JP4200509B2 - Epo誘導体含有血液関連疾患治療剤 - Google Patents
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Description
(1)エリスロポエチン(EPO)誘導体を有効成分とする虚血性疾患治療剤。
(2)EPO誘導体がアシアロEPOである(1)の治療剤。
(3)幹細胞含有物質とともに投与される(1)または(2)の治療剤。
(4)幹細胞含有物質が骨髄細胞である(3)の治療剤。
(5)EPO誘導体を有効成分とする血管促進剤。
(6)EPO誘導体がアシアロEPOである(5)の促進剤。
(7)幹細胞含有物質とともに投与される(5)または(6)の促進剤。
(8)幹細胞含有物質が骨髄細胞である(7)の促進剤。
(9)EPO誘導体を有効成分とする血流増加剤。
(10)EPO誘導体がアシアロEPOである(9)の増加剤。
(11) 幹細胞含有物質とともに投与される(9)または(10)の増加剤。
(12)幹細胞含有物質が骨髄細胞である(11)の増加剤。
本発明に用いるEPOは、どのようなEPOでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたEPOであり、より具体的には、哺乳動物EPO、特にヒトEPOと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。
EPO誘導体
本発明においてEPO誘導体とは、EPO分子中のアミノ酸を修飾したEPO又はEPO分子中の糖鎖を修飾したEPOのことをいう。
EPO分子中のアミノ酸の修飾としては、カルバミル化、ビオチン化、アミジン化、アセチル化、グアニジン化、などを挙げることができるが、本発明において好ましいアミノ酸の修飾はカルバミル化である。
疾患
本発明の治療剤は、血流増加剤、血管促進剤又は虚血性疾患治療剤として有用である。
治療用製剤
本発明の治療剤には、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
幹細胞含有物質
本発明の治療剤は幹細胞含有物質とともに投与すると、治療効果が増強される。
本発明の効果
本発明者らは、後述の実施例に示したように、下肢虚血モデルを用いる治療効果実験を行ったところ、アシアロEPO単独投与はEPO単独投与に比べて、下肢の壊死をさらに強く抑制する(生存効果)が観察され、また、EPO単独投与によってはチアノーゼからの回復が見られないが、アシアロEPO単独投与によってチアノーゼからの回復(実効的な血管再生効果)が観察された。さらに、骨髄細胞移植とアシアロEPO投与の併用によって、生存効果および実効的な血管再生効果が著しく助長された。
CHO細胞を用いて遺伝子組換え法で作製したEPO(中外製薬株式会社製)から、文献(Imai N. Higuchi M. Kawamura A. Tomonoh K. Oh-Eda M. Fujiwara M. Shimonaka Y. Ochi N. Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoietin. Suppressive effects of sialic acid in the expression of biological activity of human erythropoietin in vitro. European Journal of Biochemistry. 194(2):457-62, 1990 Dec 12.)記載の方法により、アシアロEPOを調製した。シアル酸が除去されたことはSDSゲル電気泳動による分子量低下ならびに等電点電気泳動によるpI変化により確認した。また、生物活性が保持されていることはEPO依存性細胞株の増殖を指標としたバイオアッセイにより確認した。
アシアロEPOの作製
EPO凍結乾燥粉末およびノイラミニダーゼ(生化学工業)を10 mMクエン酸−リン酸緩衝液(pH 6.5)で溶解し、それぞれ1 mg/mlおよび250 mUとなるよう混和した。37℃にて1時間インキュベートした後、C4逆相HPLCカラム(バイダック)のアセトニトリル濃度勾配溶出によってアシアロEPOを精製した。
アシアロEPOの生物活性
アシアロEPOが生物活性を有していることは、EPO依存性細胞株の増殖を指標としたバイオアッセイにより確認した。すなわち、EPO依存性に増殖するAS-E2細胞株(文献:Miyazaki Y. Kuriyama K. Higuchi M. Tsushima H. Sohda H. Imai N. Saito M. Kondo T. Tomonaga M. Establishment and characterization of a new erythropoietin-dependent acute myeloid leukemia cell line, AS-E2. Leukemia. 11(11):1941-9, 1997 Nov.)10000個を0.04〜10 ng/mlのアシアロEPOあるいはEPOを含む20% FCS/IMDM培地(Hyclone)中で、37℃, 5.0% CO2条件下で3〜4日間培養し、WST-1試薬(宝酒造)にて生細胞数を測定した。アシアロEPOにおいてもEPOと同様の増殖刺激が得られることを確認した。
実施例2:ICRマウスによる下肢虚血モデルの作製
