JP5895278B2 - Ｇ−ｃｓｆを含む線維芽細胞動員剤及び創傷治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む線維芽細胞動員剤に関する。また、本発明は、Ｇ−ＣＳＦを有効成分として含む線維芽細胞の生着剤に関する。さらに、本発明は、Ｇ−ＣＳＦを有効成分として含む創傷治療剤に関する。

ヒトＧ−ＣＳＦは顆粒球系造血幹細胞の分化誘導因子として発見された造血因子であり、生体内では好中球造血を促進することから、骨髄移植や癌化学療法後の好中球減少症治療剤として臨床応用されている。また、上記作用のほかにも、ヒトＧ−ＣＳＦには、幹細胞に作用してその分化増殖を刺激する作用や骨髄中の幹細胞を末梢血中に動員する作用がある。実際に後者の作用に基づいて、臨床の現場では強力な化学療法を施行した後の癌患者の造血回復促進を目的として、ヒトＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血造血幹細胞を移植する末梢血幹細胞移植術が行われている。

本発明は、線維芽細胞を移植することなく、簡便に線維芽細胞を創傷組織に動員し、線維芽細胞を創傷組織に生着させ、そして創傷を治療することを目的とする。
本発明者らは、心筋梗塞後の創傷組織の再生について検討を行った。その結果、Ｇ−ＣＳＦを投与することにより、心筋梗塞巣に線維芽細胞が移動し、心機能の低下が防止され、心臓のリモデリングを改善することを見出した。本発明はこの知見に基づき完成したものである。

すなわち、本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む線維芽細胞動員剤を提供するものである。
また、本発明は、Ｇ−ＣＳＦを有効成分として含む、心疾患発症後の心臓における線維芽細胞の生着剤を提供するものである。

また、本発明は、Ｇ−ＣＳＦを有効成分として含む創傷治療剤を提供するものである。
さらに、本発明は、有効量のＧ−ＣＳＦを投与することを含む、線維芽細胞動員方法を提供する。

また、本発明は、有効量のＧ−ＣＳＦを投与することを含む、線維芽細胞を心疾患発症後の心臓に生着させるための方法を提供するものである。
また、本発明は、有効量のＧ−ＣＳＦを投与することを含む、創傷治療方法を提供するものである。

心筋梗塞後にＧ−ＣＳＦを投与することにより、梗塞巣に骨髄細胞由来の心筋細胞が多数観察された。一方、その１０倍近い数の線維芽細胞も観察された。すなわち、Ｇ−ＣＳＦ投与により骨髄から種々の幹細胞由来の細胞が梗塞巣に遊走し、梗塞巣が再生され、心筋梗塞後のリモデリングを防止したことが明らかとなった。Ｇ−ＣＳＦ投与により、急性期に白血球が多数浸潤するだけでなく、慢性期（梗塞後６０日）に線維芽細胞が梗塞巣に移動することが創傷治癒を促進し、リモデリングを改善したと考えられる。心筋梗塞後の梗塞巣に線維芽細胞を移植することで梗塞巣のリモデリングが防止できたことが報告されている（Ｈｕｔｃｈｅｓｏｎ ＫＡ，Ａｔｋｉｎｓ ＢＺ，Ｈｕｅｍａｎ ＭＴ，Ｈｏｐｋｉｎｓ ＭＢ，Ｇｌｏｗｅｒ ＤＤ，Ｔａｙｌｏｒ ＤＡ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．９，２０００，３５９−３６８）。本発明においては、心筋梗塞後にＧ−ＣＳＦを投与することにより、骨髄から線維芽細胞を遊走させることができる。したがって、線維芽細胞を移植することなく梗塞巣のリモデリングを防止することが可能であり、臨床応用上極めて有利である。

また、この事実は心筋梗塞以外でも、外傷等の種々の創傷治癒過程においてＧ−ＣＳＦを臨床応用することが出来ることを意味する。すなわち、創傷治癒過程においてＧ−ＣＳＦを投与することにより、早期の顆粒球浸潤だけでなく線維芽細胞も供給され、創傷治癒を加速し、さらにより強固な治癒組織を作ることが可能である。これまで、創傷治癒時にＧ−ＣＳＦを投与すると、顆粒球を大量に浸潤させることとなり、組織破壊に繋がると考えられていたが（Ｒｏｍｓｏｎ，ＪＬ，Ｈｏｏｋ ＢＧ，Ｋｕｎｋｅｌ ＳＬ，Ａｂｒａｍｓ ＧＤ，Ｓｃｈｏｒｋ ＭＡ，Ｌｕｃｃｈｅｓｉ ＢＲ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ６７（５），１９８３，１０１６−１０２３）、本発明においては、Ｇ−ＣＳＦを投与することでより強固な創傷部位の治癒が可能である。

