CN103834613A - 制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法。首次揭示一种高效诱导多能干细胞分化为多能心血管前体细胞的方法，包括采用抗坏血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制剂进行诱导。本发明还提供了稳定培养多潜能心血管前体细胞的方法，包括采用BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂使之稳定生长和传代。本发明获得的多潜能心血管前体细胞，能够进一步分化为心血管谱系的一些细胞如心肌细胞、血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，可用于心脏疾病的治疗和心肌再生研究、药物心血管细胞毒性检测、心脏药物的开发。

Description

制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域；更具体地，本申请涉及诱导多能干细胞衍生多能心血管前体细胞及维持心血管前体细胞心血管分化能力的方法。

背景技术

人多能干细胞(human pluripotent stem cells(hPSCs))，包括人胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，因为其可在体外无限增殖及具有分化成心脏主要细胞类型的能力，为心血管研究、药物研发和安全性测试和基于细胞治疗的再生医学提供了一个全新的机遇。但为避免其直接移植的致瘤性，必须将这类细胞定向诱导分化成组织前体细胞和组织细胞。因此，在过去的十多年中，研究者们为了将人多能干细胞定向分化为心血管细胞，特别是分化到成熟心血管细胞类群，诸如心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞，进行了不懈的探索，并取得了一定的进展，但是在这方面仍存在诸多问题。如，诱导过程耗时长(2～4周)，在组织细胞的产出和纯度方面，不同细胞系之间存在巨大的差异；而且在分化体系中残留的未分化细胞有致瘤性潜能增加了其临床应用安全的新顾虑；更重要的是对于受损心脏的移植研究发现这种细胞疗法仅能实现瞬时弱小的功能改善。这可能是由于这些完全分化的心肌细胞的不成熟性和有限的增殖能力、以及血管形成不够完善导致的氧气和养分供给不足造成的(Lam,J.T.等(2009)，Pediatr.Cardiol.30,690-698)。

心脏发育是一个高度精密调控的过程，涉及程序性诱导中胚层、多能心血管前体细胞(或称为心血管祖细胞，cardiovascular progenitor cells(CVPCs)以及功能性心血管细胞。多能心血管前体细胞可从人多能干细胞分化而来，理论上具有在体外多次传代的潜能，并且没有致瘤性，从而为心肌再生提供了一个极具吸引力的替代途经。更重要的是，当CVPCs在体内暴露于心脏的旁分泌微环境中能够分化成具有完善横纹结构的成熟心肌细胞。用人胚胎干细胞(Yang,L.等(2008)；Nature 453,524-528)和小鼠诱导多能性干细胞(Mauritz,C.等(2011)；Eur.Heart J.32,2634-2641)分化得来的CVPCs进行移植研究发现，反映左心室射血分数的心脏功能的改善程度分别达到了31%和39-69%，远高于单纯心肌细胞注射的(5%-10%)疗效。因此，人多能干细胞分化得来的CVPCs对于心脏再生医学和心血管系统的发育生物学和干细胞生物学有着良好应用价值。

已有的文献报道从人胚胎干细胞诱导分化CVPCs需要经4～6天内程序性加入五种生长因子，通过调节多种信号转导通路，包括骨形态发生蛋白(BMP)，成纤维细胞生长因子(FGF)、激活素(Activin)/Nodal、血管内皮生长因子(VEGF)和Wnt，采用类胚体、牛血清或滋养层细胞共培养可达到10-60%的分化效率(Yang et al.，2008；Bu et al.，2009；Blin et al.，2010b；Kattman,S.J.等(2011).CellStem Cell 8,228-240)。本发明人在之前等研究中已发现，丝裂原活化蛋白激酶(MEK)-ERK1/2信号通路的激活在抗坏血酸(AA)促进iPSC衍生CVPCs/心肌前体细胞的过程中起着至关重要的作用(Cao,F.等(2008).PLoS.One.3,e3474)。

