CN110713984A - 诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞诱导技术领域,具体涉及一种诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法。针对现有MSC诱导转化成内皮细胞的方法效率低,耗时长的问题,本发明提供了一种诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,包括以下步骤:获取能表达转录因子ETV2的人间充质干细胞,多西环素DOX诱导ETV2表达,第一阶段培养6天后,再添加TGF‑β信号抑制剂,第二阶段继续培养4天,获得功能性早期内皮样细胞。本发明方法诱导效率高,仅诱导培养10天就能够得到功能性早期内皮样细胞,该细胞可在体外稳定增殖、大量获取,可以作为种子细胞冻存备用,同时在体外也具有成管样结构的能力,移植体内后能促进裸鼠缺血肢体血管重建,维持裸鼠肢体功能。
Description
技术领域
本发明属于细胞诱导技术领域,具体涉及一种诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的 方法。
背景技术
缺血性疾病主要包括缺血性心脏病、缺血性脑卒中和终末期糖尿病肢端缺血等,它是由 于组织血管损伤,血流减缓甚至闭塞,细胞营养物质和氧气供应不足等导致细胞死亡和器官 功能障碍,严重威胁人类生命健康。以严重下肢缺血(CLI)患者为例,50岁以上男性中,CLI 的发病率高达0.2%,其中10%~30%患者半年内死亡,25%~35%的患者需高位截肢。目前 的药物、外科手术及介入、重组血管生成因子注射和基因治疗等治疗手段已在临床广泛应用, 早期或轻中度患者治疗后可以获得较好疗效,但是对于已经失去手术或腔内血管重建的重度 患者,以及伴有严重并发症的患者则收效甚微。因此,为严重缺血性疾病患者寻找新的治疗 策略具有重大的临床需求,也是我们面临的重大科学问题。
有研究报道从成人外周血中分离出的CD34阳性的内皮祖细胞(EPCs)能够参与出生后 新生血管形成和内皮损伤后的修复过程,在模型动物体内能促进血管新生,改善缺血。如 Kawamoto等将人外周血EPCs和内皮细胞(ECs)一起经静脉注入心肌缺血模型小鼠体内, 发现移植到体内的细胞参与了血管新生,缺血处的心肌毛细血管密度增加,左心室功能得到 明显提高。Kocher等将人ECs移植到心肌梗死的裸鼠体内,同样发现ECs参与血管新生, 新生血管能占整个心肌毛细血管数目的20%~25%。在脑中风动物模型中,移植的ECs也证 实参与了缺血脑组织血管新生。近年来,应用自体血管EPCs或功能性ECs治疗多种缺血性 疾病,通过补充自体高增殖活性的EPCs/ECs,促进旁路血管新生代偿缺血组织的血供,以 达到改善缺血脏器功能的目的,为严重缺血性疾病的治疗带来了新的希望。然而要获得能够 满足临床需求的细胞数量且有功能的EPCs/ECs非常困难的,即使利用集落刺激因子动员后, 外周血中EPCs/ECs的含量也仅只有0.2%-2%,而且自体分离的细胞体外增殖潜力有限,无 法实现细胞的大量获取。因此寻找新的方法,获取大量有功能的ECs是细胞移植治疗严重缺 血性疾病需解决的首要问题。
近年来,多个研究团队发现了获取内皮样细胞的新方法,如利用多能干细胞(PSCs),包括胚胎 干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs),能诱导生成内皮样细胞的。然而,PSCs向ECs分化耗 时长,费用高,而且分化后残留的未分化细胞潜在的成瘤特性,以及免疫排斥和伦理问题等都极大的 限制其在临床的广泛应用。随着人们对建立和维持特定细胞一致性所必须的转录因子(Transcription factor,TF)和微环境信号以及培养条件研究的深入,使一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化 细胞的技术,即细胞转分化的技术得到迅速发展,为ECs的获取提供了新的可能。据报道,在特定的 ECs培养条件下,可通过过表达iPSC诱导因子(oct 4、sox2、klf4和c-myc)来实现成纤维细胞向 ECs的直接转化。也有报道表明转录因子,包括ETS变异体2(ETs Variant 2,ETV2),flip-1原癌基因 (Fli-1proto-oncogene,FLI1)和ETS相关基因(ETS related gene,ERG)可以将羊膜细胞诱导为有功 能的ECs。但是对于自体细胞替代治疗而言,从患者身上取下所需量的皮肤用于分离成纤维细胞是非 常痛苦且难于被接受。同样,异基因羊水细胞极有可能引起免疫排斥,也难以在临床推广。相对而言, 人间充质干细胞,特别是人脂肪来源间充质干细胞(humanadipose-derived stem cells,hADSCs)因为 来源充足,取材容易,创伤小,易于储存,并且具有多向分化潜能和较强增殖活力,免疫排斥反应很 低以及不存在伦理问题等被认为是最理想的种子细胞来源。以往研究表明在含有VEGF、EGF、bFGF、 IGF等血管生长因子的条件下培养14-50天,hADSCs可以诱导分化为内皮样细胞。但是这些诱导方 法没有提供明确的诱导效率数据,实验结果中多单一的以CD31或VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)作为 内皮细胞出现的依据,该类细胞是否是真正意义上内皮细胞还值得商榷,而且到目前为止,仍没有实验结果说明获得的CD31阳性或VE-钙粘蛋白阳性的细胞能在体外进行长期稳定的扩增培养。因此, 建立高效快速的hADSC向ECs转化的方法,以及维持ECs体外长期稳定的扩增具有非常重要的临床 意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题为:现有MSC诱导转化成内皮细胞的方法效率低,耗时长,难 以满足自体细胞移植治疗需求的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为:提供一种诱导人间充质干细胞生成功能内皮细 胞的方法。