基化的化学方法。

通常，去糖基化分别从糖蛋白中去除所有聚糖，并因此实际上导致去除与唾液酸缀合的乙酰基残基。

可以根据WO2011061275A1中公开的方法降低糖蛋白聚糖中唾液酸含量。

步骤/特征c)优选是指表达子细胞系，其(i)自身表现出乙酰化程度降低(即其中乙酰化率未经人工处理的情况)，或(ii)已经以乙酰化的方式进行了修饰，使得翻译后蛋白质修饰过程中的唾液酸残基受到影响。

这可以通过例如抑制或减少编码催化唾液酸乙酰化的酶的基因的基因表达、或催化唾液酸乙酰化的功能失调或无活性酶的表达、或催化具有降低活性的唾液酸乙酰化的酶来实现。

步骤/特征d)优选是指例如已经被修饰的表达子细胞系，按照这种方式，蛋白质糖基化受到影响。

例如，通过改变表达子细胞系可以实现这一目的，按照这种方式，它表达或过表达催化去糖基化的异源或同源酶。

催化去糖基化的酶的实例包括NANase II、内切糖苷酶H、O-糖苷酶和/或肽-N-糖苷酶F(PNGase F)。在适合的表达子细胞系中的任何这些基因的过表达、或在适合的表达子细胞系中的异源表达导致翻译后蛋白质修饰期间的去糖基化。

所述异源表达可以例如通过基因改造技术实现，包括用编码相应酶的载体非瞬时转染细胞。

所述同源过表达可以例如通过基因改造技术实现，包括通过已插入编码基因上游的适合的启动子诱导的过表达编码相应酶的内在基因。

所述缺失或诱变可以通过本文其他地方描述的方法完成。

如本发明人已经在本文中所示，本发明的糖蛋白具有降低的唾液酸残基的乙酰化率，提供了施用较低剂量同时实现相同治疗效果的机会。这通过向患者施用较少量的糖蛋白，导致成本节省并降低不希望的副作用的风险，例如抗体的形成。施用较低剂量的可能性还降低了给予患者的体积，为这种治疗剂增加了进一步的益处，并增加了患者的依从性。

此外，本发明的具有降低的唾液酸乙酰化率的糖蛋白可以降低与ESA治疗相关的主要风险，即死亡率增加。作为最突出的风险，心血管事件发生在Hb的高度增加时，这被讨论是由ESA诱发的RBC增加引起的。本发明的用糖蛋白治疗导致上述平均红细胞血红蛋白(MCH)增加，而RBC增加不太明显。总之，这导致有利的安全性，例如，关于心血管安全性和总体死亡率。

在一个实施方案中，糖蛋白是促红细胞生成刺激剂(ESA)。在优选的实施方案中，促红细胞生成刺激剂(ESA)是促红细胞生成素、修饰的促红细胞生成素或促红细胞生成素模拟物。

如本文所用，术语“促红细胞生成素”包含不同的野生型促红细胞生成素(重组人肾红细胞生成素α、重组人肾红细胞生成素β、重组人肾红细胞生成素γ、重组人肾红细胞生成素δ、重组人肾红细胞生成素ε、重组人肾红细胞生成素ζ、重组人肾红细胞生成素θ、重组人肾红细胞生成素K或重组人肾红细胞生成素ω)。

如本文所用，术语“修饰的促红细胞生成素”是指一种在结构上和/或序列上依赖于野生型促红细胞生成素的蛋白质，但包括(i)其氨基酸序列，其(ii)糖基化模式或(iii)通过添加其他部分的结构修饰。这些修饰不影响其与促红细胞生成素受体的激动相互作用，照此，或者改变所述激动相互作用，或者改变其另外的物理化学、药理学或PK/PD特性，如生物利用度、血清半衰期、组织分布、效能、贮存期限等。

如本文所用，术语“促红细胞生成素模拟物”是指与促红细胞生成素受体激动相互作用的蛋白质和多肽。促红细胞生成素模拟物尤其在Johnson，&Jolliffe(2000)和US8642545B2中公开。研究表明，EPO受体是一种484个氨基酸的糖蛋白，其单个跨膜区段位于细胞外和细胞内区域之间，每个区域的大小几乎相等，Phe⁹³对于结合EPO以及结合促红细胞生成素模拟肽至关重要(Middleton等人1999)。

很明显，修饰的促红细胞生成素和促红细胞生成素模拟物是具有大的重叠的两类。因此，一些修饰的促红细胞生成素也可以被认为是促红细胞生成素模拟物，反之亦然。

在一个实施方案中，促红细胞生成素或修饰的促红细胞生成素是选自如下的至少一种：

·重组人肾红细胞生成素α

·重组人肾红细胞生成素-β

·促红血球生成素α

·CERA(连续红细胞生成受体激活剂)

