KR20060107745A

KR20060107745A - Ｇ－ｃｓｆ 를 함유하는 선유아세포 동원제 및 창상 치료제

Info

Publication number: KR20060107745A
Application number: KR1020067008042A
Authority: KR
Inventors: 게이이치 후쿠다; 준 후지타
Original assignee: 각고호우징 게이오기주크; 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2003-10-27
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2006-10-16
Also published as: KR101144687B1; EP1693065A1; CN1886150B; JP5895278B2; EP1693065A4; JPWO2005039621A1; CA2543817A1; US20070081970A1; AU2004283609B2; CA2543817C; HK1098964A1; US7531510B2; WO2005039621A1; JP2013241452A; CN1886150A; EP1693065B1; AU2004283609A1

Abstract

본 발명은 선유아세포를 이식하지 않고, 간편하게 선유아세포를 창상 조직으로 동원하여, 선유아세포를 창상 조직에 생착시키고, 그리고 창상을 치료하는 것을 목적으로 한다. G-CSF를 투여함으로써, 심근 경색소로 선유아세포가 이동하여, 심기능의 저하가 방지되고, 심장의 리모델링을 개선한다.

선유아세포

Description

Ｇ－ＣＳＦ 를 함유하는 선유아세포 동원제 및 창상 치료제 {FIBROBLAST-MOBILIZING AGENT CONTAINING G-CSF AND WOUND REMEDY}

본 발명은 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 를 유효 성분으로 함유하는 선유아세포 동원제(動員劑)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 함유하는 선유아세포의 생착제(生着劑)에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 포함하는 창상(創傷) 치료제에 관한 것이다.

인간 G-CSF는 과립구계 조혈 줄기 세포의 분화 유도 인자로 발견된 조혈 인자이고, 생체 내에서는 호중구 조혈을 촉진한다는 점에서, 골수 이식이나 암 화학 요법 후의 호중구 감소증 치료제로서 임상 응용되고 있다. 또한, 상기 작용 이외에도, 인간 G-CSF에는 줄기 세포에 작용해 그 분화 증식을 자극하는 작용이나 골수 중의 줄기 세포를 말초혈 속으로 동원하는 작용이 있다. 실제로 후자의 작용에 기초하여, 임상 현장에서는 강력한 화학 요법을 시행한 후의 암 환자의 조혈 회복 촉진을 목적으로, 인간 G-CSF에 의해 동원된 말초혈 조혈 줄기 세포를 이식하는 말초혈 줄기 세포 이식술이 행해지고 있다.

발명의 개시

본 발명은 선유아세포를 이식하지 않고, 간편히 선유아세포를 창상 조직에 동원하여, 선유아세포를 창상 조직에 생착시키고, 그리고 창상을 치료하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 심근 경색 후의 창상 조직의 재생에 관하여 검토하였다. 그 결과, G-CSF를 투여함으로써, 심근 경색소(梗塞巢)로 선유아세포가 이동하여, 심기능의 저하가 방지되고, 심장의 리모델링을 개선시키는 것을 발견하였다. 본 발명은 이 식견에 기초하여 완성한 것이다.

즉, 본 발명은 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 를 유효 성분으로 포함하는 선유아세포 동원제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 포함하는, 심질환 발증 후의 심장에 있어서의 선유아세포 생착제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 포함하는 창상 치료제를 제공하는 것이다.

더욱이, 본 발명은 유효량의 G-CSF를 투여하는 것을 포함하는, 선유아세포 동원 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 유효량의 G-CSF를 투여하는 것을 포함하는, 선유아세포를 심질환 발증 후의 심장에 생착시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 유효량의 G-CSF를 투여하는 것을 포함하는, 창상 치료 방법를 제공하는 것이다.

심근 경색 후에 G-CSF를 투여함으로써, 경색소에 골수 세포 유래의 심근 세포가 다수 관찰되었다. 한편, 그 10배에 가까운 수의 선유아세포도 관찰되었다. 즉, G-CSF 투여에 의해 골수로부터 여러 가지 줄기 세포 유래의 세포가 경색소로 유주(遊走)하고, 경색소가 재생되고, 심근 경색 후의 리모델링을 방지하였음이 분명해 졌다. G-CSF 투여에 의하여, 급성기에 백혈구가 다수 침윤될 뿐만 아니라, 만성기 (경색 후 60일) 에 선유아세포가 경색소로 이동하는 것이 창상 치유를 촉진하여, 리모델링을 개선하였다고 생각된다. 심근 경색 후의 경색소에 선유아세포를 이식함으로써 경색소의 리모델링을 방지할 수 있던 것이 보고되어 있다 (Hutcheson KA, Atkins BZ, Hueman MT, Hopkins MB, Glower DD, Taylor DA, Transplant. 9, 2000, 359-368). 본 발명에 있어서는 심근 경색 후에 G-CSF를 투여함으로써, 골수로부터 선유아세포를 유주시킬 수 있다. 따라서, 선유아세포를 이식하지 않고 경색소의 리모델링을 방지할 수 있고, 임상 응용 상 매우 유리하다.

