CN101940594B - 用于治疗缺血性心血管疾病的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗缺血性心血管疾病的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)，进而在低血清及低氧条件培养上述EPC细胞，最后分离EPC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的治疗缺血性心血管疾病的制剂及其制备方法能够有效的治疗缺血性心血管疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种可以治疗缺血性心血管疾病的制剂及其制备方法。
背景技术
心血管疾病是世界上致死率和发病率最高的疾病。根据2010年美国心脏学会的统计报告指出，2005年全世界大约有1750万人死于各类心血管疾病，大约占死亡总人数的30％。预计到2020年，全球因心血管疾病死亡人数将达2500万人。另据WHO的报告指出，在2006年到2015年的10年之间，中国在因心血管病及糖尿病而导致的收入损失将高达5580亿美元。在2004年欧洲有430万人死于各类心血管疾病，高达总死亡人数的48％。在各类心血管疾病中，动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是最常见和最重要的发病机理。在疾病初期，由活性氧激发的对低密度脂蛋白的修饰会逐渐导致血管内皮机能障碍。机体的免疫系统对此产生慢性炎症并持续分泌富含T细胞，巨噬细胞，肥大细胞的白血球细胞群，并形成脂纹，纤维斑块，粥样斑块，使血管腔狭窄并导致血流量减少。当最终粥样斑块破碎后，脱落的碎斑会导致血小板聚集并产生大规模的闭合性血栓及其他继发性改变，包括由该动脉所供应养份的组织或器官的缺血或坏死。由动脉粥样硬化所导致的缺血性心血管疾病主要包括有冠心病，中风，以及外周闭塞性动脉疾病。其中冠心病是世界上致死率最高的单项疾病，2005年全球有760万人死于此病；全球每年的中风患者有1500万人，并导致500万人终身残疾及570万人死亡；在北美和欧洲有将近2700万人患有各种程度的外周闭塞性动脉疾病，一项2003年的研究表明，全球有将近20％的成年人患有无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病。尽管有保守锻炼，化学药物，和手术搭桥的传统治疗手段，大部分由动脉粥样硬化所导致的缺血性心血管病患者依然无法获得有效的治疗，究其原因，主要是因为对保守治疗和化学药物的不敏感，以及身体或疾病条件而无法进行有效的手术搭桥等。
干细胞疗法是近年来在治疗癌症和心血管疾病等领域最受人期待的新发展方向。从理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。尤其是其具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，在心血管疾病的治疗中有着巨大疗效。
在全球现阶段开展的临床试验中，针对缺血性心血管疾病的促血管再生干细胞移植作为一种极有希望替代传统疗法的再生疗法已取得了很好的效果。然而，考虑到异体移植所带来的免疫应答及其严重的组织排斥甚至致死后果，(包括患者自身的免疫系统对异体干细胞的排斥及异体干细胞群落中不可避免的含有的异源免疫细胞亚群对患者组织的排斥)，此类临床试验都使用了患者自体同源的细胞。另外，在检测了不同器官组织来源的干细胞种群之后发现，来源于骨髓及外周血液的成体CD34+干细胞亚类具有极强的促血管再生能力，在治疗缺血性血管疾病中有较好的效果，也免除了采用胚胎干细胞所带来的伦理问题。然而，现阶段一系列技术和应用上的不足极大的限制了干细胞疗法在临床上的进一步推广和应用，这些限制包括并不局限于(1)此类干细胞在骨髓及血液中的极低含量(大约0.01％)；(2)此类细胞疗法所需细胞的极大数量(1×105-1×106个/千克体重)；(3)细胞移植入体内后的极低存活率和存活细胞的实际效率(低于10％)；以及(4)患者自体干细胞因慢性疾病及长期大量心血管危险因子的影响所导致的功能失常。
基于上述事实，特别是现有的干细胞疗法应用于临床时的缺陷和不足，有必要提供更为有效、普适的治疗缺血性心血管疾病药物，以改善现有的由动脉粥样硬化所导致的缺血性心血管疾病的临床治疗状况。
血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)是调节和诱导新血管生成的主要干细胞亚类。动物体内实验数据表明，EPC参与血管生成的过程主要有(1)少量细胞分化为成熟的内皮细胞，形成新的血管内壁以及(2)大部分细胞分泌出大量促血管新生的生长因子和细胞活素，激发缺血组织内部的内皮细胞，平滑肌细胞，壁细胞及其他干细胞亚群及祖细胞亚群共同参与新血管的形成。事实上，此类EPC在缺血组织中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由EPC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损血管的修复和再生，从而恢复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，EPC在体外人工环境中分泌的促血管新成的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗缺血性心血管疾病提供一种新的治疗药物。
上述缺血性心血管疾病主要指由于动脉粥样硬化导致的血管阻塞类的疾病，具体包括：在冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常。
本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂的方法，该方法步骤为：
1)从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；
2)培养单核细胞以获得EPC细胞；
3)在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；
4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗缺血性心血管疾病制剂。