·

·

·PT-401

·Epo-Fc

·CEPO(氨基甲酰化EPO)

·MOD-7023

·重组人肾红细胞生成素δ

·GO-EPO

·MK2578

在本发明的另一个实施方案中，改变的效能是生理效能或治疗效能。优选地，改变的治疗效能是MCH的相对增加和/或血红蛋白(Hb)合成的相对刺激作用。

在本发明的另一个实施方案中，导致唾液酸残基的乙酰化率降低的步骤也影响糖蛋白的生物利用度、暴露、血清半衰期或绝对血清浓度。

例如，本发明人已经证明，唾液酸乙酰化的降低一方面可降低ESA的生物利用度，但同时与未修饰的ESA相比增加MCH，如所显示甚至过度补偿以Hb水平测量的较低暴露的程度。因此，尽管就Hb而言似乎产生了相反的生产效果，但生物利用度的降低令人惊讶地并未转化为降低的Hb。该实例表明，通过用修饰的ESA处理产生的增加的MCH，甚至过度补偿了减少的暴露。这可能会产生多重后果。从制造角度来看，纠正患者造血所需的较低剂量的蛋白质可以转化为较低的商品成本。从患者的角度来看，这种较低的剂量以及由于快速消除而导致的暴露减少将意味着进一步的益处。暴露于治疗性蛋白质与个体发展抗药物抗体(ADA)的风险相关。在ESA的情况下，这种ADA形成的可能性通常很低。因此，较低的暴露也会降低免疫原性风险。最后也是最重要的是，Hb的增加没有RBC的其他相当线性的增加，使Hb升高与血栓形成风险增加脱钩。

在一个实施方案中，修饰的促红细胞生成素具有选自如下的至少一个：

a)绝对乙酰化率≤10％，和/或

b)乙酰化率降低之50％。

如本文所用，术语“绝对乙酰化率(％)”是指给定糖蛋白类型的唾液酸的总百分比，其携带一个或多个O-乙酰化。重要的是要强调，在本公开的含义中，部分或全部去糖基化也将导致乙酰化速率的降低。

优选地，绝对乙酰化率≤9、8、7、6、5、4、3、2或1％。最优选地，绝对乙酰化率为0％。在该实施方案中，指定糖蛋白的所有聚糖的唾液酸完全被去或无乙酰化。

然而，在某些情况下，绝对乙酰化率应当相同，但不小于0.1；0.2；0.3；0.4或0.5％。

如本文所用，术语“乙酰化率降低X％”是指携带一个或多个乙酰基的给定糖蛋白类型的唾液酸与(i)相同或相似氨基酸序列的市售糖蛋白相比或(ii)由其天然宿主或适合的表达系统表达的相同或相似氨基酸序列的野生型糖蛋白相比的减少，其中在任一情况下，相应的市售糖蛋白或野生型糖蛋白未被修饰以影响唾液酸残基的乙酰化率。

优选地，乙酰化率减少≥51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95％。

然而，在某些情况下，乙酰化率减少应不超过99；98；97或96％。

例如，本发明的ESA(达依泊汀α)的绝对乙酰化率＜1％，而相同或相似氨基酸序列

的市售ESA具有29.5％的绝对乙酰化率。因此，乙酰化率降低至相同或相似氨基酸序列的市售ESA的约3％。

优选地，使用选自如下的至少一种方法测定乙酰化率：

·使用酶(用神经氨酸酶)或化学方法(用弱酸水解)从糖蛋白或分离的聚糖切割糖苷键后的唾液酸的相对定量

·用1，2--二氨基-4，5-亚甲二氧基苯(DMB)衍生唾液酸，然后进行使用荧光检测的高效液相色谱

·超三甲基甲硅烷基化(Pertrimethylsilylation)，然后是GLC(气液色谱)-MS

·薄层色谱(放射-TLC或密度计定量)

有关适合于乙酰化率测定方法的概述，请参见例如Reuter和Schauer，1994)。在间接完成乙酰化率降低的情况下，即通过部分或总糖基化，乙酰化率尤其也可以通过用三氟甲磺酸进行化学去糖基化来确定(在Sojar和Bahl(1987)中讨论)。

根据本发明的另一个方面，提供了与促红细胞生成素受体(EpoR)相互作用或作为其激动剂的糖基化蛋白，该糖蛋白具有改变的效能。用上述方法或工艺生产糖蛋白。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了这种糖蛋白在制备用于治疗人或动物患者或受试者的药物中的用途。或者，提供了这种糖蛋白用于治疗人或动物患者或受试者的用途。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了治疗人或动物患者或受试者的方法，该方法包含以药学有效量施用根据上述描述的糖蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了药物制剂，其包含在药学上可接受的载体中的上述描述的糖蛋白。

