CN105062957A - 血管内皮细胞祖细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血管内皮细胞祖细胞的培养方法，包括：1)将多能干细胞于培养基A中诱导分化形成中内胚层前体细胞；2)将中内胚层前体细胞于培养基B中诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞；培养基A含DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制剂；培养基B含DMEM培养基、F12培养基、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂。该培养方法中使用的未含有动物源成分，能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，从而能够高效地将人类多能干细胞诱导分化形成具有高度类似于人类脐带血管内皮细胞的血管状网格的血管内皮细胞祖细胞。

Description

血管内皮细胞祖细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养方法，具体地，涉及一种血管内皮细胞祖细胞的培养方法。

背景技术

干细胞指的是能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。从干细胞在发育中所处的阶段来看，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)和成体干细胞(adultstemcell)。胚胎干细胞是一种多能干细胞(pluripotentstemcell)，可以无限增殖并分化成人体两百多种类型细胞、形成机体的组织和器官，即能分化成多种细胞和组织的潜能的干细胞。1981年Evans和Kaufman从小鼠内细胞团(innercellmass，ICM)分离胚胎干细胞以来，ES细胞研究成为各国科学家研究的热点，近年来围绕干细胞定向分化成其它类型细胞的研究如雨后春笋般出现(1981；Nature292(5819):154-6)。1998年Thomson成功分离、培养人类胚胎干细胞，为干细胞的人类医学应用提供了可能(1998；Science282(5391)：1145-7)。2006年日本京都大学的山中伸弥等率先报道了iPS细胞的研究(2006；Cell126(4):663-76)，他们通过向终端分化的小鼠表皮成纤维细胞中导入四种转录因子OSKM(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc),可以诱导终端分化的细胞成干细胞状态，即iPS细胞(inducedpluripotentstemcell)，此后出现了各种制造iPS细胞的技术路径。人工诱导的多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化能力、表观遗传修饰和细胞形态等其他特征，为干细胞的研究提供了新的思路。

干细胞具有多种分化潜能，可以在体外长期保存，具有自我更新和无限增殖潜力。干细胞的这些特点为科学研究和医学应用提供了很好的细胞来源。目前干细胞主要研究与应用方向主要包括：1)细胞治疗，已有报道可以将干细胞定向分化成肝细胞(公告号为CN102666853A的专利)和心肌细胞(公告号为CN103602633A和CN104293730A的专利)等其他类型的细胞，为细胞治疗提供了大量的有生理功能的细胞来源；2)再生医学领域，传统再生医学如器官移植是通过供体者器官移植到受体体内，这种移植手段会产生很多问题，如免疫排斥反应和感染等。通过体外人工诱导病人自己的干细胞定向分化成成熟的具有生理功能的器官可以有效地解决这些负面效应，为再生医学提供新方法。3)药物开发，体外诱导干细胞定向分化成特定类型细胞后加入各种药物，研究药物对特定组织或细胞的毒性，节省大量研究成本，为临床应用提供大量数据。

血管是体内负责运输血液、氧气和营养物质等的重要通道，血管出现问题，可能造成组织和器官衰竭甚至坏死而危及生命，如血管内皮细胞损伤可以诱导高血压和冠心病等血管疾病的发生。心血管疾病是威胁人类健康的常见疾病，位于我国疾病发病率的首位。同时，科学研究也需要大量血管，为药物对血管组织损伤实验提供材料。另外，体外人造组织器官需要血管运输营养物质为器官生长提供养分。此外，临床和再生医学领域也迫切需要各种血管组织细胞。鉴于上述情况，如何在体外得到大量的血管组织细胞显得极为重要。多能干细胞能够为我们提供大量的种子细胞，可以定向分化成血管内皮细胞(endothelialcell)和祖细胞(endothelialprogenitorcell)，从而能够为修复治疗提供大量细胞、为体外构建组织模型提供血管细胞来源，也能够为药物筛选和药物毒性研究提供很好的材料。

目前，多能干细胞的培养过程中使用的培养基中往往含有动物源成分，尤其是中内胚层前体细胞的培养，如使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞，MouseEmbryonicFibroblast)滋养层细胞和培养基中的动物血清。虽然上述培养基可以保证干细胞及其诱导分化的细胞具有优异的自我更新能力，但是由于培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；同时可能引入动物源性污染，如支原体污染等；另外，在细胞治疗的过程中还会诱发免疫反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种血管内皮细胞祖细胞的培养方法，该培养方法中使用的未含有动物源成分，并且该培养基能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，从而能够高效地将多能干细胞诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞，并且该血管内皮细胞祖细胞形成有高度类似于人类脐带血管内皮细胞的血管状网格。