チャールスリバー(Yokohama, Japan)より雄8週齢のICRマウス(30 - 35g)を購入し実験に用いた。すべての実験手順は Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication No.86 - 23; National Institute of Health, Bethesda, MD)に基づき無菌的に行われた。マウスをケタミン(60 mg/kg BW)およびキシラジン(6 mg/kg BW)の腹腔内投与により麻酔した。Isnerの方法に準じ左下肢の中間部に皮膚切開を加え、血管を露出した(Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichler B, Isner JM: Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol 152: 1667 - 1679, 1998)。大腿動脈起始部を結紮ののちその末梢の伏在動脈を結紮し、その他の側枝を剥離して本管とともに切除した。
実施例3:下肢虚血モデルを用いる治療効果実験(生存効果および血管再生効果)
(実験方法)
実施例2の方法によって作製したICRマウスの下肢虚血モデルを用いて治療実験を行った。実験では、下肢の壊死を死と定義した(survival)。また、下肢のチアノーゼからの回復を回復と定義した(recovery)。
C群 :無治療
E群:EPO(400 U/kg体重、虚血部位筋肉内注射)の6日間連日投与によって治療
AE群:同量同投与法のアシアロEPOによって治療
B群:1 X 107個の骨髄細胞を虚血部位筋肉内注射して治療(1日目に4箇所に分けて投与)
B+E群:B(骨髄細胞)とE(EPO)を併用
B+AE群:B(骨髄細胞)とAE(アシアロEPO)を併用
(結果)
各治療の生存効果及び回復効果に及ぼす結果を図1及び図2に示す。結果をまとめると以下の通りである。
(1)EPO単独投与は下肢の壊死を抑制するが、アシアロEPO単独投与は下肢の壊死をさらに強く抑制する(生存効果)。
(2)EPO単独投与によってはチアノーゼからの回復が見られないが、アシアロEPO単独投与によってチアノーゼからの回復が観察される(実効的な血管再生効果)。
(3)骨髄細胞移植によって生存効果および実効的な血管再生効果が観察されるが、これにEPO投与を併用するとこれらの効果が助長され、EPOのかわりにアシアロEPO投与を併用するとこれらの効果がさらに著しく助長される。
実施例4:下肢虚血モデルを用いる治療効果実験(血流回復効果)
実施例3の下肢生存・回復モデルと同じマウス、同じ手技によって作成したマウス下肢虚血モデルを用いて血流を測定した。
(実験方法)
下肢虚血作成の当日に治療開始した (day 1)。移植は day 1に行った。EPO等の投与はday 1 - 6の6日間行った。Day 7 にレーザー・ドップラーを用いて下肢血流の回復を測定した。
C群:生理食塩液筋肉内注射6日間(n=12)
E群:EPO 400 IU/kg体重の筋肉内注射6日間(n=5)
A群:アシアロEPO 400 IU/kg体重の筋肉内注射6日間(n=10)
B群:同種同系骨髄細胞移植(1x107骨髄細胞) (n=7)
BE群:BとEの併用 (n=5)
BA群:BとAの併用 (n=6)
測定は、Moor Instruments社 (Wilmington, Delaware, USA) の moorLDI laser Doppler system を用いて両下肢の血流を測定し、虚血肢の測定値を健常肢の測定値で割った値を flux ratio とした。
(結果)
得られた結果を図3に示す。下肢の血流の回復に関して、アシアロEPOはEPOよりも、単独治療および骨髄細胞移植併用の両方で優れていた。
実施例5:下肢虚血モデルを用いる治療効果実験(血管新生効果)
(実験方法)
実施例4で、Laser Doppler で血流を測定したのち、虚血下肢大腿筋を取り出して標本にし、抗CD31抗体とペルオキシダーゼ法で血管を染色した。血管数と筋繊維数を計数し、前者を後者で割った値を、筋繊維あたりの血管数とした。
(結果)
得られた結果を図4に示す。血管の新生に関して、アシアロEPOはEPOよりも、単独治療および骨髄細胞移植併用の両方で優れていた。
実施例6:多血症の発症に及ぼす効果
(実験方法)
EPOの副作用である多血症の発症を見る目的で、下肢虚血を作成しない無処置のICRマウスにEPOまたはアシアロEPOを6日間連日投与(下肢筋肉内注射)し、投与初日の10日後に採血したのち安楽死させ、脾臓の重量(Sp)を測定した。また、ヘモグロビン濃度(Hb)、ヘマトクリット値(Hct)及び網赤血球比率(Ret)を測定した。
C群:コントロール
E群:EPOの一回あたり投与量40、400 または 4,000 U/kg体重
AE群:同量のアシアロEPO
(結果)
各投与によるSp:脾臓重量、Hb:ヘモグロビン濃度、Hct:ヘマトクリット値、Ret:網赤血球比率に及ぼす効果を図5に示す。結果をまとめると以下の通りである。
(1)EPOの投与によって、赤芽球造血の亢進(Ret)、脾臓での髄外造血の亢進(Sp)および多血症(Hb、Hct)が観察された。
(2)アシアロEPOの投与によっては、このような副作用が観察されなかった。
Claims (10)
- アシアロEPOを有効成分とする末梢循環障害治療剤。
- 局所投与される請求項1に記載の治療剤。
- 幹細胞含有物質とともに投与される請求項1または2いずれかに記載の治療剤。
- 幹細胞含有物質が骨髄細胞である請求項3記載の治療剤。
- アシアロEPOを有効成分とする血管新生促進剤。
- 幹細胞含有物質とともに投与される請求項5記載の促進剤。
- 幹細胞含有物質が骨髄細胞である請求項6記載の促進剤。
- アシアロEPOを有効成分とする血流増加剤。
- 幹細胞含有物質とともに投与される請求項8記載の増加剤。
- 幹細胞含有物質が骨髄細胞である請求項9記載の増加剤。
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