本发明所述制备能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂的方法中，步骤1)所述的健康人血液的来源可以是自体来源(仅局限于无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病)或异体来源，获得途径可以是直接抽血，或由血库直接购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。血液提供者的限制范围为50岁以下，无烟酒史，无传染性疾病，血液疾病的健康人群。所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为：将所获得的血液或白细胞悬液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque(GE healthcare)、Histopaque-1077(Sigma)，或其他公司同类产品，优选为Histopaque-1077；适用温度范围为15到25℃，优选为25℃；每15mL Histopaque可分离15至30mL全血样品。具体操作为：将含有血液及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞，丰富表达单核细胞特异性受体CD14，其内所含多种细胞亚群，呈多形性。
本发明所述制备能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞所用的培养基可为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF 2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10100μg/ml)。培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白。在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中培养。
本发明所述制备能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得EPC细胞的步骤为以下所述方法①，②，③或④中的一种：
方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2-4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3-7天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR，CD31，单核细胞受体CD14，造血细胞受体CD45，少量表达干细胞特有受体CD34，CD133。
方法②：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1×105至2×105个细胞密度重新培养3-7天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及Tie-2。
方法③：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-6天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养10-21天。所获III型EPC为细胞集落，并可持续培养及增殖12个星期以上，此III型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。
方法④：将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选(
由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1×105至1×106个细胞的密度培养2-6天。所获IV型EPC为CD34+细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。
本发明所述制备能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂的方法中，步骤3)中的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2)所获得的I、II、III或IV型EPC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白。
培养完成后收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去EPC细胞。
本发明所述制备能够有效的治疗缺血性心血管疾病的制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括：
①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。
②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管生长因子及细胞活素如MCP-1，EGF，MMP-9，IL-8，Angiogenin，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics)，细胞活素阵列(cytokine array)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-PlexTM细胞因子测试。
③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。
附图说明
图1：本发明所述治疗缺血性心血管疾病制剂对成体内皮细胞的存活影响。
图2：本发明所述治疗缺血性心血管疾病制剂对大鼠急性心肌梗塞损伤的修复。
具体实施方式
以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。
实施例1.单核细胞的制备。
将100mL血液加入密度梯度剂Histopaque-1077(Sigma)，每15mL Histopaque中加入30mL血液。将含有血液及梯度剂的试管在400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液。视具体情况，每100ml血液可以获得1x108～1x1010个单核细胞。
实施例2.EPC细胞的获取。
针对I类EPC细胞的获取方法：将富含单核细胞的悬浮液在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米1×106细胞的密度培养4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2×105的密度重新培养2天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR、CD31、CD14、CD45、少量表达CD34、CD133及血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin。
