KR20230048469A - 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 당단백질 - Google Patents
시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 당단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에리트로포이에틴 수용체 (EpoR)와 상호작용하거나 또는 그에 대한 효능제로서 작용하며, 변형된 효능을 갖는 당단백질을 제조하는 방법 또는 공정이며, 여기서 방법 또는 공정은 적합한 발현 시스템에서의 상기 당단백질의 이종 발현을 포함하고, 여기서 당단백질에서의 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 유발하는 적어도 하나의 단계가 제공되는 것인 방법 또는 공정에 관한 것이다 (도 16).
Description
본 발명은 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 당단백질에 관한 것이다.
시알산은 9-탄소 골격을 갖는 모노사카라이드인 뉴라민산의 N- 또는 O-치환된 유도체에 대한 총칭이다. N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac) 다음으로, 가장 빈번한 종은 N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc) 및 O-아세틸화된 유도체이다.
시알산은 동물 조직에, 및 식물 및 진균으로부터 효모 및 박테리아에 이르는 다른 유기체에 보다 적은 정도로, 주로 이들이 후자에 결합된 글리칸의 말단에서 발생하는 당단백질에 폭넓게 분포되어 발견된다.
단백질에의 글리칸의 공유 결합은 프로테옴의 다양성이 크게 증가될 수 있는 진화적 메카니즘을 제시한다. 다수의 다양한 메카니즘이 단백질의 글리코실화에 대해 진화된 상황은 이러한 유형의 단백질 변형의 진화적 이익 및 전체적인 관련성에 대해 논증한다. 이러한 메카니즘의 범위는 비-효소적 당화반응으로부터 여러 효소적 변형을 포함하는 다중-단계 및 다중-세포 구획 프로세스인 복잡한 번역후 글리코실화에 이른다.
도 17은 시알산 패밀리를 제시한다. 하나의 시알산 분자는 1개 또는 여러 개의 아세틸 기를 운반할 수 있다. N-아세틸-뉴라민산은 그의 가장 통상적인 것이다.
아세틸화된 시알산은 많은 생물학적 현상에 관여하는 것으로 보인다. 당구조는 단백질-단백질 상호작용에서 역할을 하며, 이는 정확한 기능적 형태로의 폴딩에 대한 전제조건일 수 있다. 또한 소위 "종양태아성 항원"의 일부로서 발달 및 악성종양 동안의 발현의 그들의 우세 및 가변성은 수많은 생리학적 및 병리학적 프로세스에서의 그들의 참여를 시사한다. 놀랍지 않게, 단백질에의 글리칸 모이어티의 합성 또는 부착을 손상시키는 유전적 결함은 다중 인간 질환을 초래한다. 이들 당구조는 추가로 변형됨으로써, 추가의 다양화를 도입할 수 있다. 이러한 변형의 한 예는 아세틸화이다. 세포 상호작용의 강력한 조절제로서의 그의 역할은 아세틸화를 세포 기능의 다른 생화학적 조절, 예컨대 단백질 인산화, 또는 N-아세틸글루코스아민 (GlcNAc)으로의 변형 및 메틸화로 분류한다.
시알산의 아세틸화는 글리코실화의 다양성을 자명하게 추가로 증가시키며, 즉, 내인성으로, 부착된 당은 추가적으로 효소적으로 변형된다. 시알산은 말단 글리칸의 이러한 변형에 대한 원형적 예이며, 아세틸화는 이러한 추가의 변형의 널리 퍼진 유형이다. 천연 발생 시알산은 9-탄소 골격을 공유하며, 모든 그들의 히드록실 기에서 아세틸화될 수 있다. 이는 이들이 위치 C4, C7, C8 및 C9에서 아세틸화될 수 있음을 의미한다. 각각의 시알산은 1회 변형될 수 있지만, 또한 단일 시알산의 다중 유도체가 가능하며, 이는 구체적으로 1개 초과의 시알산을 운반하는 당구조에 대한 여러 조합 패턴을 생성한다.
단백질의 기능에 대한 글리코실화의 명백한 중요성 및 변형을 위한 자명하게 중요한 공간을 고려하면, 실질적인 노력은 그들의 글리칸 구조의 표적화된 변형에 의한 단백질의 치료 특성을 최적화하는 것으로 갔다. 최근, 이러한 신세대의 생물제약의 최초 2종의 예는 시판 허가를 달성하였다: 모가물리주맙 (포텔리지오(Poteligeo)®) 및 오비누투주맙 (가지바로(Gazyvaro)® / 가지바(Gazyva)®).
그러나, 글리코실화의 표적화된 변형은 모노클로날 항체에 제한되지 않는다. 다르베포에틴 알파 (아라네스프(Aranesp)®)는 이 경우 연장된 효능, 즉, 감소된 치료 빈도를 초래하는 2개의 시알릴화된 탄수화물 쇄를 첨가하는 것을 통해 또한 구형 단백질의 특징이 개선된 예이다.
그러나, 이들 접근법의 일부는 혈청 반감기 및 다른 인자의 개조에 초점을 맞추는 반면, 좁은 의미에서 효능의 변형은 아직 잠재적인 질적 변형에 대한 초점에 있지 않았다. 이는 특히 혈액의 기체 (산소 / 이산화탄소) 수송 능력을 증가시키는데 사용되는 적혈구생성-자극제 (ESA)에 대해 사실이다.
ESA 요법과 연관된 하나의 주요한 위험은 증가된 사망률이다. 가장 중요한 위험으로서, 심혈관 사건은 헤모글로빈 (Hb)의 높은 증가에서 발생하며, 이는 적혈구 (RBC)에서의 ESA-유발된 증가에 의해 초래되는 것으로 논의된다.
본 발명의 하나의 목적은 치료 당단백질의 효능을 변형시키기 위한 새로운 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 그들의 효능을 증가시키도록 적혈구생성-자극제를 변형시키기 위한 새로운 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 또 다른 목적은 부작용 및/또는 사망률의 감소된 위험을 갖는 적혈구생성-자극제를 변형시키기 위한 새로운 접근법을 제공하는 것이다.
이들 목적은 본 발명의 독립 청구항에 따른 방법 및 수단으로 달성된다. 종속 청구항은 바람직한 실시양태와 관련된다.
Shahrokh Zahra et al., Molecular Pharmaceutics, Vol. 8, No. 1, January 2011, pages 286-296
Hua Serenus et al., Trac, Trends in Analytical Chemistry, Elsevier, Amsterdam, NL, Vol. 68, 25 March 2015, pages 18-27
Christian Reichel and Gunter Gmeiner, Handbook of Experimental Pharmacology/Doping in Sports: Biochemical Principles, Effects and Analysis, Springer Verlag, DE, pages 251-254
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 이러한 발명은 기재된 장치의 특정한 구성성분 부분 또는 기재된 방법의 공정 단계에 제한되지 않음이 이해되어야 하는데, 이는 이러한 장치 및 방법이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한적인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면, 단수 및/또는 복수 언급대상을 포함함을 유념해야 한다. 더욱이, 수치 값에 의해 한계가 정해진 파라미터 범위가 주어지는 경우, 범위는 이들 한계 값을 포함하는 것으로 간주됨이 이해되어야 한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 에리트로포이에틴 수용체 (EpoR)와 상호작용하거나 또는 그에 대한 효능제로서 작용하며, 변형된 효능을 갖는 당단백질을 제조하는 방법 또는 공정이 제공된다. 방법 또는 공정은 적합한 발현 시스템에서의 상기 당단백질의 이종 발현을 포함하고, 여기서 당단백질에서의 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 유발하는 적어도 하나의 단계 또는 특색이 제공된다.
청구된 변형된 효능에 관한 비교는 동일하거나 유사한 아미노산 서열의 시판되는 당단백질로, 또는 그의 천연 숙주에 의해, 또는 적합한 발현 시스템에 의해 발현되는 야생형 당단백질에 대해 수행될 수 있으며, 여기서 야생형 당단백질은 시알산 잔기의 아세틸화율에 영향을 미치도록 변형되지 않았다.
