CN101947241B - 用于保护血管内皮细胞氧化损伤的抗氧化制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)，进而在低血清及低氧条件培养上述EPC细胞，最后分离EPC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂能够有效的修复血管组织由于氧化应激所受的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种可以对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂及其制备方法。
背景技术
心脑血管疾病是目前危害中老年人身体健康最严重的疾病之一，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是引发多种心脑血管疾病的直接病因，而氧自由基的形成与心脑血管疾病的发生存在因果关系，有关氧自由基对心血管的损伤作用已受到广泛重视。
氧化应激(oxidative stress，OS)是指机体活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生过多或/和机体抗氧化能力降低，氧化系统和抗氧化系统平衡紊乱，导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对机体造成多种毒性作用的病理状态。大量研究结果显示，OS以及在OS过程中产生的ROS与多种心血管疾病的发生发展有着密切关系，是内皮细胞受损的主要病理。
过氧化氢(H2O2)是体内氧化代谢的中间产物，是一种危害性很大的氧自由基，可以穿透细胞膜到达细胞内，当积累到一定程度时就会造成血管内皮细胞的损伤。血管内皮细胞(endothelial cell)的氧化损伤直接关系到动脉粥样硬化的发生和发展，血管内皮细胞是心血管系统重要的组成部分，内皮细胞的损伤及功能紊乱与高血压、冠心病、糖尿病、慢性肾功能衰竭等多种疾病关系密切。因此，深入探讨血管内皮细胞受氧化损伤的机制，保护和修复损伤的内皮细胞，对改善心血管疾病的愈后有着积极的意义。
在动脉粥样硬化疾病初期，由活性氧激发的对低密度脂蛋白的修饰会逐渐导致血管内皮机能障碍。机体的免疫系统对此产生慢性炎症并持续分泌富含T细胞，巨噬细胞，肥大细胞的白血球细胞群，并形成脂纹，纤维斑块，粥样斑块，使血管腔狭窄并导致血流量减少。当最终粥样斑块破碎后，脱落的碎斑会导致血小板聚集并产生大规模的闭合性血栓及其他继发性改变，包括由该动脉所供应养份的组织或器官的缺血或坏死。在北美和欧洲有将近2700万人患有各种程度的外周闭塞性动脉疾病，一项2003年的研究表明，全球有将近20％的成年人患有无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病。尽管有保守锻炼，化学药物，和手术搭桥的传统治疗手段，大部分由动脉粥样硬化所导致的疾病患者依然无法获得有效的治疗，究其原因，主要是因为对保守治疗和化学药物的不敏感，以及身体或疾病条件而无法进行有效的手术搭桥等。
干细胞疗法是近年来在治疗癌症和心血管疾病等领域最受人期待的新发展方向。从理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，尤其是其具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，在血管疾病的治疗中有着巨大疗效。
然而，现阶段一系列技术和应用上的不足极大的限制了干细胞疗法在临床上的进一步推广和应用，这些限制包括并不局限于：(1)此类干细胞在骨髓及血液中的极低含量(大约0.01％)；(2)此类细胞疗法所需细胞的极大数量(1×105-1×106个/千克体重)；(3)细胞移植入体内后的极低存活率和存活细胞的实际效率(低于10％)；以及(4)患者自体干细胞因慢性疾病及长期大量心血管危险因子的影响所导致的功能失常。
基于上述事实，特别是现有的干细胞疗法应用于临床时的缺陷和不足，有必要提供更为有效、普适的可以对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂，以改善现有的由动脉粥样硬化所导致的疾病的临床治疗状况。
血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)是调节和诱导新血管生成的主要干细胞亚类。动物体内实验数据表明，EPC参与血管生成的过程主要有(1)少量细胞分化为成熟的内皮细胞，形成新的血管内壁以及(2)大部分细胞分泌出大量促血管新生的生长因子和细胞活素，激发缺血组织内部的内皮细胞，平滑肌细胞，壁细胞及其他干细胞亚群及祖细胞亚群共同参与新血管的形成。事实上，此类EPC在缺血组织中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由EPC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损血管的修复和再生，从而恢复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，EPC在体外人工环境中分泌的促血管新成的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗由于血管内皮氧化损伤引起的疾病提供一种新的治疗药物。
上述由于血管内皮氧化损伤引起动脉粥样硬化导致的血管阻塞类的疾病，具体包括：在冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常；脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩；外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压等。
本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的方法，该方法步骤为：
1)从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；
2)培养单核细胞以获得EPC细胞；
3)在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；
4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂。
本发明所述制备能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的方法中，步骤1)所述的健康人血液的来源可以是自体来源(仅局限于无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病)或异体来源，获得途径可以是直接抽血，或由血库直接购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。血液提供者的限制范围为50岁以下，无烟酒史，无传染性疾病，血液疾病的健康人群。所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为：将所获得的血液或白细胞悬液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque(GEhealthcare)、Histopaque-1077(Sigma)，或其他公司同类产品，优选为Histopaque-1077；适用温度范围为15到25℃，优选为25℃；每15mL Histopaque可分离15至30mL全血样品。具体操作为：将含有血液及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体米源于骨髓髓系干细胞，丰富表达单核细胞特异性受体CD14，其内所含多种细胞亚群，呈多形性。