为了实现上述目的，本发明提供了一种血管内皮细胞祖细胞的培养方法，该培养方法包括：

1)将多能干细胞于培养基A中诱导分化形成中内胚层前体细胞；

2)将中内胚层前体细胞于培养基B中诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞；

其中，培养基A含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制剂；培养基B含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂。

通过上述技术方案，本发明提供的培养方法中的培养基包括培养基A和培养基B，这两种培养基中各组分通过协同作用可以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境使得培养细胞具有优异的自我更新能力，同时该培养基中未使用动物源成分进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。在上述内容的基础上，本发明提供的方法能够有效地将人类多能干细胞诱导分化为血管内皮细胞祖细胞，进而使得血管内皮细胞祖细胞能够实现大规模的工业应用，并且该血管内皮细胞祖细胞能够形成高度类似于人类脐带血管内皮细胞的血管状网格，进而使得该血管内皮细胞祖细胞可以在细胞治疗，体外组织构建、体外移植物构建、药物筛选和血管生物学研究中的得以广泛应用。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是人类多能干细胞的形态特征图；

图2是检测例1中基于CD31+CD34+表征细胞D1的形态特征图；

图3是人类多能干细胞的细胞系图；

图4是检测例1中人类多能干细胞诱导分化后5天CD31和CD34的表达检测结果图；

图5是人类脐带血管内皮细胞系图(作为阳性对照)；

图6是检测例2中细胞D1的类血管网络生成结果。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种血管内皮细胞祖细胞的培养方法，该培养方法包括：

1)将多能干细胞于培养基A中诱导分化形成中内胚层前体细胞；

2)将中内胚层前体细胞于培养基B中诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞；

其中，培养基A含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制剂；培养基B含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂。

在上述培养基A中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了使得培养基A能够为培养细胞提供更加充足的营养物质和更加稳定的生存环境，优选地，在培养基A中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为1-100μg/ml，胰岛素的浓度为1-100μg/ml，激活素A的浓度为5-100ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为1-100ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为1-100μM，硒酸钠的浓度为1-100μg/L，碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L。更优选地，在培养基A中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为20-100μg/ml，胰岛素的浓度为5-50μg/ml，激活素A的浓度为5-50ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为1-50ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为2-40μM，硒酸钠的浓度为1-50μg/L，碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L。进一步优选地，在培养基A中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为50-100μg/ml，胰岛素的浓度为10-30μg/ml，激活素A的浓度为10-30ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为2-10ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为10-30μM，硒酸钠的浓度为2-30μg/L，碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。

在上述培养基B中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了使得培养基B能够为培养细胞提供更加充足的营养物质和更加稳定的生存环境，优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为1-100μg/ml，胰岛素的浓度为1-100μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-50μM，硒酸钠的浓度为1-100μg/L，碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L。更优选地,在培养基B中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为20-100μg/ml，胰岛素的浓度为5-50μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-20μM，硒酸钠的浓度为1-50μg/L，碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L。进一步优选地，在培养基B中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为50-100μg/ml，胰岛素的浓度为10-30μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为5-10μM，硒酸钠的浓度为2-30μg/L，碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。

同时，上述培养基A的pH与培养基B的pH均可以在在宽的范围内选择，但是为了使得培养细胞能够具有更为稳定的生存环境，优选地，培养基A的pH为7.5-8，培养基B的pH为7.5-8。

另外，糖原合成酶激酶-3抑制剂可以是本领域中任何一种常规的糖原合成酶激酶-3抑制剂，但是为了使得糖原合成酶激酶-3抑制剂能够起到更为优异的诱导调控的作用，优选地，糖原合成酶激酶-3抑制剂选自牌号为BIO或CHIR99021的抑制剂。

此外，转化生长因子β信号通路抑制剂可以是本领域中任何一种常规的转化生长因子β信号通路抑制剂，但是为了使得转化生长因子β信号通路抑制剂能够起到更为优异的诱导调控的作用，优选地，转化生长因子β信号通路抑制剂为牌号为SB431542的抑制剂。