에리트로포이에틴 수용체 (EpoR)는 인간에서 EPOR 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. EpoR은 EPO 반응 세포의 표면 상에서 발견되는 대략 56-57 kDa 단백질을 유발하는 단일 탄수화물 쇄를 갖는 52 kDa 펩티드이다. EpoR은 적합한 리간드의 결합 시 그의 동종이량체화된 상태를 변화시키는 이량체로서 미리-존재한다.
EpoR의 세포질 도메인은 리간드 결합에 의해 초래되는 형태적 변화 시, Jak2에 의해 인산화되는 다수의 포스포티로신을 함유하며, 다양한 세포내 경로 활성화제 및 Stat (예컨대 Stat5)에 대한 도킹 부위로서 기능한다.
EpoR의 주요한 역할은 적혈구 전구체 세포의 증식을 촉진시키고, 적혈구 전구체를 세포 사멸로부터 구조하는 것이다. 그러나, 현재의 증거에 기초하여, EpoR이 생체내에서 적혈구 전구체의 "증식 및 분화"를 직접적으로 초래하는지 여부는 여전히 미지이다.
관여하는 것으로 생각되는 EpoR의 또 다른 역할은 적혈구 분화를 촉진시키는 것이다. EpoR의 PI3-K/AKT 신호화 경로는 GATA-1 활성을 증강시킨다. 하나의 가설은 적혈구 분화가 주로 적혈구 전사 인자, 예컨대 GATA-1, FOG-1 및 EKLF의 존재 및 유도에 의존한다는 것이다.
또한, EpoR은 유사분열촉진 신호화 경로를 활성화시킬 수 있으며, 시험관내에서 적백혈병성 세포주에서의 세포 증식을 초래할 수 있음이 공지되어 있다. EpoR 발현은 조혈 줄기 세포 구획까지 거슬러 연장될 수 있다. 그러나, EpoR 신호화가 충분한 적모세포 수를 생성하기 위해 초기 다능성 전구체에서 허용적인 또는 유익한 역할을 하는지 여부는 미지이다.
용어 "변형된 효능"은 본원의 다른 곳에서 논의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시알산 잔기의 아세틸화율"은 1개 이상의 아세틸 잔기를 운반하는 주어진 당단백질 유형의 시알산의 전체적인 백분율을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 용어는 이들 시알산 상의 O-아세틸 잔기에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "당단백질"은 폴리펩티드 측쇄에 공유적으로 부착된 올리고사카라이드 쇄 (글리칸)를 함유하는 단백질 및 펩티드를 지칭한다. 탄수화물은 번역동시 또는 번역후 변형에서 단백질에 부착된다. 이러한 프로세스는 글리코실화로 공지되어 있다.
바람직하게는, 감소된 아세틸화는 감소된 O-아세틸화이다. 이는 용어 아세틸화가 인용된 본원에 개시된 모든 실시양태에 대해 적용된다. 모든 경우, O-아세틸화는 바람직한 실시양태이다.
한 실시양태에서, 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 유발하는 단계 또는 특색은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다
a) 상기 당단백질의 글리칸에서의 시알산 잔기의 탈아세틸화,
b) 아세틸화된 시알산 잔기의 감소를 유발하는, 상기 당단백질의 전체적인 글리코실화의 감소,
c) 탈아세틸화된 또는 비-아세틸화된 시알산 잔기를 갖거나 또는 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 당단백질을 발현할 수 있는 발현자 세포주의 사용,
d) 탈글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는 당단백질을 발현할 수 있는 발현자 세포주의 사용,
e) 상기 당단백질의 글리칸에서의 시알산 함량의 감소, 및
f) 시알산의 감소된 양이 감소되었거나 또는 시알산이 결여된 당단백질을 발현할 수 있는 발현자 세포주의 사용.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현자 세포주"는 당단백질을 동종으로 또는 이종으로 발현할 수 있는 세포주에 관한 것이다.
바람직하게는, 단계/특색 a), b 및 e)는, 예를 들어, 당단백질의 번역후 효소적 또는 화학적 처리에 의해 수행되는 시험관내 공정에 관한 것이다.
시알산 잔기의 탈아세틸화 (단계 또는 특색 a)는, 예를 들어, 적합한 아세틸에스테라제로의 번역후 처리에 의해 달성될 수 있다. 한 예는 인간에서 염색체 11 상에 위치한 SIAE 유전자에 의해 코딩되는 시알레이트 O-아세틸에스테라제 (SIAE)이다. SIAE는 모 시알산의 위치 9로부터의 O-아세틸 에스테르 기의 제거를 촉매한다.
그러나, 다른 유기체, 및 다른 발현자 세포주는 다른 유형의 아세틸에스테라제를 갖는다. 시알레이트 O-아세틸에스테라제는 엑스파시 (Expasy) 효소 엔트리 EC 3.1.1.53에 개시되어 있다. 이들 효소는 그 중에서도 하기 반응을 촉매한다:
N-아세틸-O-아세틸뉴라미네이트 + H(2)O <=> N-아세틸뉴라미네이트 + 아세테이트
따라서, 본원에 개시된 교시에 기초하여 각각의 유기체, 및 다른 발현자 세포주에서 각각의 아세틸트랜스퍼라제를 침묵시키거나, 결실시키거나, 돌연변이시키는 것은 통상의 기술자의 상용 작업이다.
전체적인 글리코실화의 감소 (단계 b)는, 예를 들어, NANase II, 엔도글리코시다제 H, O-글리코시다제, 및/또는 펩티드-N-글리코시다제 F (PNGase F)와 같은 적합한 효소로의 번역후 처리에 의해 달성될 수 있다. 프로토콜은 문헌 [Kim & Leahy (2013)]에 기재되어 있다. 트리플루오로메탄술폰산을 사용하는 당단백질의 탈글리코실화에 대한 화학적 접근법은 문헌 [Sojar H & Bahl (1987)]에 개시되어 있다.
일반적으로, 탈-글리코실화는 당단백질로부터 모든 글리칸, 따라서 각각 모든 시알산 잔기, 또는 그들의 아세틸 치환기를 제거한다. 따라서, 탈글리코실화는 사실상 시알산에 접합된 아세틸 잔기의 제거를 유발하며, 따라서, 유사한 효과를 갖는다.
당단백질의 글리칸 중의 시알산 함량의 감소는 WO2011061275A1에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.
단계/특색 c)는 바람직하게는 (i) 그 자체로 감소된 아세틸화를 나타내는 (즉, 아세틸화율이 인공적으로 조작되지 않은), 또는 (ii) 번역후 단백질 변형 동안 시알산 잔기의 아세틸화가 영향을 받도록 하는 방식으로 변형된 발현자 세포주를 지칭한다.
이는, 예를 들어, 시알산 아세틸화를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현, 또는 시알산 아세틸화를 촉매하는 기능이상적 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 시알산 아세틸화를 촉매하는 효소의 발현의 억제 또는 감소에 의해 달성될 수 있다.
단계/특색 d)는 바람직하게는 예를 들어 단백질 글리코실화가 영향을 받도록 하는 방식으로 변형된 발현자 세포주를 지칭한다.
이는, 예를 들어, 그것이 탈글리코실화를 촉매하는 이종 또는 동종 효소를 발현하거나, 과다발현하도록 하는 방식으로 발현자 세포주를 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
탈글리코실화를 촉매하는 효소에 대한 예로는 NANase II, 엔도글리코시다제 H, O-글리코시다제, 및/또는 펩티드-N-글리코시다제 F (PNGase F)를 들 수 있다. 적합한 발현자 세포주에서의 이들 유전자 중 임의의 것의 과다발현, 또는 적합한 발현자 세포주에서의 이종 발현은 번역후 단백질 변형 동안 탈글리코실화를 유발한다.
상기 이종 발현은, 예를 들어, 각각의 효소를 코딩하는 벡터로의 세포의 비-일시적 형질감염을 비롯한 유전적 조작 기법에 의해 달성될 수 있다.
상기 동종 과다발현은, 예를 들어, 코딩 유전자의 상류에 삽입된 적합한 프로모터에 의해 각각의 효소를 코딩하는 내재적 유전자의 유도된 과다발현을 비롯한 유전적 조작 기법에 의해 달성될 수 있다.
