CN101265464A

CN101265464A - 一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法

Info

Publication number: CN101265464A
Application number: CNA2008100373247A
Authority: CN
Inventors: 方国恩; 周虹; 罗天航; 吴建国; 卢正茂; 毛岸荣
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2008-05-13
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2028-05-13
Also published as: CN101265464B

Abstract

本发明属生物细胞技术领域，具体涉及一种小型猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法。传统的EPCs培养方法较为繁琐，且用免疫磁珠分离会大大降低细胞的获得率。本发明的方法直接用骨髓中单个核细胞进行体外培养以获得EPCs，在培养液中加入生长因子，以一定的密度种植于用纤维连接蛋白包被的培养瓶/皿中或玻璃片上，进行合适培养获得EPC。本发明简化了传统培养方法的步骤，有效的避免传统的分离和培养方法带来的不必要的细胞损失，提高EPCs的获得率，可重复性高，并节省大量的经费。本发明的方法也为今后临床应用做准备，能相应减少骨髓的用量，为自体回输治疗创伤性或缺血性疾病提供合理的技术平台。

Description

一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法。

背景技术

随着20世纪末期以来干细胞技术和理论迅猛发展，创伤引起的缺血性疾病以及创伤修复机制的研究和临床治疗面临着新的契机。研究表明：机体损伤后，血循环中具有多向分化潜能的干/祖细胞一方面可以在炎症细胞产生的细胞因子/生长因子作用下动员、增殖、迁徙入损伤器官，分化为相应的组织细胞进行损伤修复，另一方面，迁徙到损伤部位的干细胞还可以对不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反应，依次释放血管活性物质、生长因子以及参与免疫调节的细胞因子和趋化因子，参与创伤后的炎症反应。

研究表明，内皮细胞不仅是炎症反应的参与者，还是首先受损的靶细胞，并进而造成微血管损伤、微循环障碍，这可能是创伤后器官功能障碍的始发环节。1997年，Asahara等首先从外周血单个核细胞(PBMCs)里分离出一种被称为内皮祖细胞(EPCs)的祖细胞亚群，这些细胞具有在体内外增殖、迁徙和分化为成熟内皮细胞的能力。血循环中的EPC主要来源于骨髓，另外，循环中的多能干细胞也可以在细胞因子刺激下分化为EPC。目前认为，外周血中的EPC包含有两种形式：即刚被动员进入血循环早期EPC，它们都表达三种祖细胞分子标志：CD133、CD34和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，之后循环中EPC则逐渐失去CD133表型和祖细胞特性，并开始表达内皮系的特征性分子标志：血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)和VIII因子(vWF)，从而分化为晚期EPC。

体外实验中，两种EPC都可以摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)，并结合内皮特异性植物血凝素(lectin)，这成为体外鉴定EPC的特异性表型。Hill等通过对外周血EPC体外培养后集落形成单位计数，来间接测定循环中EPC的数量，并认为内皮损伤后循环中EPC的水平可以影响心血管疾病的进程。大量的动物和临床实验都已经证明：当组织受到损伤时，尤其是缺血性损伤时，循环及组织中EPC动员和增殖能力增强，并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区，并参与缺血或损伤组织内新血管生成，从而改善缺血器官的功能；而如果创伤后EPC的分化、迁徙功能发生严重障碍，则会导致损伤部位微循环严重损害而无法得到修复，甚至发生器官功能衰竭。