为了使得提高中内胚层前体细胞(中胚层前体细胞和/或内胚层前体细胞)的存活率，优选地，培养基A还含有Rho蛋白激酶抑制剂。当然，Rho蛋白激酶抑制剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高中内胚层前体细胞，优选牌号为Y27632的抑制剂。另外，Rho蛋白激酶抑制剂的用量可以在宽的范围内选择，从提高细胞存活率的效果上考虑，，更优选地，在培养基A中，Rho蛋白激酶抑制剂的浓度为1-50μM，进一步优选为2-20μM。

在上述内容的基础上，培养细胞的诱导分化条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得培养细胞能够更加快速地诱导分化，优选地，在步骤1)中，诱导分化满足以下条件：培养温度为35-40℃，培养时间为1-3天；在步骤2)中，诱导分化满足以下条件：培养温度为35-40℃，培养时间为1-30天。

另外，在本发明中，为了使得多能干细胞能够更加快速地诱导分化为中内胚层前体细胞，优选地，在步骤1)之前，培养方法还包括将多能干细胞消化至单层多能干细胞，这是因为以单层存在的多能干细胞能够更大程度与培养基进行接触，进而促进诱导分化。

其中，细胞消化的方法可以是本领域中任何一种常规的方法，如酶消化法、离子螯合剂法、物理法和冷冻法，优选为酶消化法，具体为将融合度为70-80％的多能干细胞通过PBS缓冲液清洗，接着通过胰蛋白酶消化，然后将消化后的单层细胞转移至培养皿中进行诱导分化。胰蛋白酶消化的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高消化效率，优选地，消化满足以下条件：消化时间为3-6min。另外，将消化后的单层细胞转移至培养皿中的过程中，单层细胞的用量可以在宽的范围内选择，但是从诱导分化的效果上考虑，优选地，以培养皿的上表面的面积为基准，单层细胞的占据面积为0.1-0.2。

在本发明中，为了更有利于培养细胞的粘附、生长、转移和分化，优选地，在步骤1)之前，培养方法还包括将Matrigel基质胶或者玻璃粘连蛋白包被培养基。

此外，在本发明中，多能干细胞的具体种类可以在宽的范围内选择，可以是本领域中任何一种多能干细胞，但是从制得的血管内皮细胞祖细胞的应用范围来考虑，优选地，多能干细胞为人类多能干细胞。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中DMEM培养为ThermoFisherScientific公司的市售品，F12培养基为ThermoFisherScientific公司的市售品，维生素C，胰岛素为SigmaAldrich公司的市售品，血管内皮生长因子为R&DBiosystems公司的市售品，转化生长因子β信号通路抑制剂为SigmaAldrich公司牌号为SB431542的市售品，激活素A为R&DBiosystems公司的市售品，骨形成蛋白4为R&DBiosystems公司的市售品，糖原合成酶激酶-3为SigmaAldrich公司的牌号为BIO的市售品，Rho相关的蛋白激酶(ROCK抑制剂)为SigmaAldrich公司的牌号为Y27632的市售品。

制备例1

1)将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、维生素C、碳酸氢钠、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)和糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)混合制得混合物W1；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：2，维生素C的浓度为50μg/ml，胰岛素的浓度为50μg/ml，激活素A的浓度为55ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为60ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)的浓度为30μM，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)的浓度为25μM，硒酸钠的浓度为20μg/L，碳酸氢钠的浓度为500mg/L.

2)将氢氧化钠加入至上述混合物W1中以将pH调至7.8制得混合物W2；

3)将上述混合物W2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A1。

制备例2

按照制备例1的方法进行制得细胞培养基A2，所不同的是步骤1)中未使用Rho蛋白激酶抑制剂，并且Rho蛋白激酶抑制剂的浓度为10μM。

制备例3

1)将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、维生素C、碳酸氢钠、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)和糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)混合制得混合物W1；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1，维生素C的浓度为5μg/ml，胰岛素的浓度为3μg/ml，激活素A的浓度为7ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为3ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)的浓度为2μM，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)的浓度为1μM，硒酸钠的浓度为2μg/L，碳酸氢钠的浓度为400mg/L，Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)的浓度为2μM。

2)将氢氧化钠加入至上述混合物W1中以将pH调至7.8制得混合物W2；

3)将上述混合物W2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A3。

制备例4

1)将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、维生素C、碳酸氢钠、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)和糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)混合制得混合物W1；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：4，维生素C的浓度为80μg/ml，胰岛素的浓度为90μg/ml，激活素A的浓度为95ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为85ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)的浓度为45μM，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)的浓度为50μM，硒酸钠的浓度为30μg/L，碳酸氢钠的浓度为600mg/L，Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)的浓度为20μM。