図１は、骨髄移植６０日後の末梢血有核細胞についてＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。 図２は、骨髄のサイトスピン標本の共焦点レーザー顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞であることを示し、青色はＤＡＰＩ染色により有核細胞であることを示す。 図３は、心筋梗塞作製後、Ｇ−ＣＳＦを１０日間皮下投与したマウス（Ｇ−ＣＳＦ投与群）、及び生理食塩水を投与したマウス（対照群）についての生存率を示した図である。 図４は、心筋梗塞作製後６０日での経胸壁心エコーＭモード画像である。上から、正常マウス、対照マウス及びＧ−ＣＳＦ投与（１００μｇ／ｋｇ）マウスの左室を示す。 図５は、心筋梗塞作製後６０日における、左室駆出率に対するＧ−ＣＳＦ投与の効果を示すグラフである。左から、正常群、Ｇ−ＣＳＦ投与群（１００μｇ／ｋｇ）及びＧ−ＣＳＦ投与群（３００μｇ／ｋｇ）の結果を示す。 図６は、心筋梗塞作製後６０日おける、左室拡張末期径に対するＧ−ＣＳＦ投与の効果を示すグラフである。左から、正常群、Ｇ−ＣＳＦ投与群（１００μｇ／ｋｇ）及びＧ−ＣＳＦ投与群（３００μｇ／ｋｇ）の結果を示す。 図７（ａ）は、心筋梗塞作製後６０日における対照群（左図）及びＧ−ＣＳＦ投与群（右図）の心臓左心室短軸断面についてのアザン染色図である。赤色部分が筋線維、青色部分が膠原線維を示す。 図７（ｂ）は、心筋梗塞作製後６０日におけるＧ−ＣＳＦ投与群の心臓左心室短軸断面についてのアザン染色図（左図）及び共焦点レーザー顕微鏡写真（右図）である。 図８は、心筋梗塞巣の共焦点レーザー顕微鏡写真である。（ａ）は非梗塞巣、（ｂ）は対照群における心筋梗塞巣、（ｃ）はＧ−ＣＳＦ投与群（１００μｇ／ｋｇ）の心筋梗塞巣を示す。（ｄ）はＬａｃ−ＺトランスジェニックマウスにＧ−ＣＳＦを投与（１００μｇ／ｋｇ）した場合の心筋梗塞巣を示す。 図９は、心筋梗塞巣に存在するＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。 図１０は、心筋梗塞巣を、抗α−平滑筋アクチン抗体を用いて免疫染色したときの共焦点レーザー顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はα−平滑筋アクチンを示す。 図１１は、心筋梗塞巣を、抗フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）抗体を用いて免疫染色したときの共焦点レーザー顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はｖＷＦを示す。 図１２は、心筋梗塞巣を、抗アクチニン抗体を用いて免疫染色したときの顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はアクチニンを示す。 図１３は、心筋梗塞巣を、抗アクチニン抗体を用いて免疫染色したときの顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はアクチニンを示す。 図１４は、心筋梗塞巣を１μｍごとにスライスした切片について、抗アクチニン抗体を用いて免疫染色したときの顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はアクチニンを示す。 図１５は、Ｇ−ＣＳＦ投与後の心筋梗塞巣におけるＧＦＰ陽性細胞の種類別の割合を示すグラフである。 図１６は、全骨髄移植群及び単一造血幹細胞移植群における末梢血有核細胞数に対するＧ−ＣＳＦ投与の効果を示すグラフである。 図１７は、心筋梗塞作製後の生存率に対するＧ−ＣＳＦ投与の効果を示す図である。図中、点線は全骨髄移植群、直線は単一造血幹細胞移植群を示し、四角はＧ−ＣＳＦ投与群（＋）、丸はＧ−ＣＳＦ非投与群（−）を示す。 図１８は、単一造血幹細胞移植群における心筋梗塞巣を抗ビメンチン抗体で免疫染色したときの共焦点レーザー顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はビメンチンを示す。 図１９は、全骨髄移植群及び単一造血幹細胞移植群におけるＧＦＰ陽性細胞数に対するＧ−ＣＳＦ投与の効果を示すグラフである。 図２０は、単一造血幹細胞移植群にＧ−ＣＳＦ投与した場合の心筋梗塞境界領域について抗アクチニン抗体を用いて免疫染色したときの共焦点レーザー顕微鏡写真である。緑色はＧＦＰ陽性細胞、青色はＤＡＰＩにより染色された核、赤色はアクチニンを示す。