然而，简单且可重复的、无需经过细胞分选并在无滋养层细胞/无血清的条件下高效转化hPSCs成均一的CVPCs仍然充满挑战，且对于CVPCs的自我更新与分化决定的调控和分子基础仍然知之甚少，在体外稳定扩增由HPSC衍生的CVPCs，使其长期维持自我更新和定向分化为心血管细胞的潜能仍是领域内的一项重大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供诱导多能干细胞衍生多潜能心血管前体细胞及维持心血管前体细胞心血管分化能力的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备心血管前体细胞(诱导多能干细胞分化为心血管前体细胞)的方法，包括：以抗坏血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制剂诱导多能干细胞，使之分化为心血管前体细胞。

在一个优选例中，所述的抗坏血酸(AA)的工作浓度为20-100μg/ml(较佳的为30-80μg/ml；更佳的为40-60μg/ml)；所述的骨形成蛋白4(BMP4)的工作浓度为10-80ng/ml(较佳的为15-60ng/ml；更佳的为20-40ng/ml)；或所述的糖原合成酶激酶3抑制剂的工作浓度为1-6μM(较佳的为1.5-5μM；更佳的为2-4μM)。

在另一优选例中，所述的多能干细胞用含有Rho激酶抑制剂的CIM培养基培养15-30小时(较佳的20-28小时；更佳的22-26小时)；之后用不含Rho激酶抑制剂的CIM培养基继续培养40-60小时(较佳的42-55小时；更佳的44-52小时)；其中，所述的CIM培养基是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：

0.8-5%(较佳的为1-4%；更佳的为1.5-3%)v/v B27添加物，

0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)v/v L-谷氨酰胺，

0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)v/v青-链霉素，

100-800μM(较佳的为200-600μM；更佳的为300-500μM)α-硫代甘油，

20-100μg/ml(较佳的为30-80μg/ml；更佳的为40-60μg/ml)抗坏血酸(AA)，

10-80ng/ml(较佳的为15-60ng/ml；更佳的为20-40ng/ml)骨形成蛋白4，和

1-6μM(较佳地为1.5-5μM；更佳地为2-4μM)糖原合成酶激酶3抑制剂。

在另一优选例中，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂包括CHIR99021。

在另一优选例中，所述的多能干细胞包括：胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；或所述的多能干细胞是人多能干细胞。

在另一优选例中，获得心血管前体细胞之后，还包括步骤：稳定培养心血管前体细胞，包括：在心血管前体细胞的培养基中加入BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂，使之稳定生长或传代(即：维持增殖、不发生显著分化)。

在另一优选例中，所述的BMP抑制剂是dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021；且

所述dorsomorphin的工作浓度为0.5-8μM(较佳的1-6μM；更佳的1.5-4μM)；

所述的A83-01的工作浓度为0.1-2μM(较佳的0.2-1.2μM；更佳的0.3-1μM)；

所述的CHIR99021的工作浓度为0.8-8μM(较佳的1-6μM；更佳的2-4μM)。

在另一优选例中，稳定培养心血管前体细胞的培养基是CPM培养基，其是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：

0.8-5%(较佳的为1-4%；更佳的为1.5-3%)v/v B27添加物，

0.4-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)v/v N2添加物，

0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)L-谷氨酰胺，

0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)非必需氨基酸储存液，

0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)青-链霉素，

0.05-0.3mM(较佳的0.06-0.2mM；更佳的0.08-0.15mM)β-巯基乙醇

100-800μM(较佳的为200-600μM；更佳的为300-500μM)α-硫代甘油，

0.5-8μM(较佳的1-6μM；更佳地1.5-4μM)dorsomorphin，

0.1-2μM(较佳的0.2-1.2μM；更佳的0.3-1μM)A83-01，和

0.8-8μM(较佳的1-6μM；更佳的2-4μM)CHIR99021。

在本发明的另一方面，提供一种稳定培养心血管前体细胞的方法，包括：在心血管前体细胞的培养基中加入BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂，使之稳定生长或传代(即：维持增殖但不发生显著分化)。