2)将氢氧化钠加入至上述混合物W1中以将pH调至7.8制得混合物W2；

3)将上述混合物W2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A4。

制备例5

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W3；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：2，维生素C的浓度为50μg/ml，胰岛素的浓度为55μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为45ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为25μM，硒酸钠的浓度为20μg/L，碳酸氢钠的浓度为500mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4；

c、将上述混合物W4通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基B1。

制备例6

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W3；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1，维生素C的浓度为2μg/ml，胰岛素的浓度为4μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为3μM，硒酸钠的浓度为2μg/L，碳酸氢钠的浓度为200mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4；

c、将上述混合物W4通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基B2。

制备例7

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W3；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：4，维生素C的浓度为90μg/ml，胰岛素的浓度为95μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为100ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为45μM，硒酸钠的浓度为50μg/L，碳酸氢钠的浓度为600mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4；

c、将上述混合物W4通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基B3。

实施例1

1)将培养皿用Matrigel基质胶进行包被(当然使用玻璃连粘蛋白Vitronection亦可)2h；然后在37℃的水浴中复苏冻存的人类多能干细胞，并将该细胞接种至上述培养基中，然后加入E8多能干细胞培养液(购自LifeTechnologies公司)在37℃下进行培养，并且每天更换培养基，直至多能干细胞增殖到80％融合度(confluency)时，接着以0.5mMEDTA(PH＝8.0，渗透压(Osmolarity)＝340mOsm)进行消化传代以保持了人多能干细胞细胞团的状态。当需要单细胞传代时，应用Trypsin酶(当然TrypLEExpress酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为Y-27632的Rock抑制剂(工作浓度为10μM，提高细胞的存活率)培养24h。

2)去除培养基，以PBS缓冲溶液清洗3次，接着用Trypsin(胰蛋白酶)消化细胞5分钟至单细胞状态，以面积比1：8传至新的用Matrigel基质胶或者Vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基A2在37℃下培养1天；接着更换细胞培养基A1在37℃下培养1天制得中内胚层前体细胞。

3)在37℃下，将上述中内胚层前体细胞于细胞培养基B1中培养3天得到细胞D1，其中，每天更换培养基。

实施例2

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D2，所不同的是将细胞培养基A1换成细胞培养基A3。

实施例3

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D3，所不同的是将细胞培养基A1换成细胞培养基A4。

实施例4

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D4，所不同的是将细胞培养基B1换成细胞培养基B2。

实施例5

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D5，所不同的是将细胞培养基B1换成细胞培养基B3。

对比例1

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D6，所不同的是细胞培养基A1不含有激活素A。

对比例2

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D7，所不同的是细胞培养基A1不含有骨形成蛋白4。

对比例3

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D8，所不同的是细胞培养基A1不含有硒酸钠。

对比例4

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D9，所不同的是细胞培养基B1不含有血管内皮生长因子。

对比例5

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D10，所不同的是细胞培养基B1不含有硒酸钠。

对比例6

根据实施例1的方法进行培养得到细胞D11，所不同的是细胞培养基B1不含有转化生长因子β信号通路抑制剂。

检测例1

首先，用trypsin消化上述细胞D1至单细胞状态，用PBS缓冲溶液轻轻摇晃重新悬浮并计数。取8万单细胞悬浮的细胞，800g离心3分钟，丢弃上清液，加入100ul含有1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲溶液，轻轻摇晃重新悬浮细胞。加入各个检测抗体(CD31和CD34)，轻轻混匀。在4℃下避光孵育30分钟；接着800g离心5分钟，丢弃上清，加入100ul含有1％BSA的PBS，轻轻摇晃重新悬浮细胞，最后流式细胞仪进行检测。检测结果见图2和图4。

其中，图1是人类多能干细胞的形态特征图，图2是基于CD31+CD34+表征细胞D1的形态特征图，由图可知，细胞D1已成功诱导分化为血管内皮细胞祖细胞。

图3是人类多能干细胞的细胞系图，图4是人类多能干细胞诱导分化后5天CD31和CD34的表达检测结果图，其中，CD31的抗体和PE荧光基团(Phycoerythrin)偶联，CD34的抗体和APC蛋白荧光基团(Allophycocyanin)偶联。由于CD31和CD34可以与血管内皮细胞及其祖细胞表面上的标记蛋白进行偶联，进而使得血管内皮细胞及其祖细胞表面获得荧光或磁性，从而使得血管内皮细胞及其祖细胞能够在流式细胞仪中被鉴定、分离或者富集。通过图4和图5可知，分化后的细胞中，一部分为CD31+CD34+表达的血管内皮细胞祖细胞，另一部分为CD31+CD34-表达的血管内皮细胞。

