JP5326079B2

JP5326079B2 - エリスロポエチンを用いた虚血性疾患の治療

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Publication number: JP5326079B2
Application number: JP2008520614A
Authority: JP
Inventors: 俊夫松本; 哲也北川; 正博安倍; 雅史赤池; 和成永吉; 要山本; 正人樋口
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; University of Tokushima
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; University of Tokushima
Priority date: 2006-06-07
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2027-06-07
Also published as: TW200815026A; HK1128419A1; IL195648A0; JPWO2007142288A1; NO20085098L; NZ573792A; CA2654154A1; RU2008152746A; WO2007142288A1; AR061269A1; AU2007255717B2; BRPI0712063A2; CN101460188B; AU2007255717A1; CN101460188A; EP2047859A4; EP2047859A1; JP2013116919A; US20090280094A1; MX2008015392A

Description

本発明は、血管の再生方法および虚血性疾患の治療方法、およびこれらの方法に用いられる組成物に関する。

末梢循環障害は血管内腔の狭窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘性の増加などにより末梢動脈の血流が減少し、末梢の組織が虚血状態に陥る病状である。近年、骨髄由来単核球細胞を虚血部位に移植すると血管の新生が増強されることが見出され、骨髄由来単核球移植が末梢循環障害の治療方法の1つと考えられている。しかしながら、骨髄由来単核球細胞を移植する為には、患者から骨髄を採取する必要があり、患者にとって負担が大きいという問題点があった。

一方、患者の負担を少なくするという観点から、骨髄由来単核球細胞の代わりに末梢血由来単核球細胞を用いる試みも行なわれたが、末梢血中に存在する単核球細胞は数が少なく、効果的な治療ができないという問題点があった。

エリスロポエチン（以下においてＥＰＯと記載することもある）は、赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであり、主として腎臓から産生される。血液中に最も豊富に存在する赤血球は、一定期間機能した後に脾臓などで破壊される（ヒトでは平均寿命が約１２０日）が、骨髄から絶えず供給されることによって、正常な状態では末梢の全赤血球数は常に一定に保たれている。ＥＰＯはこのような生体の赤血球の恒常性維持において中心的な役割を担っている。臨床的にはＥＰＯは貧血の治療や術前術後の管理に利用されている。

また、ＥＰＯが血管新生促進作用を有し、虚血性疾患の治療剤として有用であることも報告されている（Besarab A et al.,The New England Journal of Medicine, 339(9), 584-590, (1998)、Heeschen C et al., Blood,102(4), 1340-1346, (2003)、Bahlmann F H et al., Blood,103(3), 921-926, (2004), Smith K J et al.,Cardiovascular Research, (59), 538-548, (2003), Bahlmann F H et al.,Kidney International, 64, 1648-1652, (2003)）。さらに、ＥＰＯが末梢血中への血管内皮前駆細胞の動員を促進することが報告されている（Heeschen C et al., Blood,102(4), 1340-1346, (2003),Bahlmann F H et al., Blood,103(3), 921-926, (2004))。

しかしながら、ＥＰＯにより末梢血中に動員された細胞が末梢循環障害などの虚血性疾患の治療に有効であるか否かは不明であった。

本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
Besarab A et al.,The New England Journal of Medicine, 339(9), 584-590, (1998) Heeschen C et al., Blood,102(4), 1340-1346, (2003) Bahlmann F H et al., Blood,103(3), 921-926, (2004) Smith K J et al.,Cardiovascular Research, (59), 538-548, (2003) Bahlmann F H et al.,Kidney International, 64, 1648-1652, (2003)

本発明者らは、ＥＰＯを投与することにより末梢血中での単核球細胞の動員を促進すること、さらにこのようにしてＥＰＯにより動員された単核球細胞が虚血性疾患の治療に特に有用であることを見出した。

本発明は、エリスロポエチンを有効成分として含む、虚血性疾患の治療に使用する若しくは血管再生に使用するための単核球細胞を末梢血中に動員するための組成物を提供する。好ましくは、動員された単核球細胞は、被験者から採取された後に当該被験者に投与される。