该方法包括以下步骤:获取能表达转录因子ETV2的人间充质干细胞,多西环素 DOX诱导ETV2表达,第一阶段培养6天后,再添加TGF-β信号抑制剂,第二阶段继续培养 4天,获得功能性早期内皮样细胞。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述人间充质干细胞为人 脂肪或脐带来源的间充质干细胞。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述ETV2表达是瞬时的, 表达时间为多西环素DOX诱导ETV2表达开始计10天。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述DOX诱导浓度为1μg/ml。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述TGF-β信号抑制剂在 细胞培养物中持续存在4天。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述TGF-β信号抑制剂为 小分子化合物SB431542。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述小分子化合物SB431542在细胞培养体系中的浓度为10μg/ml。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述第一阶段培养6天过 程中,培养基为MSCM培养基逐渐转换成内皮诱导培养基EIM。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述的逐渐转换具体操作 为:培养第1-2天,培养基为MSCM与EIM按体积比1:1混合而成;培养第3-4天,培养基为MSCM与EIM按体积比1:2混合而成;培养第5-6天,MSCM与EIM按体积比1:4混合 而成。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述MSCM培养基(Mesenchymal Stem Cell Basal Medium,间充质干细胞基础培养基)为中国达科为生物技术 有限公司的货号为6114011的间充质干细胞基础培养基,再加入5%的由德国Helios公司生产 的货号为HPCFDCRL50的UltraGROTM组成。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述EIM(Endothelial Induce Medium,内皮细胞诱导培养基)培养基组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白蛋 白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml, 肝素5u/ml,VEGF50ng/ml,bFGF20ng/ml和EGF20ng/ml。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述第二阶段继续培养4 天过程中,培养基为EIM培养基。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,还包括功能性早期内皮样 细胞扩增培养的步骤。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述的扩增培养具体操作 为:将功能性早期内皮样细胞在EMM1(Endothelial Maintain Medium 1,内皮细胞扩增培养 基1)培养基中继续培养50天;细胞放置于5%CO2,37℃培养箱中培养,每2天换液1次, 细胞达到80-90%融合时用0.25%胰酶消化传代,3天传代1次。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述的EMM1培养基组成 包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链 霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF50ng/ml,bFGF20ng/ml, EGF20ng/ml,DOX1μg/ml,SB43154210μg/ml。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,还包括将功能性早期内皮 样细胞诱导培养成成熟内皮样细胞的步骤。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述诱导培养的具体操作 为:将功能性早期内皮样细胞在EMM2(Endothelial Maintain Medium 2,内皮细胞维持培养 基2)培养基中继续培养30天;细胞放置于5%CO2,37℃培养箱中培养,每2天换液1次, 细胞达到80-90%融合时用0.25%胰酶消化传代,3天传代1次。
其中,上述诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法中,所述EMM2培养基的组成 包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF20ng/ml,bFGF10ng/ml,EGF10ng/ml,SB43154210μg/ml。
本发明所述的功能内皮细胞共包括功能性早期内皮样细胞和成熟内皮样细胞两种。所述 的功能性早期内皮样细胞是指能够高表达包括CD34,、KDR或NRP1等内皮祖细胞相似的表 面标记蛋白分子及基因组合,具有成管能力和较强增殖能力的内皮样细胞;所述的成熟内皮 样细胞是指能够高表达包括CD31,TEK等终末内皮细胞相似的表面标记蛋白分子及基因组 合,具有摄取ac-LDL的能力,成管能力和一定的增殖能力的内皮样细胞。
本发明的有益效果为:
本发明提供了一种诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,通过在hADSCs中瞬 时表达ETV2并与TGF-β信号通路的抑制分子相结合可以促进hADSCs高效快速地转化为 具有增殖能力的功能血管内皮细胞群。本发明方法诱导效率高,仅诱导培养10天就能够得到 功能性早期内皮样细胞,该早期内皮样细胞能够表达早期内皮细胞表面标记蛋白和基因,体 外稳定增殖、大量获取,可以作为种子细胞冻存备用,同时在体外也具有成管样结构的能力。 本发明还提供了继续诱导功能性早期内皮样细胞成为成熟内皮样细胞的方法,得到的成熟内 皮样细胞表现出与hUVECs相似的蛋白分子和基因表达模式,移植入体内后可以于宿主脉管 系统融合,提高缺血区域血流灌注和功能恢复,使缺血性疾病自体内皮细胞治疗成为可能, 为hADSCs在缺血性疾病细胞治疗提供了依据,具有重要的意义。
附图说明
图1:人脂肪间充质干细胞(hADSCs)转化而来的诱导早期内皮细胞(ieECs)增殖能力和 功能鉴定;
(A)在内皮诱导过程中实时观察细胞形态变化,阳性对照为表现出铺路石样细胞形态的人 脐静脉内皮细胞,比例尺:50μm。(B)hADSCs向内皮细胞诱导第10天,收集细胞做流式 分析,检测早期内皮细胞特异的表面标记分子的表达情况。(C)流式检测结果的统计分析,*P <0.05,**P<0.01。(D)hADSCs向内皮细胞诱导第10天做免疫荧光检测,检测早期内皮细 胞特异的表面标记分子的表达情况。(E)免疫荧光检测结果的统计分析,*P<0.05,**P< 0.01。(F)hADSCs向内皮细胞诱导第0天,5天,7天,10天收集细胞,定量PCR动态 检测早期内皮细胞特异基因的表达情况。(G)分离纯化的ieECs体外培养60天,评估细胞在 体外的增殖能力。(H)将分离纯化的ieECs以及对照细胞人脐静脉内皮细胞和人脂肪间充质 干细胞接种在包被基质胶(matrigel)的96孔培养板中,培养在含有50ng/ml的内皮生长因 子(VEGF)培养基条件下,培养12小时后进行体外成管形成检测,比例尺:50μm。(I)成 管实验中管状结构分叉点的数目的统计分析,*P<0.05,**P<0.01。
图2:检测几种化合物对内皮诱导效率的影响;
(A)准备5组ETV2-hADSCs,第一组从诱导第1天开始加入TGF-β抑制剂,SB431542(SB), 第二组从诱导第2天开始加入SB,第三组从诱导第4天开始加入SB,第四组从诱导第6天开 始加入SB,第五组细胞作为对照,培养在不含SB内皮诱导培养基中。第10天收集各组细胞, 流式检测KDR表达情况,评估SB及加入时间点的改变对内皮诱导效率的影响。右下为其统 计分析图。(B)按照以上的实验流程和分组,将SB换成Wnt信号通路激动剂Chir99021。第 10天收集各组细胞,流式检测KDR表达情况,评估Chir99021本身及加入时间点的改变对内 皮细胞诱导效率的影响。右下为其统计分析图。(C)按照以上的实验流程和分组,将SB换成BMP4因子。第10天收集各组细胞,流式检测KDR表达情况,评估BMP4本身及加入时 间点的改变对内皮细胞诱导效率的影响。右下为其统计分析图,*P<0.05。
图3:下调ETV2表达促进ieECs向成熟内皮细胞分化。
(A)ieECs向成熟内皮细胞分化的实验流程图。纯化的ieECs培养在内皮细胞扩增培养液中 并分成两组,一组持续加入DOX处理,另一组则撤去DOX,于培养第0天,15天,30天和 60天收集细胞,定量PCR检测成熟内皮细胞基因表达情况,判断ETV2转录因子对ieECs向成熟内皮细胞转化的影响。(B)定量PCR检测各组细胞在不同处理条件下表达成熟内皮细胞基因情况,*P<0.05,**P<0.01。
图4:诱导成熟内皮细胞(imECs)增殖能力及体外功能检测;包括:
流式检测imECs成熟内皮细胞特异表面标记分子的表达情况,人脐带内皮细胞为阳性对照。 检验imECs体外成管能力,人脐静脉内皮细胞和人脂肪间充质干细胞为对照细胞,比例尺: 50μm。成管实验中管状结构分叉点的数目的统计分析,*P<0.05,**P<0.01。imECs体外培 养30天,评估细胞在体外的增殖能力。
图5:移植入体内imECs可以形成功能性的灌注血管。
(A)建立裸鼠肢端缺血模型,将imECs和对照细胞hUVECs和hADSCs分别混合于含有30%Matrigel,取3个点位注射入缺血肢体肌肉内。等量PBS为阴性对照。动态观察治疗后裸鼠 肢体形态变化,判断细胞治疗效果(每组10只小鼠)。(B)同时激光多普勒血流仪定量监测各组裸鼠缺血肢体血流情况。
(C)细胞治疗14天后血流重建趋于稳定,根据激光多普勒血流数据进行统计 分析,判断不同处理组裸鼠血流重建情况,*P<0.05,**P<0.01。
具体实施方式
本发明中,术语“人脂肪间充质干细胞”(hADSCs)指从脂肪组织中提取出的间充质干细 胞。
术语“ieECs”指使用本申请所公开的诱导转化方案由hADSCs产生的诱导早期内皮细胞, 其生物学特征更接近于从哺乳动物发育过程中的早期内皮细胞。imECs表达KDR,NRP1以及 CD34等早期内皮细胞特异的表面蛋白分子,在成分明确的扩增培养条件下能长期稳定增殖, 实现细胞的大量扩增,因此可以作为种子细胞冻存备用。
术语“imECs”指使用本申请所公开的诱导转化方案由hADSCs产生的诱导成熟内皮细 胞,它们从ieECs转化而来,其生物学特征更接近于从哺乳动物对象中分离的成年血管内皮 细胞,如hUVECs或成人肝窦EC(LSEC)。经检验imECs和hUVECs具有相似的形态特征、细胞表型,转录表达谱和良好的缺血治疗效果。
本发明以hADSCs为主要研究对象,经过反复试验摸索,得到了一种能高效快速将hADSCs转化为ieECs和imECs的诱导方法。
本发明选取hADSCs为主要研究对象,脂肪组织来源充足,细胞增殖活性强、具有多向 分化潜能,更重要是可以取自患者本人,避免免疫排斥反应,并且可以在体外长期冻存备用。
本发明所述诱导转化涉及在hADSCs中瞬时表达ETS家族的转录因子ETV2并且与TGF-β信号通路的抑制分子相结合的方法。参与本发明所述诱导转化的ETS家族转录因子ETV2(人ETV2,小鼠和斑马鱼也称为ER71或Estrp)。在现有技术中已对ETV2进行了描述 并且其核酸和蛋白序列也能够从GenBank中获得(ETV2:NCBI登录号NM_014209.2,GI:153791177)。本专利中公开了ETV2是诱导hADSCs获得内皮细胞命运的关键因素。例如, 与未转导的hADSCs相比,单独的ETV2转导能够启动hADSCs上早期内皮细胞特异标记物 CD34,KDR和NRP1的表达。