在以前的实验和临床研究表明，肌肉内注射VEFG表达质粒能促进缺血组织新生血管的形成，Iwaguro发现给患者肌肉注射VEGF表达质粒后循环血中内皮祖细胞增加了219％，提示增加的内皮祖细胞对新生血管的形成有关。他们收集健康成人的外周血单核细胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF的培养基里，7-10天后内皮祖细胞数量扩增了90倍。截断无胸腺裸鼠的单侧股动脉制成后肢缺血模型后心脏内注入人内皮祖细胞，发现移植了人内皮祖细胞的缺血后肢血流加快，缺血后肢的毛细血管密度显著增加，缺血造成的肢体坏死和肢体自身断离都分别减少60％。制成组织切片进行观察，发现内皮祖细胞参与了新血管的形成。将VEGF基因转入内皮祖细胞再移植，缺血后肢的血管新生进一步得到改善，缺血造成的肢体坏死和肢体自身断离比对照组减少了1/30。在骨髓移植小鼠皮下接种同系的结肠癌细胞，1周后发现肿瘤的新生血管网中有部分供体来源的内皮祖细胞，而且，内皮祖细胞参与了损伤处新血管的形成。在后肢缺血模型中，发现骨骼肌新生的毛细血管壁有供体来源的内皮祖细胞。永久性结扎的左前降支冠状动脉，发现内皮祖细胞参与心肌梗死边缘处的新血管形成。以上实验表明，出生后的新血管形成，不仅仅是现有血管出芽延伸的结果，骨髓来源的循环血中的内皮祖细胞也发挥了作用。目前逐渐开始应用EPC于临床治疗肢体缺血疾病。

在正常条件下，循环系统中EPC仅占单核细胞0.03～0.06％。局部的血管损伤、缺血、烧伤、创伤及细胞因子等均能刺激EPC从骨髓中动员出来，进入血液循环系统，迁移到损伤内皮处。生理学上认为局部缺血是介导EPC从骨髓动员的显著信号。近年来研究表明EPCs不仅参与胚胎期血管发生，在生后血管的生理或病理性重建中也发挥重要作用，特别研究发现EPCs在肿瘤血管生成过程中起着重要的作用。由于EPC有多种分化潜能，是机体创伤修复过程中不可缺少的组成部分，同时可以帮助恢复和重建动脉粥样硬化的血管内皮功能，防止动脉粥样硬化的进一步恶化，减少心肌梗死的发生。除此之外，EPCs还能够分泌多种促进新生血管生长的因子；如一氧化氮(NO)，EGF，成纤维细胞生长因子-4、9(FGF-4、9)，肝细胞生长因子(HGF)，白介素-8(IL-8)，VEGF等。

内皮祖细胞目前主要根据其来源、表型变化以及分化和功能特征进行定性，可归纳为以下5条：①来源特征：EPC来源于骨髓、脐血、胎肝、外周血和脾脏等组织。②形态特征：EPC大小不一，以圆形、半月形和梭形为主，体外培养时呈典型的铺路石样生长，在半固体培养基中能形成毛细血管样结构，在电镜下观察细胞；细胞内可检测到典型的Weibel-Palade小体。③细胞表面标识检测：可根据内皮细胞系和祖细胞系的表型特征进行鉴别，如CD133，CD34，KDR，CD31等。④功能特征：EPC具有血管新生功能，因此可通过体外血管功能实验来鉴定。⑤细胞双荧光染色鉴定：进行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定，显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞，显示绿色荧光的为UEA-1阳性细胞，显示双荧光阳性(黄色)的细胞被认为是EPC。

而目前，传统的EPCs分离和培养的方法如下：

1、用传统的Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞(MNC)。

2、用人CD34⁺抗体包被的免疫磁珠采取磁珠分选法在MNC中分离出MNCCD34⁺。然后将MNC CD34⁺单独种植于培养皿中进行培养。

3、MNC CD34⁺的培养：培养液配方：DMEM或/M-199+20％胎牛血清+牛脑提取物十抗生素，或DMEM/M-199+20％胎牛血清+VEGF-1+人FGF-2(成纤维细胞生长因子)+人EGF+人IGF-1+抗坏血酸。培养皿采用人纤维结合蛋白(fibronectin)或胶原I型(collagen type I)包被。

传统的培养方法较为繁琐，在用CD34⁺抗体包被的免疫磁珠分选MNC的过程中不可避免会有MNC CD34^-的损失加上磁珠本身对细胞的损伤，会大大降低细胞的获得率，同时免疫磁珠分离方法代价大，特别随着George等提出了CD34^-EPC的概念后，证明EPC上的表型表达率均不一致，运用免疫磁珠分选MNC而得到EPC的方法已经不被采用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养方法简便、细胞获得率高的猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法。