由于增加的效能，这种制剂可以以较小的剂量或体积施用，由此可以有助于降低药物聚集风险、延长贮存期限、减少储存需求、减少与施用相关的不适感并增加患者的依从性。

根据本发明的一个实施方案，所述人或动物患者或受试者患有至少一种疾病或症状、处于发生它们的风险中和/或被诊断为它们，所述疾病或症状选自：

·贫血，

·AIDS-相关疾病和癌症-相关疾病和相关疗法如化疗的不希望发生的后果，和

·含氧量低综合征。

所述贫血可以具有不同的起源，例如肾病缺陷、放疗、癌症例如骨髓增生异常综合征伴或不伴骨髓抑制化疗、铁或铁代谢缺陷、透析前中的症状性贫血、或骨髓缺陷或疾病。

根据本发明的一个实施方案，人或动物患者或受试者是具有病症或进行选择如下的治疗的受试者：

·造血干细胞移植，

·重症监护，

·对红细胞生成、手术前或围手术刺激例如用于自体血供给的需求。

根据本发明的另一个方面，提供了用于根据上述描述的糖蛋白的异源表达的细胞，该细胞

a)能够表达糖蛋白，该糖蛋白具有去或非乙酰化唾液酸残基或降低的唾液酸残基乙酰化率，和/或

b)能够表达糖蛋白，该糖蛋白是去糖基化的或具有减少的糖基化。

在一个实施方案中，具有去或非乙酰化唾液酸残基或降低的唾液酸残基乙酰化率的糖蛋白的表达通过如下方式的至少一种进行：

a)抑制或减少编码催化唾液酸乙酰化的酶的基因的基因表达，

b)催化唾液酸乙酰化的功能失调或无活性酶或催化具有降低活性的唾液酸乙酰化的酶的表达，

c)抑制或减少催化唾液酸乙酰化的酶活性，和/或

d)编码催化唾液酸残基的去乙酰化的酶的基因的异源表达或同源过表达。

优选地，选项a)-c)的所述酶催化唾液酸的O-乙酰化。这类酶的实例如下表单中所示，然而，其不被预期为限制性的：

·N-乙酰神经氨酸7-O(或9-O)-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.45)

·聚唾液酸O-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.136)

·唾液酸O-乙酰基转移酶(neuD家族)

·α-N-乙酰-神经酰胺α-2，8-唾液酸转移酶1(GD3合酶)

·人唾液酸-O-乙酰基转移酶(CasD1)

这些酶催化例如如下类型的反应：

乙酰-CoA+N-乙酰神经氨酸—＞CoA+N-乙酰基-7-O(或9-O)-乙酰神经氨酸；

乙酰-CoA+α-2，8-连接的唾液酸聚合物—＞CoA+O-7或O-9位上乙酰化的聚唾液酸。

适合的人表达子细胞系中所述基因的沉默、缺失或诱变导致缺乏或功能失调的酶，由此导致翻译后蛋白质修饰期间唾液酸残基的乙酰化减少或缺乏。

然而，其他生物和其他表达子细胞系具有其他类型的唾液酸乙酰基转移酶。因此，本领域技术人员通常可以基于本文公开的教导，在相应的生物体或表达子细胞系中沉默、删除或突变相应的乙酰基转移酶。

优选地，选项d)的所述酶催化唾液酸的去-O-乙酰化。这类酶的实例如下表单中所示，然而，其不被预期为限制性的：

·唾液酸-9-O-乙酰基酯酶(EC 3.1.1.53)

·9-O-乙酰基N-乙酰神经氨酸酯酶

·血细胞凝集素酯酶

·胞质唾液酸9-O-乙酰基酯酶

这些酶特别地催化如下反应：

N-乙酰基-O-乙酰神经氨酸+H₂O—＞N-乙酰神经氨酸+乙酸

人唾液酸O-乙酰基酯酶(SIAE)例如由位于染色体11上的SIAE基因编码。SIAE催化从母体唾液酸的9位去除O-乙酰基酯基团。

来自以上列表的基因在适合的人表达子细胞系中的过表达或在非人表达子细胞系中的异源表达导致翻译后蛋白质修饰期间唾液酸残基的翻译后去乙酰化。

然而，其他生物和其他表达子细胞系具有其他类型的乙酰酯酶。因此，对于本领域技术人员常规的是，基于本文公开的教导，在相应的生物体或表达子细胞系中沉默、缺失或突变相应的乙酰基转移酶。