本発明は、Ｇ−ＣＳＦを有効成分として含む線維芽細胞動員剤に関するものである。線維芽細胞が動員される場所は特に制限されない。例えば、創傷を負った組織が存在する場合、Ｇ−ＣＳＦを投与することにより、創傷を負った組織に線維芽細胞を動員することが可能である。

本発明において創傷とは、体組織の障害・損傷のことをいい、例えば、心臓、肺、腎臓、腸、肝臓、腱などの内部組織や臓器への障害・損傷や、皮膚などへの外傷を含む。創傷を負った組織の具体的な例としては、心筋梗塞後の心臓を好適に挙げることができる。

線維芽細胞は、通常、結合組織の固有細胞であり、粗面小胞体とゴルジ装置の良好な発育を特徴とする楕円形の核と紡錘状の原形質を持つ細胞である。又、多くの臓器に存在する間葉系細胞で実質細胞を埋める役をする細胞も含まれる。線維芽細胞は通常、体内の間質物質（コラーゲン、フィブロネクチン、ムコ多糖など）を多量産生する能力を有する。創傷を負った組織に線維芽細胞を動員することにより、創傷の治癒を促進することが可能である。

又、本発明はＧ−ＣＳＦを有効成分として含む、心疾患発症後の心臓における線維芽細胞生着剤に関する。
心疾患の具体的な例としては、例えば、虚血性心疾患（心筋梗塞など）や心筋疾患（心筋症など）などを挙げることができる。例えば、心筋梗塞後にＧ−ＣＳＦを投与することにより、心筋梗塞巣へ線維芽細胞を生着させることが可能である。

さらに、本発明はＧ−ＣＳＦを有効成分として含む創傷治療剤に関するものである。
本発明に用いるＧ−ＣＳＦは、どのようなＧ−ＣＳＦでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＧ−ＣＳＦであり、より具体的には、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦ、特にヒトＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。Ｇ−ＣＳＦの由来は特に限定されず、天然由来のＧ−ＣＳＦ、遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦなどを用いることができるが、好ましくは遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦである。遺伝子組換え法により得られるＧ−ＣＳＦには、天然由来のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。

また、本発明においては、Ｇ−ＣＳＦはタンパク質として投与してよいが、遺伝子治療のようにＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を投与してもよい。Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子は、通常、発現カセットを含む発現ベクター等として投与されるのが一般的である。ベクターは特に限定されず、非ウイルスベクターを用いてもよいし、ウイルスベクターを用いてもよい（別冊実験医学、「遺伝子導入と発現解析実験方法」、羊土社、１９９６など）。ベクターの例としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣベクターなどを挙げることができる。発現ベクターには、通常、プロモーター等の調節因子などが含まれる。遺伝子の導入方法はどのような方法を用いてもよく、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、リポソーム法を用いた導入方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡ法、レセプター介在性遺伝子導入方法、遺伝子銃を用いた方法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いた方法などを用いることが可能である。また、本発明においては、遺伝子を直接体内に導入してもよいし、取り出した細胞や培養して得た細胞などに遺伝子を導入した後に該細胞を体内に戻してもよい。

又、Ｇ−ＣＳＦと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＧ−ＣＳＦとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。

又、化学修飾したＧ−ＣＳＦを用いることも可能である。化学修飾したＧ−ＣＳＦの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったＧ−ＣＳＦや、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＧ−ＣＳＦなどを挙げることができる。

本発明で用いるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞やヒトＧ−ＣＳＦ産生ハイブリドーマの細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦ、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦなどを用いることができる。本発明において用いられるＧ−ＣＳＦは、遺伝子工学的手法により製造されたＧ−ＣＳＦが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＧ−ＣＳＦが好ましい（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報）。