当該組成物はまた、末梢血採取の３日前〜１２日前に被験者に投与されることが好ましい。

本発明はまた、予めエリスロポエチンを投与した被験者から採取された末梢血から分離された単核球細胞を有効成分とする虚血性疾患治療用組成物ならびに血管再生用組成物を提供する。当該組成物において、エリスロポエチンの投与が末梢血採取の３〜１２日前であることが好ましい。

本発明はまた、エリスロポエチンを有効成分として含む、虚血性疾患の治療若しくは血管再生に用いるためのＣＤ３４陽性細胞を末梢血中に動員するための組成物を提供する。

別の観点においては、本発明は、予めエリスロポエチンを投与した被験者から採取された末梢血から単核球細胞を分離することを特徴とする、血管再生用単核球細胞の製造方法ならびに虚血性疾患治療用単核球細胞の製造方法を提供する。

別の観点においては、本発明は、以下の工程：
(a) エリスロポエチンを被験者に投与する工程；
(b) 当該被験者から末梢血単核球細胞を採取する工程；および
(c) 採取した末梢血単核球細胞を当該被験者の所望の部位に投与する工程、
を含むことを特徴とする、虚血性疾患を治療する方法ならびに血管を再生する方法を提供する。

図１は、エリスロポエチンによる造血幹細胞の動員を測定したＦＡＣＳ分析の結果を示す。図２は、エリスロポエチン投与により動員された造血幹細胞のコロニー数を測定した結果を示す。図３は、エリスロポエチンを投与した患者（症例３）の末梢血単核球細胞を移植して１ヶ月後の血管造影写真を示す。

エリスロポエチンによる末梢血単核球細胞の動員
１つの観点においては、本発明は、エリスロポエチンを有効成分として含む、虚血性疾患の治療に使用する若しくは血管再生に使用するための単核球細胞を末梢血中に動員するための組成物に関する。単核球細胞を動員するとは、各種臓器に存在する多能性幹細胞の分化増殖を促し、多能性幹細胞を含む単核球を血中へ放出させることを意味する。このようにして動員された単核球細胞を被験者の末梢血から採取して、虚血性疾患の治療および血管再生のために当該被験者に投与することができる。被験者としては、虚血性疾患に罹患している患者、血管再生治療が必要な患者が好ましい。

本発明において、末梢血単核球細胞を採取する前に被験者にエリスロポエチンを投与する回数は特に限定されず、如何なる回数でもよいが、通常１〜３回である。３回投与する場合は、例えば、末梢血単核球細胞を採取する約２週間前に被験者に１回目のエリスロポエチンを全身投与（例えば皮下注射や静脈注射）し、その約１週間後に貯血（瀉血）を行った後に２回目のエリスロポエチンを全身投与する。さらにその約１週間後に３回目のエリスロポエチンを局所投与した後に、末梢血から目的の末梢単核球を採取することができる。また、２回投与する場合は、例えば、末梢血単核球細胞を採取する約１週間前に被験者に１回目のエリスロポエチンを全身投与し、その約１週間後に２回目のエリスロポエチンを局所投与した後に、末梢血から目的の末梢単核球を採取することができる。１回投与の場合は、例えば、被験者にエリスロポエチンを全身投与し、その約１週間後に目的の末梢血単核球細胞を採取することができる。

１回に投与されるエリスロポエチンは通常、1000U/body〜100000U/body、好ましくは3000U/body〜12000U/body（例えば6000U/body）の投与量で投与する。個々の被験者に対する投与量は被験者の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して医師により決定される。従って、本発明においてエリスロポエチンを投与する投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。

エリスロポエチンは通常、非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。

末梢血単核球細胞は末梢血中に存在する単核球細胞である。単核球細胞は単球細胞とも呼ばれ、主に血液に存在する、マクロファージ系細胞の分化の一段階にある細胞である。骨髄中では造血幹細胞が単芽球、前単球へと分化し、その後、単核球へと分化して血中に放出される。単核球は組織に移行するとマクロファージ、樹状細胞、組織球などに分化する。