在一个实施方案中，通过编码催化去糖基化的酶的基因的异源表达或同源过表达来实现去糖基化或具有减少的糖基化的糖蛋白的表达。

在一个实施方案中，通过至少一个选自下列的遗传改造步骤实现基因表达的抑制或减少：

·基因沉默，

·基因敲低，

·基因敲除，

·显性负性构建体的递送，

·条件基因敲除，和/或

·编码催化唾液酸乙酰化或唾液酸残基去乙酰化的酶的基因方面的基因改变。

如本文所用，术语“基因表达”意指包括选自下列的至少一个步骤：DNA转录成mRNA、mRNA加工、非编码mRNA成熟、mRNA输出、翻译、蛋白质折叠和/或蛋白质转运。

基因表达的抑制或减少是指直接干扰基因表达的方法，包括但不限于抑制或减少DNA转录，例如通过使用特异性启动子相关阻遏物，通过指定启动子的位点特异性诱变，通过启动子交换，或抑制或减少翻译，例如通过RNAi诱导的转录后基因沉默。功能失调或无活性酶或具有活性降低的酶的表达可以例如通过编码基因内的位点特异性或随机诱变、插入或缺失来实现。

酶活性的抑制或降低可以例如通过在蛋白质表达之前或与之同时与相应酶的抑制剂一起施用或与其一起孵育来实现。此类抑制剂的实例包括但不限于抑制肽、抗体、适体、融合蛋白或针对所述酶的抗体模拟物、或其配体或受体、或抑制性肽或核酸、或具有类似结合活性的小分子。文献中描述的N-乙酰神经氨酸酯7-O(或9-O)-乙酰基转移酶活性的一些抑制剂是碘醋酸盐、CoA、碳酸二乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺、Triton X-100或对氯汞苯甲酸。

抑制酶的其他方式包含减少培养基中酶的特异性辅因子。

基因沉默、基因敲低和基因敲除是指通过遗传修饰或通过用具有与mRNA转录物或基因互补的序列的寡核苷酸处理来减少基因表达的技术。如果进行DNA的遗传修饰，则结果是敲低或敲除生物体。如果基因表达的变化是由寡核苷酸与mRNA结合或暂时与基因结合引起的，则这导致基因表达的暂时变化而不修饰染色体DNA，并且被称为瞬时敲低。

在瞬时敲低(也包括在上述术语中)中，该寡核苷酸与活性基因或其转录物的结合通过阻断转录(在基因结合的情况下)、mRNA转录物降解(例如通过小干扰RNA(siRNA)或RNase-H依赖性反义)或阻断mRNA翻译、前mRNA剪接位点或用于其他功能性RNA、例如miRNA(例如通过吗啉代寡核苷酸或其他RNase-H独立的反义)成熟的核酸酶切割位点导致表达减少。其他方法涉及使用shRNA(小发夹RNA，这是一个RNA序列，通过RNA干扰可以用于沉默基因表达的紧密发夹转换)、esiRNA(内切核糖核酸酶制备的siRNA，其为用内切核糖核酸酶切割长双链RNA(dsRNA)产生的siRNA寡核苷酸的混合物)、或RNA诱导的沉默复合物(RISC)的激活。

可用于本文中的遗传修饰的另一种方法包含使用CRISPR Cas(Baumann等人，2015)、TALEN或ZFN(Gaj等人，2013)。

进行基因沉默、敲低或敲除的其他方法是本领域技术人员从相应的文献中已知的，并且它们在本发明的上下文中的应用被认为是常规的。

基因敲除是指基因表达被完全阻断的技术，即相应的基因不起作用乃至被除去。实现该目标的方法学方法是多方面的并且是本领域技术人员已知的。实例是产生对给定基因显性负的突变体。这种突变体可以通过定点诱变(例如缺失、部分缺失、插入或核酸取代)，通过使用适合的转座子，或通过本领域技术人员从相应文献中已知的其他方法产生，其应用在本发明的上下文中被认为是常规的。本领域技术人员认为在本发明的上下文中有用的新开发技术的一个实例是通过使用靶向锌指核酸酶敲除。Sigma Aldrich提供相应的试剂盒作为“CompoZR敲除ZFN”。另一种方法包括使用转录激活剂-样效应子核酸酶(TALEN)。

显性阴性构建体的递送涉及导入编码功能失调酶的序列，例如通过转染。所述编码序列在功能上与强启动子偶联，按照这种方式使得功能失调酶的基因表达优先于野生型酶的天然表达，这由此导致相应酶活性的有效生理缺陷。

条件基因敲除允许以组织或时间特异性方式阻断基因表达。例如，这通过在感兴趣的基因周围导入称为loxP位点的短序列来进行。此外，本领域技术人员从相应的文献中已知其他方法，并且它们在本发明的上下文中的应用被认为是常规的。