상기 결실 또는 돌연변이유발은 본원의 다른 곳에 기재된 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명자들이 본원에 제시한 바와 같이, 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 본 발명에 따른 당단백질은 동일한 치료 효과를 달성하면서 보다 낮은 용량을 적용하는 기회를 제공한다. 이는 보다 적은 양의 당단백질을 환자에게 적용함으로써 비용 절감을 유발하며, 원하지 않는 부작용, 예컨대 항체의 형성의 위험을 감소시킨다. 보다 낮은 용량을 적용하는 가능성은 또한 환자에게 주어지는 부피를 감소시키며, 이는 이러한 치료제에 대한 추가의 이익을 추가하고, 환자 순응도를 증가시킨다.
또한, 시알산의 감소된 아세틸화율을 갖는 본 발명에 따른 당단백질은 ESA 요법과 연관된 주요한 위험, 즉, 증가된 사망률을 감소시킬 수 있다. 가장 중요한 위험으로서, 심혈관 사건은 Hb의 높은 증가에서 발생하며, 이는 RBC의 ESA-유발된 증가에 의해 초래되는 것으로 논의된다. 본 발명에 따른 당단백질로의 요법은 상기 평균 적혈구 헤모글로빈 (MCH)의 증가를 유발하는 반면, RBC 증가는 덜 현저하다. 함께 취해져, 이는, 예를 들어 일반적으로 심혈관 안전성 및 사망률에 관한 바람직한 안전성 프로파일을 초래한다.
한 실시양태에서, 당단백질은 적혈구생성-자극제 (ESA)이다. 바람직한 실시양태에서, 적혈구생성-자극제 (ESA)는 에리트로포이에틴, 변형된 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 모방체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에리트로포이에틴"은 상이한 야생형 에리트로포이에틴 (에포에틴 α, 에포에틴 β, 에포에틴 γ, 에포에틴 δ, 에포에틴 ε, 에포에틴 ζ, 에포에틴 θ, 에포에틴 κ 또는 에포에틴 ω)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 에리트로포이에틴"은 구조적으로 및/또는 서열-방식으로, 야생형 에리트로포이에틴에 의존하지만, (i) 그의 아미노산 서열, 그의 (ii) 글리코실화 패턴에서 또는 (iii) 다른 모이어티의 첨가에 의한 구조적 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 그와 같은 에리트로포이에틴 수용체와의 그의 효능작용적 상호작용에 영향을 미치지 않지만, 상기 효능작용적 상호작용을 변형시키거나, 생체이용률, 혈청 반감기, 조직 분포, 효능, 저장 기간 등과 같은 그의 다른 물리-화학적, 약리학적 또는 PK/PD 특성을 변형시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에리트로포이에틴 모방체"는 에리트로포이에틴 수용체와 효능작용적으로 상호작용하는 단백질 및 펩티드를 지칭한다. 에리트로포이에틴 모방체는 그 중에서도 문헌 [Johnson, & Jolliffe (2000)], 및 US8642545B2에 개시되어 있다. 연구는 각각 거의 동등한 크기의 세포외 및 세포내 도메인 사이에 위치한 단일 막횡단 절편을 갖는 484-아미노산 당단백질인 EPO 수용체에서, Phe93이 EPO에 결합하는 것, 뿐만 아니라 에리트로포이에틴 모방체 펩티드에 결합하는 것에 중요함을 제시한 바 있다 (Middleton et al. 1999).
매우 자명하게, 변형된 에리트로포이에틴 및 에리트로포이에틴 모방체는 큰 중첩을 갖는 2종의 부류이다. 따라서, 일부 변형된 에리트로포이에틴은 또한 에리트로포이에틴 모방체로 간주될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 에리트로포이에틴 또는 변형된 에리트로포이에틴은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다:
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 변형된 효능은 생리학적 효능 또는 치료 효능이다. 바람직하게는, 변형된 치료 효능은 MCH의 상대적 증가 및/또는 헤모글로빈 (Hb) 합성의 상대적 자극이다.
본 발명의 추가의 또 다른 실시양태에서, 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 유발하는 단계는 또한 당단백질의 생체이용률, 노출, 혈청 반감기 또는 절대 혈청 농도에 영향을 미친다.
본 발명자들은 예를 들어 Hb 수준에 의해 측정된 바로 심지어 보다 낮은 노출을 과보상하는 정도로 제시된 바와 같이, 시알산 아세틸화의 감소가 비-변형된 ESA에 비해 한편으로는 ESA의 생체이용률을 감소시키지만, 동시에 MCH를 증가시킬 수 있음을 보였다. 따라서, 외견상 Hb의 관점에서 비-생산적이지만, 생체이용률의 감소는 놀랍게도 감소된 Hb로 해석되지는 않는다. 실시예는 감소된 노출이 심지어 변형된 ESA로의 처리로부터 유발되는 증가된 MCH에 의해 과보상됨을 제시한다. 이는 다중 결과를 가질 수 있다. 제조 관점에서, 환자 혈구생성을 교정하는데 요구되는 단백질의 보다 낮은 용량은 상품의 보다 낮은 비용으로 해석될 수 있다. 환자 관점에서, 신속한 소거로 인한 감소된 노출과 함께 이러한 보다 낮은 용량은 추가의 이익을 암시할 것이다. 치료 단백질에의 노출은 항-약물 항체 (ADA)를 발생할 개체의 위험과 상관된다. ESA의 경우, 이러한 ADA 형성의 가능성은 전형적으로 낮다. 따라서, 보다 낮은 노출은 또한 면역원성 위험을 감소시킬 것이다. 마지막으로 및 가장 중요하게는, RBC의 그렇지 않다면 오히려 선형 증가 없는 Hb의 증가는 Hb 상승을 증가된 혈전증 위험으로부터 분리시킨다.
본 발명의 한 실시양태에서, 변형된 당단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 갖는다:
a) ≤ 10 %의 절대 아세틸화율, 및/또는
b) ≥ 50 %만큼 감소된 아세틸화율.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "절대 아세틸화율 (%)"은 1개 이상의 O-아세틸화를 운반하는 주어진 당단백질 유형의 시알산의 전체적인 백분율을 지칭한다. 본 개시내용의 의미에서, 부분적 또는 전체적 탈글리코실화는 또한 아세틸화율의 감소를 유발할 것임을 강조하는 것은 중요하다.
바람직하게는, 절대 아세틸화율은 ≤ 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 %이다. 가장 바람직하게는, 절대 아세틸화율은 0 %이다. 이러한 실시양태에서, 주어진 당단백질의 모든 글리칸의 시알산은 완전히 탈아세틸화되거나 또는 비-아세틸화된다.
그러나, 일부 조건 하에서, 절대 아세틸화율은 동시에 0.1; 0.2; 0.3; 0.4 또는 0.5 %보다 작지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "X %만큼 감소된 아세틸화율"은 (i) 동일하거나 유사한 아미노산 서열의 시판되는 당단백질에 비해, 또는 (ii) 그의 천연 숙주에 의해, 또는 적합한 발현 시스템에 의해 발현되는 동일하거나 유사한 아미노산 서열의 야생형 당단백질에 대해 1개 이상의 아세틸 기를 운반하는 주어진 당단백질 유형의 시알산의 상대적 감소를 지칭하며, 여기서 또한 어느 경우든, 각각의 시판되는 당단백질 또는 야생형 당단백질은 시알산 잔기의 아세틸화율에 영향을 미치도록 변형되지 않았다.
바람직하게는, 아세틸화율은 ≥ 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 %만큼 감소된다.
그러나, 일부 조건 하에서, 아세틸화율은 99; 98; 97 또는 96 % 초과만큼 감소되지 않아야 한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 ESA (다르베포에틴 알파)의 절대 아세틸화율은 < 1 %인 반면, 동일하거나 유사한 아미노산 서열의 시판되는 ESA (아라네스프®)는 29.5 %의 절대 아세틸화율을 갖는다. 따라서, 아세틸화율은 동일하거나 유사한 아미노산 서열의 시판되는 ESA의 그것의 약 3 %로 감소된다.