在本发明中,编码所需转录因子的核酸可通过慢病毒载体递送。慢病毒载体是本领域熟 知的并且能够提供较强的和持续的表达。在具体的实施例中,使用Lenti-XTM Tet-on诱导表 达系统,实现ETV2基因的调控表达。在DOX存在条件下,所述调节载体中Tet-on转录激 活子的表达启动所述应答载体中ETV2的转录,上调ETV2在转基因细胞中的表达,相反, 去除DOX的处理即可下调ETV2的表达。
本发明中,所述内皮样细胞的诱导转化涉及ETV2的瞬时表达。ETV2的瞬时表达指ETV2 表达约8-10天。实验结果提示,ETV2过表达10天即能稳定促进hADSCs向内皮细胞命运的 转化。延长ETV2的表达反而显示出对内皮样细胞中成熟标记分子CD31(PECAM)和vWF表达的负性调节。ETV2表达的下调可以明显促进ieECs向imECs的转化。因此,通过对ETV2 表达的精确调控,可以获得均质性更高的成熟内皮样细胞。
本专利提供的诱导方法还包括对TGF-β信号通路的调控。已有文献报道,TGF-β信号 通路可以促进内皮向间质的转化(EMT),抑制内皮细胞转化效率。因此,在具体的实施方式 中,TGF-β信号的抑制剂(SB431542,SB)以10μM浓度加入内皮诱导基础培养基中,实现对TGF-β信号的抑制,从诱导第6天开始加入可以进一步增加hADSCs向内皮细胞转化的效率,而过早的TGF-β信号抑制反而会降低诱导效率。在本专利中,对内皮细胞发育相关的其他重要信号因子也进行了验证,包括Wnt信号通路以及骨形态发生蛋白4(BMP4)激活的信号通路,实验结果提示,它们都对hADSCs向内皮细胞的转化没有积极的作用。
TGF-β信号的抑制还可以使内皮细胞特异标记分子KDR稳定持续表达,提高内皮细胞增 殖活力。在具体的实施方式中,将SB431542(10μM)加入内皮扩增培养基中,促进KDR阳性的早期内皮细胞成熟和体外扩增培养。
本发明诱导得到的ieECs具有较强增殖能力,在化学成分明确的扩增培养条件下,体外 培养2个月后ieECs可以稳定增殖高达1010倍。降低了ETV2表达的ieECs可以进一步分化 为成熟的ECs样细胞(imECs),它们呈铺路石样的细胞形态,具有与脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,hUVECs)相似的基因表达模式及表面标记分子。值得注意的是, imECs植入肢端缺血裸鼠体内后能显著改善缺血区域血运重建,改善裸鼠缺血肌肉功能。采 用本发明的诱导方法,我们可以大量获取自体脂肪间充质干细胞来源的具有增殖能力的功能 内皮细胞,有望为将来血管组织工程的发展和个性化再生医学的应用提供安全有效的细胞来 源。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明,但不表示将本发明的 保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例1诱导人脂肪间充质干细胞分化实验
1、细胞培养
人脂肪间充质干细胞的分离培养:手术取出人腹部皮下脂肪,在冷D-Hank’s液中漂洗3 次,去除肉眼可见的纤维成分和血管,用手术剪将其碎成1mm3左右的小颗粒。将组织小颗 粒移入50mL离心管并加入0.1%Ⅰ型胶原酶(每克脂肪组织加2-5mL),置于37℃,振荡消化30min-45min。加入等量的含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基终止消化,并用 滤网过滤掉组织碎片。过滤液于4℃1500rpm离心10分钟,重复离心两次后弃去上清。用间 充质干细胞无血清培养基MSCM(DAKEWE)重悬,按2.5x105的细胞密度接种于75cm2培养 皿中,并放置于5%CO2 37℃培养箱中培养。1天后,用Hank's平衡盐溶液漂洗培养皿2-3 次,清除未贴壁细胞,加入完全培养基继续培养。每2天换培养液1次,直至细胞达到80-90% 融合后用0.25%胰酶消化传代。一般3天传代一次。
2、ETV2-hADSCs转基因细胞的建立
构建含有ETV2基因编码区序列(NM_014209.2)的重组慢病毒表达载体(带绿色荧光GFP 标签),慢病毒表达载体构建工作由广州复能生物有限公司完成。利用293FT细胞包装出 Tet-on诱导表达慢病毒,浓缩后感染生长状态良好的hADSCs,获取ETV2-hADSCs转基因 细胞。之后按常规方法继续培养扩增。为获取纯化的转基因细胞,通过流式分选表达GFP的 阳性细胞,经过定量聚合酶联反应(qPCR)和Western blot检测,证明我们获取的细胞为受 DOX诱导表达的转基因细胞,ETV2-hADSCs。
3、诱导ETV2-hADSCs转化为早期血管内皮样细胞
选取生长状态良好的ETV2-hADSC细胞,以2×105个细胞/孔接种于包被有I型胶原的六 孔板上,并在MSCM完全培养基中培养。当细胞完全贴壁生长后(约24小时),即可进行为 期10天的诱导培养,此阶段需要多西环素(DOX,1μg/ml)激活ETV2表达。
在诱导培养过程中,MSCM培养基逐渐转换成内皮诱导培养基(EIM)(具体替换过程为: 培养第1-2天,培养基为MSCM与EIM按体积比1:1混合而成;培养第3-4天,培养基为MSCM与EIM按体积比1:2混合而成;培养第5-6天,MSCM与EIM按体积比1:4混合而成。), 然后在诱导第7天采用完全的EIM,继续培养4天,TGF-β抑制分子SB431542(10μg/ml) 在诱导第7天加入,进一步提高内皮细胞转化效率。诱导10天后利用流式分选出KDR阳性 的早期内皮样细胞(ieECs)。所述EIM培养基组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血 清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸 50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF50ng/ml,bFGF20ng/ml和EGF20ng/ml。