本发明的方法首先采用传统的EPCs分离和培养的方法中的第1步：采用Ficoll密度梯度法分离猪骨髓中单个核细胞MNC后，然后，通过二次贴壁法，并运用添加特定生长因子和血清的培养液，经过体外直接培养并诱导分化MNC得到内皮祖细胞EPCs。

本发明提供一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，依次包括下述步骤：

A、取猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞；

B、体外培养单个核细胞：

先将M-199培养液加入装有细胞的试管混匀后，种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱培养2小时后，取出培养皿中的悬浮液，将悬浮液离心，离心条件为4℃，300g，6分钟；离心后去上清液，将添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液加入试管后混匀，将混匀的细胞液二次接种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱进行培养；每48-96小时给培养皿内的细胞更换为添加低浓度血清和生长因子的M-199培养液一次；培养7天后，所得的贴壁细胞即为EPC；

所述的添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液的配方为：M-199为基础培养液，20％胎牛血清，重组人EGF(表皮生长因子)10.0ng/ml，重组bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)20.0ng/ml，vEGF(血管内皮细胞生长因子)2.0ng/ml，Long R3 IGF-1(胰岛素样生长因子)40.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；

所述的添加低浓度血清和生长因子的培养液的配方为：M-199为基础培养液，5％胎牛血清，重组人EGF 5.0ng/ml，重组人bFGF 10.0ng/ml，vEGF 0.5ng/ml，Long R3 IGF-120.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；

C、体外消化传代扩增EPC；

D、内皮祖细胞鉴定：进行细胞形态学、表型和细胞功能鉴定。

本发明的方法，更优地，依次包括下述步骤：

A、用Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞(MNC)：

无菌条件下取小型猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，将骨髓细胞移入试管和无菌PBS液1∶1混匀后离心，离心条件为20℃，400g，10分钟；离心后去上清液，再和无菌的PBS液1∶1混匀；取Ficoll液10ml分两份加入空白试管；将混匀的骨髓细胞液体缓慢的滴入装有Ficoll液的试管后离心，离心条件为20℃，900g，30分钟；离心后，先去除最上层的上清液，将单个核细胞层取出加入空白试管，再加入1∶1无菌PBS液混匀后离心，离心条件为4℃，500g，10分钟；离心后去上清液，再加入1∶1无菌PBS液混匀后再次离心，离心条件为4℃，300g，10分钟，所得的即为分离出的单个核细胞，并对分离出的单个核细胞进行计数；

B、体外培养单个核细胞：

先将M-199培养液加入装有细胞的试管混匀后，将混匀的细胞液按照2×10⁵-5×10⁵/cm²的密度种于预先包被有纤维连接蛋白(FN，fibronectin)的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱(温度：37℃，5％的二氧化碳，饱和湿度)，培养2小时后，取出悬浮液，丢弃原培养瓶/皿，将所得的悬浮液离心(4℃，300g，6分钟)；离心后去上清液，将添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液加入试管后混匀，将混匀的细胞液二次接种于预先包被有FN的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱(同前)进行培养；每48-96小时给培养皿内的细胞更换为添加低浓度血清和生长因子的M-199培养液一次；培养7天后，所得的贴壁细胞即为EPC；

C、体外消化传代扩增EPC：

原代细胞培养7天后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，准备消化传代；先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化计数后5×10³-1×10⁴/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P1；以后细胞每培养4d后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，即消化传代；先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化后5×10³-1×10⁴/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P2；以此类推；

上述的方法，步骤B中所述的单个核细胞种植密度为2×10⁵-5×10⁵/cm²，更优地，为5×10⁵个细胞/cm²。

上述的方法，步骤B中所述的纤维连接蛋白包被的浓度为25mg/l，密度为5-10μl/cm²，在4℃环境下，包被时间不少于12小时。

上述的方法，步骤C中所述的消化传代时EPC的种植密度，更优地，为1×10⁴个细胞/cm²。

本发明方法采用密度梯度离心法分离骨髓中MNC后，通过二次贴壁法，运用添加特定生长因子和血清的培养液，经过体外直接培养并诱导分化MNC得到EPCs，本方法的优点如下：