또한, 이 사실은 심근 경색 이외라도, 외상 등의 여러 가지 창상 치유 과정에 있어서 G-CSF를 임상 응용할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 창상 치유 과정에 있어서 G-CSF를 투여함으로써, 조기의 과립구 침윤뿐만 아니라 선유아세포도 공급되어, 창상 치유를 가속하고, 더욱이 보다 강고한 치유 조직을 만들 수 있다. 지금까지, 창상 치유 시에 G-CSF를 투여하면, 과립구를 대량으로 침윤시키게 되어, 조직 파괴로 이어진다고 생각되어 왔으나 (Romson, JL, Hook BG, Kunkel SL, Abrams GD, Schork MA, Lucchesi BR, Circulation 67(5), 1983, 1016-1023), 본 발명에 있어서는 G-CSF를 투여함으로써 보다 강고한 창상 부위의 치유가 가능하다.

도 1 은 골수 이식 60일 후의 말초혈 유핵 세포에 관하여 FACS 해석한 결과를 나타내는 도이다.

도 2 는 골수의 사이트 스핀 표본의 공초점 레이저 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성의 골수 유래 세포인 것을 나타내고, 청색은 DAPI 염색에 의해 유핵 세포인 것을 나타낸다.

도 3 은 심근 경색 제작 후, G-CSF를 10일간 피하 투여한 마우스 (G-CSF 투여군) 및 생리 식염수를 투여한 마우스 (대조군) 에 관한 생존율을 나타낸 도면이다.

도 4 는 심근 경색 제작 후 60일에서의 경흉벽 심에코 M 모드 화상이다. 위로부터, 정상 마우스, 대조 마우스 및 G-CSF 투여 (100㎍/㎏) 마우스의 좌실을 나타낸다.

도 5 는 심근 경색 제작 후 60일에 있어서의, 좌실 구출률에 대한 G-CSF 투여 효과를 나타내는 그래프이다. 왼쪽으로부터, 정상군, G-CSF 투여군 (100㎍/㎏) 및 G-CSF 투여군 (300㎍/㎏) 의 결과를 나타낸다.

도 6 은 심근 경색 제작 후 60일에서의 좌실 확장 말기 직경에 대한 G-CSF 투여 효과를 나타내는 그래프이다. 왼쪽으로부터, 정상군, G-CSF 투여군 (100㎍/㎏) 및 G-CSF 투여군 (300㎍/㎏) 의 결과를 나타낸다.

도 7(a) 는 심근 경색 제작 후 60일에 있어서의 대조군 (위쪽 도면) 및 G-CSF 투여군 (아래쪽 도면) 의 심장 좌심실 단축 단면에 관한 아잔 염색도이다. 적 색부분이 근 섬유, 청색 부분이 교원 섬유를 나타낸다.

도 7(b) 는 심근 경색 제작 후 60일에 있어서의 G-CSF 투여군의 심장 좌심실 단축 단면에 대한 아잔 염색도 (위쪽 도면) 및 공초점 레이저 현미경 사진 (아래쪽 도면) 이다.

도 8 은 심근 경색소의 공초점 레이저 현미경 사진이다. (a) 는 비경색소, (b) 는 대조군에 있어서의 심근 경색소, (c) 는 G-CSF 투여군 (100㎍/㎏) 의 심근 경색소를 나타낸다. (d) 는 Lac-Z 트랜스제닉 마우스에게 G-CSF를 투여 (100㎍/㎏) 한 경우의 심근 경색소를 나타낸다.

도 9 는 심근 경색소에 존재하는 GFP 양성 세포수를 나타내는 그래프이다.

도 10 은 심근 경색소를 항α-평활근 액틴 항체를 사용해 면역 염색하였을 때의 공초점 레이저 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 α-평활근 액틴을 나타낸다.

도 11 은 심근 경색소를 항폰빌레브란트 인자 (vWF) 항체를 사용해 면역 염색하였을 때의 공초점 레이저 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 vWF를 나타낸다.

도 12 는 심근 경색소를 항액티닌 항체를 사용해 면역 염색하였을 때의 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 액티닌을 나타낸다.

도 13 은 심근 경색소를 항액티닌 항체를 사용해 면역 염색하였을 때의 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 액티닌을 나타낸다.

도 14 는 심근 경색소를 1㎛ 씩 슬라이스한 절편에 대하여, 항액티닌 항체를 사용해 면역 염색하였을 때의 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 액티닌을 나타낸다.