在一个优选例中，所述的BMP信号通路抑制剂是dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021；且所述dorsomorphin的工作浓度为0.5-8μM(较佳的1-6μM；更佳的1.5-4μM)；所述的A83-01的工作浓度为0.1-2μM(较佳的0.2-1.2μM；更佳的0.3-1μM)；所述的CHIR99021的工作浓度为0.8-8μM(较佳地1-6μM；更佳的2-4μM)。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备心血管前体细胞的培养基，其是DMEM/F12培养基，且包括20-100μg/ml(较佳的为30-80μg/ml；更佳地为40-60μg/ml)抗坏血酸(AA)，10-80ng/ml(较佳的为15-60ng/ml；更佳地为20-40ng/ml)骨形成蛋白4，和1-6μM(较佳的为1.5-5μM；更佳的为2-4μM)糖原合成酶激酶3抑制剂。

在另一优选例中，所述的用于制备心血管前体细胞的培养基还包括：2%v/v量B27添加物，0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)L-谷氨酰胺，0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)青-链霉素，100-800μM(较佳的为200-600μM；更佳的为300-500μM)α-硫代甘油。

在另一优选例中，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂包括CHIR99021。

在本发明的另一方面，提供所述的用于制备心血管前体细胞的培养基的用途，用于诱导多能干细胞分化为心血管前体细胞。

在本发明的另一方面，提供一种用于稳定培养心血管前体细胞的培养基，其是DMEM/F12培养基，且包括：BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂。

在另一优选例中，所述用于稳定培养心血管前体细胞的培养基中，所述的BMP信号通路抑制剂是dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021；且所述的dorsomorphin的浓度为0.5-8μM(较佳的1-6μM；更佳的1.5-4μM)，所述的A83-01的浓度为0.1-2μM(较佳的0.2-1.2μM；更佳的0.3-1μM)A83-01，所述的CHIR99021的浓度为0.8-8μM(较佳的1-6μM；更佳的2-4μM)CHIR99021。

在另一优选例中，所述的用于稳定培养心血管前体细胞的培养基，中还包括：2%v/v量B27添加物，1%v/v量N2添加物，0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)L-谷氨酰胺，0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)非必需氨基酸储存液，0.3-3%(较佳的为0.5-2%；更佳的为0.8-1.5%)(v/v)青-链霉素，0.05-0.3mM(较佳的0.06-0.2mM；更佳的0.08-0.15mM)β-巯基乙醇，100-800μM(较佳的为200-600μM；更佳的为300-500μM)α-硫代甘油。

在本发明的另一方面，提供所述用于稳定培养心血管前体细胞的培养基的用途，用于稳定培养心血管前体细胞。

在本发明的另一方面，提供一种含心血管前体细胞的细胞群，其通过前面任一所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供所述的含心血管前体细胞的细胞群的用途，用于制备心肌细胞、血管平滑肌细胞或血管内皮细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人多能性干细胞衍生的心血管祖细胞的诱导(CVPCs)。

(A)分化方法概要。CIM，CVPC诱导培养基，Y，Y27632。

(B)在各种条件下SSEA1+细胞的百分比和3天的分化后的总细胞数，(平均值±SEM，n=3时)。NC，无细胞因子的对照；-表示撤除。CHIR，CHIR99021；AA，抗坏血酸，Cluster表示以细胞团块替代单细胞。*P<0.01，与NC相比较。＃P<0.01，与CIM相比较。