另一种方法是基因改变，其可产生功能失调的基因产物或活性降低的基因产物。该方法涉及导入移码突变、无义突变(即导入未成熟终止密码子)或导致氨基酸取代的突变，所述氨基酸取代赋予整个基因产物功能失调或导致活性降低。这种基因改变可以例如通过诱变(例如缺失、部分缺失、插入或核酸取代)、非特异性(随机)诱变或定点诱变产生。

描述基因沉默、基因敲低、基因敲除、显性阴性构建体的递送、条件基因敲除和/或基因改变的实际应用的方案通常是技术人员可获得的，并且在其常规范围内。因此，本文提供的技术教导完全能够实现所有可预期的方法，所述方法导致抑制或减少编码酶的基因的基因表达抑制或减少，或功能失调或无活性的酶或具有活性降低的酶的表达。

本文公开的教导包含：

a)发现异源表达的针对EpoR的激动剂的酶促去-O-乙酰化具有给定的改变的效能，

b)示例性酶的公开，该酶催化不同细胞表达系统中的O-乙酰化或去-O-乙酰化，

c)对于本领域技术人员可利用的技术的枚举，其能够使得本领域技术人员生成表达子细胞系，该细胞系具有受损或缺陷的同源酶或表达异源酶或过表达同源酶。

因此，本申请的技术教导使本领域技术人员能够开发一种表达子细胞系，其具有受损或缺陷的O-乙酰化或具有增加的去-O-乙酰化，以产生具有给定改变的效能的EpoR激动剂。

在本发明的一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。术语“真核细胞”包括但不限于动物细胞，例如昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。优选地，所述细胞是动物细胞和/或植物细胞。更多优选地，所述细胞是哺乳动物细胞。

优选地，所述细胞是选自如下的至少一种：

·婴儿仓鼠肾细胞(例如BHK21)，

·中国仓鼠卵巢细胞(例如CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB或CHO-dhf)，

·小鼠骨髓瘤细胞(例如SP2/0或NSO)，

·人胚肾细胞(例如HEK-293)，

·人视网膜衍生的细胞(例加PER-C6)，和

·羊水细胞(例如CAP)。

在一个优选的实施方案中，所述细胞是重组细胞。如本文所用，术语“重组细胞”用于指其中掺入外源和/或异源核酸的细胞，其稳定掺入以保持掺入细胞的克隆扩增中，或瞬时导入细胞(或细胞群)。这种外源和/或异源核酸可以编码待表达的异源蛋白质，或者它可以影响编码酶的基因的基因表达的抑制或减少，或者功能失调或无活性酶的表达，或者具有活性降低的酶。

放弃的权利要求

为了在不过度延长说明书的情况下提供全面的公开，申请人在此通过引用并入上述引用的每个专利和专利申请作为参考。

上述详细实施方案中的要素和特征的特定组合仅是示例性的；这些教导与本文中的其他教导的交换和替换以及通过引用并入的专利/申请也被明确考虑。如本领域技术人员将认识到的，在不脱离所要求保护的本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以想到本文所述内容的变化、变型和其他实施方式。因此，上述描述仅是作为实施例而不是限制性的。本发明的范围由以下权利要求及其等同方案限定。此外，在说明书和权利要求中使用的参考标记不限制所要求保护的本发明的范围。

实施例和附图简述

在从属权利要求中公开了本发明的目的的其他细节、特征、特性和优点，以及相应的附图和实施例的以下描述，其以示例性方式示出了本发明的优选实施方案。然而，这些附图决不应理解为限制本发明的范围。

附图

图1：家兔单次输注人IgG和去糖基化人IgG时的平均血清水平(n＝8-10/组)的时程。

图2：家兔单次输注人IgG和去糖基化人IgG时的个体C_max(n＝8-10/组)。

图3：家兔单次皮下注射两个批次的在O-乙酰化方面不同(批次1具有高O-乙酰化，批次2具有低O-乙酰化)的Fc融合蛋白

(阿巴西普)时的平均血清水平(n＝11/组)的时程。

图4：家兔中单次皮下注射两个

批次时的个体AUC(n＝11/组，棒条表示组平均值)。在本文图5-7和10-13中使用的术语“O-乙酰化的水平”表示“唾液酸残基的乙酰化率”，如本文其他地方所定义。