도 15 는 G-CSF 투여 후의 심근 경색소에서의 GFP 양성 세포의 종류별 비율을 나타내는 그래프이다.

도 16 는 전체 골수 이식군 및 단일 조혈 줄기 세포 이식군에 있어서의 말초혈 유핵 세포수에 대한 G-CSF 투여 효과를 나타내는 그래프이다.

도 17 은 심근 경색 제작 후의 생존율에 대한 G-CSF 투여 효과를 나타내는 도이다. 도면 중, 점선은 전체 골수 이식군, 직선은 단일 조혈 줄기 세포 이식군을 나타내며, 네모는 G-CSF 투여군 (+), 동그라미는 G-CSF 비투여군 (-) 을 나타낸다.

도 18 은 단일 조혈 줄기 세포 이식군에 있어서의 심근 경색소를 항비멘틴 항체로 면역 염색하였을 때의 공초점 레이저 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 비멘틴을 나타낸다.

도 19 는 전체 골수 이식군 및 단일 조혈 줄기 세포 이식군에 있어서의 GFP 양성 세포수에 대한 G-CSF 투여 효과를 나타내는 그래프이다.

도 20 은 단일 조혈 줄기 세포 이식군에 G-CSF 투여한 경우의 심근 경색 경계 영역에 관하여 항액티닌 항체를 사용해 면역 염색하였을 때의 공초점 레이저 현미경 사진이다. 녹색은 GFP 양성 세포, 청색은 DAPI에 의해 염색된 핵, 적색은 액티닌을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 포함하는 선유아세포 동원제에 관한 것이다. 선유아세포가 동원되는 장소는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 창상을 입은 조직이 존재하는 경우, G-CSF를 투여함으로써, 창상을 입은 조직에 선유아세포를 동원할 수 있다.

본 발명에 있어서 창상이란, 체조직의 장애·손상을 말하며, 예를 들어, 심장, 폐, 신장, 장, 간장, 건 (腱) 등의 내부 조직이나 장기에의 장애·손상이나, 피부 등에의 외상을 포함한다. 창상을 입은 조직의 구체적인 예로는 심근 경색 후의 심장을 바람직하게 들 수 있다.

선유아세포는 통상, 결합 조직의 고유 세포이고, 조면 소포체와 골지 장치의 양호한 발육을 특징으로 하는 타원형의 핵과 방추상의 원형질을 가지는 세포이다. 또, 많은 장기에 존재하는 간엽계 세포로 실질 세포를 메우는 역할을 하는 세포도 포함된다. 선유아세포는 통상, 체내의 간질 물질 (콜라겐, 피브로넥틴, 무코다당 등) 을 다량 생성하는 능력을 갖는다. 창상을 입은 조직에 선유아세포를 동원함으로써, 창상의 치유를 촉진할 수 있다.

또, 본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 포함하는, 심질환 발증 후의 심장에 있어서의 선유아세포 생착제에 관한 것이다.

심질환의 구체적인 예로는 예를 들어, 허혈성 심질환 (심근 경색 등) 이나 심근 질환 (심근증 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 심근 경색 후에 G-CSF를 투여함으로써, 심근 경색소에 선유아세포를 생착시킬 수 있다.

더욱이, 본 발명은 G-CSF를 유효 성분으로 포함하는 창상 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 사용하는 G-CSF는 어떠한 G-CSF라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 고도로 정제된 G-CSF이고, 보다 구체적으로는 포유 동물 G-CSF, 특히 인간 G-CSF와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것이다. G-CSF의 유래는 특별히 한정되지 않으며, 천연 유래의 G-CSF, 유전자 재조합에 의해 얻어진 G-CSF 등을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 유전자 재조합에 의해 얻어진 G-CSF 이다. 유전자 재조합에 의해 얻어지는 G-CSF에는 천연 유래의 G-CSF와 아미노산 서열이 동일한 것, 또는 그 아미노산 서열 중의 1 또는 복수의 아미노산을 결실, 치환, 부가 등을 한 것으로, 천연 유래의 G-CSF와 동일한 생물학적 활성을 갖는 것 등이어도 된다. 아미노산의 결실, 치환, 부가 등은 당업자에게 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 당업자이면, 부위 특이적 변이 유발법 (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275 ; Zoller, M. J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500 ; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 ; Kramer, W. and Fritz, H. J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 ; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하여, G-CSF의 아미노산에 적절히 변이를 도입함으로써, G-CSF와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에서도 생길 수 있다. 일반적으로, 치환되는 아 미노산 잔기에 있어서는 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 별도의 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 예를 들어 아미노산 측쇄의 성질로는 소수성 아미노산 (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산 (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (H, F, Y, W) 을 들 수 있다 (괄호 안은 모두 아미노산의 1 문자 표기를 나타낸다). 어떤 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수 개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다 (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 ; Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 ; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).