바람직하게는, 아세틸화율은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법으로 결정된다:
아세틸화율 결정에 적합한 방법의 개관에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Reuter and Schauer (1994)]을 참조한다. 아세틸화율의 감소가 간접적으로, 즉, 부분적 또는 총 글리코실화에 의해 달성된 경우, 아세틸화율은 또한 그 중에서도 트리플루오로메탄 술폰산으로의 화학적 탈글리코실화 (문헌 [Sojar & Bahl (1987)]에 개시됨)로 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 에리트로포이에틴 수용체 (EpoR)와 상호작용하거나 또는 그에 대한 효능제로서 작용하며, 변형된 효능을 갖는 당단백질이 제공된다. 당단백질은 상기 설명에 따른 방법 또는 공정으로 제조된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 또는 동물 환자 또는 대상체의 치료용 의약의 제조를 위한 이러한 당단백질의 용도가 제공된다. 대안적으로, 인간 또는 동물 환자 또는 대상체의 치료를 위한 이러한 당단백질의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 제약 유효량으로의 상기 설명에 따른 당단백질의 투여를 포함하는, 인간 또는 동물 환자 또는 대상체의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 제약상 허용되는 담체 중의 상기 설명에 따른 당단백질을 포함하는 제약 제제가 제공된다.
증가된 효능 때문에, 이러한 제제는 보다 적은 용량 또는 부피로 투여될 수 있으며, 이는 다시 약물 응집 위험을 감소시키고, 저장 기간을 증가시키고, 저장 필요를 감소시키고, 투여 관련된 불편을 감소시키고, 환자 순응도를 증가시키는 것을 도울 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 인간 또는 동물 환자 또는 대상체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환 또는 증상을 앓고 있고/거나, 이를 발생할 위험이 있고/거나, 이로 진단된다:
상기 빈혈은 상이한 기원, 예를 들어, 신장 질환 결핍, 방사선요법, 암, 예컨대 골수 억제 화학요법이 있거나 없는 골수이형성 증후군, 철 또는 철 대사 결핍, 투석전에서의 증상적 빈혈, 또는 골수 결핍 또는 질환을 가질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 인간 또는 동물 환자 또는 대상체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태의 대상체이거나 또는 치료를 받고 있다:
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 설명에 따른 당단백질의 이종 발현을 위한 세포로서,
a) 탈아세틸화된 또는 비-아세틸화된 시알산 잔기를 갖거나 또는 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 당단백질을 발현할 수 있고/거나,
b) 탈글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는 당단백질을 발현할 수 있는
세포가 제공된다.
한 실시양태에서, 탈아세틸화된 또는 비-아세틸화된 시알산 잔기를 갖거나 또는 시알산 잔기의 감소된 아세틸화율을 갖는 당단백질의 발현은 하기 중 적어도 하나에 의해 달성된다:
a) 시알산 아세틸화를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소,
b) 시알산 아세틸화를 촉매하는 기능이상적 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 시알산 아세틸화를 촉매하는 효소의 발현,
c) 시알산 아세틸화를 촉매하는 효소의 활성의 억제 또는 감소, 및/또는
d) 시알산 잔기의 탈아세틸화를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 이종 발현 또는 동종 과다발현.
바람직하게는, 옵션 a)-c)의 상기 효소는 시알산 O-아세틸화를 촉매한다. 이러한 효소에 대한 예를 하기 목록에 제시되지만, 이는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다:
이들 효소는, 예를 들어, 하기 유형의 반응을 촉매한다:
아세틸-CoA + N-아세틸뉴라미네이트 -> CoA + N-아세틸-7-O(또는 9-O)-아세틸뉴라미네이트
아세틸-CoA + 시알산의 알파-2,8-연결된 중합체 -> CoA + O-7 또는 O-9에서 아세틸화된 폴리시알산
적합한 인간 발현자 세포주에서의 상기 유전자의 침묵, 결실 또는 돌연변이유발은 결여적 또는 기능이상적 효소를 유발하며, 이는 다시 번역후 단백질 변형 동안 시알산 잔기의 감소되거나 결여된 아세틸화를 초래한다.
그러나, 다른 유기체, 및 다른 발현자 세포주는 다른 유형의 시알산 아세틸트랜스퍼라제를 갖는다. 따라서, 본원에 개시된 교시에 기초하여 각각의 유기체 또는 발현자 세포주에서의 각각의 아세틸트랜스퍼라제를 침묵시키거나, 결실시키거나, 돌연변이시키는 것은 통상의 기술자의 상용 작업이다.
바람직하게는, 옵션 d)의 상기 효소는 시알산의 탈-o-아세틸화를 촉매한다. 이러한 효소에 대한 예를 하기 목록에 제시되지만, 이는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다:
이들 효소는 그 중에서도 하기 반응을 촉매한다:
N-아세틸-O-아세틸뉴라미네이트 + H2O -> N-아세틸뉴라미네이트 + 아세테이트
인간 시알레이트 O-아세틸에스테라제 (SIAE)는 예를 들어 염색체 11 상에 위치한 SIAE 유전자에 의해 코딩된다. SIAE는 모 시알산의 위치 9로부터의 O-아세틸 에스테르 기의 제거를 촉매한다.
적합한 인간 발현자 세포주에서의 상기 목록으로부터의 유전자의 과다발현, 또는 비-인간 발현자 세포주에서의 이종 발현은 번역후 단백질 변형 동안 시알산 잔기의 번역후 탈아세틸화를 유발한다.
그러나, 다른 유기체, 및 다른 발현자 세포주는 다른 유형의 아세틸에스테라제를 갖는다. 따라서, 본원에 개시된 교시에 기초하여 각각의 유기체 또는 발현자 세포주에서 각각의 아세틸트랜스퍼라제를 침묵시키거나, 결실시키거나, 돌연변이시키는 것은 통상의 기술자의 상용 작업이다.
한 실시양태에서, 탈글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는 당단백질의 발현은 탈글리코실화를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 이종 발현 또는 동종 과다발현에 의해 달성된다.
한 실시양태에서, 유전자 발현의 억제 또는 감소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전적 조작 단계에 의해 달성되었다:
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자 발현"은 mRNA로의 DNA 전사, mRNA 프로세싱, 비-코딩 mRNA 성숙, mRNA 외수송, 번역, 단백질 폴딩 및/또는 단백질 수송으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함하는 것을 의미한다.
유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소는, 예를 들어, 특이적 프로모터-관련된 리프레서의 사용에 의한, 주어진 프로모터의 부위 특이적 돌연변이유발에 의한, 프로모터 교환, 또는 번역의 억제 또는 감소에 의한, 예를 들어, RNAi 유도된 전사후 유전자 침묵에 의한 DNA 전사의 억제 또는 감소를 포함하나 이에 제한되지 않는 유전자 발현을 직접적으로 간섭하는 방법을 지칭한다. 기능이상적 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 효소의 발현은, 예를 들어, 부위 특이적 또는 무작위 돌연변이유발, 코딩 유전자 내의 삽입 또는 결실에 의해 달성될 수 있다.
효소의 활성의 억제 또는 감소는, 예를 들어, 단백질 발현 전에 또는 그와 동시에 각각의 효소에 대한 억제제의 투여, 또는 그와 함께의 인큐베이션에 의해 달성될 수 있다. 이러한 억제제에 대한 예로는 억제성 펩티드, 항체, 압타머, 융합 단백질 또는 상기 효소에 대한 항체 모방체, 또는 그의 리간드 또는 수용체, 또는 억제성 펩티드 또는 핵산, 또는 유사한 결합 활성을 갖는 소분자를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. N-아세틸뉴라미네이트 7-O(또는 9-O)-아세틸트랜스퍼라제 활성에 대해 문헌에 기재된 일부 억제제는 아이오도아세테이트, CoA, 디에틸 카르보네이트, N-브로모숙신이미드, 트리톤 X-100 또는 p-클로로머큐리벤조에이트이다.
효소를 억제하는 다른 방식은 배지 중에서의 효소의 특이적 조인자의 감소를 포함한다.