(C)免疫荧光分析显示CIM处理的细胞在分化第3天表达CVPC标记物。比例尺=25微米。

(D-E)定量PCR(D)和流式细胞术(E)分析在心血管诱导的过程中多能性标志物的表达下调和CVPC标记物的表达上调(N=3)。

(F)不同的人多能性干细胞系的CVPCs诱导效率。百分数(%)表示细胞群中携带相应表面标记的细胞的比例。

图2、H9人类胚胎干细胞系诱导衍生的均质CVPCs的特征。

(A)相差图像显示H9人类胚胎干细胞系在CVPC诱导培养基处理诱导CVPC分化过程中细胞形态。比例尺=100微米。

(B)免疫荧光分析显示细胞在CIM处理3天后表达心血管祖细胞(CVPC)的标记ISL1，但不表达内胚层标记SOX17。比例尺=25微米。

图3、CVPCs维持和扩增的条件检测。

(A)相差图像显示在10种信号抑制剂条件下p2代(passage 2，指扩增第2代)或p8代(passage 8，指扩增第8代)CVPCs形成的克隆形态。比例尺=100μm.

(B)相差图像显示在PD，SU或FGF2存在或不存在的条件下p5代CVPCs的克隆形态。PD，丝裂原活化蛋白激酶抑制剂PD0325901；SU，成纤维细胞生长因子受体抑制剂SU5402。-，表示去除；+，表示加入。比例尺=100微米。

图4、人多能性干细胞衍生的心血管祖细胞长期维持培养。

(A-C)CVPCs在各种条件下培养5天后，相差图像(A，上图)，MESP1+细胞百分比(A，下图)，总细胞数(B，N=3)，CVPC，心肌，平滑肌，和内皮细胞标记物的表达(C)。Basal，基础培养基；CPM，CVPC扩增培养基；DOR，Dorsomorphin。*P<0.01与Basal相比较;＃P<0.01与CPM相比较。

(D-E)CVPCs典型形态的图像(D，左侧图)，流式细胞术展示SSEA1和MESP1的表达(D，中间和右侧图)，和免疫组化(E)展示ISL1和MESP1在第15代CVPC克隆中的表达。

(F-G)CVPCs的生长曲线(F)，平均倍增时间(G组，n=3)。*P<0.05与P3相比较。

(H)细胞剂量反应显示CVPCs的种植数目和克隆形成数目之间的关系示意图。N=3。比例尺=100微米。

图5、CVPCs的致瘤性分析。

(A)代表图像显示小鼠左腿在注射H9胚胎干细胞后畸胎瘤形成(左图)；右腿在注射P0或P15代的H9衍生的CVPCs后畸胎瘤缺失(右图)。

(B)H9胚胎干细胞和P0或P15CVPCs的畸胎瘤形成能力的概括。

图6、CVPCs的体外分化潜能。

(A)诱导CVPC分化的条件概要

(B)P15代的CVPCs的心肌细胞，平滑肌细胞和内皮细胞的分化潜能的相差图像和免疫组化分析。比例尺=50微米。

(C)P0和P15CVPCs分别按特定的分化方案处理12天，处理之前和之后的cTnT+(心肌细胞)，α-SMA+(平滑肌)和PECAM1+(内皮细胞)的代表图(左图)和平均类群分析。n=3。*P<0.01与CVPC相比较。

(D)RT-PCR分析显示各组之间心血管衍生物的标志物的表达。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次揭示一种高效诱导多能干细胞分化为多潜能心血管前体细胞的方法，包括采用抗坏血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制剂进行诱导。本发明还提供了稳定培养多潜能心血管前体细胞的方法，包括采用BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂使之稳定生长和传代。本发明获得的多潜能心血管前体细胞，能够进一步分化为心血管谱系的一些细胞如心肌细胞、血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，可用于心脏疾病的治疗和心肌再生研究、药物心血管细胞毒性检测、心脏药物的开发。

干细胞的定向分化的难点在于：①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集；③分化的细胞的真实性。本发明人针对这三个难题，对干细胞向心血管前体细胞的分化进行了深入探索和优化，成功获得含高比例心血管前体细胞的细胞群，并通过细胞表面分子的分析确证了所获得的细胞群的真实性。

本发明中，以胚胎干细胞或诱导性多能干细胞作为初始细胞来制备心血管前体细胞。胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的培养是本领域人员已知的技术。