本発明の線維芽細胞動員剤等には、その投与方法や剤形に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。

懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。

溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。

安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。

保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。

含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。

酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。

さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。

本発明の線維芽細胞動員剤等は、注射剤（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、など）として、または経皮、経粘膜、経鼻などの投与に適した剤形、又は経口投与に適した剤形（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤など）として投与することが可能である。本発明は投与経路や剤形などによって限定されるものではない。

本発明のＧ−ＣＳＦを有効成分とする線維芽細胞動員剤等の投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して当業者が適宜決定することができるが、通常、成人一人あたり０．１〜５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは１〜５０μｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量でＧ−ＣＳＦを投与することができる。投与回数は一週間に１〜７日間投与することができる。しかし、本発明はヒトＧ−ＣＳＦの用量によって限定されるものではない。又、本発明の線維芽細胞動員剤等は、他の薬剤と併用してもよい。

［実施例１］
全骨髄移植
（１）骨髄移植モデルマウスの作製
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＣＬＥＡ、東京、日本）に、４×１０６Ｖ ｌｉｎｅａｒ ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを用いて致死量の放射線（８５０ｃＧｙ）を全身に単回照射し、レシピエントマウスとして用いた。ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、１０〜１２週齢）（Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．４０７，３１３−３１９）の大腿骨及び頸骨より骨髄粗分画を採取し、５×１０６個の骨髄細胞をレシピエントマウスの尾静脈より移植した。

レシピエントの骨髄中にドナー由来のＧＦＰ陽性骨髄細胞がどの程度生着しているか（これを「キメラ率」という）を確認するため、骨髄移植後６０日の末梢血有核細胞について、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析を行った。結果を図１に示す。対照マウスでは骨髄有核細胞中にＧＦＰの発現は認められないが、骨髄移植マウスの細胞は９７．８％がＧＦＰ陽性であった。キメラ率の多寡はドナー由来のＧＦＰ陽性細胞を定量化する上で重要な指標となる。本実験では、骨髄移植モデルマウスとして、末梢血細胞のキメラ率が平均９５％以上のマウスを使用した。これは、骨髄由来細胞の創傷治癒への貢献を定量評価するに足る条件を満たしているものと考えられる。

図２に骨髄のサイトスピン標本を示す。ＤＡＰＩ染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、ほとんどの有核細胞（青色）が緑色に発色しており、骨髄細胞がＧＦＰ陽性であることが示された。

（２）心筋梗塞マウスに対するＧ−ＣＳＦ投与の効果
骨髄移植の６０日後、マウスに０．５％イソフルランガスを吸入麻酔し、開胸して左心室を露出させ、左冠動脈を結紮して心筋梗塞を作製した。心筋梗塞作製後２４時間に、生理食塩水に溶解した組換えヒトＧ−ＣＳＦ（中外製薬（株）製）（１００又は３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１日１回、１０日間連続してマウスに皮下投与した（Ｇ−ＣＳＦ投与群）。対照群のマウスには生理食塩水のみを投与した。
生存率
Ｇ−ＣＳＦ投与群（３００μｇ／ｋｇ）及び対照群について生存率（ｎ＝６８）を調べた（図３）。対照群の生存率は、心筋梗塞作製後６０日で約６０％であったが、Ｇ−ＣＳＦ投与群の生存率は約９０％であった。

形態観察
心筋梗塞作製後６０日に、正常マウス並びに対照群及びＧ−ＣＳＦ投与群のマウスについて、１５ＭＨｚ整相列トランスデューサーを備えたイメージポイント１５００超音波診断装置（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて、経胸壁心エコー（Ｍモード心エコー）を行い、心筋梗塞巣の形態観察を行った。マウスは、ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、自発呼吸を維持させた。図４から明らかなように、対照群では、正常な左室と比較して、前壁部分の心筋が薄化し、無収縮であり、左室内径が拡大していた。これに対し、Ｇ−ＣＳＦ投与群（１００μｇ／ｋｇ）では、左室拡張末期経の拡大の程度が対照群に比して抑制されていた。また、左室前壁は低収縮であるものの、対照群と比較すると有意に改善していた。