또한, 본 발명에 있어서는 G-CSF는 단백질로서 투여해도 되지만, 유전자 치료와 같이 G-CSF를 코드하는 유전자를 투여해도 된다. G-CSF를 코드하는 유전자는 통상, 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 등으로서 투여되는 것이 일반적이다. 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 비바이러스 벡터를 사용해도 되고, 바이러스 벡터를 사용해도 된다 (별책 실험 의학, 「유전자 도입과 발현 해석 실험 방법」, 요도사, 1996 등). 벡터의 예로는 플러스미드 벡터, 바이러스 벡터, 파 지 벡터, 코스미드 벡터, YAC 벡터 등을 들 수 있다. 발현 벡터에는 통상, 프로모터 등의 조절 인자 등이 포함된다. 유전자 도입 방법은 어떠한 방법을 사용해도 되고, 예를 들어 인산칼슘법, 리포펙션법, 리포솜법을 사용한 도입 방법, naked-DNA법, 리셉터 개재성 유전자 도입 방법, 유전자 총을 사용한 방법, DEAE-덱스트란법, 미소 유리관을 사용한 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는 유전자를 직접 체내로 도입해도 되고, 추출한 세포나 배양해 얻은 세포 등에 유전자를 도입한 후에 그 세포를 체내로 되돌려도 된다.

또, G-CSF와 다른 단백질과의 융합 단백질을 사용하는 것도 가능하다. 융합 폴리펩티드를 제작하기 위해서는 예를 들어, G-CSF를 코드하는 DNA와 다른 단백질을 코드하는 DNA를 프레임이 일치하도록 연결하고 이것을 발현 벡터에 도입하여, 숙주로 발현시키면 된다. 본 발명의 G-CSF와의 융합에 부여되는 다른 단백질로는 특별히 한정되지 않는다.

또, 화학 수식한 G-CSF를 사용하는 것도 가능하다. 화학 수식한 G-CSF의 예로는 예를 들어, 당쇄의 구조 변환·부가·결실 조작을 한 G-CSF나, 폴리에틸렌글리콜·비타민 B12 등, 무기 또는 유기 화합물 등의 화합물을 결합시킨 G-CSF 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용하는 G-CSF는 어떠한 방법으로 제조된 것이어도 되고, 예를 들어, 인간 종양 세포나 인간 G-CSF 생성 하이브리도마의 세포주를 배양하여, 이로 부터 여러 가지 방법으로 추출해 분리 정제한 G-CSF, 또는 유전자 공학적 수법에 의해 대장균, 이스트균, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), C127 세포, COS 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, 곤충 세포 등으로 생성시켜, 여러 가지 방법으로 추출해 분리 정제한 G-CSF 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 G-CSF는 유전자 공학적 수법에 의해 제조된 G-CSF가 바람직하고, 포유 동물 세포 (특히 CHO 세포) 를 사용하여 제조된 G-CSF가 바람직하다 (예를 들어, 일본 특허공고공보 평1-44200호, 일본 특허공고공보 평2-5395호, 일본 공개특허공보 소62-129298호, 일본 공개특허공보 소62-132899호, 일본 공개특허공보 소62-236488호, 일본 공개특허공보 소64-85098호).

본 발명의 선유아세포 동원제 등에는 그 투여 방법이나 제형에 따라 필요에 의하여, 현탁화제, 용해 보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착 방지제, 계면 활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제(無痛化劑), 완충제, 함유(含硫) 환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다.

현탁제의 예로는 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트분말, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있다.

용액 보조제로는 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리소르베이트80, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 마크로골, 피마자유지방산에틸에스테르 등을 들 수 있다.

안정화제로는 덱스트란40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타아황산나트륨 등을 들 수 있다.

등장화제로는 예를 들어, D-만니톨, 소르비트 등을 들 수 있다.

보존제로는 예를 들어, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.

흡착 방지제로는 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥사이드·프로필렌옥사이드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.

함유 환원제로는 예를 들어, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소원자수 1∼7 의 티오알칸산 등의 술피드히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.

산화 방지제로는 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산2나트륨 (EDTA), 피롤린산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.

추가로는, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 탄산수소나트륨 등의 무기염; 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 아세트산나트륨 등의 유기염 등의 통상 첨가되는 성분을 함유하고 있어도 된다.

본 발명의 선유아세포 동원제 등은 주사제 (피하, 피내, 근육내, 정맥내, 복강내 등) 로, 또는 경피, 경점막, 경비 등의 투여에 알맞은 제형, 또는 경구투여에 알맞은 제형 (정제, 캡슐제, 과립제, 액제, 현탁제 등) 으로서 투여할 수 있다. 본 발명은 투여 경로나 제형 등에 의해서 한정되는 것이 아니다.