具体的处理流程如表1所示。
表1诱导ETV2-hADSCs转化为早期血管内皮样细胞过程表
4、早期血管内皮样细胞的扩增培养
继续对ieECs体外扩增培养。流式分离纯化出具有早期内皮细胞特性的KDR阳性细胞, 培养在含有DOX和SB的内皮扩增培养液1(EMM1)中。细胞放置于5%CO2 37℃培养箱 中培养。每2天换液1次,细胞达到80-90%融合后用0.25%胰酶消化传代。一般3天传代一 次。培养时间为50天,所述的EMM1培养基组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血 清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸 50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF50ng/ml,bFGF20ng/ml,EGF20ng/ml,DOX1μg/ml, SB43154210μg/ml。
5、诱导早期内皮样细胞(ieECs)成为imECs
ieECs培养在含有SB的内皮扩增培养液(EMM2)中,去除DOX处理,下调ETV2基 因表达,促进ieECs的成熟转化及其在体外的稳定增殖。细胞放置于5%CO2 37℃培养箱中 培养。每2天换液1次,细胞达到80-90%融合后用0.25%胰酶消化传代。一般3天传代一次。 培养时间为30天,所述EMM2培养基的组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白 蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸 50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF20ng/ml,bFGF10ng/ml,EGF10ng/ml,SB43154210μg/ml。
所述的小分子化合物SB431542
Cas No.:301836-41-9;分子量:384.39;分子式:C22H16N4O3;化学名:
4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide,结构式:
6、流式细胞术
在FACSCanto II(BD公司)购买的上进行流式细胞检测和流式细胞分选。
所有电压和补偿使用CompBeads(BD公司)进行,使用荧光扣除(FMO)对照进 行设门。抗体信息见表3。
7、定量PCR
收集不同时间点的细胞,根据试剂说明书使用Trizol(英韦创津公司,美国) 制备总RNA,使用一步法定量PCR试剂盒(Step-One Real-Time PCR system) (Takara)进行逆转录。在7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems(应用 生物系统公司))上进行定量PCR反应。循环条件为:95℃下5分钟进行1个 循环,随后95℃下30秒,60℃下30秒和72℃下45秒进行40个循环,完成后 72℃下5分钟,最后在4℃下结束。将各基因表达的循环值归一化至管家基因β -肌动蛋白(β-actin)并转化为相对值。引物序列见表2。
8、免疫荧光
选取待检测的细胞,吸弃培养基,用PBS洗3次,每次5min。4%的PFA固定20-30min,PBS 洗3次,每次5min。0.2%Triton X 100室温穿透细胞20-30min,正常山羊血清封闭30min。吸去 封闭液后滴加PBS稀释的荧光一抗,置湿盒内4℃过夜。PBS洗3次,每次5min。滴加PBS稀释 的荧光二抗(1:200)避光孵育40-60min。
PBS洗3次,每次5min,DAPI染核后镜下观察并拍照。如果是冰冻切片的组织,从-20℃冰箱 取出,室温放置10min,4℃丙酮固定15min。PBS漂洗3次,每次5min。山羊血清封闭后其他 操作同细胞荧光染色,抗荧光淬灭封片剂封片,镜下观察结果并拍照。乙酰化的低密度脂蛋 白(ac-LDL)摄取实验:分别向hADSCs、hUVECs和EiECs的培养液中加入浓度为10mg/ml 的ac-LDL,37℃培养1h,PBS漂洗3次。倒置荧光显微镜下观察并拍照。抗体信息见表3。
9、体外成管实验和体内血管生成测定
为检测细胞体外成血管能力,收集细胞溶于含有50ng/mlEGM2溶液中,接种于预先铺好 基质胶(Matrigel)的96孔板中,每孔接种10000-15000细胞。培养板放入孵箱中培养24 小时后观察细胞的成管结构。在40倍镜下随机选取5个视野,计数各组细胞形成的管样结构 交叉点的数目并进行统计分析。
为了评估imECs体内血管生成的能力,收集1x 106/组的细胞悬浮在含有30%基质胶的 100ul PBS中,植入裸鼠皮下(每组5只裸鼠)。两周后取出基质胶块,对其内部血管样结构 进行观察比较。
10、基因表达谱(RNA-Seq)测序和分析
收集各组培养细胞,制备总RNA,送交上海欧易生物有限公司,利用Solexa高通量测序 服务进行基因测序。RNA序列原始数据和详细的信息已经存放在NCBI GEO中,登录号分别 为SRR 7072218、SRR 7072220、SRR 7072221。使用desq(2012)功能估计系统和nbionemot 来鉴定基因的差异表达。选择在hADSCs和imECs之间表达水平显示两倍或更多变化的基因 (P<0.05,t检验)描绘热图和进行基因富集分析。
11、建立裸鼠肢端缺血模型及建立细胞治疗方案
裸鼠经2%异氟烷混合100%氧吸入麻醉后,仰卧手术台,四肢牵引固定,于左侧腹股沟 部行1.5cm纵行切口,以自制小拉钩牵开。用棉签推开大腿肌肉四周脂肪组织,暴露出股动 脉,股静脉和周围血管神经束。在10倍光学显微镜下游离出股动脉,并以7-0手术丝线由上 至下结扎,离断包括旋髂浅动脉,股深动脉,腹壁阴部动脉从等其他动脉分支。缝合并消毒 皮肤。肢端缺血可首先出现股动脉结扎下端,相应血液供应区域的肌肉变白,5-6小时后肢体 出现淤青水肿,2-3天缺血肢体发紫变黑,指端出现溃烂、脱落,严重的累积下肢肢体。