エリスロポエチンを用いて末梢血中に単核球細胞を動員する場合、単核球細胞が末梢血へ動員されるにはＥＰＯを投与してから２週間を要すると考えられていた(Bahlmann F H et al., Blood,103(3), 921-926, (2004))。しかしながら、本発明においては、ＥＰＯを投与してから約1週間で虚血性疾患の治療や血管再生に十分な量の単核球細胞が末梢血に動員されることが見出された。

従って、本発明は以下の工程を含む、単核球細胞を得る方法又は移植用の単核球細胞を製造する方法に関する:
(a) エリスロポエチンを被験者に投与する工程；および
(b) エリスロポエチン投与から約１週間後に当該被験者から末梢血単核球細胞を採取する工程。

本発明において約１週間とは、通常３〜１２日であり、好ましくは５〜９日（例えば、６〜８日、７日など）である。

別の観点においては、本発明は、エリスロポエチンを有効成分として含む、虚血性疾患の治療若しくは血管再生に用いるＣＤ３４陽性細胞を末梢血中に動員するための組成物に関する。

ＣＤ３４は血液幹細胞抗原であり、血液幹細胞のほかに血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、ストロマ細胞などにも発現している。血管内皮前駆細胞などのＣＤ３４陽性細胞は血管新生に関与することが知られていることから、虚血性疾患の治療若しくは血管再生効果を得るために、移植する単核球細胞中のＣＤ３４陽性細胞の割合を高くすることが望ましい。本発明の方法により末梢血中に動員された単核球細胞の集団中には、通常、虚血性疾患治療効果若しくは血管再生効果を得るために充分量のＣＤ３４陽性細胞が含まれている。さらに、本発明の方法により得られた単核球細胞からＣＤ３４陽性細胞を単離または濃縮して、ＣＤ３４陽性細胞の割合を高くすることは、虚血性疾患の治療若しくは血管再生を目的とした移植を行う場合に特に有用である。

本発明において単核球細胞中のＣＤ３４陽性細胞の割合が高いとは、単核球細胞中のＣＤ３４陽性細胞の割合が１％以上であり、好ましくは２％以上であり、さらに好ましくは３％以上である。単核球細胞中のＣＤ３４陽性細胞の割合の上限としては、例えば、９９．９９％、９９．９％、９９％などを挙げることができるが、理論上は１００％である。

本発明にしたがって得られる単核球細胞中に含まれるＣＤ３４陽性細胞は、さらにＣＤ４５陽性でもよい。ＣＤ４５は白血球共通抗原であり、造血系細胞の主要膜糖タンパク質である。

被験者からの末梢血単核球細胞の採取は、常法に従って行うことができる。例えば、血液アフェレーシスから血液由来単核細胞を直接回収し、必要であれば遠心分離を行うことによって、赤血球、顆粒球及び血小板の実質的部分を除去して末梢血白血球を捕集後、得られた末梢血白血球を、遠心分離等を行うことによって洗浄して、単核球細胞を得ることができる。

このようにして得られた末梢血単核球細胞は、さらに添加、単離、精製などの何らかの加工をしてもよい。例えば、採取された末梢血単核球細胞からＣＤ３４陽性細胞や血管内皮前駆細胞などの所望の細胞をさらに濃縮または単離して投与してもよい。ＣＤ３４陽性細胞は、常法により、例えば、末梢血単核球細胞を抗ＣＤ３４抗体と反応させた後、抗マウスＩｇＧ抗体が結合した磁気ビーズと反応させてＣＤ３４陽性細胞に磁気ビーズを付着させた後、板磁石で磁気ビーズに結合したＣＤ３４陽性細胞を回収し、酵素処理によって磁気ビーズを切り離すことで、ＣＤ３４陽性細胞のみを回収する方法により、あるいは蛍光色素が結合したＣＤ３４抗体と反応させ、蛍光細胞分別装置により採取する方法により、実質的に純粋な細胞を得ることができる。