本发明所述制备能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得EPC的方法中，所用的培养基可为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)。培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白。在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中培养。
本发明所述制备能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得EPC细胞的步骤为以下所述方法①，②，③或④中的一种：
方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2-4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3-7天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR，CD31，单核细胞受体CD14，造血细胞受体CD45，少量表达干细胞特有受体CD34，CD133。
方法②：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1×105至2×105个细胞密度重新培养3-7天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及Tie-2。
方法③：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-6天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养10-21天。所获III型EPC为细胞集落，并可持续培养及增殖12个星期以上，此III型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。
方法④：将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选(
，由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1×105至1×106个细胞的密度培养2-6天。所获IV型EPC为CD34+细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。
本发明所述制备能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的方法中，步骤3)中的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2)所获得的I、II、III或IV型EPC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白。
培养完成后收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去EPC细胞。
本发明所述制备能够有效的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括：
①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。
②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管生长因子及细胞活素如MCP-1，EGF，MMP-9，IL-8，Angiogenin，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics)，细胞活素阵列(cytokine array)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-PlexTM细胞因子测试。
③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。
附图说明
图1：本发明所述对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂对成体内皮细胞的氧化应激保护作用。
具体实施方式
以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。
实施例1.单核细胞的制备。
将100mL血液加入密度梯度剂Histopaque-1077(Sigma)，每15mL Histopaque中加入30mL血液。将含有血液及梯度剂的试管在400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液。视具体情况，每100ml血液可以获得1x108～1x1010个单核细胞。
实施例2.EPC细胞的获取。
针对I类EPC细胞的获取方法：将富含单核细胞的悬浮液在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米1×106细胞的密度培养4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2×105的密度重新培养2天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR、CD31、CD14、CD45、少量表达CD34、CD133及血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin。
针对II类EPC细胞的获取方法：将富含单核细胞的悬浮液在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米1×106细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米2×105个细胞的密度重新培养3天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及Tie-2。
针对III类EPC细胞的获取方法：将富含单核细胞的悬浮液在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米1×106个细胞的密度培养3天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2×105个细胞的密度重新培养20天。所获III型EPC为细胞集落，具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。
针对IV类EPC细胞的获取方法：将单核细胞通过CD34特异性抗体通过磁珠分选(
，由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在在添加有10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米5×105个细胞的密度培养2天。所获IV型EPC为CD34+细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。
视具体情况，所获得的各型EPC细胞的量约为单核细胞量的1％～10％。
实施例3.对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的获取。
将实施例2所获得的I型EPC细胞置于不含任何生长因子的磷酸盐缓冲液(PBS)内(每平方厘米2×105个细胞)，在氧浓度为1.5％的环境中培养2天，并添加1％的医用人血清白蛋白。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的EPC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为0.2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80℃冷库冷藏备用。视具体情况，每1x106个EPC细胞可以制备2-5ml所述对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂。