细胞治疗方案如下:
1)将肢端缺血模型老鼠随机分配,每组10只小鼠。胰酶消化对数生长期的细胞,用无血清 RPMI-1640培养基洗涤3次后计数,调整浓度为1×107cells/ml,取100μl细胞悬液混入预先 溶化的Matrigel中,每管200μl,每只小鼠接种一管。
2)将分装好的细胞悬液放置在冰上,拿到动物饲养室,在超净台上接种,固定好裸鼠后,分 别选取缺血下肢三个点进行肌肉内注射,每个点位60-70μl。对每只小鼠做耳标标记,动态监 测各组小鼠肢体缺血后肿胀及坏死甚至脱落情况。
3)利用彩色超声多普勒动态监测缺血肢体血流恢复情况,对侧肢体为正常对照,并计算出血 流恢复率=缺血肢体血流值/同只老鼠对侧肢体血流值×100%。
12、统计学处理
实验数据以均数±标准差(χ±SEM)表示,所以数据均以SPSS software version17.0统计 软件进行分析。多组数据比较采用方差分析,有统计学意义后进行两两比较以t检验,进行处 理,P<0.05则认为有显著性差异。做图采用Graph Prism 6.0软件。
实施例2瞬时诱导ETV2基因表达和抑制TGF-β信号通路共同促进hADSCs转化为具有 内皮样细胞特性的细胞
为了检验ETV2具有促进hADSCs向ECs转化潜能,按照实施例1中提供的诱导方法对hADSCs实行内皮诱导。诱导第5-7天镜下观察细胞形态出现改变,诱导10天即可见大量细胞由成纤维样向卵圆形或铺路石样形态转变(图1中的A图)。从诱导第6天加入SB431542 能显著提高KDR阳性细胞比例(48.8%±6.94%),按细胞10天内传代3-4代,相当于每个 起始的hADSCs经过10天诱导后可产生至少40个KDR阳性细胞。收集诱导10天的细胞, 流式检测发现,与相同培养条件下的hADSCs相比,内皮细胞特异的表面标志蛋白KDR、 CD34、NRP1在ETV2-hADSCs来源的诱导细胞上明显上调(图1中的B-C图)。免疫荧光及 定量PCR同样显示内皮特异基因KDR、CD34、NRP1在ETV-hADSCs来源的诱导细胞中表 达上调(图1中的D-F图)。以上实验结果说明本申请提供的第一阶段诱导方案可以促进 hADSCs高效快速地向内皮样细胞命运的转化。
实施例3KDR阳性细胞是可增殖的早期内皮样细胞。
KDR是早期内皮细胞重要的分子标记之一。诱导第一阶段结束后(10天),流式分选出 具有不同细胞形态的KDR阳性和KDR阴性细胞群。经流式鉴定,KDR阳性细胞表达高水平的NRP1(81.7±5.1%),VE-钙粘蛋白(40.6±3.2%),中等水平的CD34(20±3.2%)。定 量PCR检测结果进一步证实,KDR阴性细胞的内皮特异性基因呈低水平表达,KDR阳性细 胞则高表达KDR,NRP1和CD34。
通过60天的细胞增殖实验,在EMM1培养条件下,ieECs表现出持续稳定的增殖能力。 在这一过程中,细胞传代多达18次,以5×104的起始细胞为例,经过60天的体外培养可增 到1.48×1014细胞量(图1中的G图),培养60天的细胞仍保持着正常的核型。在功能上,ieECs 在体外具有成管能力(图1中的H-I图)。免疫荧光染色观察,结果显示ieECs高表达VE-钙 粘蛋白,而其他成熟内皮标记分子,包括CD31和血管性血友病因子(vWF)与hUVECs相比呈低水平表达,同流式及定量PCR检测结果类似。酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)摄取是成熟内皮细胞功能之一,在ac-LDL摄取实验中,与hUVECs相比,也只有少部分ieECs表现 出ac-LDL的摄取能力。综合前两部分实验我们得出结论,ieECs在细胞形态,分子表型,基 因表达及体外功能等方面均表现出了内皮样细胞特性,但是更倾向于早期内皮样细胞。
实施例4重要信号通路调节分子对内皮细胞诱导效率的影响
为了进一步提高hADSCs向内皮样细胞转分化效率,我们检测了文献报道的能影响血管 发育的三种重要信号通路调节分子,包括TGF-β信号通路抑制剂SB431542(SB),Chir99021 (GSK-3α/β抑制剂,有激活WNT通路的作用),和BMP4促内皮转化效率。在EIM和DOX 持续添加的培养条件下,以转基因细胞中KDR表达作为诱导效率检测指标,按照图2中的A 所显示的实验步骤,我们发现从诱导第6天加入SB能显著增强KDR阳性率(49.2%±1.94%) (图2中的B图)。相比之下,Chir99021和BMP4在不同时间点加入培养体系均不能有效提 高内皮诱导效率,BMP4的加入甚至会抑制EC的转化(图2中的C-D图)。
实施例5下调ETV2表达促进ieECs向成熟内皮细胞转化第二阶段
为了促进ieECs向成熟ECs转化,我们按照图3中的A图提供的实验方案,在诱导的第 三阶段,添加或去除多西环素(DOX)的处理,实现ETV2的调控表达,分析ETV2的表达 与否对细胞成熟的影响。分别收集诱导培养15天、30天和60天的细胞进行定量PCR检测结 果发现,与持续DOX处理组相比,下调ETV2基因的表达,可以促进ieECs群中表达CD31 和TEK的细胞比例在1周内逐渐增加(图3中的B图),收集诱导培养15天、30天和60天 的细胞进行流式细胞检测,与持续DOX处理组相比,下调ETV2表达后,ieECs群中成熟内 皮细胞标记分子CD31和VE-cad的表达随着培养时间增加而逐渐增加,在培养第30天分别 达到约72%和82%,在培养第60天分别达到约62%和82%。收集诱导30天的细胞做免疫 荧光染色,同hUVECs相比,去除DOX处理的ieECs高表达VE-cad,CD31,TEK和vWF 等成熟内皮细胞特异的标记分子,且大部分细胞具有摄取ac-LDL的潜能。从以上几方面结 果可见,通过第三阶段的诱导培养,ieECs来源的imECs表现出同hUVECs类似的生物学特 性和功能,提示ieECs成功转化为成熟内皮样细胞。
实施例6 imECs体外具有成管能力和促血管生长因子分泌能力