虚血性疾患の治療および血管再生
本発明にしたがって調製された末梢血単核球細胞は、虚血性疾患の治療を目的として、被験者に投与することができる。すなわち、別の観点においては、本発明は、以下の工程を含む虚血性疾患を治療する方法に関する。
(a) エリスロポエチンを被験者に投与する工程；
(b) 当該被験者から末梢血単核球細胞を採取する工程；および
(c) 採取した末梢血単核球細胞を当該被験者の所望の部位に投与する工程。

虚血性疾患は血管内腔の狭窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘性の増加などの様々な要因により、血管における血流量が減少し、組織が虚血状態に陥る病状である。虚血性疾患の例としては、末梢循環障害、虚血性心疾患（虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）、虚血性脳血管障害、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、などがある。

末梢循環障害は血管内腔の狭窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘性の増加などにより末梢動脈の血流が減少し、末梢の組織が虚血状態に陥る病状である。末梢循環障害を伴う疾患としては、閉塞性動脈硬化症、バージャー（Buerger）病などの慢性動脈閉塞症、進行性全身硬化症、全身性エリテマトーデス、レイノー病、振動病、動脈瘤、血管炎などを挙げることができる。本発明の治療剤の好適な対象となる疾患は、末梢循環障害であり、特に閉塞性動脈硬化症又はバージャー病が好ましい。

また、本発明にしたがって調製された末梢血単核球細胞は、血管再生を目的として、被験者に投与することができる。すなわち、別の観点においては、本発明は、以下の工程を含む血管を再生する方法に関する：
(a) エリスロポエチンを被験者に投与する工程；
(b) 当該被験者から末梢血単核球細胞を採取する工程；および
(c) 採取した末梢血単核球細胞を当該被験者の所望の部位に投与する工程。

本発明において血管を再生するとは、血管新生を促進すること、及び／又は血管の成長・発達を促進することをいう。本発明の方法により新生、成長、発達などが促進される血管は特に限定されないが、動脈が好ましく、特に末梢動脈が好ましい。血管の再生は、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば、アルカリフォスファターゼ染色などを用いて毛細血管密度を測定することができる。

本発明において所望の部位とは、通常、虚血が生じている部位および血管の再生が望まれる部位をいう。あるいは、他の部位に末梢血単核球細胞を移植することにより、血管の再生が望まれる部位において血管が再生される場合には、所望の部位とはそのような他の部位であってもよい。具体的な局所投与部位の例としては、例えば、下肢骨格筋、上肢骨格筋、心臓（心筋）などを挙げることができる。

採取した単核球細胞を所望の部位に投与ないし移植する際の細胞数は特に限定されないが、通常、1.0×10⁷〜1.0×10¹²個であり、好ましくは1×10⁹〜1×10¹¹個である。

局所投与は、全身に大きな影響を及ぼすことなく患部局所に効率的に細胞を投与できる方法である。局所投与は、通常の注射器、ニードル、局所針などを用いて行うことが可能である。

又、採取した単核球細胞を所望の部位に投与する際、単核球細胞を単独で投与してもよいし、他の物質と一緒に投与してもよい。単核球細胞を投与する際に一緒に投与される物質は特に限定されないが、血管再生作用を増強させる物質であることが好ましい。

エリスロポエチン
本発明に用いるＥＰＯは、どのようなＥＰＯでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＥＰＯであり、また好ましくは哺乳動物ＥＰＯ、特にヒトＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。

本発明で用いるＥＰＯは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト由来の抽出物から精製して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平1-38800号公報、など）や、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したヒトＥＰＯなどを用いることができる。本発明において用いられるＥＰＯは、遺伝子工学的手法により製造されたＥＰＯが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＥＰＯが好ましい（例えば、特公平1-44317号公報、Kenneth Jacobs et al.,Nature,313 806-810(1985)、など）。