1.猪骨髓源性内皮祖细胞具有取材方便，来源广并且价格便宜的优点，可以进行大规模的体外培养和扩增；同时猪骨髓源性的EPC和人骨髓源性EPC相比，可以较长时间保持祖细胞的特点，并能够持续扩增，可以更好的应用于实验研究。

2.密度梯度离心法对细胞的损伤小，可以将由于实验原因导致的细胞损伤降到最低，同时可以较特异性的分离出单个核细胞，极大程度上避免了其他的细胞的干扰。

3.本方法采用二次贴壁的方法，可以有效的去除分子量较大，贴壁早的巨噬细胞等，可以避免这些贴壁细胞影响EPC的得出率。

4.本方法利用添加特定生长因子和血清的培养液对MNC进行体外培养并诱导分化为EPC，EPC的得出率高，经过30天的体外培养和传代，可以得到1×10⁸个细胞。

5.本方法所用培养液分为高浓度血清和生长因子的培养液和低浓度血清和生长因子的培养液两种，可节约大规模体外扩增细胞时的成本。培养30天可以节约血清约600ml及重组人EGF 17.5μg，重组人bFGF 35μg，vEGF 5.25μg，LongR3 IGF-170μg，可以大大降低扩增细胞的成本。

因此本发明的方法在简化EPC培养步骤同时降低培养的成本，极大程度提高了细胞的获得率，为体外大规模扩增培养EPC提供了技术可能，同时为临床上治疗缺血性疾病创造了条件。

附图说明

图1：细胞形态学特征图(×100倍)

分离骨髓中单个核细胞培养48小时即可出现梭形细胞

图2：细胞形态学特征图(×100倍)

6-7天后梭形的EPC数明显增多，部分成集落样生长

图3：细胞形态学特征图

EPC的超微结构图(5000倍电镜显示细胞全貌)

图4：细胞形态学特征图

EPC的超微结构(黑色箭头所指的即为30000倍电镜显示细胞浆中的Weible-Palade小体)

图5：EPC的功能检测图(摄取功能)

EPC摄取带有红色荧光的Dil-acLDL

图6：EPC的功能检测图(摄取功能)

EPC摄取带有绿色荧光的FITC-UEA-1

图7：EPC的功能检测图(摄取功能)

EPC同时摄取带有红色荧光的Dil-acLDL和绿色荧光的FITC-UEA-1，而呈现黄色荧光

图8：EPC的细胞表型检测图(免疫组化)

EPC的CD133染色(×40倍)

图9：EPC的细胞表型检测图(免疫组化)

EPC的CD34染色(×40倍)

图10：EPC的细胞表型检测图(免疫组化)

EPC的CD31染色(×40倍)

图11：EPC的细胞表型检测图(免疫组化)

EPC的KDR染色(×40倍)

图12：EPC的细胞表型检测图(流式细胞仪技术)

EPC的CD133流式结果

图13：EPC的细胞表型检测图(流式细胞仪技术)

EPC的CD34流式结果

图14：EPC的细胞表型检测图(流式细胞仪技术)

EPC的CD31流式结果

图15：EPC的细胞表型检测图(流式细胞仪技术)

EPC的KDR流式结果

图16：EPC的功能检测图(血管形成功能)

EPC的血管形成功能检测

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：

1)分离小型猪骨髓单个核细胞：无菌条件下取小型猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，将骨髓细胞移入试管和无菌PBS液1∶1混匀后离心(20℃，400g，10分钟)。离心后去上清液，再和无菌的PBS液1∶1混匀。取Ficoll液(Histopaque-10771，1.077g/ml，Sigma公司)10ml分两份加入空白试管；将混匀的骨髓细胞液体缓慢的滴入装有Ficoll液的试管(此步一定要慢，注意不要破坏Ficoll和骨髓细胞液之间的平面)后离心(20℃，900g，30分钟)。离心后，先去除最上层的上清液(注意不要将上清液下的单个核细胞层取走)，将单个核细胞层取出加入空白试管，再加入1∶1无菌PBS液混匀后离心(4℃，500g，10分钟)。离心后去上清液，再加入1∶1无菌PBS液混匀后再次离心(4℃，300g，10分钟)，所得的即为分离出的单个核细胞。并对所得的单个核细胞进行计数。(加入无菌的PBS液3ml并混匀，取20μl混匀液加入预先准备的装有380μl白细胞稀释液(3％冰醋酸)并混匀后计数)