본 발명의 G-CSF를 유효 성분으로 하는 선유아세포 동원제 등의 투여량, 투여 회수는 대상 질환 환자의 병상을 배려하여 당업자가 적절히 결정할 수 있지만, 통상, 성인 1인당 0.1∼500㎍/㎏/day, 바람직하게는 1∼50㎍/㎏/day 의 용량으로 G-CSF를 투여할 수 있다. 투여 회수는 1주간에 1∼7일간 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명은 인간 G-CSF의 용량에 의해서 한정되는 것은 아니다.

또, 본 발명의 선유아세포 동원제 등은 다른 약제와 병용해도 된다.

실시예 1

전체 골수 이식

(1) 골수 이식 모델 마우스의 제작

8∼10주령 C57BL/6마우스 (CLEA, 동경, 일본) 에, 4×10⁶V linear accelerator를 사용해 치사량의 방사선 (850cGy) 을 전신에 단회 조사하여, 레시피언트 마우스로 사용하였다. GFP 트랜스제닉 마우스 (C57BL/6, 10∼12주령) (Okabe et al., (1997) FEBS. Lett. 407, 313-319) 의 대퇴골 및 경골로부터 골수 조분획을 채취하여, 5×10⁶개의 골수 세포를 레시피언트 마우스의 꼬리 정맥을 통해 이식하였다.

레시피언트의 골수 중에 도너 유래의 GFP 양성 골수 세포가 어느 정도 생착해 있는가 (이것을「키메라율」이라고 한다) 를 확인하기 위해, 골수 이식 후 60일 인 말초혈 유핵 세포에 관하여, FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 를 사용하여 해석하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 대조 마우스에서는 골수 유핵 세포 중에 GFP의 발현은 인정되지 않지만, 골수 이식 마우스의 세포는 97.8% 가 GFP 양성이었다. 키메라율의 다과는 도너 유래의 GFP 양성 세포를 정량화하는 데에 있어서 중요한 지표가 된다. 본 실험에서는 골수 이식 모델 마우스로서, 말초혈 세포의 키메라율이 평균 95% 이상인 마우스를 사용하였다. 이는 골수 유래 세포의 창상 치유에의 공헌을 정량 평가할 만한 조건을 만족하고 있는 것으로 생각된다.

도 2 에 골수의 사이트 스핀 표본을 나타낸다. DAPI 염색을 하여, 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 대개의 유핵 세포 (청색) 가 녹색으로 발색하고 있어, 골수 세포가 GFP 양성인 것이 나타났다.

(2) 심근 경색 마우스에 대한 G-CSF 투여 효과

골수 이식 60일 후, 마우스에게 0.5% 이소플루란 가스를 흡입 마취하고, 개흉하여 좌심실을 노출시켜, 좌관동맥을 결찰하여 심근 경색을 제작하였다. 심근 경색 제작 후 24시간에, 생리 식염수에 용해한 재조합 인간 G-CSF (쥬가이제약 (주) 제조) (100 또는 300㎍/㎏/day) 를 1일 1회, 10일간 연속해 마우스에게 피하 투여했다 (G-CSF 투여군). 대조군의 마우스에게는 생리 식염수만을 투여하였다.

생존율

G-CSF 투여군 (300㎍/㎏) 및 대조군에 관하여 생존율 (n= 68) 을 조사하였다 (도 3). 대조군의 생존율은 심근 경색 제작 후 60일에 약 60% 이지만, G-CSF 투여군의 생존율은 약 90% 이었다.

형태 관찰

심근 경색 제작 후 60일에, 정상 마우스 및 대조군 및 G-CSF 투여군의 마우스에 관하여, 15MHz 정상열 (整相列) 트랜스듀서를 구비한 이미지 포인트 1500 초음파 진단 장치 (Philips Co., USA) 를 사용하여, 경흉벽 심에코 (M 모드 심에코) 를 하여, 심근 경색소의 형태를 관찰하였다. 마우스는 케타민 (30mg/㎏) 및 자일라진 (6㎎/㎏) 으로 마취하여, 자발 호흡을 유지시켰다. 도 4 로부터 분명하듯이, 대조군에서는 정상인 좌심실과 비교하여, 전벽 부분의 심근이 얇아져, 무수축이고, 좌실 내경이 확대되어 있었다. 이에 대하여, G-CSF 투여군 (100㎍/㎏) 에서는 좌실 확장 말기 직경의 확대 정도가 대조군에 비하여 억제되어 있었다. 또한, 좌실 전벽은 저수축이지만, 대조군과 비교하면 유의하게 개선되었다.

심기능

심근 경색 제작 후 60일에, 대조군 및 G-CSF 투여군 (100 또는 300㎍/㎏) 의 M 모드 화상으로부터 좌실 수축 말기 내경 (LVESD) 및 확장 말기 내경 (LVEDD) 을 측정하였다 (n=68). 또한, 확장 말기 용량 (EDV) 및 수축 말기 용량 (ESV) 을 Teichholz 법에 의해 계산하였다. 좌실 구출률 (EF) 은 아래 식에 의해 계산하였다.