图5：单次皮下注射两个

批次时的平均AUC与O-乙酰化水平之间的相关性(n＝11-14/组)。

图6：家兔中单次皮下注射两个

批次(批次1具有低O-乙酰化，且批次2具有高O-乙酰化)时的个体C_max(n＝1l/组，棒条表示组平均值)。

图7：单次皮下注射两个

批次时的平均Cmax与O-乙酰化水平之间的相关性(n＝11/组)。

图8：去-O-乙酰化后的唾液酸分布(样品A假拟处理对照，样品E去-O-乙酰化

)。

图9：家兔中单次皮下注射假拟修饰或去-O-乙酰化

时的平均血清水平的时程(n＝11-14/组)。

图10：家兔中单次皮下注射假拟修饰或去-O-乙酰化

时的个体AUC和组平均值(n＝11/组，棒条形表示组平均值)。

图11：家兔中单次皮下注射

(假拟修饰和去-O-乙酰化材料)时的平均AUC与O-乙酰化水平之间的相关性(n＝11-14/组)。

图12：家兔中单次皮下注射假拟修饰或去-O-乙酰化

时的个体C_max和组平均值(n＝11-14/组，棒条表示组平均值)。

图13：家兔中单次皮下注射

(假拟修饰和去-O-乙酰化材料)时的平均C_max与O-乙酰化水平之间的相关性(n＝11-14/组)。

图14：去-O-乙酰化后的唾液酸分布(样品1去-O-乙酰化

样品2未处理的对照)。

图15：用

和修饰的

处理后(平均值+SD，n＝10/组)Hb的时程(在基线时标准化为Hb水平)。

图16：用

和修饰的

处理后(平均值+SD，n＝10/组)MCH的时程。

图17：N-或O-乙酰化唾液酸的一些实例。

图18：N-连接聚糖和包含乙酰化唾液酸的O-连接的聚糖的一般结构。N-连接的聚糖连接至内质网中的蛋白质至序列基元中的Asn(Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除Pro之外的任何AA酸)。O-连接的聚糖在高尔基体中的Ser或Thr残基上一次组装一个糖。显然不存在共有基元，但相对于Ser或Thr在-1或+3上存在Pro是有利的。

实施例1：完全去除糖-结构对糖蛋白生物制品的药代动力学的影响

在第一项研究中，研究了完全去除糖结构对糖蛋白生物制剂的药代动力学的影响。对于该实验，使用糖基化的IgG1型单克隆抗体。虽然有证据表明抗体Fc结构域的半乳糖基化对效应细胞的有效募集起作用，但对于糖基化本身、特别是唾液酸的唾液酸化和O-乙酰化的作用对于剩余的特征如药代动力学了解得较少。

为此目的，根据标准方案将人IgG1mAb酶促去糖基化(参见，例如Kim和Leahy2013)，并且在单次i.v.输注后评估药代动力学，如表1中所概括。

表1：家兔中的研究设计、单剂量PK研究

在处理后，采集致密血清样品以密切监测整个时程直至14天，冷冻保存并使用常规ELISA定量人IgG浓度，其已经验证用于此目的。

图1表示除了初始阶段之外，比较未修饰的和去糖基化的IgG的相当类似的时程。谨慎地研究初始阶段，即如图2所示例的C_max，数据显示尽管大多数糖结构不位于蛋白质骨架的外表面，但这些结构不仅可以在募集效应细胞上起作用，而且可以在分布中发挥作用。具体而言，本实施例的结果表明，完全除去所有聚糖降低了最大浓度。

实施例2：具有不同唾液酸O-乙酰化率的不同批次糖蛋白生物制品的的生物利用度差异

测试了两批具有不同O-乙酰化水平的CTLA-FC融合蛋白阿巴西普

在单次皮下施用时的暴露/生物利用度是否不同。对于1号批次，相应的二-O-乙酰化率为11.4％，对于2号批次，相应的二-O-乙酰化率为6.5％。未观察到三-O-乙酰化唾液酸。

表2：家兔中的研究设计、单剂量PK研究

在处理后，采集致密血清样品以密切监测直至14天，冷冻保存并使用常规ELISA定量阿巴西普浓度。

图3显示了在家兔中单次皮下注射两个

批次时的平均血清水平(n＝11/组)的时程(根据制造商说明重构和进一步处理步骤，在

缓冲液中稍做稀释，以使两组的注射体积相同)。图4显示了个体AUC。图5显示了平均AUC与O-乙酰化水平之间的相关性。图6显示了在家兔中单次皮下注射两个

批次的个体AUC。图7显示了单次s.c注射两个

批次时的平均C_max与O-乙酰化合物水平之间的相关性。

图3示例了所用两批的平均血清浓度的时程。显然，尽管施用相同的剂量，但两个批次在所达到的血清浓度方面不同。图4进一步显示了在两组中观察到的动物的个体AUC及其不同的暴露。图5示例了O-乙酰化水平与暴露之间的明显相关性。不仅观察到AUC的差异，图6还示例最大血清浓度也与AUC不同，显然也与C_max相关(图6和7)。因此，较高的O-乙酰化率显然提高了生物利用度。与去糖基化并因此与去唾液酸化/去-O-乙酰化IgG相比，这与实施例1中对IgG观察到的较高C_max一致。