유전자 침묵, 유전자 녹-다운 및 유전자 녹-아웃은 유전자의 발현이 유전적 변형을 통해 또는 mRNA 전사체 또는 유전자 중 어느 하나에 대해 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로의 처리에 의해 감소되는 기법을 지칭한다. DNA의 유전적 변형이 수행되는 경우, 결과는 녹-다운 또는 녹-아웃 유기체이다. 유전자 발현의 변화가 mRNA에의 올리고뉴클레오티드 결합 또는 일시적으로 유전자에의 결합에 의해 유발되는 경우, 이는 염색체 DNA의 변형 없이 유전자 발현의 일시적 변화를 유발하며, 일시적 녹-다운으로 지칭된다.
또한 상기 용어에 의해 포괄되는 일시적 녹-다운에서, 활성 유전자 또는 그의 전사체에의 이러한 올리고뉴클레오티드의 결합은 전사의 차단 (유전자-결합의 경우), mRNA 전사체의 분해 (예를 들어 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 RNase-H 의존적 안티센스에 의해) 또는 다른 기능적 RNA, 예컨대 miRNA의 성숙에 사용되는 mRNA 번역, 프리-mRNA 스플라이싱 부위 또는 뉴클레아제 절단 부위 중 어느 하나의 차단 (예를 들어, 모르폴리노 올리고 또는 다른 RNase-H 독립적 안티센스에 의해)을 통해 감소된 발현을 초래한다. 다른 접근법은 shRNA (작은 헤어핀 RNA, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 조밀한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열임), esiRNA (엔도리보뉴클레아제-제조된 siRNA, 이는 긴 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 절단으로부터 유발되는 siRNA 올리고와 엔도리보뉴클레아제의 혼합물임)의 사용, 또는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)의 활성화를 포함한다.
본 맥락에서 사용될 수 있는 유전적 변형에 대한 또 다른 접근법은 CRISPR Cas (Baumann et al., 2015), TALEN 또는 ZFN (Gaj et al., 2013)의 사용을 포함한다.
유전자 침묵, 녹-다운 또는 녹-아웃을 수행하는 다른 접근법은 각각의 문헌으로부터 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 맥락에서 그들의 적용은 상용 작업으로 간주된다.
유전자 녹-아웃은 유전자의 발현이 완전히 차단되는, 즉, 각각의 유전자가 비작동적이거나, 심지어 제거되는 기법을 지칭한다. 이러한 목표를 달성하기 위한 방법론적 접근법은 많으며, 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예는 주어진 유전자에 대한 우성적으로 음성인 돌연변이체의 생성이다. 이러한 돌연변이체는 부위 지정 돌연변이유발 (예를 들어, 결실, 부분적 결실, 삽입 또는 핵산 치환)에 의해, 적합한 트랜스포존의 사용에 의해, 또는 각각의 문헌으로부터 통상의 기술자에게 공지된 다른 접근법에 의해 생성될 수 있으며, 따라서 그의 적용은 본 발명의 맥락에서 상용 작업으로 간주된다. 통상의 기술자가 본 발명의 맥락에서 유용한 것으로 간주할 새롭게 개발된 기법에 대한 한 예는 표적화된 아연 손가락 뉴클레아제의 사용에 의한 녹-아웃이다. 각각의 키트는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에 의해 "콤포ZR(CompoZR) 녹아웃 ZFN"으로서 제공된다. 또 다른 접근법은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (Transcription Activator-Like Effector Nuclease: TALEN)의 사용을 포함한다.
우성 음성 구축물의 전달은, 예를 들어, 형질감염에 의해 기능이상적 효소를 코딩하는 서열의 도입을 포함한다. 상기 코딩 서열은 기능이상적 효소의 유전자 발현이 야생형 효소의 천연 발현을 무효로 하고, 이는 다시 각각의 효소 활성의 유효한 생리학적 결함을 초래하는 방식으로, 강한 프로모터에 기능적으로 커플링된다.
조건부 유전자 녹-아웃은 유전자 발현을 조직- 또는 시간-특이적 방식으로 차단하는 것을 허용한다. 이는, 예를 들어, 관심의 유전자 주위에 loxP 부위로 지칭되는 짧은 서열을 도입함으로써 수행된다. 다시, 다른 접근법은 각각의 문헌으로부터 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 맥락에서 그들의 적용은 상용 작업으로 간주된다.
한 다른 접근법은 기능이상적 유전자 산물 또는 감소된 활성을 갖는 유전자 산물을 초래할 수 있는 유전자 변경이다. 이러한 접근법은 프레임 시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이 (즉, 미성숙 정지 코돈의 도입) 또는 전체 유전자 산물을 기능이상적으로 만들거나, 감소된 활성을 초래하는 아미노산 치환을 초래하는 돌연변이의 도입을 포함한다. 이러한 유전자 변경은 예를 들어 돌연변이유발 (예를 들어, 결실, 부분적 결실, 삽입 또는 핵산 치환), 비특이적 (무작위) 돌연변이유발 또는 부위 지정 돌연변이유발 중 어느 하나에 의해 생성될 수 있다.
유전자 침묵, 유전자 녹-다운, 유전자 녹-아웃, 우성 음성 구축물의 전달, 조건부 유전자 녹-아웃, 및/또는 유전자 변경의 실제적인 적용을 설명하는 프로토콜은 통상의 기술자에게 통상적으로 이용가능하며, 그의 상용 작업 내에 있다. 따라서, 본원에서 제공된 기술적 교시는 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소를, 또는 기능이상적 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 효소의 발현을 초래하는 모든 상상가능한 방법에 관하여 전체적으로 가능하게 된다.
본원에 개시된 교시는 하기를 포함한다:
a) EpoR에 대한 이종성으로 발현된 효능제의 효소적 탈-O-아세틸화가 주어진 변형된 효능을 갖는다는 발견
b) 상이한 세포 발현 시스템에서의 O-아세틸화 또는 탈-O-아세틸화를 촉매하는 예시적인 효소의 개시
c) 통상의 기술자가 손상된 또는 결함성 동종 효소를 갖거나, 이종 효소를 발현하거나, 동종 효소를 과다발현하는 발현자 세포주를 생성하는 것을 가능하게 하는 그에게 이용가능한 기술의 열거.
따라서, 본 출원의 기술적 교시는 통상의 기술자가, 주어진 변형된 효능을 갖는 EpoR 효능제를 제조하기 위해, 손상된 또는 결함성 O-아세틸화를 갖거나 또는 증가된 탈-O-아세틸화를 갖는 발현자 세포주를 개발하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 세포는 진핵생물 세포이다. 용어 "진핵생물 세포"는, 예를 들어, 곤충 세포와 같은 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 세포는 동물 세포 및/또는 식물 세포이다. 보다 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포이다.
바람직하게는, 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다:
한 바람직한 실시양태에서, 세포는 재조합 세포이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 세포"는 세포의 클론 확장에 혼입되어 잔류하도록 안정하게 혼입되거나, 세포 (또는 세포의 집단) 내로 일시적으로 도입된, 그 내로 혼입된 외인성 및/또는 이종 핵산을 갖는 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 외인성 및/또는 이종 핵산은 발현되는 이종 단백질을 코딩할 수 있거나, 이는 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현, 또는 기능이상적 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 효소의 발현의 억제 또는 감소에 영향을 미칠 수 있다.
면책조항
명세서를 과도하게 길어지게 하지 않고 포괄적인 개시를 제공하기 위해, 출원인은 상기 언급된 특허 및 특허 출원의 각각을 본원에 참조로 포함시킨다.
상기 상세화된 실시양태에서 요소 및 특색의 특정한 조합은 단지 예시적이며; 이러한 및 참고로 포함되는 특허/출원에서 이들 교시의 다른 교시로의 호환 및 치환은 또한 명백하게 고려된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 것인 바와 같이, 본원에 기재된 것의 변경, 변형, 및 다른 실행은 청구된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 수 있다. 따라서, 상기 설명은 단지 예로서이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 범주는 하기 청구범위 및 그에 대한 등가물에서 정의된다. 더욱이, 설명 및 청구범위에 사용된 참조 부호는 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 및 도면의 간단한 설명
본 발명의 목적의 추가의 상세사항, 특색, 특징 및 이점은 하위청구항, 및 예시적인 방식으로 본 발명의 바람직한 실시양태를 제시하는 각각의 도면 및 실시예의 하기 설명에 개시된다. 그러나, 이들 도면은 어떤 식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
도 1: 토끼에서의 인간 IgG 및 탈글리코실화된 인간 IgG의 단일 주입 시의 평균 혈청 수준의 시간 과정 (n=8-10/군)
도 2: 토끼에서의 인간 IgG 및 탈글리코실화된 인간 IgG의 단일 주입 시의 개별적 Cmax (n=8-10/군).