遺伝子組換え法により得られるＥＰＯには、天然由来のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＥＰＯと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh,T.et al.(1995) Gene 152,271-275；Zoller,M.J.and Smith,M.(1983) Methods Enzymol.100,468-500；Kramer,W.et al.(1984) Nucleic Acids Res.12,9441-9456；Kramer,W.and Fritz,H.J.(1987) Methods Enzymol.154,350-367；Kunkel,T.A.(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,488-492；Kunkel (1988) Methods Enzymol.85,2763-2766）などを用いて、ＥＰＯのアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＥＰＯと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、アミノ酸残基を、アミノ酸側鎖の性質が類似している別のアミノ酸に置換することが好ましい。このようなアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸またはアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,D.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81,5662-5666；Zoller,M.J.&Smith,M.Nucleic Acids Research(1982)10,6487-6500；Wang,A.et al.,Science 224,1431-1433；Dalbadie-McFarland,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79,6409-6413）。

又、ＥＰＯと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合タンパク質を作製するには、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＥＰＯとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。

又、化学修飾したＥＰＯを用いることも可能である。化学修飾したＥＰＯの例としては、例えば、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＥＰＯなどを挙げることができる。又、本発明で用いられるＥＰＯはＥＰＯ誘導体であってもよい。

本発明においてＥＰＯ誘導体とは、ＥＰＯ分子中のアミノ酸を修飾したＥＰＯ又はＥＰＯ分子中の糖鎖を修飾したＥＰＯのことをいう。ＥＰＯ分子中の糖鎖の修飾としては、糖鎖の付加、置換、欠失などが含まれる。本発明において好ましい糖鎖の修飾としては、ＥＰＯ分子中のシアル酸の欠失を挙げることができる。

通常、組換え動物細胞により生産したＥＰＯ、尿由来のＥＰＯのいずれにおいても、糖鎖構造の異なる多様なＥＰＯを含むＥＰＯ組成物として得られる。ＥＰＯ組成物中のＥＰＯ分子に付加しているシアル酸の数は、個々のＥＰＯ分子によって異なるが、通常、1つのＥＰＯ分子に１１個〜１５個のシアル酸が付加している。これらのシアル酸を除去することによりアシアロ化されたＥＰＯ（アシアロＥＰＯ）を作製することが可能である。アシアロ化の際に除去されるシアル酸の数は特に限定されず、全てのシアル酸を除去してもよいし、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14個のシアル酸を除去してもよい。本発明において好ましいアシアロＥＰＯは、ＥＰＯ分子に付加しているシアル酸の数が１０個以下であり、さらに好ましくは５個以下であり、特に好ましくは２個以下である。なお、本発明において、シアル酸の数は、ＥＰＯ組成物に含まれているＥＰＯ分子上のシアル酸の平均数を用いる。1分子あたりのシアル酸の平均は当業者に公知の方法によって測定することが可能である（ＥＰ0428267公報、など）。

シアル酸が除去されたＥＰＯ（アシアロＥＰＯ）は当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、シアリダーゼなどの酵素でＥＰＯを処理すること等により作製することが可能である。シアリダーゼは市販されているものを用いることが可能である（特表2005-507426号、Nobuo Imai et al.,Eur.J.Biochem,194,457-462(1990)、など)。

ＥＰＯ分子中のアミノ酸の修飾としては、カルバミル化、ビオチン化、アミジン化、アセチル化、グアニジン化、などを挙げることができるが、本発明において好ましいアミノ酸の修飾はカルバミル化である。

修飾されるアミノ酸残基は特に限定されず、例えば、リジン、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファンなどを挙げることができるが、本発明において修飾される好ましいアミノ酸はリジンである。

従って、本発明においてアミノ酸が修飾されたＥＰＯの特に好ましい態様として、リジンがカルバミル化されたＥＰＯを挙げることができる（Marcel L et al.Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic.Science,2004;305:239、 Fiordaliso E et al.A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury.PNAS,2005;102:2046、など)。ＥＰＯのカルバミル化には、シアナートイオン等との反応によるカルバミル化、アルキル−イソシアナート等との反応によるアルキル−カルバミル化、アリール−イソシアナート等との反応によるアリール−カルバミル化などが含まれる。

医薬製剤
ＥＰＯは、当該技術分野において公知の手法にしたがって、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加して製剤化して用いることができる。

懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。

溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。

安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。

また、安定化剤としてある種のアミノ酸を添加することも可能である（例えば、特開平10-182481号公報など）。安定化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は1種又は２種以上を組み合わせて添加することができる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特に限定されないが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンを挙げることができる。

等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。

保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。

吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。

界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。

含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。

酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。

さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００６−１５８９９８の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

ＥＰＯによる造血幹細胞の動員
マウス（C57BL/6、９週齢）に組換えヒトＥＰＯ（エポジン（登録商標）、有効成分：エポエチンベータ）を１００μｇ／ｋｇ／日の用量で１日１回４日間皮下投与した。対照マウスには、ベヒクルを同様にして皮下投与した。５日目にマウスを犠牲死させ、末梢血細胞(0.6〜1mL)を採取した。溶血剤として8.3g/L ammonium chloride in 0.01M Tris-HCl buffer pH7.5±0.2 を含むRed blood cell lysing buffer（SIGMA）を入れ、室温5〜10分放置後2%BSF＋PBS(-)で洗浄した。非特異反応抑制抗体(BD-Pharmigen,San Diego,CA) CD16/CD32(FcγIII/IIreceptor)を1μg/106 cells 添加し、30分間氷温した。次に、FITC-conjugatedされた抗mSca-1抗体(BD pharmingen San Diego,CA),PE-conjugatedされた抗mCD34抗体、APC-conjugatedされた抗mc-Kit抗体(BD pharmingen San Diego,CA),APC-Cy7-conjugatedされた抗mCD3,CD4,CD8a,CD45R/B220,Ly6G(Gr-1),CD11b(Mac-1αchain),Ter119抗体のカクテルをLineage markerとした。抗体染色後FACSvantageSE(Becton Dickinson,Mountain View,CA)を用いて解析した。
結果を図１に示した。図１中のR3に示されるように、ＥＰＯの投与により、c-Kit⁺Sca-1⁺Lin―細胞数が約１３倍に増加した。マウスにおいて、c-Kit⁺Sca-1⁺Lin―細胞はＣＦＵ-Ｓ様細胞のマーカーとなる(Blood.1992 Dec 15;80(12):3044-50等に記載)ため、上記の結果から、ＥＰＯの投与により、ＣＦＵ-Ｓ様細胞が末梢血に動員されていることが確認できた。

CFU-Sコロニーアッセイ
EPOを5日間皮下投与したC57/b6マウスの抹消血細胞10⁴〜10⁵ cells/100〜200μlをドナー細胞として放射線照射装置(日立メディコ製)を用いて950 cGy of 137Cs γ- radiationの致死量放射線を照射したC57/b6マウスをレシピエントマウスとして、尾静脈より移植後、８および12日後の脾臓を取り出した。その後、ブアン染色をして脾臓コロニーを測定(脾臓に出来たコロニーを数える)した。
結果を図２に示した。ＦＡＣＳ分析結果と同様にＣＦＵ-Ｓ様細胞が末梢血に動員されていることが確認できた。

末梢血単核球細胞移植による血管新生治療
重症の虚血肢疾患を有する５名の患者を対象として、エリスロポエチン製剤の投与により末梢血中に造血幹細胞が動員されるか否かを調べ、さらに自己末梢血単核球細胞移植による血管新生治療の臨床試験を行った。臨床試験の全般的なデザインはOpen-labeled studyの形式により行った。

細胞移植予定の２週間前に患者にＥＰＯ6000Uを皮下注射した（１回目）。さらに、細胞移植の1週間前に貯血を目的として瀉血（約４００ｍｌ）し、ＥＰＯ6000Uを皮下注射した（２回目）。術当日午前にＥＰＯ6000Uを注射した（３回目）後、末梢血から血液アフェレーシスにより約１０⁹個の末梢単核球を分離した。ＥＰＯ投与前、２回目投与後およびアフェレーシス直前に末梢血サンプルを採取し、血液検査（ＷＢＣ、ＣＲＰ、ＣＫ）およびＣＤ３４陽性細胞数の測定を行った。