如本发明所用，所述的胚胎干细胞或诱导性多能干细胞是哺乳动物的胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；或是通过商业途径购买的，而并非通过破坏胚胎的方式获得的胚胎干细胞。所述的胚胎干细胞或诱导性多能干细胞例如是人或非人哺乳动物的胚胎干细胞或诱导性多能干细胞，所述的非人哺乳动物如兔、鼠、羊、猪、猴。较佳的，所述的胚胎干细胞或诱导性多能干细胞优选的是人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。

早在1998年人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞就已经建系成功，例如1998年Thomson领导的小组从14个囊胚中最终建立起5个人类ES细胞系：H1、H13、H14、H7和H19；Gearhart领导的小组从5-9周龄的流产胎儿的性腺嵴及肠系膜中分离原始的干细胞，以期避免因直接利用胚胎所造成的伦理学上的麻烦。见晁岚等，“人胚胎干细胞的研究进展”，《现代妇产科进展》，2003年7月第12卷第4期。基于上述工作，在2000年的2月份，Wisconsin Alumni ResearchFoundation(WARF)建立了WiCell，WiCell是一家非官方的、非盈利性的附属机构，它以低费用向合格的科学家分配人胚胎干细胞。此外，提供这种现成的人胚胎干细胞的机构还包括NSCB(National Stem Cell Bank)、ES CELLINTERNATIONAL、nov cell、TECHNION-HOME TO ISRAEL’S NOBELSCIENTISTS、UCSF(University of California San Fransisco)等机构。

制备心血管前体细胞的方法

本发明提供一种制备心血管前体细胞的方法，所述方法包括：以抗坏血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制剂诱导多能干细胞，使之分化为心血管前体细胞。

以往，通过4～6天内程序性加入五种生长因子来诱导心血管前体细胞，步骤复杂且诱导效率不高。本发明人在深入研究中意外地发现，抗坏血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制剂协同发挥作用，非常有效地诱导胚胎干细胞或诱导性多能干细胞定向分化为心血管前体细胞，诱导效率显著提高。

作为本发明的优选方式，所述的抗坏血酸(AA)的工作浓度为20-100μg/ml；所述的骨形成蛋白4(BMP4)的工作浓度为10-80ng/ml；所述的糖原合成酶激酶3抑制剂的工作浓度为1-6μM。较佳地，所述的抗坏血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制剂被包含在诱导培养基(CIM)中；更佳地，所述的CIM培养基是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：B27添加物，L-谷氨酰胺，青-链霉素，α-硫代甘油，抗坏血酸，骨形成蛋白4，和CHIR99021。

维持心血管前体细胞稳定的方法

本发明还提供了一种稳定培养心血管前体细胞，包括：在心血管前体细胞的培养基中加入BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂，使之稳定生长或传代(即：不发生显著分化)。较佳地，所述的BMP抑制剂是Dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021。更佳地，所述Dorsomorphin的工作浓度为0.5-8μM；所述的A83-01的工作浓度为0.1-2μM；所述的CHIR99021的工作浓度为0.8-8μM。

细胞群

本发明还包括采用前述的制备方法获得的含心血管前体细胞的细胞群。所述的细胞群中，心血管前体细胞数量占细胞整体数量的70%以上，较佳地占细胞整体数量的80%以上；更佳地占细胞整体数量的85%以上(以表面标记物SSEA1或MESP1阳性的细胞统计)。

获得了含心血管前体细胞的细胞群之后，利用RT-PCR以及其它基因表达分析技术，能够实现心血管前体细胞的鉴定。

可以采用本领域技术人员已知的方法来鉴定或分离或富集心血管前体细胞。较为经典的方法如荧光激活的细胞分选技术(FACS)或磁性细胞分选法，也即利用抗心血管前体细胞特定表面分子的抗体从总的细胞群中分离表达心血管前体细胞特定表面分子的细胞群。优选的方法例如是FACS法。各种细胞都有相应的表面分子表达方式，通过免疫荧光标记技术将细胞表面分子同标记有特异染料或荧光的一种或以上特异性抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下可产生一种或集中特异荧光色，由荧光检测器对每个细胞的体积、结构、荧光种类及性质等多种参数同时测定，从而可分析得到细胞群体的多种表面分子的表达情况，或分选出特定细胞。FACS法是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的细胞分析或分选技术，利用合适的细胞表面分子，通过FACS法来分析或分选细胞是本领域人员熟知的技术。