도 3: 토끼에서의 O-아세틸화에 있어서 상이한 Fc 융합 단백질 오렌시아(Orencia)® (아바타셉트)의 2종의 배치 (고 O-아세틸화를 갖는 배치 1, 저 O-아세틸화를 갖는 배치 2)의 단일 피하 주사 시의 평균 혈청 수준의 시간 과정 (n=11/군).
도 4: 토끼에서의 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 개별적 AUC (n=11/군, 막대는 군 평균을 지시함). 본원에 및 도 5 - 7 및 10 - 13에 사용된 용어 "O-아세틸화의 수준"은 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 "시알산 잔기의 아세틸화율"을 의미한다.
도 5: 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 평균 AUC 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11-14/군).
도 6: 토끼에서의 2종의 오렌시아® 배치 (저 O-아세틸화를 갖는 배치 1 및 고 O-아세틸화를 갖는 배치 2)의 단일 피하 주사 시의 개별적 Cmax (n=11/군, 막대는 군 평균을 지시함).
도 7: 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 평균 Cmax 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11/군).
도 8: 탈-O-아세틸화 후의 시알산 프로파일 (샘플 A 모의 처리된 대조군, 샘플 E 탈-O-아세틸화된 오렌시아®).
도 9: 토끼에서의 모의-변형된 또는 탈-O-아세틸화된 오렌시아®의 단일 피하 주사 시의 평균 혈청 수준의 시간 과정 (n=11-14/군).
도 10: 토끼에서의 모의-변형된 또는 탈-O-아세틸화된 오렌시아®의 단일 피하 주사 시의 개별적 AUC 및 군 평균 (n=11/군, 막대는 군 평균을 지시함).
도 11: 토끼에서의 오렌시아® (모의-변형된 및 탈-O-아세틸화된 물질)의 단일 피하 주사 시의 평균 AUC 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11-14/군).
도 12: 토끼에서의 모의-변형된 또는 탈-O-아세틸화된 오렌시아®의 단일 피하 주사 시의 개별적 Cmax 및 군 평균 (n=11-14/군, 막대는 군 평균을 지시함).
도 13: 토끼에서의 오렌시아® (모의-변형된 및 탈-O-아세틸화된 물질)의 단일 피하 주사 시의 평균 Cmax 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11-14/군).
도 14: 탈-O-아세틸화 후의 시알산 프로파일 (샘플 1 탈-O-아세틸화된 아라네스프®, 샘플 2 비처리 대조군).
도 15: 아라네스프® 및 변형된 아라네스프®로의 처리 후의 Hb (기준선에서의 Hb 수준에 대해 정규화됨)의 시간 과정 (평균 +SD, n=10/군).
도 16: 아라네스프® 및 변형된 아라네스프®로의 처리 후의 MCH의 시간 과정 (평균 +SD, n=10/군).
도 17: N- 또는 O-아세틸화된 시알산의 일부 예.
도 18: 아세틸화된 시알산을 포함하는 N-연결된 글리칸 및 O-연결된 글리칸의 일반적 구조. N-연결된 글리칸은 서열 모티프에서 세포질 세망에서 Asn에 대한 단백질에 부착된다 (Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 AA 산). O-연결된 글리칸은 골지체에서 Ser 또는 Thr 잔기 상에 한 번에 하나의 당이 어셈블리된다. 컨센서스 모티프는 없는 것으로 보이지만, Ser 또는 Thr에 비해 -1 또는 +3 중 어느 하나에서의 Pro의 존재는 바람직하다.
도 2: 토끼에서의 인간 IgG 및 탈글리코실화된 인간 IgG의 단일 주입 시의 개별적 Cmax (n=8-10/군).
도 3: 토끼에서의 O-아세틸화에 있어서 상이한 Fc 융합 단백질 오렌시아(Orencia)® (아바타셉트)의 2종의 배치 (고 O-아세틸화를 갖는 배치 1, 저 O-아세틸화를 갖는 배치 2)의 단일 피하 주사 시의 평균 혈청 수준의 시간 과정 (n=11/군).
도 4: 토끼에서의 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 개별적 AUC (n=11/군, 막대는 군 평균을 지시함). 본원에 및 도 5 - 7 및 10 - 13에 사용된 용어 "O-아세틸화의 수준"은 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 "시알산 잔기의 아세틸화율"을 의미한다.
도 5: 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 평균 AUC 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11-14/군).
도 6: 토끼에서의 2종의 오렌시아® 배치 (저 O-아세틸화를 갖는 배치 1 및 고 O-아세틸화를 갖는 배치 2)의 단일 피하 주사 시의 개별적 Cmax (n=11/군, 막대는 군 평균을 지시함).
도 7: 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 평균 Cmax 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11/군).
도 8: 탈-O-아세틸화 후의 시알산 프로파일 (샘플 A 모의 처리된 대조군, 샘플 E 탈-O-아세틸화된 오렌시아®).
도 9: 토끼에서의 모의-변형된 또는 탈-O-아세틸화된 오렌시아®의 단일 피하 주사 시의 평균 혈청 수준의 시간 과정 (n=11-14/군).
도 10: 토끼에서의 모의-변형된 또는 탈-O-아세틸화된 오렌시아®의 단일 피하 주사 시의 개별적 AUC 및 군 평균 (n=11/군, 막대는 군 평균을 지시함).
도 11: 토끼에서의 오렌시아® (모의-변형된 및 탈-O-아세틸화된 물질)의 단일 피하 주사 시의 평균 AUC 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11-14/군).
도 12: 토끼에서의 모의-변형된 또는 탈-O-아세틸화된 오렌시아®의 단일 피하 주사 시의 개별적 Cmax 및 군 평균 (n=11-14/군, 막대는 군 평균을 지시함).
도 13: 토끼에서의 오렌시아® (모의-변형된 및 탈-O-아세틸화된 물질)의 단일 피하 주사 시의 평균 Cmax 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계 (n=11-14/군).
도 14: 탈-O-아세틸화 후의 시알산 프로파일 (샘플 1 탈-O-아세틸화된 아라네스프®, 샘플 2 비처리 대조군).
도 15: 아라네스프® 및 변형된 아라네스프®로의 처리 후의 Hb (기준선에서의 Hb 수준에 대해 정규화됨)의 시간 과정 (평균 +SD, n=10/군).
도 16: 아라네스프® 및 변형된 아라네스프®로의 처리 후의 MCH의 시간 과정 (평균 +SD, n=10/군).
도 17: N- 또는 O-아세틸화된 시알산의 일부 예.
도 18: 아세틸화된 시알산을 포함하는 N-연결된 글리칸 및 O-연결된 글리칸의 일반적 구조. N-연결된 글리칸은 서열 모티프에서 세포질 세망에서 Asn에 대한 단백질에 부착된다 (Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 AA 산). O-연결된 글리칸은 골지체에서 Ser 또는 Thr 잔기 상에 한 번에 하나의 당이 어셈블리된다. 컨센서스 모티프는 없는 것으로 보이지만, Ser 또는 Thr에 비해 -1 또는 +3 중 어느 하나에서의 Pro의 존재는 바람직하다.
실시예 1: 당단백질 생물제제의 약동학에 대한 당-구조의 완전한 제거의 효과
첫번째 연구에서, 당단백질 생물제제의 약동학에 대한 당-구조의 완전한 제거의 효과를 조사하였다. 이러한 실험을 위해, 글리코실화된 IgG1-유형 모노클로날 항체를 사용하였다. 항체의 Fc 도메인의 갈락토실화는 이펙터 세포의 효율적인 동원을 위한 역할을 한다는 일부 증거가 있지만, 나머지 특징, 예컨대 약동학에 대한 그와 같은 글리코실화, 및 특히 시알릴화 및 시알산의 O-아세틸화의 역할은 덜 이해되어 있다.