2)体外培养单个核细胞：先将无添加血清和生长因子的M-199培养液(购自美国Gibco BRL公司)加入装有细胞的试管混匀后，将混匀的细胞液按照5×10⁵/cm²种于预先包被有纤维连接蛋白(FN，fibronectin)(FN包被的浓度为25mg/l，密度为5μl/cm²)的培养瓶/皿中。放入常规细胞培养箱(温度：37℃，5％的二氧化碳，饱和湿度)，培养2小时后，取出悬浮液，丢弃原培养瓶/皿，将所得的悬浮液离心(4℃，300g，6分钟)。离心后去上清液，将添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液(配方为：M-199为基础培养液，20％胎牛血清，重组人EGF 10.0ng/ml，重组bFGF 20.0ng/ml，vEGF 2.0ng/ml，Long R3 IGF-140.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml。)加入试管后混匀，将混匀的细胞液二次接种于预先包被有FN(同前)的培养瓶/皿中。放入常规细胞培养箱(同前)进行培养。每96小时给培养皿内的细胞更换低浓度血清和生长因子的M-199培养液(低浓度血清和生长因子的培养液的配方为：M-199为基础培养液，5％胎牛血清，重组人EGF 5.0ng/ml，重组人bFGF 10.0ng/ml，vEGF 0.5ng/ml，Long R3 IGF-120.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml)一次。(所有的细胞因子和血清均购自美国GibcoBRL公司)

3)体外消化传代扩增EPC：原代细胞培养7-8天时，当观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，准备消化传代。先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化计数后1×10⁴/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养(使用添加低浓度血清和生长因子的培养液)，记为P1。以后细胞每培养4d后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，即消化传代。先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化后1×10⁴/cm²的密度的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P2。以此类推。

4)内皮祖细胞鉴定：进行细胞形态学、表型和细胞功能鉴定。

细胞形态学特征：每ml骨髓经Ficoll密度梯度离心可得到MNC 1×10⁵-1×10⁶个细胞，培养前48小时内细胞的贴壁率很低，多数细胞形态为扁圆形。培养48小时后逐渐出现梭形贴壁细胞(attaching cell，AT cell)，并出现成簇现象，培养第五天时的EPC，已经开始出现成集落的贴壁细胞；到培养第7-8天时EPC，贴壁细胞已经成集落布满整个培养皿，细胞排列无极向。(图1-2)

细胞的超微结构鉴定：消化培养的P6代细胞，取细胞悬液离心(4℃，300g，6分钟)，离心后去上清液，用4℃预冷的PBS并混匀，进行离心(4℃，300g，6分钟)洗涤2次后加入3％戊二醛，4℃固定2h，洗涤后再用1％四氧化饿4℃下固定30min，洗涤、系列丙酮脱水后用专用包埋剂包埋进行超薄切片，用透射电镜进行超微结构的鉴定。在电镜下观察细胞；细胞内可检测到典型的Weibel-Palade小体。(图3-4)

细胞摄取功能鉴定：消化培养的细胞，取细胞悬液离心(4℃，300g，6分钟)，离心后去上清液，用加入5ml培养液稀释并计数；在细胞悬液中加入12.5pg(密度：2.5pg/mL)的Dil-acLDL(红色，最大激发波长543nm)在37℃孵育1h，然后用2％多聚甲醛固定细胞10min，用PBS洗涤二次，每次3分钟；加入50μg(密度：10μg/ml)的FITC-UEA-1(绿色，最大激发波长477nm)，在37℃的条件下孵育1h；在37℃的条件下孵育1h后用激光共聚焦显微镜观察。细胞浆内Dil-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性(黄色)的细胞被认为是正在分化的EPC，，并用倒置荧光显微镜对每孔细胞进行计数(随机选择15个×200的视野)。(图5-7)