实施例4.对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。
将实施例3所制得的对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokine array)鉴定(由R&D Systems购买)，此对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子：MCP-1、EGF、IL-8、MMP-9、μPAR、Angiogenin、SDF-1、HGF、VEGF以及PDGF。通过Bio-PlexTM细胞因子测试检测(由Bio-rad公司生产)，其中有效成分的含量为，IL-8：1-4μg/ml；SDF-1：50-100ng/ml；HGF：5-10ng/ml；Angiogenin：1-5ng/ml；PDGF-BB：1-5ng/ml；VEGF：0.1-1ng/ml。其他成分组成见表1。
表1.本发明所述对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
| ActivinA | FGF-4 | IL-1ra | MMP-9 |
| AgRP | FGF-9 | IL-1RII | MPIF-1 |
| Angiogenin | GITR | IL-2Ralpha | NAP-2 |
| B7-1(CD80) | GITR-Ligand | IL-2Rbeta | NT-4 |
| BMP-4 | GM-CSF | IL-2Rα | OncostatinM |
| BMP-5 | GRO-α | IL-4 | PDGF |
| BMP-6 | HCC-4 | IL-6R | RANTES |
| b-NGF | HGF | IL-8 | SCF |
| Cardiotrophin-1 | ICAM-1 | IL-9 | SDF-1 |
| CD14 | ICAM-3 | LeptinR | Siglec-5 |
| CTACK | IGFBP-3 | LIF | sTNFRI |
| CXCL-16 | IGF-I | L-Selectin | sTNFRII |
| Dtk | IGF-II | MCP-1 | TECK |
| EGF | IGF-ISR | MCP-2 | TGFbeta2 |
| ENA-78 | IL-10 | MCP-4 | Thrombopoietin |
| Eotaxin | IL-10Rbeta | M-CSF | TIMP-1 |
| Eotaxin-2 | IL-12p40 | M-CSFR | TRAILR4 |
| Eotaxin-3 | IL-13Ralpha2 | MDC | uPAR |
| ErbB3 | IL-18BPalpha | MIF | VE-Cadherin |
| Fas/TNFRSF6 | IL-18Rbeta | MIP-1β | VEGF |
| FasLigand | IL-1R4/ST2 | MMP-13 | VEGF-D |
实施例5.体外检测抗氧化制剂在氧化应激环境中对成体内皮细胞的保护作用。
将人脐静脉内皮细胞HUVEC(此细胞可通过商业途径购买，例如：ATCC细胞库)以每孔1×104个细胞的密度接种于12孔板中，置于本发明所述的抗氧化制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白的PBS，pH＝7.4)中，同时向每孔内添加250μM的过氧化氢以激发细胞的氧化应激，于37℃，5％二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养12小时(结果见图1)。结果显示，此抗氧化制剂能够在氧化应激环境下显著保护HUVEC细胞并减少细胞凋亡率。具体方法为在12小时培养结束后向孔内添加10μM的超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium)，当细胞内的活性氧(ROS)水平较高(即细胞受超氧化物氧化损伤较大)时，红色荧光就较强，反之则较弱。在发明所述的抗氧化制剂中培养的HUVEC细胞内的活性氧(ROS)水平大大低于对照组(见图1A)。在用Annexin V荧光探针来特异性标定凋亡细胞的实验中发现，在发明所述的抗氧化制剂中培养的HUVEC细胞在氧化应激环境中的凋亡率仅为16±0.2％(见图1B，p＜0.05)。
Claims (6)
1.一种对血管内皮细胞氧化损伤起保护作用的抗氧化制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤1).从健康人血液中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；密度梯度离心获取单核细胞的方法为：使用梯度剂为Histopaque-1077，温度为常温，离心力为400g，时间30分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液；
步骤2).培养单核细胞以获得EPC细胞；所用的培养基为EBM-2，并添加有1％的生长因子添加剂EGM；培养基中另含有质量比为10％的人血清白蛋白；培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度为5％；培养方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：
方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2-4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3-7天，获I型EPC细胞；
方法②：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3-7天，获II型EPC细胞；
方法③：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-6天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养10-21天，获III型EPC细胞；
方法④：将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1×105至1×106个细胞的密度培养2-6天，获IV型EPC细胞；
步骤3).在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；培养EPC细胞的方法为：在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白；
步骤4).对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得抗氧化制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液的来源是自体来源，或异体来源，或通过血库购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，不添加1％的医用人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述EPC细胞为I型EPC细胞。
5.一种由权利要求1的方法制备获得的制剂。
6.权利要求5所述的制剂在制备治疗由血管内皮细胞氧化损伤所导致的疾病的药物中的应用。
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