imECs培养于内皮扩增培养基2(EMM2)进行体外稳定增殖,收集诱导30天的细胞进行流式细胞检测,imECs群中CD31,VE-cad和TEK等成熟内皮细胞标记分子表达量与 hUVECs阳性细胞接近,而间充质干细胞相关分子CD90,CD29以及早期内皮细胞标记分子 CD34在imECs中呈低表达(图4)。在功能上,imECs在基质胶包被的培养板上形成管样结 构的能力明显优于hADSCs,统计学上与hUVECs阳性细胞表现无明显差异(图4)。ELISA 检测实验中,我们发现hADSCs分泌量较多的IL8在imECs和hUVECs中表达降低了,而imECs分泌上清中其他促血管生长因子VEGF,bFGF和EGF能被检测到。在为期30天的细 胞增殖实验中,imECs传代可达8-10代次,以5×104的起始细胞为例,经过30天的体外培养 可增到1.2×1010细胞量(图4),培养30天的细胞仍保持着正常的核型。以上结果表明,我 们的培养方案同样可以大量获取有功能的成熟内皮样细胞,有望满足未来临床需求。
实施例7 imECs有着与成熟内皮细胞hUVECs相似的基因表达模式
利用GeneSpring 11.0软件绘制芯片数据,分析hADSCs,hUVEC和imECs的基因表达模式。hADSCs与imECs基因表达差异显著。与hADSCs相比,imECs中超过两倍的上调基 因和下调基因分别有577个和505个。热图分析可见imECs基因表达水平更接近于成熟内皮 细胞hUVECs。基因功能聚类(GO)分析表明在imECs样品中参与血管生成,内皮细胞发育 和维持内皮细胞增殖的基因显著上调,而涉及细胞粘附和细胞外基质的基因显著下调。结果 表明,在基因水平上hADSCs分化成了成熟内皮样细胞。本部分实验结果说明ETV2诱导的 内皮样细胞除了在细胞表型,细胞功能上,同时也在基因表达谱方面都具有成熟内皮细胞类 似的生物学特性。
实施例8 imECs有效改善裸鼠肢端缺血症状
为了评估EiECs体内成血管能力,我们分别将1×106个imECs,hUVECs,hADSCs重悬于100μl含有30%matrigel的PBS混合液中,皮下移植到裸鼠背部(n=5)。植入14天后将细胞团取出。与hADSCs细胞团相比,imECs和hUVECs细胞团内可见明显多的红色血流样区 域。为了进一步检验imECs促进缺血组织血管重建功能,我们建立了裸鼠肢端缺血模型(6 周龄,雄性,北京维通达公司),分别将1×106个imECs,hUVECs和hADSCs重悬于100μl含 有30%matrigel的PBS混合液中,取3个点位注射入缺血肢体肌肉内(n=10)。PBS对照裸 鼠注射等量的不含细胞的混合液,动态监测各组实验鼠肢体血流及形态变化。PBS对照组裸 鼠在随后的观察中出现了明显的足部及肢体肌肉缺血,表现出严重水肿,淤血青紫等症状,最终导致严重的肢体坏死(60%,6/10)或肢体完全丧失(40%,4/10)。同样,接受hADSC 移植的裸鼠中有近60%患有肢体坏死,一只裸鼠最终失去了肢体。而imECs和hUVECs移 植治疗的裸鼠肢体血流恢复情况普遍较好,部分裸鼠足部出现坏死,四分之一多的裸鼠肢体 得以保留(图5的A-B)。与缺血肢体的生理状态一致,激光多普勒血流定量监测分析显示,imECs同hUVECs一样,移植后肢体血流平均灌注比率比hADSCs和PBS对照组显著增高, 缺血状况得到良好的改善(图5的C)。
细胞移植14天后取出细胞团进行冰冻切片组织染色分析。分别使用能与人和小鼠交叉反 应的CD31抗体(总CD31)和特异性与人反应的CD31抗体,分析组织切片中总的血管和移 植细胞来源的血管结构,imECs和hUVEC组织切片中CD31阳性的血管密度明显多于hADSCs来源的组织切片,且部分血管样结构能同时与表达人鼠交叉的CD31抗体和人CD31的抗体反应。对新生血管区域进行免疫荧光染色可见,表达人CD31的EiEC血管结构同时表达人特异性CD144(VE-cad)和vWF,并且部分人来源的血管样结构能与小鼠α-SMA阳性 周细胞形成紧密连接。以上结果表明EiECs移植到缺血肌肉内能存活并形成与宿主脉管系统 吻合的功能性血管系统,加快缺血组织内的血流恢复和缺血症状的改善。
实施例9 imECs体内安全性评估
细胞治疗的重要前提是细胞在体内的安全性,其中细胞成瘤特性和异常分化潜能是判断 细胞体内安全性的重要标志。为了评估imECs在体内的安全性,我们随机保留了5只接受过 imECs治疗的肢端缺血模型鼠,在长达4个月的后续观察中,模型鼠缺血肢体血供恢复良好, 5只裸鼠没有形成肉眼可见的肿瘤样包块。患侧肢体肌肉取样,组织切片H&E染色观察,肌 肉纹理清晰,结构完整,无肿瘤样结构形成。本部分实验结果表明imECs体内治疗能安全有 效地促进缺血区域的长期血运重建,imECs移植体内具有较强安全性。
表2定量PCR引物序列
表3免疫荧光和流式检测分析抗体汇总
本发明分离培养出高纯度的人脂肪间充质干细胞(hADSCs),建立了DOX诱导的ETV2-hADSCs转基因细胞。本发明以hADSCs为研究对象,首次验证了ETV2较强的促间充 质干细胞向内皮样细胞转化的能力。
本发明还建立了一种新的诱导方法促进hADSCs快速高效地转分化为内皮样细胞。与以 往完全依赖生长因子的方法相比,通过利用ETV2短期表达和TGF-β信号通路阶段性的调控 以及对诱导培养条件的优化,实现了hADSCs更快速高效地向早期和成熟内皮样细胞的转化。 该方法诱导时间短,效率高,诱导内皮样细胞从形态,表面标记分子,基因表达谱和体内体 外血管形成的能力等方面被证实接近于人体内分离的内皮细胞,更关键是可以在体外大量稳 定的增殖,为大量获取临床所需自体细胞提供了丰富的细胞来源。
本发明中诱导10天获取的内皮样细胞具有早期内皮细胞的生物学特性,在去除DOX处 理,下调ETV2表达后,早期内皮样细胞即可有效的向成熟内皮细胞转化。因此,本发明提 供的诱导方案通过DOX添加和去除,实时灵活的调控ETV2表达,促进内皮样细胞状态的转 化。
本发明获得的imECs移植体内展现出较强的血管再生功能。移植到裸鼠体内的imECs能 长期存活并参与血管新生过程,同时可以通过生长因子的旁分泌作用进一步促进血管的修复 和组织再生。本研究中获取的imECs是血管再生潜在的安全有效的细胞来源,为多种严重的 缺乏其他有效治疗的缺血性疾病患者带来了新的希望。
序列表
<110> 四川大学