同样地，通过检测例1的方法可知，细胞D2-D5已成功诱导分化为血管内皮细胞祖细胞，而细胞D6-D11未成功诱导分化为血管内皮细胞祖细胞，从而说明细胞培养基A和细胞培养基B能够将多能干细胞成功地诱导分化为血管内皮细胞祖细胞。

检测例2

首先，将Matrigel基质胶在4℃下孵育3小时使其成为流动状半固态，并放置于冰上。接着在细胞培养皿中铺设一层Matrigel基质胶，在37℃下待其凝固。将细胞D1铺设在凝固后的Matrigel上，加入培养基以培养4天后通过显微镜观察类血管网络生成情况。检测结果见图6。

其中，图5是人类脐带血管内皮细胞系图(作为阳性对照)，图6是细胞D1的类血管网络生成结果图，由图可知，细胞D1形成有与人类脐带血管内皮细胞相似的类似血管状的网格，进一步说明细胞培养基A和细胞培养基B能够将多能干细胞成功地诱导分化为血管内皮细胞祖细胞。

同样地，通过检测例2的方法可知，细胞D2-D5形成有与人类脐带血管内皮细胞相似的类似血管状的网格，而细胞D6-D11未形成有与人类脐带血管内皮细胞相似的类似血管状的网格，从而进一步说明细胞培养基A和细胞培养基B能够将多能干细胞成功地诱导分化为血管内皮细胞祖细胞。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种血管内皮细胞祖细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：

1)将多能干细胞于培养基A中诱导分化形成中内胚层前体细胞；

2)将所述中内胚层前体细胞于培养基B中诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞；

其中，所述培养基A含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制剂；所述培养基B含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，在所述培养基A中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为1-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为1-100μg/ml，所述激活素A的浓度为5-100ng/ml，所述骨形成蛋白4的浓度为1-100ng/ml，所述糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为1-100μM，所述硒酸钠的浓度为1-100μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L；

在所述培养基B中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为1-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为1-100μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-50μM，所述硒酸钠的浓度为1-100μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其中，在所述培养基A中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为20-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为5-50μg/ml，所述激活素A的浓度为5-50ng/ml，所述骨形成蛋白4的浓度为1-50ng/ml，所述糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为2-40μM，所述硒酸钠的浓度为1-50μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L；

在所述培养基B中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为20-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为5-50μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-20μM，所述硒酸钠的浓度为1-50μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其中，在所述培养基A中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为50-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为10-30μg/ml，所述激活素A的浓度为10-30ng/ml，所述骨形成蛋白4的浓度为2-10ng/ml，所述糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为10-30μM，所述硒酸钠的浓度为2-30μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L；

在所述培养基B中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为50-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为10-30μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为5-10μM，所述硒酸钠的浓度为2-30μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L；

优选地，所述培养基A的pH为7.5-8，所述培养基B的pH为7.5-8。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养方法，其中，所述糖原合成酶激酶-3抑制剂选自牌号为BIO或CHIR99021的抑制剂；

优选地，所述转化生长因子β信号通路抑制剂为牌号为SB431542的抑制剂。

6.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养方法，其中，所述培养基A还含有Rho蛋白激酶抑制剂，优选牌号为Y27632的抑制剂。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其中，所述Rho蛋白激酶抑制剂的浓度为1-50μM。

8.根据权利要求1-3中任意一项所述的培养方法，其中，在步骤1)之前，所述培养方法还包括将多能干细胞消化至单层多能干细胞；

优选地，将融合度为70-80％的多能干细胞通过PBS缓冲液清洗，接着通过胰蛋白酶消化，然后将消化后的单层细胞转移至培养皿中进行诱导分化。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其中，所述消化满足以下条件：消化时间为3-6min；

优选地，以所述培养皿的上表面的面积为基准，所述单层细胞的占据面积为0.1-0.2。

10.根据权利要求8所述的培养方法，其中，在步骤1)之前，所述培养方法还包括将Matrigel基质胶或者玻璃粘连蛋白包被所述培养器皿；

优选地，所述多能干细胞为人类多能干细胞。