이러한 목적을 위해, 인간 IgG1 mAb를 표준 프로토콜에 따라 효소적으로 탈글리코실화하고 (예를 들어, 문헌 [Kim & Leahy 2013] 참조), 약동학을 단일 정맥내 주입 후에 표 1에 요약된 바와 같이 평가하였다.
표 1: 연구 설계, 토끼에서의 단일 용량 PK 연구
농밀한 혈청 샘플을 취하여 처리 후 14일까지의 전체 시간 과정을 면밀하게 모니터링하고, 동결 저장하고, 이러한 목적을 위해 입증된 통상적인 ELISA를 사용하여 인간 IgG 농도에 대해 정량화하였다.
도 1은 초기 상을 제외한 비변형된 및 탈글리코실화된 IgG를 비교하는 매우 유사한 시간 과정을 지시한다. 초기 상, 즉, 도 2에 예시된 바와 같은 Cmax를 보다 면밀하게 조사하면, 데이터는 대부분의 당구조는 단백질 골격의 외표면 상에 위치하지 않지만, 이들 구조는 이펙터 세포의 동원 뿐만 아니라, 분포에 대해서도 역할을 잘 할 수 있음을 제시한다. 구체적으로, 본 실시예의 결과는 모든 글리칸의 완전한 제거가 최대 농도를 저하시킴을 제시한다.
실시예 2: 상이한 시알산 O-아세틸화율을 갖는 당단백질 생물제제의 상이한 배치의 생체이용률의 차이
상이한 수준의 O-아세틸화를 갖는 CTLA-FC 융합 단백질 아바타셉트 (오렌시아®)의 2종의 배치가 단일 피하 투여 시 그들의 노출/생체이용률에 있어서 상이할 것인지 여부를 시험하였다. 각각의 디-O-아세틸화율은 배치 번호 1에 대해 11.4% 및 배치 번호 2에 대해 6.5%였다. 트리-O-아세틸화된 시알산은 관찰되지 않았다.
표 2: 연구 설계, 토끼에서의 단일 용량 PK 연구
농밀한 혈청 샘플을 처리 후 14일까지 취하여 혈청 수준의 면밀한 모니터링을 허용하고, 동결 저장하고, 통상적인 ELISA를 사용하여 아바타셉트 농도에 대해 정량화하였다.
도 3은 토끼에서의 2종의 오렌시아® 배치 (제조자 지시서에 따라 재구성 및 추가의 취급 단계, 둘 다의 군에 대한 동일한 주사 부피를 유발하기 위해 오렌시아® 완충제에 약간 희석하여 적용됨)의 단일 피하 주사 시의 평균 혈청 수준의 시간 과정 (n=11/군)을 제시한다. 도 4는 개별적 AUC를 제시한다. 도 5는 평균 AUC 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계를 제시한다. 도 6은 토끼에서의 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 개별적 AUC를 제시하고, 도 7은 2종의 오렌시아® 배치의 단일 피하 주사 시의 평균 Cmax 및 O-아세틸화의 수준 사이의 관계를 제시한다.
도 3은 사용된 2종의 배치의 평균 혈청 농도의 시간 과정을 예시한다. 자명하게, 2종의 배치는 동일한 용량이 투여되었지만, 달성된 혈청 농도에 관하여 상이하다. 도 4는 또한 둘 다의 군에서의 동물에 대해 관찰된 개별적 AUC 및 그들의 상이한 노출을 제시한다. 도 5는 O-아세틸화의 수준 및 노출 사이의 명백한 관계를 예시한다. 차이는 AUC에 관하여 관찰될 뿐만 아니라, 도 6은 또한 최대 혈청 농도가 AUC와 같이 상이하며, 명백하게 또한 Cmax와 상관됨을 예시한다 (도 6 및 7). 따라서, 보다 높은 O-아세틸화율은 명백하게 생체이용률을 증가시킨다. 이는 탈-글리코실화된 및 따라서 탈-시알릴화된/탈-O-아세틸화된 IgG에 비해, 실시예 1에서 IgG에 대해 관찰된 보다 높은 Cmax와 긴밀히 연관될 것이다.
실시예 3: 노출/생체이용률에 대한 감소된 시알산 O-아세틸화율의 효과
본 실시예에서, 선택된 당단백질 생물제제의 O-아세틸화율 및 노출/생체이용률 사이의 인과 관계를 조사한다.
이러한 목적으로, 아바타셉트 (오렌시아®)의 단일 배치의 충분한 양을 구입하고, 재구성하고, pH 7의 10 mM 인산나트륨 / 1 mM MgCl2 완충제 내로 탈염시켰다. 배치를 2개의 절반으로 분리하였다. 첫번째 절반을 시알레이트-9-O-아세틸에스테라제 (어플라이드 바이오테크 (Applied BioTech), 안게반드테 비오테크놀로기 게엠베하 (Angewandte Biotechnologie GmbH))와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 두번째 절반을 동일한 방식으로 처리하였으나, 효소는 첨가하지 않았다. 이어서, 에스테라제를 친화성 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 2종의 생성된 물질의 특징을 표 3 및 도 8에 요약한다. 표 4는 이들 2종의 물질의 비교를 위한 연구 설계를 요약한다.
*형광 화합물 1,2-디아미노-4,5-메틸렌-디옥시벤젠 (DMB)으로 태그부착된 시알산으로의 HPLC; **IEC: 양이온 교환 크로마토그래피; ***SEC: 크기 배제 크로마토그래피
표 3: 탈-O-아세틸화된 및 모의-처리된 오렌시아
®
의 특징화
표 4: 연구 설계, 토끼에서의 단일 용량 PK 연구
농밀한 혈청 샘플링 (시간 경과에 따른 혈청 수준의 면밀하고 신뢰성있는 모니터링을 허용하는 고 빈도의 샘플링)을 처리 후 14일까지 채용하고, 샘플을 동결 저장하고, 통상적인 ELISA를 사용하여 오렌시아® 농도에 대해 정량화하였다.
그 후, 2종의 배치의 용량을 토끼에게 피하 투여하였다. 결과를 도 9 - 13에 제시한다. 평균 혈청 농도의 시간 과정 (도 9), 상응하는 개별적 AUC (도 10, 도 11)는 명백하게 감소된 O-아세틸화율이 생체이용률의 감소를 유발함을 제시한다. Cmax는 또한 보다 낮은 O-아세틸화율을 감소시킨 물질에 대해 보다 낮았다 (도 12, 도 13).
실시예 4: 감소된 수준의 O-아세틸화된 시알산을 갖는 ESA의 증가된 효능
적혈구생성 자극제의 전형적인 예로서, 아라네스프® (다르베포에틴 알파)를 선택하였다. 아라네스프®는 고도로 시알릴화되고, 또한 O-아세틸화된 시알산을 운반한다. 래트를 인간에 대해 관찰된 결과의 우수한 예측도로 인해 모델로서 선택하였다. 주사 경로로서, 임상적 방식을 위한 전형적인 경로를 대표하는 피하 주사를 다시 선택하였다. 용량 범위를 또한 임상적 방식을 따르도록 선택하였다.
생체내에서 시험되는 탈-O-아세틸화된 아라네스프®의 제조를 위해, 아라네스프®를 사용하였다. 간략하게, 여러 개의 주사기를 풀링하여, 완충제를 140 mM NaCl을 함유하는 50 mM Na-포스페이트 완충제 pH 7.6 내로의 투석에 의해 교환한 약 1 mg 다르베포에틴 출발 물질을 제공한 후, 1 ml (= 이는 1 U의 시알레이트 9-O-아세틸에스테라제로 처리되었음)와 함께 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 효소를 항-Epo 항체 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 칼럼 용리액을 다시 140 mM NaCl을 함유하는 20 mM Na-포스페이트 완충제 pH 6.2에 대해 완충제 교환하고, 필터-멸균하고, 분취하고, 본 실시예에 제시된 바와 같이 동물의 처리를 위해 사용할 때까지 -60℃ 미만에서 저장하였다. 함량 결정을 RP-HPLC에 의해 수행하였다. RP-HPLC에 의해 측정된 농도는 0.136 mg/ml였으며, 이를 투약량을 계산하기 위한 기초로서 사용하였다.