实施例3：降低的唾液酸O-乙酰化率对暴露/生物利用度的影响

在本实施例中，研究了O-乙酰化率与所选糖蛋白生物制剂的暴露/生物利用度之间的因果相关性。

为此，购买足量的单批阿巴西普

重构并脱盐入10mM磷酸钠/1mMMgCl₂缓冲液pH7中。将该批次分成两半。将前半部分与唾液酸-9-O-乙酰基酯酶(AppliedBioTech，Angewandte Biotechnologie GmbH)在37℃下孵育2小时。将第二半部分以相同方式处理，但未添加任何酶。随后通过亲和色谱法除去酯酶。将所得到的两种材料的特征概括在表3和图8中。表4概括了用于比较这两种材料的研究设计。

^＊使用荧光化合物1，2-二氨基-4，5-亚甲基-二氧基苯(DMB)标记的唾液酸的HPLC；^＊＊IEC：阳离子交换色谱法；^＊＊＊SEC：尺寸排阻色谱法

表3：去-O-乙酰化和假拟处理的

的表征：

表4：家兔中的研究设计、单剂量PK研究

在处理后，使用致密血清采样(以高频采样，使得接近和可靠地检测随时间变化的血清水平)以密切监测直至14天，其中冷冻保存样品并使用常规ELISA定量

然后分两批次给家兔皮下施用剂量。结果如图9-13中所示。平均血清浓度的时程(图9)、相应的个体AUC(图10、图11)清楚地显示降低的O-乙酰化率导致生物利用度降低。对于具有降低的较低O-乙酰化率的材料，C_max也较低(图12，图13)。

实施例4：具有降低水平的O-乙酰化唾液酸的ESA的增加的效能

作为红细胞生成刺激剂的典型实例，选择

(达依泊汀α)。

是高度唾液酸化的并且也带有O-乙酰化唾液酸。选择大鼠作为模型，因为对人类获得的结果具有极好的预测性。作为注射途径，再次选择皮下注射，其代表临床实践的典型途径。选择剂量范围以便也遵循临床实践。

为了制备体内测试的去-O-乙酰化

使用

简言之，合并几个注射器以提供约1mg达依泊汀起始材料，通过透析将其缓冲液更换为含有140mM NaCI的50mM磷酸钠缓冲液pH 7.6，然后与1ml孵育＝用1U的唾液酸9-O-乙酰基酯酶在37℃处理20h。

温育后，在抗Epo抗体柱上通过亲和色谱法除去酶。将柱洗脱液再次与含有140mMNaCl的20mM磷酸钠缓冲液pH 6.2进行缓冲液交换，过滤灭菌，等分并储存在-60℃以下直至用于处理动物，如本实施例所示。通过RP-HPLC进行含量测定。通过RP-HPLC测量的浓度为0.136mg/ml，其用作计算给药剂量的基础。

通过LC-MS分析去-O-乙酰化

以确定酶处理和控制完整蛋白质结构的效率。没有检测到具有O-乙酰化唾液酸的种类，表明有效的去-O-乙酰化。否则，光谱显示预期的糖基化种类，其具有在所有五个N-连接位点处携带四触角、四唾液酸聚糖结构的高丰度分子和一个二唾液酸化的O-连接聚糖(具有22个唾液酸的种类)，并且通常具有高度唾液酸化。糖型的分布也与唾液酸聚糖图谱的结果定性一致。

唾液酸的分析通过DMB标记和RP-HPLC进行。得到的色谱图如图14所示，与未处理的

样品进行比较。该分析表明去-O-乙酰化非常有效，因为只能检测到相当于单-或二-O-乙酰化唾液酸的极低强度峰。去-O-乙酰化材料的进一步表征在于也在冻融循环时聚集和聚糖分析(通过离子交换色谱的唾液酸聚糖图谱)。将两种所得材料的特征概括在表5中。

n.d.：未检测，^＊使用荧光化合物1，2-二氨基-4，5-亚甲基-二氧基苯(DMB)标记的唾液酸的RP-HPLC；^＊＊用2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记的聚糖的阳离子交换色谱法；^＊＊＊SEC：尺寸排阻色谱法

表5：去-O-乙酰化和未处理的

的表征

选择大鼠作为比较物种，因为对人类获得的结果具有极好的预测性。作为注射途径，选择皮下注射，其代表临床实践的典型途径。选择剂量范围以便也遵循临床实践。

由于PD读数的灵敏度，在本实施例中进一步改进了研究设计。除了高度特异性的酶促修饰之外，给药考虑了通过修饰改变分子量。天然

均分子量约为37,100Da。在完全去-O-乙酰化的情况下，MW降低至约36,366Da。虽然在前述实施例中剂量是基于重量的(mg/kg)，但是在本研究中基于施用的分子数量，即等摩尔给药，从而考虑到分子量的1-2％变化(表6)。