EF (%)=[(EDV-ESV)/EDV]×100

결과를 도 5 및 도 6 에 나타낸다. 모두 G-CSF 투여군에서 심기능의 현 저한 개선이 관찰되었다.

조직학적 관찰

(i) 절편의 제작

마우스를 케타민 (30㎎/㎏) 및 자일라진 (6㎎/㎏) 으로 마취하고, 심장을 PBS로 관류하여, PBS에 용해시킨 4% 파라포름알데히드로 관류 고정하였다. 심장을 취출하여, 이것을 OCT 화합물 (Miles Scientific, Naperville, IL, USA) 중에 포매(包埋)하고, 액체 질소로 급속 동결하였다. 포매한 심장을 슬라이스해 절편을 제작하였다.

(ⅱ) 아잔 염색

심근 경색 제작 후 60일에, 대조군 및 G-CSF 투여군 (300㎍/㎏) 의 심장 좌심실 단축 단면의 동결 절편에 대하여 아잔 염색을 하였다. 결과를 도 7(a) 에 나타낸다. 대조군에서는 좌심실의 직경 확대, 경색소의 「피박화」·신전화(伸展化)가 관찰되어, 이른바 심근 경색 후의 리모델링이 관찰된다. 이에 대하여, G-CSF 투여군에서는 경색 후의 리모델링은 경도(輕度)이고, 경색소의「피박화」·신전화는 경감되었다. 즉, G-CSF 투여에 의하여, 심근 경색소의 조직이 재생되어, 리모델링이 방지된 것이 분명해졌다.

또한, G-CSF 투여군의 절편을 공초점 레이저 현미경으로 관찰한 바, 심근 경색소에 GFP 양성 골수 세포가 다수 침윤되어 있는 것이 나타났다 (도 7(b), 오른쪽도).

(ⅲ) 면역 염색

동결 절편 (6㎛) 을 PBS로 세정하여, 항체를 사용해 4℃에서 하룻밤 염색하였다. 그 후, PBS로 3회 세정하여, TRITC (DAKO, Japan) 결합 2차 항체와 함께 4℃ 에서 4시간 인큐베이트하였다 (적색). 핵은 DAPI (Sigma Aldrich) 로 염색하였다 (청색).

공초점 레이저 현미경 (LSM410 ; Carl Zeiss, Jena, Germany) 으로 심근 경색소를 관찰하였다 (도 8). 비경색소의 절편은 항α-액티닌 항체 (clone EA-53 ; Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA) 를 사용해 염색했다. 심근 세포가 빨갛게 염색되어, 혈관 내에는 GFP 양성 세포가 아주 조금 잔존하고 있었다 (a). 대조군의 경색소에서는 아주 조금 GFP 양성 세포가 관찰될 뿐이었다 (b). 이에 대하여, G-CSF 투여군 (300㎍/㎏) 에서는 경색소에 다수의 GFP 양성 세포가 관찰되었다 (c). 도너 마우스로서 Lac-Z 트랜스제닉 마우스 (10∼12주령 : Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) 를 사용하여 (c) 와 동일한 실험을 함으로써, (c) 의 경색소에서의 녹색의 형광이 비특이적인 형광이 아닌 것을 확인하였다 (d). 또한, 공초점 레이저 현미경으로 촬영한 화상을 컴퓨터에 입력하여, NIH 이미지로 해석하였다. 경색소에 존재하는 단위 면적당 세포수에 대한 GFP 양성 세포수를 계산하였다. 결과를 도 9 에 나타낸다. G-CSF 투여에 의하여, 골수 유래의 세포가 심근 경색소로 유주한 것이 분명해졌다.

다음으로, 이 GFP 양성 세포가 어떠한 세포인가를 확인하였다.

도 10 에 항α-평활근 액틴 항체 (clone 1A4 ; Sigma Aldrich) 를 사용하여 면역 염색한 결과를 나타낸다. 골수 유래의 GFP 양성 세포가 빨갛게 염색되어 있고, 평활근 세포로 분화되어 있는 것이 분명해졌다.

다음으로, 내피 세포 마커인 폰빌레브란트 인자 (vWF) 에 관하여, 항 vWF 항체 (clone F8/86 ; DAKO) 를 사용하여 면역 염색을 하였다 (도 11). GFP 시그널이 vWF의 시그널로 둘러싸여 있는 영역이 인정되어, GFP 양성 세포는 내피 세포로도 분화되어 있는 것이 분명해졌다.