<120> 诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法
<130> A191254K(序)
<141> 2019-11-15
<150> 201811429180.X
<151> 2018-11-27
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<400> 16
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Claims (18)
1.诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:获取能表达转录因子ETV2的人间充质干细胞,多西环素DOX诱导ETV2表达,第一阶段培养6天后,再添加TGF-β信号抑制剂,第二阶段继续培养4天,获得功能性早期内皮样细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述人间充质干细胞为人脂肪或脐带来源的间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述ETV2表达是瞬时的,表达时间为多西环素DOX诱导ETV2表达开始计10天。
4.根据权利要求1-3任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述多西环素DOX诱导的浓度为1μg/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述TGF-β信号抑制剂在细胞培养物中持续存在4天。
6.根据权利要求1-5任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述TGF-β信号抑制剂为小分子化合物SB431542。
7.根据权利要求1-6任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述小分子化合物SB431542在细胞培养体系中的浓度为10μg/ml。
8.根据权利要求1-7任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述第一阶段培养6天过程中,所用的培养基为MSCM培养基逐渐转换成内皮诱导培养基EIM。
9.根据权利要求1-8任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述培养基的逐渐转换具体操作为:培养第1-2天,培养基为MSCM与EIM按体积比1:1混合而成;培养第3-4天,培养基为MSCM与EIM按体积比1:2混合而成;培养第5-6天,MSCM与EIM按体积比1:4混合而成。
10.根据权利要求1-9任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述MSCM培养基为中国达科为生物技术有限公司的货号为6114011的间充质干细胞基础培养基,再加入5%的由德国Helios公司生产的货号为HPCFDCRL50的UltraGROTM组成。
11.根据权利要求1-10任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述EIM培养基组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF50ng/ml,bFGF20ng/ml和EGF20ng/ml。
12.根据权利要求1-11任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述第二阶段继续培养4天过程中,培养基为EIM培养基。
13.根据权利要求1-12任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:还包括功能性早期内皮样细胞扩增培养的步骤。
14.根据权利要求1-13任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述的扩增培养具体操作为:将权利要求1-12任一项所得到的功能性早期内皮样细胞在EMM1培养基中继续培养50天;细胞放置于5%CO2,37℃培养箱中培养,每2天换液1次,细胞达到80-90%融合时用0.25%胰酶消化传代,3天传代1次。
15.根据权利要求1-14任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述的EMM1培养基组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF50ng/ml,bFGF20ng/ml,EGF20ng/ml,DOX1μg/ml,SB43154210μg/ml。
16.根据权利要求1-12任一项所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:还包括将功能性早期内皮样细胞诱导培养成成熟内皮样细胞的步骤。
17.根据权利要求16所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述诱导培养的具体操作为:将权利要求1-12任一项所得到的功能性早期内皮样细胞在EMM2培养基中继续培养30天;细胞放置于5%CO2,37℃培养箱中培养,每2天换液1次,细胞达到80-90%融合时用0.25%胰酶消化传代,3天传代1次。
18.根据权利要求16或17所述的诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法,其特征在于:所述EMM2培养基的组成包括:M199基础培养基,干细胞级牛血清白蛋白15mg/ml,1%L-谷氨酰胺,1%青霉素或链霉素,人胰岛素17.5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml,肝素5u/ml,VEGF20ng/ml,bFGF10ng/ml,EGF10ng/ml,SB43154210μg/ml。
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