因此，本发明还包括经过分选技术分离出来的心血管前体细胞含量更高的细胞群。优选地，所述的细胞群是细胞表面SSEA1分子阳性、MESP1分子阳性、MEF2C分子阳性、GATA4分子阳性或ISL1分子阳性的细胞群。

培养基

本发明还提供了一种用于诱导多能干细胞分化为心血管前体细胞的培养基，所述的分化培养基是以DMEM/F12培养基为基础，加入了抗坏血酸、骨形成蛋白4和CHIR99021。所述的DMEM/F12培养基是本领域人员已知的培养基。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

作为本发明的优选方式，所述的培养基中含有20-100μg/ml，10-80ng/ml骨形成蛋白4和1-6μM CHIR99021。

作为本发明的更优选方式，所述的分化培养基还含有：按照体积0.8-5%量B27添加物，按照体积0.3-3%L-谷氨酰胺，按照体积0.3-3%青-链霉素，100-800μM α-硫代甘油。

本发明还提供了一种用于稳定培养心血管前体细胞的培养基，其是以DMEM/F12培养基为基础，且包括：0.5-8μM Dorsomorphin，0.1-2μM A83-01，和0.8-8μM CHIR99021。更佳地，其中还包括：按照体积0.8-5%(v/v)量B27添加物，按照体积0.4-3%(v/v)量N2添加物，0.3-3%L-谷氨酰胺，0.3-3%非必需氨基酸储存液，0.3-3%青-链霉素，0.05-0.3mM β-巯基乙醇，100-800μM α-硫代甘油。

本发明所述的培养基中，各组分均可以通过商购的途径获得。因此，根据本发明人提供的配方，可以方便地配制出培养基。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供了一种从人多能干细胞高效、简便获得非致瘤性、均一的心血管前体细胞的方法，并建立了在体外较长时间维持和扩增所获得的心血管前体细胞的方法。利用这些方法获得的细胞产品可用于心脏疾病的治疗和心肌再生研究、药物心血管细胞毒性检测、心脏药物的研发；产生心血管前体细胞的体系可用于研究心脏的早期发育。

(2)本发明提供的方法，具有诱导条件简单，重复性高；诱导效率高的优点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料与方法

1、人多能干细胞的培养及向心血管前体细胞的分化

1.1材料和试剂

(1)本发明中涉及的多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。使用的人胚胎干细胞(hES，或称为hESC(s))系H1和H9由美国威斯康星大学麦迪逊分校WiCell研究所提供。人诱导性多能干细胞(hiPSC(s)系hAFDC-iPS-36获自中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所(参见Li,C.等，Hum.Mol.Genet.18,4340-4349)。

(2)人心血管前体细胞诱导培养液(CIM培养基)：DMEM/F12溶液加入2%(v/v)1×B27添加物(不包含维生素A，Sigma)，1%(v/v)L-谷氨酰胺储存液(Gibco)，1%(v/v)青-链霉素储存液(Gibco)，400μM α-硫代甘油(Sigma)，50μg/ml抗坏血酸(AA)(Sigma)，25ng/ml骨形成蛋白4(BMP4，R&D)，和3μM糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂CHIR99021(Stemgent)，用0.22μm滤器抽滤后备用。其中，抗坏血酸(AA)＋骨形成蛋白4(BMP4)＋CHIR99021三种成分构成了CIM，含有它们的培养基称为CIM培养基。