더욱이, 항α-액틴 항체를 사용하여, 심근 세포를 면역 염색하였다 (도 12∼도 14). 도 12 및 도 13 으로부터 분명하듯이, GFP 양성 세포에 액티닌 양성 시그널이 인정되었다. 또한, 그 중 몇 개에서는 줄무늬가 보여, 심근 세포인 것이 시사되었다. GFP 양성 세포에 의하여, 완전한 줄무늬를 갖는 심근이 재생되었다. 도 14 는 1㎛ 씩 슬라이스한 절편의 사진이다. 골수 유래의 GFP 양성 세포가 완전한 심근 세포를 재생시키고 있는 것이 나타났다.

심근 경색 제작 후 60일에 심근 경색소에서 관찰된 GFP 양성 세포 중 차지하는 심근 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포 및 선유아세포의 비율을 도 15 에 정리한다. 세포수는 아래와 같이 하여 구했다. 심장을 심첨부(心尖部), 중부, 기부(基部)로 3분할하여, 각각의 GFP 양성 세포 면적과 조직 두께로부터 경색부 조직의 체적을 산출하였다. 단위 면적당 GFP 양성 세포수를 계측하여, GFP 양성 세포 밀도를 구하였다. GFP 양성 세포 밀도와 경색부 체적으로부터, 경색부 조직 중의 GFP 양성 세포 세포수를 산출하였다. 80% 이상의 세포는 방추형을 띄고 있어, 조혈 세포와는 다른 형태를 하고 있었다. 또한, 이들 세포는 CD45 음성, Mac-1 음성이었다. 즉, 심근 경색소에 가장 많이 존재하는 것은 선 유아세포인 것이 나타났다.

실시예 2

골수 유래 단일 조혈 줄기 세포의 이식

GFP 트랜스제닉 마우스로부터 골수를 채취하여, 셀소터로 GFP 양성획분을 분리한 후, c-kit 양성, Sca-1 양성, linage 항원 음성, CD34 음성인 조혈 줄기 세포를 회수하였다. 이 중의 세포 1개와, 별도의 정상 도너 마우스로부터 채취한 골수 조분획의 5×10⁶개 세포를 치사량 방사선을 조사한 레시피언트 마우스에게 골수 이식하였다. 3개월 후, 골수에 있어서의 GFP 양성 세포 생착률을 확인하였다. 마취 개흉한 후, 좌관동맥을 결찰하여 심근 경색을 제작하였다. 그 후, G-CSF (300㎍/㎏) 를 10일간 피하 투여하였다. G-CSF 투여후 10일에 있어서의 말초혈 유핵 세포수는 전체 골수 이식군과 단일 조혈 줄기 세포 이식군에서 함께 약 30,000 정도이고, 차이는 보이지 않았다 (도 16).

단일 조혈 줄기 세포 이식군 (직선) 과 전체 골수 이식군 (점선) 에 관하여, G-CSF 투여 (네모) 및 비투여 (동그라미) 의 경우에 있어서의 생존율을 조사하였다 (도 17). 전체 골수 이식군 뿐만 아니라 단일 조혈 줄기 세포 이식군에 있어서도, G-CSF 투여에 의하여, 유의하게 생존율이 개선되었다.

다음으로, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 단일 조혈 줄기 세포 이식군의 심근 경색소의 절편을 제작하고, 항비멘틴 항체 (PROGEN BIOTECHNIK GMBH사 제조, Cat. No. GP53) 를 사용하여 면역 염색을 하였다. 도 18 로부터 분명하듯이, 심근 경색소에서 GFP 양성 세포의 존재가 인정되었다. 1개의 GFP 양성 조혈 줄기 세포가 심근 경색소에 생착하고 있는 것이 분명해졌다. 또한, 항비멘틴 항체로 염색되어 있는 점에서, 선유아세포로의 분화가 인정되었다.

더욱이, 단일 조혈 줄기 세포 이식군과 전체 골수 이식군에 관하여, G-CSF 투여 및 비투여의 경우에 있어서의 GFP 양성 세포수를 실시예 1 과 동일하게 하여 측정하였다 (도 19). 전체 골수 이식군 뿐만 아니라, 단일 조혈 줄기 세포 이식군에 있어서도, G-CSF 투여에 의해 유의하게 GFP 양성 세포수가 증가하고 있었다.

단일 조혈 줄기 세포 이식군에 G-CSF 투여한 경우의 좌심실 절편에 대해 항심근 액티닌 항체를 사용하여 면역 염색을 하였다 (도 20). GFP 양성 세포가 액티닌 양성으로 되어 있고, 심근 세포로 분화하고 있는 것이 나타났다.

상기 실시예 1 및 2 에 있어서, 수치는 평균 ±SEM 으로 나타내었다. 평균치 사이의 유의차는 ANOVA에 의해 산출하였다. 대조군과 G-CSF 투여군과의 비교는 log-rank 검정 또는 논파라메틱인 Fisher의 다중 비교 검정으로 행하였다. p<0.05를 유의로 하였다.