탈-O-아세틸화된 아라네스프®를 LC-MS에 의해 분석하여 무손상 단백질 구조에 대한 효소적 처리군 및 대조군의 효율을 결정하였다. O-아세틸화된 시알산을 갖는 종은 검출되지 않았으며, 이는 효율적인 탈-O-아세틸화를 지시한다. 다르게는, 스펙트럼은 모든 5개의 N-연결된 부위 및 1개의 디시알릴화된 O-연결된 글리칸 (22 시알산을 갖는 종)에서의 테트라-안테나리, 테트라-시알로 글리칸 구조 및 일반적으로 높은 정도의 시알릴화를 운반하는 고 풍부도의 분자를 갖는 예상된 글리코실화된 종을 제시한다. 당형태의 분포는 또한 시알로 글리칸 지도의 결과와 정성적으로 일치한다.
시알산의 분석을 DMB-표지화 및 RP-HPLC에 의해 수행하였다. 생성된 크로마토그램을 비처리된 아라네스프® 샘플과 비교하여 도 14에 제시한다. 이러한 분석은 탈-O-아세틸화가 매우 효율적이었음을 제시하는데, 이는 모노- 또는 디-O-아세틸화된 시알산에 상응하는 단지 극도로 낮은 강도 피크가 검출될 수 있었기 때문이다. 탈-O-아세틸화된 물질을 응집에 관하여, 또한 동결-해동 주기 시, 및 글리칸 분석 (이온 교환 크로마토그래피에 의한 시알로 글리칸 지도)으로 추가로 특징화하였다. 2종의 생성된 물질의 특징을 표 5에 요약한다.
n.d.: 검출되지 않음, *형광 화합물 1,2-디아미노-4,5-메틸렌-디옥시벤젠 (DMB)으로 태그부착된 시알산의 RP-HPLC; **2-아미노벤즈아미드 (2AB)로 태그부착된 글리칸의 양이온 교환 크로마토그래피; ***SEC: 크기 배제 크로마토그래피.
표 5: 탈-O-아세틸화된 및 비처리된 아라네스프
®
의 특징화
래트를 인간에 대해 관찰된 결과의 우수한 예측도로 인해 비교를 위한 종으로서 선택하였다. 주사 경로로서, 임상적 방식을 위한 전형적인 경로를 대표하는 피하 주사를 선택하였다. 용량 범위를 또한 임상적 방식을 따르도록 선택하였다.
PD 판독의 민감도로 인해, 연구 설계를 본 실시예에서 추가로 개량하였다. 고도로 특이적인 효소적 변형 외에도, 투약량은 변형에 의한 분자량의 변화를 고려하였다. 천연 아라네스프®의 분자량은 약 37,100 Da이다. 완전한 탈-O-아세틸화의 경우, MW은 약 36,366 Da으로 감소한다. 용량은 이전의 실시예에서 중량 기준이었지만 (mg/kg), 용량은 분자량의 1-2 % 변화를 고려하여, 본 연구에서 투여된 분자의 수를 기준으로 동일하였으며, 즉, 등몰 투약량이었다 (표 6).
표 6: 연구 설계, 래트에서의 단일 용량 PK 연구
동물을 표준 조건 하에서 하우징하고, 표 6에 상세화된 바와 같이 단일 주사로 처리하였다. 처리군에의 할당을 투약 전에 무작위로 수행하였다. 혈액을 꼬리 정맥으로부터 샘플링하고, 표준 혈액학적 장비를 사용하여 분석하였다.
표 7은 실질적인 수의 아라네스프® 로트에 대해 관찰된 O-아세틸화의 최소 수준을 요약하며, 이는 Neu5Ac의 O-아세틸화가 일관되게 O-아세틸화의 전체적인 평균 수준에 관하여 주요한 역할을 함을 예시한다.
표 7: 아라네스프
®
에 대해 관찰된 O-아세틸화의 최소 수준
군 사이의 Hb의 최소 기준선 차이, 즉, 처리 전에 대해 보상하기 위해, 도 15는 기준선 수준의 %로서 관찰된 Hb를 예시한다. 데이터는 천연 아라네스프®에 비해 변형된 아라네스프®로의 처리 후의 Hb의 약간 더 현저한 증가를 입증한다. 보다 현저한 증가는 시험된 모든 3종의 용량 수준에서 일관되게 관찰되었다.
Hb 증가의 상세사항에 대한 보다 많은 통찰을 얻기 위해, 망상적혈구 뿐만 아니라 적혈구 카운트를 조사하였다. 예상치 않게, 변형된 아라네스프®로 처리된 군에서의 RBC 증가의 수준은 아라네스프® 처리된 군에서 관찰된 것보다 약간 덜 현저하였다.
결과적으로, MCH는 도 16에 예시된 바와 같이 분석되었다. 놀랍게도, 처리 후에 관찰된 증가된 Hb와 동기적으로, 변형된 아라네스프®로의 처리 후의 MCH 증가는 천연 아라네스프®에 대한 것보다 더 현저하였다.
그 결과, 탈아세틸화된 또는 비-아세틸화된 시알산을 갖는 ESA는 비변형된 ESA에 비해 RBC 증식의 덜 현저한 자극, 그러나 생성된 RBC에서 증가된 MCH를 제시하였다.
RBC는 응혈원성 인지질의 노출을 통한 항상성에 참여하기 때문에 (Peyrou et al., 1999), RBC의 ESA-매개된 증가는 증가된 심혈관 위험을 유발한다. 그러나, ESA 치료의 치료 목표는 혈액의 산소 용량의 증가이지, 반드시 RBC의 증가는 아니다. 통상적인 ESA 치료는 RBC 증식의 자극에 의해 이를 달성하며, 따라서, 보다 높은 산소 용량을 유발한다.
본 발명자들은 탈아세틸화된 또는 비-아세틸화된 시알산을 갖는 ESA가 여전히 혈액의 산소 용량을 증가시키지만, RBC를 통상적인 ESA와 동일한 정도로 증가시키지 않고, 그러나, MCH, 즉, RBC 당 Hb의 평균 로드를 증가시킴으로써 그렇게 함을 제시하였다. 이러한 접근법은 증가된 심혈관 위험과 같은 ESA 치료와 동시발생하는 부작용을 감소시키는 것을 도울 수 있다.
이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 하나의 설명은 성숙 동안 RBC 내로 로딩되는 Hb의 양이 상이할 수 있다는 것이다. 저색소성 빈혈을 특징으로 하는 일부 상태는 정상적인 RBC 카운트, 그러나 낮은 Hb를 입증하는 반면, RBC의 부피에 비해 Hb의 불균형적 감소가 있기 때문에, 탈아세틸화된 또는 비-아세틸화된 시알산을 갖는 ESA는 반대 현상을 초래하는 것으로 보이며, 즉, Hb/RBC의 패킹이 증가되는 것으로 보인다.
일반적으로, 시알산은 수많은 생물학적 프로세스에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있는 당구조에 대한 예이다. 시알릴화의 수준을 증가시키는 치료 단백질의 유전적 변형은 성공적이며, 투여된 용량으로부터 유발되는 노출을 최대화하기 위해 빈번히 사용되는 접근법이다. ESA에서의 시알산의 O-아세틸화의 감소된 수준은 일관되게 한편으로는 보다 낮은 수준의 노출/생체이용률을, 그러나 동시에 MCH의 관점에서 증가된 효능을 초래함은 놀랍다. 이는 에리트로포이에틴에 대한 간행물이 시알산의 O-아세틸화가 실제로 반감기를 증가시킴을 제시하기 때문에 예상치 않은 것이다 (Shahrokh et al., 2011).
따라서, 시알산의 보다 낮은 수준의 O-아세틸화를 갖는 ESA는 산소 용량의 관점에서 보다 낮은 효능을 가질 것임을 예상하였을 것이지만, 관찰된 효과는 반대였다.
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