针对II类EPC细胞的获取方法：将富含单核细胞的悬浮液在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米1×106细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米2×105个细胞的密度重新培养3天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及Tie-2。
针对III类EPC细胞的获取方法：将富含单核细胞的悬浮液在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米1×106个细胞的密度培养3天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2×105个细胞的密度重新培养20天。所获III型EPC为细胞集落，具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。
针对IV类EPC细胞的获取方法：将单核细胞通过CD34特异性抗体通过磁珠分选(
由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米5×105个细胞的密度培养2天。所获IV型EPC为CD34+细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。
视具体情况，所获得的各型EPC细胞的量约为单核细胞量的1％～10％。
实施例3.治疗缺血性心血管疾病制剂的获取。
将实施例2所获得的I型EPC细胞置于不含任何生长因子的磷酸盐缓冲液(PBS)内(每平方厘米2×105个细胞)，在氧浓度为1.5％的环境中培养2天，并添加1％的医用人血清白蛋白。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的EPC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为0.2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80℃冷库冷藏备用。视具体情况，每1x106个EPC细胞可以制备2-5ml所述治疗缺血性心血管疾病制剂。
实施例4.治疗缺血性心血管疾病制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。
实施例3所制得的治疗缺血性心血管疾病制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokine array)鉴定(由R&D Systems购买)，此治疗缺血性心血管疾病制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子：MCP-1、EGF、IL-8、MMP-9、μPAR、Angiogenin、SDF-1、HGF、VEGF以及PDGF。通过Bio-PlexTM细胞因子测试检测(由Bio-rad公司生产)，其中有效成分的含量为，IL-8：1-4μg/ml；SDF-1：50-100ng/ml；HGF：5-10ng/ml；Angiogenin：1-5ng/ml；PDGF-BB：1-5ng/ml；VEGF：0.1-1ng/ml。其他成分组成见表1。
表1.本发明所述治疗缺血性心血管疾病制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
| ActivinA | FGF-4 | IL-1ra | MMP-9 |
| AgRP | FGF-9 | IL-1RII | MPIF-1 |
| Angiogenin | GITR | IL-2Ralpha | NAP-2 |
| B7-1(CD80) | GITR-Ligand | IL-2Rbeta | NT-4 |
| BMP-4 | GM-CSF | IL-2Rα | OncostatinM |
| BMP-5 | GRO-α | IL-4 | PDGF |
| BMP-6 | HCC-4 | IL-6R | RANTES |
| b-NGF | HGF | IL-8 | SCF |
| Cardiotrophin-1 | ICAM-1 | IL-9 | SDF-1 |
| CD14 | ICAM-3 | LeptinR | Siglec-5 |
| CTACK | IGFBP-3 | LIF | sTNFRI |
| CXCL-16 | IGF-I | L-Selectin | sTNFRII |
| Dtk | IGF-II | MCP-1 | TECK |
| EGF | IGF-ISR | MCP-2 | TGFbeta2 |
| ENA-78 | IL-10 | MCP-4 | Thrombopoietin |
| Eotaxin | IL-10Rbeta | M-CSF | TIMP-1 |
| Eotaxin-2 | IL-12p40 | M-CSFR | TRAILR4 |
| Eotaxin-3 | IL-13Ralpha2 | MDC | uPAR |
| ErbB3 | IL-18BPalpha | MIF | VE-Cadherin |
| Fas/TNFRSF6 | IL-18Rbeta | MIP-1β | VEGF |
| FasLigand | IL-1R4/ST2 | MMP-13 | VEGF-D |
实施例5.体外检测治疗缺血性心血管疾病制剂对成体内皮细胞的存活影响。
将人脐静脉内皮细胞HUVEC(此细胞可通过商业途径购买，例如：ATCC细胞库)以每孔3×103个细胞的密度接种于96孔板中，在含10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下中培养24小时，弃去原培养基，将细胞重新置于本发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白的PBS，pH＝7.4)中，于37℃，5％二氧化碳浓度的细胞培养箱中继续培养24小时，用
NF细胞增殖试剂盒(由Invitrogen公司购买)检测活细胞含量(结果见图1A)。结果显示，此治疗缺血性心血管疾病制剂能够显著增加HUVEC细胞在低血清环境中的存活率，在发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂中培养的HUVEC细胞的存活量为阴性对照组的1.43±-0.06倍(*：p＜0.0001)。
使用