心機能
心筋梗塞作製後６０日に、対照群及びＧ−ＣＳＦ投与群（１００又は３００μｇ／ｋｇ）のＭモード画像より左室収縮末期内径（ＬＶＥＳＤ）及び拡張末期内径（ＬＶＥＤＤ）を測定した（ｎ＝６８）。また、拡張末期容量（ＥＤＶ）及び収縮末期容量（ＥＳＶ）をＴｅｉｃｈｈｏｌｚ法により計算した。左室駆出率（ＥＦ）は下式により計算した。

ＥＦ（％）＝［（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ］×１００
結果を、図５及び図６に示す。いずれもＧ−ＣＳＦ投与群で心機能の著しい改善が観察された。

組織学的観察
（ｉ）切片の作製
マウスをケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、心臓をＰＢＳで灌流し、ＰＢＳに溶解した４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。心臓を取り出し、これをＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）中に包埋し、液体窒素で急速凍結した。包埋した心臓をスライスして切片を作製した。

（ｉｉ）アザン染色
心筋梗塞作製後６０日に、対照群及びＧ−ＣＳＦ投与群（３００μｇ／ｋｇ）の心臓左心室短軸断面の凍結切片についてアザン染色を行った。結果を図７（ａ）に示す。対照群では左心室の径の拡大、梗塞巣の「ひ薄化」・伸展化が観察され、いわゆる心筋梗塞後のリモデリングが観察された。これに対し、Ｇ−ＣＳＦ投与群では梗塞後のリモデリングは軽度であり、梗塞巣の「ひ薄化」・伸展化は軽減していた。すなわち、Ｇ−ＣＳＦ投与により、心筋梗塞巣の組織が再生され、リモデリングが防止されたことが明らかとなった。

また、Ｇ−ＣＳＦ投与群の切片を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、心筋梗塞巣にＧＦＰ陽性骨髄細胞が多数浸潤していることが示された（図７（ｂ）、右図）。
（ｉｉｉ）免疫染色
凍結切片（６μｍ）をＰＢＳで洗浄し、抗体を用いて４℃で一晩染色した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＲＩＴＣ（ＤＡＫＯ，Ｊａｐａｎ）結合２次抗体とともに４℃で４時間インキュベートした（赤色）。核はＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した（青色）。

共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ４１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で心筋梗塞巣の観察を行った（図８）。非梗塞巣の切片は、抗α−アクチニン抗体（ｃｌｏｎｅ ＥＡ−５３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて染色した。心筋細胞が赤く染色され、血管内にはＧＦＰ陽性細胞がわずかに残存していた（ａ）。対照群の梗塞巣では、わずかにＧＦＰ陽性細胞が観察されるのみであった（ｂ）。これに対し、Ｇ−ＣＳＦ投与群（３００μｇ／ｋｇ）では梗塞巣に多数のＧＦＰ陽性細胞が観察された（ｃ）。ドナーマウスとしてＬａｃ−Ｚトランスジェニックマウス（１０〜１２週齢：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）を用いて（ｃ）と同様の実験を行うことにより、（ｃ）の梗塞巣における緑色の蛍光が非特異的な蛍光でないことを確認した（ｄ）。また、共焦点レーザー顕微鏡で撮影した画像をコンピュータに取り込み、ＮＩＨイメージで解析した。梗塞巣に存在する単位面積あたりの細胞数に対するＧＦＰ陽性細胞数を計算した。結果を図９に示す。Ｇ−ＣＳＦ投与により、骨髄由来の細胞が心筋梗塞巣に遊走したことが明らかとなった。

次に、このＧＦＰ陽性細胞が如何なる細胞であるかを確認した。
図１０に抗α−平滑筋アクチン抗体（ｃｌｏｎｅ １Ａ４；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて免疫染色を行った結果を示す。骨髄由来のＧＦＰ陽性細胞が赤く染色されており、平滑筋細胞に分化していることが明らかとなった。

次に、内皮細胞マーカーであるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）について、抗ｖＷＦ抗体（ｃｌｏｎｅ Ｆ８／８６；ＤＡＫＯ）を用いて免疫染色を行った（図１１）。ＧＦＰシグナルがｖＷＦのシグナルに囲まれている領域が認められ、ＧＦＰ陽性細胞は内皮細胞にも分化していることが明らかとなった。