表6：大鼠中的研究设计、单剂量PK研究

将动物饲养在标准条件下，并用表6中详述的单次注射处理。在给药之前随机进行治疗组的分配。从尾静脉采血并使用标准血液学设备进行分析。

表7概括了大量

批次中观察到的O-乙酰胺的最低水平，其示例了Neu5Ac的O-乙酰化在O-乙酰化的总体平均水平方面始终起主要作用。

表7：对

观察到的O-乙酰化的最低水平

为了补偿组之间Hb的最小基线差异，即在治疗之前，图15示例了作为基线水平的％观察到的Hb。数据表明，与天然

相比，用修饰的

治疗后Hb略有增加。在测试的所有三个剂量水平下始终观察到更明显的增加。

为了更深入地了解Hb增加的细节，检查了网织红细胞和红细胞计数。出乎意料的是，用修饰的

治疗的组中RBC增加水平略低于

治疗组中观察到的水平。

因此，如图16所示例的分析MCH。令人惊讶的是，与治疗后观察到的Hb增加同步，用修饰的

治疗后的MCH增加比天然

更明显。

因此，与未经修饰的ESA相比，具有去乙酰化或去乙酰化唾液酸的ESA显示出较不明显的RBC增殖刺激，但是在所得RBC中MCH增加。

由于红细胞通过暴露促凝血磷脂参与止血(Peyrou等人，1999)，因此ESA介导的RBC增加导致心血管风险增加。然而，ESA治疗的治疗目标是增加血液的氧容量，而不一定是RBC的增加。常规的ESA治疗通过刺激RBC增殖来实现这一点，因此导致更高的氧容量。

本发明人已经证实，具有去乙酰化或去乙酰化唾液酸的ESA仍然增加血液的氧容量，然而，不将RBC增加到与常规ESA相同的程度，但是通过增加MCH，即每平均Hb载量/RBC。这种方法可能有助于减少与ESA治疗同时出现的副作用，如心血管风险增加。

不受理论束缚，一种解释可能是在成熟期间加载到RBC中的Hb的量可以不同。虽然一些以低色素性贫血为特征的病症表现出正常的RBC计数，但Hb低，因为相对于RBC的体积，Hb的比例不成比例地减少，显而易见，具有去酰化或去乙酰化的唾液酸的ESA导致出现相反的现象的方面在于Hb/RBC的填装增加。

通常，唾液酸是已知在许多生物过程中起重要作用的糖结构的实例。治疗性蛋白质的遗传修饰以增加唾液酸化水平是成功的且经常使用的方法，以最大化由施用剂量引起的暴露。令人惊讶的是，ESA中唾液酸的O-乙酰化水平的降低一方面连续地导致较低的暴露/生物利用度水平，但同时在MCH方面导致效能增加。这是出乎意料的，因为有关促红细胞生成素的出版物表明唾液酸的O-乙酰化实际上增加了半衰期(Shahrokh等人，2011)。

因此，人们可以预期，具有较低水平的唾液酸O-乙酰化的ESA在氧容量方面具有较低的效能，但观察到的效果则相反。

参考文献

Reuter和Schauer(1994)，Methods in enzymology第230卷，p.168-199

Kim和Leahy(2013)，Methods in enzymology第533卷p.259-63

Sojar和Bahl(1987)，Arch Biochem Biophys.Nov 15；259(1)：52-7

Johnson和Jolliffe(2000)，Nephrol.Dial.Transplant.15卷(9)p.1274-1277

Middleton等人(1999)，J.Biol.Chem.第274卷(20)p.14163-14169

Baumann等人(2015)，Nature communications 6卷p.7673

Peyrou等人(1999)，Thromb Haemost.第81卷(3)：400-406

Gaj等人(2013)，Trends in biotechnology第31卷(7)p.397-405

Shahrokh等人(2011)Molecular pharmaceutics第8卷(1)p.286-96

Claims

1.包含唾液酸残基的O-乙酰化率降低的选自促红细胞生成素、修饰的促红细胞生成素或促红细胞生成素模拟物的促红细胞生成刺激剂(ESA)用于增加红细胞平均血红蛋白含量(MCH)的体外用途。

2.包含唾液酸残基的O-乙酰化率降低的选自促红细胞生成素、修饰的促红细胞生成素或促红细胞生成素模拟物的促红细胞生成刺激剂(ESA)在制备治疗与降低的红细胞平均血红蛋白含量(MCH)相关的病症的药物中的用途。

3.根据权利要求2的促红细胞生成刺激剂(ESA)的用途，其中所述的病症为与正常的红细胞(RBC)计数但血红蛋白(Hb)低相关的病症。

4.根据权利要求2或3的任一项的促红细胞生成刺激剂(ESA)的用途，其中所述的病症为低色素性贫血。