Homogeneous Caspase-3/7试剂盒(由Promega公司购买，此试剂盒能检测细胞凋亡过程中的执行者效应凋亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-7的活性，此蛋白酶活性越大则细胞凋亡率越高)对HUVEC细胞在低血清培养下的细胞凋亡率进行检测(结果见图1B)。结果显示，本发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂能够显著的降低HUVEC细胞在低血清环境中的凋亡率，在发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂中培养的HUVEC细胞的凋亡率仅为阴性对照组的59.6±4.3％(*：p＜0.0001)。
上述结果显示，本申请所述治疗缺血性心血管疾病制剂能够起到显著的促血管内皮新生和保护的作用。
实施例6.大鼠急性心肌梗塞损伤的修复。
在大鼠急性心肌梗塞模型上验证本发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂对梗塞部位缺血性组织损伤的修复以及促新血管生成的作用。具体方法为对大鼠进行了心冠状动脉左前降支(LAD)的结扎手术，使其产生急性心肌梗塞。在结扎后的20分钟，在梗塞部位周边心肌注射本发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂(每次总注射量为120μl，均匀注射入缺血组织附近的6个随机肌肉注射点，即每注射点20μl)，结果显示对比安慰剂对照组(即方法相同，但注射的制剂为只含有1％人血清白蛋白的pH＝7.4的PBS)，本发明所述治疗缺血性心血管疾病制剂显著的减小了梗塞部位面积并增加了心肌微血管数量(见图2)。结果显示，此治疗缺血性心血管疾病制剂在体内具有显著的减小梗塞损伤部位的作用。肌肉注射本发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂至大鼠心肌的28天后，左心室免疫组化切片(在Masson-trichrome染色法(见图2A，其中红色为正常心肌，蛋蓝色为梗塞部位的纤维化组织)下显示其纤维化的梗塞部位面积具有显著的减小(见图2B，梗塞纤维化部位占左心室切片的面积比例为安慰剂组：30.0±1.2％，制剂组15.3±1.1％，p＜0.05)。并且，相对于安慰剂组中左心室的161.3±15.5/mm2微血管数量，本发明所述的治疗缺血性心血管疾病制剂增加了此微血管数量达273.5±10.1/mm2(见图2C，p＜0.05)。
Claims (6)
1.一种治疗缺血性心血管疾病的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤1).从健康人血液中通过密度梯度离心的方法获取外周血单核细胞；密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077，温度为15～25℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液；
步骤2).培养单核细胞以获得EPC细胞；所用的培养基为M119、DMEM、RPM1-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种；或添加有内皮细胞生长因子ECGF；培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白；培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度为5％；培养方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：
方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2-4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3-7天，获I型EPC细胞；
方法②：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3-7天，获II型EPC细胞；
方法③：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-6天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养10-21天，获III型EPC细胞；
方法④：将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1×105至1×106个细胞的密度培养2-6天，获IV型EPC细胞；
步骤3).在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；所述的在特定条件下培养EPC细胞的方法为：将步骤2)所获得的EPC细胞置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白；
步骤4).对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗缺血性心血管疾病的制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液的来源是通过血库购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，不添加1％的医用人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述EPC细胞为I型EPC细胞。
5.一种由权利要求1-4任一所述的方法制备获得的制剂。
6.权利要求5所述的制剂在制备治疗缺血性心血管疾病的药物中的应用。
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| "血管再生中的内皮祖细胞";徐清波;《Acta Physiologica Sinica》;20050225;第57卷(第1期);第1-6页 * |
| Stefano Di Santo，et al.."Novel Cell-Free Strategy for Therapeutic Angiogenesis: In Vitro Generated Conditioned Medium Can Replace Progenitor Cell Transplantation".《PLoS ONE》.2009,第4卷(第5期),第1，2，5，9页. |
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