さらに、抗α−アクチニン抗体を用いて、心筋細胞を免疫染色した（図１２〜図１４）。図１２及び図１３から明らかなように、ＧＦＰ陽性細胞にアクチニン陽性シグナルが認められた。また、そのうちのいくつかには横紋が見られ、心筋細胞であることが示唆された。ＧＦＰ陽性細胞により、完全な横紋をもつ心筋が再生された。図１４は１μｍごとにスライスした切片の写真である。骨髄由来のＧＦＰ陽性細胞が完全な心筋細胞を再生していることが示された。

心筋梗塞作製後６０日に心筋梗塞巣に観察されたＧＦＰ陽性細胞中に占める、心筋細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞の比率を図１５にまとめる。細胞数は以下のようにして求めた。心臓を心尖部、中部、基部に３分割し、各々のＧＦＰ陽性細胞の面積と組織の厚みより梗塞部組織の体積を算出した。単位面積当たりのＧＦＰ陽性細胞数を計測し、ＧＦＰ陽性細胞密度を求めた。ＧＦＰ陽性細胞密度と梗塞部体積より、梗塞部組織中のＧＦＰ陽性細胞の細胞数を算出した。８０％以上の細胞は紡錘形をしており、造血細胞とは異なる形態をしていた。また、これらの細胞はＣＤ４５陰性、Ｍａｃ−１陰性であった。すなわち、心筋梗塞巣に最も多く存在するのは線維芽細胞であることが示された。

［実施例２］
骨髄由来単一造血幹細胞の移植
ＧＦＰトランスジェニックマウスより骨髄を採取し、セルソーターでＧＦＰ陽性画分を分離後、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性、ｌｉｎａｇｅ抗原陰性、ＣＤ３４陰性の造血幹細胞を回収した。このうちの細胞１個と、別の正常ドナーマウスから採取した骨髄粗分画の５×１０６個の細胞とを、致死量放射線を照射したレシピエントマウスに骨髄移植した。３ヶ月後、骨髄におけるＧＦＰ陽性細胞の生着率を確認した。麻酔開胸後、左冠動脈を結紮して心筋梗塞を作製した。その後、Ｇ−ＣＳＦ（３００μｇ／ｋｇ）を１０日間皮下投与した。Ｇ−ＣＳＦ投与後１０日における末梢血有核細胞数は、全骨髄移植群と単一造血幹細胞移植群で共に約３０，０００ぐらいであり、差は見られなかった（図１６）。

単一造血幹細胞移植群（直線）と全骨髄移植群（点線）について、Ｇ−ＣＳＦ投与（四角）及び非投与（丸）の場合における生存率を調べた（図１７）。全骨髄移植群のみならず、単一造血幹細胞移植群においても、Ｇ−ＣＳＦ投与により、有意に生存率が改善された。

次に、実施例１と同様の方法により単一造血幹細胞移植群の心筋梗塞巣の切片を作製し、抗ビメンチン抗体（ＰＲＯＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＫ ＧＭＢＨ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＰ５３）を用いて免疫染色を行った。図１８から明らかなように、心筋梗塞巣においてＧＦＰ陽性細胞の存在が認められた。１個のＧＦＰ陽性造血幹細胞が心筋梗塞巣において生着していることが明らかとなった。また、抗ビメンチン抗体で染色されていることから、線維芽細胞への分化が認められた。

さらに、単一造血幹細胞移植群と全骨髄移植群について、Ｇ−ＣＳＦ投与及び非投与の場合におけるＧＦＰ陽性細胞数を実施例１と同様にして測定した（図１９）。全骨髄移植群のみならず、単一造血幹細胞移植群においても、Ｇ−ＣＳＦ投与により有意にＧＦＰ陽性細胞数が増加していた。

単一造血幹細胞移植群にＧ−ＣＳＦ投与した場合の左心室切片について抗心筋アクチニン抗体を用いて免疫染色を行った（図２０）。ＧＦＰ陽性細胞がアクチニン陽性となっており、心筋細胞に分化していることが示された。

上記実施例１及び２において、数値は平均±ＳＥＭで示した。平均値間の有意差はＡＮＯＶＡにより算出した。対照群とＧ−ＣＳＦ投与群との比較は、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定又はノンパラメトリックなＦｉｓｈｅｒの多重比較検定で行った。ｐ＜０．０５を有意とした。