细胞表型的鉴定：

1)免疫组化鉴定：先将培养皿内放入玻璃片，并用FN包被(方法同前)。加入培养液后，取培养的第三代细胞放入培养皿内进行培养。培养3天后观察细胞，当细胞已经长满整个玻璃切片后，取出玻璃切片。用PBS洗涤三次，运用CD133，CD34，KDR，CD31的抗体对体外培养的EPC进行免疫组化鉴定。结果显示：CD133(+)，CD34(+)，CD31(++)，KDR(++)。(图8-11)

2)流式细胞仪技术鉴定：消化培养的第三代细胞，用PBS洗涤三次，用专属的CD133，CD34，KDR，CD31的抗体对体外培养的EPC进行流式细胞术鉴定。结果显示：CD133的阳性率：18.23士7.12％；CD34的阳性率：47.71士14.85％；CD31的阳性率：71.61士13.51％；KDR的阳性率：87.24士11.40％。(图12-15)

细胞功能鉴定：

体外血管生成实验：采用体外血管形成试剂盒(BD公司)检测EPC血管形成能力。将含MatrigelTM Matrix胶液的96孔板置于4℃冰箱24小时，使之冻融；将96孔板置于37℃、5％的CO2培养箱培养30min，使MatrigelTM与Matrix发生聚合反应；用0.25％胰蛋白酶消化P3贴壁细胞，消化2-3min后，用含血清的培养液中和胰蛋白酶，将细胞悬液移入离心管中，在20℃，以2000r/min离心7min，加1ml培养液制成细胞悬液并计数，然后将同等数目的PMC(2×10⁵个)悬浮。37℃、5％的CO2培养箱24h；取出培养液，用100μL HBSS洗涤2次，加入50μL(8μg/mL)钙黄绿素，37℃、5％的CO2培养箱1h；用100μL HBSS洗涤2次；在40-100倍倒置显微镜下观察小管生成情况，细胞拉长变形，长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管。(图16)

本发明所有涉及的试剂和器材均为市场正常情况能够购买到，本发明中所涉及的实验方法均为常规已知方法。

Claims

1、一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于该方法依次包括下述步骤：

B、体外培养单个核细胞：

所述的添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液的配方为：M-199为基础培养液，20％胎牛血清，重组人EGF 10.0ng/ml，重组bFGF20.0ng/ml，vEGF2.0ng/ml，Long R3 IGF-140.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；

C、体外消化传代扩增EPC；

2、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤A，具体操作如下：

无菌条件下取小型猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，将骨髓细胞移入试管和无菌PBS液1∶1混匀后离心，离心条件为20℃，400g，10分钟；离心后去上清液，再和无菌的PBS液1∶1混匀；取Ficoll液10ml分两份加入空白试管；将混匀的骨髓细胞液体缓慢的滴入装有Ficoll液的试管后离心，离心条件为20℃，900g，30分钟；离心后，先去除最上层的上清液，将单个核细胞层取出加入空白试管，再加入1∶1无菌PBS液混匀后离心，离心条件为4℃，500g，10分钟；离心后去上清液，再加入1∶1无菌PBS液混匀后再次离心，离心条件为4℃，300g，10分钟，所得的即为分离出的单个核细胞，并对分离出的单个核细胞进行计数。

3、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤B中所述的单个核细胞种植密度为2×10⁵-5×10⁵个细胞/cm²。

4、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤B中所述的纤维连接蛋白包被的浓度为25mg/l，密度为5-10μl/cm²，在4℃环境下，包被时间不少于12小时。

5、根据权利要求1所述的一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于其中的步骤C，具体操作如下：

原代细胞培养7天后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，准备消化传代；先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化计数后5×10³-1×10⁴个细胞/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P1；以后细胞每培养4d后，观察细胞，当贴壁细胞铺满整个培养皿的底壁，即消化传代；先用PBS×2次洗去未贴壁的细胞，每次2分钟，贴壁细胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化后5×10³-1×10⁴个细胞/cm²的密度再分种于新皿中进行传代培养，记为P2；以此类推。