分離した末梢単核球は、患者の虚血肢の筋肉内に５０−１００カ所に分割して注入した。血管新生療法の効果は、細胞移植前、投与翌日、第１週目、第２週目、１ヶ月後、２ヶ月後および６ヶ月後に以下の項目について観察・測定することにより評価した。
ＱＯＬ：ＶＡＳ（visual analogue scale）による疼痛の評価（０を「痛みなし」、10を「最高に痛みを感じる」として評価した）
血液サンプリング
血液検査
血管造影
トレッドミル検査：平地２．４ｋｍ／ｈｒで最大跛行距離または疼痛出現距離を測定
皮膚・潰瘍病変の客観的評価：ABPI(Ankle-brachial pressure index)、指趾尖脈波、トレッドミルテスト（歩行可能性）、サーモグラフィー、レーザードップラー（LDPI）、経皮的酸素分圧（TdPO₂）測定

ＣＤ３４陽性細胞の変化
各症例の概要、ならびに移植細胞数およびＣＤ３４陽性細胞数を以下の表１に示す。エリスロポエチン投与前を１００％とすると、ＣＤ３４陽性細胞の末梢血中における割合はエリスロポエチン１回目を投与して1週間後の瀉血後で８２−２４５％（平均１５８％）増加した。更に1週間後のアフェレーシス直前では８８−１７５％（平均１３９％）増加した。これらの結果から、1回目のエリスロポエチン投与１週間後のＣＤ３４陽性細胞数（瀉血時）が、２週間後（アフェレーシス直前）の細胞数と比較して、同等又はそれ以上に増加していることが確認できた。
また、血液アフェレーシスにて回収した単核球細胞中のＣＤ３４陽性細胞の割合は０．０２−０．１％（平均０．０６％）であった。

細胞移植の臨床評価
自覚症状および血管造影検査による評価
自覚的には４症例中３症例において疼痛の改善を認めた。
また、症例３では、移植１ヶ月後の血管造影において血管再生が認められた（図３）。

他覚的評価

一部の症例においては、ABPIの改善やTdPO₂の改善が認められた。症例２に関しては、トレッドミルテストにおいて１６０ｍから９１５ｍへと著明な歩行距離の改善が認められた。

以上の結果から、エリスロポエチンを投与することにより末梢血中に造血幹細胞を動員することが可能であること、および末梢単核球細胞を虚血性骨格筋内に移植することにより末梢閉塞性動脈疾患の血管新生治療が可能であることが示された。

また、1回目のＥＰＯ投与１週間後に回収した末梢血単核球細胞には、２週間後に回収した単核球細胞と同等もしくはそれ以上のＣＤ３４陽性細胞が含まれていることから、ＥＰＯ投与後１週間後に回収した単核球細胞を用いた場合に、２週間後に回収した単核球細胞と同等以上の血管新生治療効果を得ることが可能であることが示された。

本発明の方法および組成物は、末梢循環障害などの虚血性疾患の治療に有用である。

Claims

エリスロポエチンを有効成分として含む、虚血性疾患の治療に使用するための単核球細胞を末梢血中に動員するための組成物であって、当該組成物は末梢血採取の５日前〜９日前に被験者に投与され、動員された単核球細胞が被験者から採取された後に当該被験者に投与されることを特徴とする、前記組成物。
エリスロポエチンを有効成分として含む、血管再生に使用するための単核球細胞を末梢血中に動員するための組成物であって、当該組成物は末梢血採取の５日前〜９日前に被験者に投与され、動員された単核球細胞が被験者から採取された後に当該被験者に投与されることを特徴とする、前記組成物。
末梢血単核球細胞を採取する前に被験者にエリスロポエチンを投与する回数が１〜３回である、請求項１または２に記載の組成物。
１回に投与されるエリスロポエチンの投与量が３０００Ｕ／ｂｏｄｙ〜１２０００Ｕ／ｂｏｄｙである、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
投与される単核球細胞の細胞数が１．０ｘ１０⁷〜１．０ｘ１０¹²個である、請求項１−４のいずれかに記載の組成物。