실시예 3

치사량의 방사선 조사를 한 8∼10주령의 C57 BL/6 마우스에, CAG-EGFP 마우스 (Okabe M. et al., FEBS Lett. 1997, 407 : 313-319) 의 골수로부터 채취한 전체 골수 세포 (w-BM), 또는 c-kit 양성, Sca-1 양성, lineage 항원 음성의 단일 집단 세포 (KSL-SP) 를 꼬리 정맥을 통해 이식하였다. 8주간 후, 좌관동맥의 결 찰에 의해 마우스에게 심근 경색 (MI) 을 제작하였다. MI 제작 후 24시간에, 생리 식염수 (G-CSF(-)) 또는 300㎍/㎏/day 의 G-CSF (G-CSF(+)) 를 1일 1회, 10일간 연속하여 마우스에게 피하 투여하였다. MI 제작 후 8주에, 마우스를 해부하여, 심장을 면역 조직학적으로 해석하였다. 각 마우스군 (n=10) 당 100샘플 표본에 관하여, 경색소의 GFP 양성 세포, GFP 양성 비멘틴 양성 세포 및 GFP 양성 액틴 양성 세포를 계측하였다. GFP 양성 세포의 평균치를 표 1 에 나타낸다.

경색소에 있어서의 GFP 양성 세포의 정량 해석

마우스	GFP 양성 세포
마우스	계^*	비멘틴 양성	액티닌 양성
w-BM G-CSF(-)	8841	1813	65
w-BM G-CSF(+)	119802	37457	5403
KSL-SP G-CSF(-)	1224	480	0
KSL-SP G-CSF(+)	41779	9322	3

* : 경색소의 전체 GFP 양성 세포수

w-BM군에서는 비멘틴 양성 세포 (선유아세포) 와 액틴 양성 세포 (심근 세포) 가 전체 골수로부터 재생되었으나, KSL-SP군에서는 선유아세포만이 재생되었다. 이 결과, 조혈 줄기 세포로부터는 심근 세포가 재생되지 않은 것을 시사하고 있다. 심근 세포의 재생은 간엽계 줄기 세포로부터의 분화에 의하는 것으로 생각된다.

다음으로 G-CSF의 효과를 보면, w-BM군에서는 선유아세포 및 심근 세포를 동원하였다. KSL-SP군에서는 선유아세포를 동원시켰지만, 심근 세포는 불과 3 세포만이 관찰되었다. 이 심근 세포는 아마 재생된 것이 아니라, 세포 융합의 결과인 것으로 생각된다.

어느 쪽 군이라도, 도 17 에 나타내는 바와 같이, G-CSF 투여에 의해서 생존율이 개선되었다. 이들 효과에는 w-BM군에서는 선유아세포 및 심근 세포의 동원이 기여하고 있고, KSL-SP군에서는 선유아세포의 동원이 기여하고 있다. 특히, 선유아세포의 증가는 심근 경색 부위의 창상 치유에 기능하여, 사망율과 상관이 있다고 알려져 있는 리모델링의 억제를 촉진하는 것으로서 중요하다.

본 발명의 선유아세포 동원제를 사용함으로써, 아주 조금인 골수 유래 세포를 유주시킬 뿐으로, 선유아세포를 이식하지 않고 심근 경색소 등의 조직을 재생시켜, 생존율을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 창상 치료제를 사용함으로써, 창상 부위의 강고한 치유가 가능하다.

Claims

과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 를 유효 성분으로 함유하는 선유아세포 동원제.
제 1 항에 있어서,

창상을 입은 조직에 선유아세포를 동원하는 것을 특징으로 하는 동원제.
제 1 항에 있어서,

심장으로 선유아세포를 동원하는 것을 특징으로 하는 동원제.
제 3 항에 있어서,

심장이 심질환 발증 후의 심장인 것을 특징으로 하는 동원제.
제 4 항에 있어서,

심질환이 심근 경색인 동원제.
G-CSF를 유효 성분으로 포함하는 심질환 발증 후의 심장에 있어서의 선유아세포의 생착제.
제 6 항에 있어서,

심질환이 심근 경색인 생착제.
제 6 항에 있어서,

심질환 발증 후의 심장이 심근 경색 후의 심근 경색소인 생착제.
G-CSF를 유효 성분으로 포함하는 창상 치료제.
유효량의 G-CSF를 투여하는 것을 포함하는 선유아세포 동원 방법.
유효량의 G-CSF를 투여하는 것을 포함하는 선유아세포를 심질환 발증 후의 심장에 생착시키기 위한 방법.
유효량의 G-CSF를 투여하는 것을 포함하는 창상 치료 방법.