［実施例３］
致死量の放射線照射を行った８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＡＧ−ＥＧＦＰマウス（Ｏｋａｂｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９７，４０７：３１３−３１９）の骨髄から採取した全骨髄細胞（ｗ−ＢＭ）、又はｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性、ｌｉｎｅａｇｅ抗原陰性の単一集団細胞（ＫＳＬ−ＳＰ）を尾静脈より移植した。８週間後、左冠動脈の結紮によりマウスに心筋梗塞（ＭＩ）を作製した。ＭＩ作製後２４時間に、生理食塩水（Ｇ−ＣＳＦ（−））又は３００μｇ／ｋｇ／ｄａｙのＧ−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ（＋））を１日１回、１０日間連続してマウスに皮下投与した。ＭＩ作製後８週に、マウスを解剖し、心臓を免疫組織学的に解析した。各マウス群（ｎ＝１０）あたり１００サンプル標本について、梗塞巣のＧＦＰ陽性細胞、ＧＦＰ陽性ビメンチン陽性細胞、及びＧＦＰ陽性アクチニン陽性細胞を計測した。ＧＦＰ陽性細胞の平均値を表１に示す。

ｗ−ＢＭ群ではビメンチン陽性細胞（線維芽細胞）とアクチン陽性細胞（心筋細胞）が全骨髄から再生されたが、ＫＳＬ−ＳＰ群では線維芽細胞のみが再生された。この結果は、造血幹細胞からは心筋細胞が再生されないことを示唆している。心筋細胞の再生は間葉系幹細胞からの分化によると考えられる。

次にＧ−ＣＳＦの効果をみると、ｗ−ＢＭ群では線維芽細胞及び心筋細胞を動員した。ＫＳＬ−ＳＰ群では線維芽細胞を動員させたが、心筋細胞はわずか３細胞のみが観察された。この心筋細胞はおそらく再生されたものではなく、細胞融合の結果であると思われる。

いずれの群でも、図１７に示すように、Ｇ−ＣＳＦ投与によって生存率が改善している。これらの効果には、ｗ−ＢＭ群では線維芽細胞及び心筋細胞の動員が寄与しており、ＫＳＬ−ＳＰ群では線維芽細胞の動員が寄与している。特に、線維芽細胞の増加は心筋梗塞部位の創傷治癒に働き、死亡率との相関が知られているリモデリングの抑制を促進するものとして重要である。

本発明の線維芽細胞動員剤を用いることにより、わずかな骨髄由来細胞を遊走させるだけで、線維芽細胞を移植することなく心筋梗塞巣などの組織を再生し、生存率を向上させることが可能である。また、本発明の創傷治療剤を用いることにより、創傷部位の強固な治癒が可能である。

Claims (5)

1. 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含み、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤からなる群から選ばれる１以上の成分を更に含んでなり、骨髄由来の線維芽細胞を心筋梗塞の梗塞巣へ動員するために用いる、線維芽細胞動員剤であって、
   前記Ｇ−ＣＳＦは１００〜５００μｇ/ｋｇ/ｄａｙで投与される、前記線維芽細胞動員剤。
2. 創傷した組織に骨髄由来の線維芽細胞を動員することを特徴とする請求項１に記載の繊維芽細胞動員剤。
3. 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含み、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤からなる群から選ばれる１以上の成分を更に含んでなり、骨髄由来の線維芽細胞を心筋梗塞の梗塞巣へ生着させるために用いる、線維芽細胞生着剤であって、
   前記Ｇ−ＣＳＦは１００〜５００μｇ/ｋｇ/ｄａｙで投与される、前記線維芽細胞生着剤。
4. 骨髄由来の線維芽細胞を心筋梗塞の梗塞巣へ動員させるために用いる線維芽細胞動員剤の製造における、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の使用であって、
   前記動員剤は、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤からなる群から選ばれる１以上の成分を更に含んでなり、そして
   前記Ｇ−ＣＳＦは１００〜５００μｇ/ｋｇ/ｄａｙで投与される、
   前記使用。
5. 骨髄由来の線維芽細胞を心筋梗塞の梗塞巣へ生着させるために用いる線維芽細胞生着剤の製造における、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の使用であって、
   前記生着剤は、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤からなる群から選ばれる１以上の成分を更に含んでなり、そして
   前記Ｇ−ＣＳＦは１００〜５００μｇ/ｋｇ/ｄａｙで投与される、
   前記使用。