1.2人多能干细胞的培养及扩增

复苏冻存的未分化人多能干细胞，接种到铺有人工细胞外基质Matrigel(BD Bioscience)的6孔培养皿中(Corning)，加入商品化人多能干细胞培养液mTeSR1(购自Stem Cell Technologies)，每天换液，5-6天长满后传代。传代前1-2小时更换新鲜培养液。

1.3诱导人多能干细胞向心血管前体细胞分化

(1)PBS清洗长满的人多能干细胞后用Accutase(Stem Cell Technologies)溶液消化5分钟，吸取细胞悬液离心后用加入了5μM Rho激酶抑制剂Y27632(Calbiochem)的CIM培养基重悬细胞后，按50000细胞/cm²的密度接种至铺有人工细胞外基质Matrigel的培养板中，放入培养箱中培养24小时。

(2)24小时后将培养液换为新鲜的不含Y27632的CIM培养基，继续培养48小时。

2.人心血管前体细胞的稳定培养和分化

2.1材料和试剂

(1)人心血管前体细胞扩增培养液(CPM培养基)：DMEM/F12溶液加入2%v/v 1×B27添加物(不包含维生素A)，1%v/v 1×N2添加物(Sigma)，1%v/vL-谷氨酰胺储存液，1%v/v非必需氨基酸储存液(Sigma)，1%v/v青-链霉素储存液，0.1mM β-巯基乙醇储存液，400μM α-硫代甘油，2μM BMP抑制剂dorsomorphin，0.5μM Activin/Nodal抑制剂A83-01和3μM糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR99021，用0.22μm滤器抽滤后备用。

(2)心肌细胞诱导液1：DMEM/F12溶液加入1×B27添加物(不包含维生素A)，1%L-谷氨酰胺储存液，1%青-链霉素储存液，400μM α-硫代甘油，50μg/ml抗坏血酸，4mg/ml聚乙烯醇(Sigma)，10ng/ml BMP4和10ng/ml成纤维生长因子2(FGF2)，用0.22μm滤器抽滤后备用。

(3)心肌细胞诱导液2：DMEM/F12溶液加入1×B27添加物(不包含维生素A)，1%L-谷氨酰胺储存液，1%青-链霉素储存液，400μM α-硫代甘油，50μg/ml抗坏血酸，5μM Wnt通路抑制剂IWR-1(Calbiochem)，用0.22μm滤器抽滤后备用。

(4)血管平滑肌细胞诱导液：DMEM／F12溶液加入1×B27添加物(不包含维生素A)，1％L-谷氨酰胺储存液，1％青-链霉素储存液，400μM α-硫代甘油，50μg／ml抗坏血酸，10ng／ml PDGF-BB(R&D)和2ng/ml TGFβ1(R&D)，用0.22μm滤器抽滤后备用。

(5)血管内皮细胞诱导液：DMEM／F12溶液加入1×B27添加物(不包含维生素A)，l％L-谷氨酰胺储存液，1％青-链霉素储存液，400μMα-硫代甘油，50μg/ml抗坏血酸，50ng/ml VEGF(R&D)(含10ng/ml FGF2)，用0.22μm滤器抽滤后备用。

2.2人心血管前体细胞的培养及扩增

PBS清洗由CIM培养基诱导得到的人心血管前体细胞后用Accutase溶液消化5分钟，吸取细胞悬液离心后用CPM培养基重悬细胞后，以1∶3比例接种至铺有人工细胞外基质Matrigel的培养板中，放入培养箱中培养24小时。每天换液，3-4天长满后传代，传代前1-2小时更换新鲜培养液。传前5代时加入5μM Rho激酶抑制剂Y27632以提高细胞存活率，5代之后则不需要继续添加。

用于体外维持心血管前体细胞的信号通路抑制剂，其购买途径，针对的靶信号通路以及工作浓度列于表3。

表3

2.3诱导人人心血管前体细胞向心肌细胞分化

(1)PBS清洗由长满的人心血管前体细胞后用Accutase溶液消化5分钟，吸取细胞悬液离心后用心肌细胞诱导液1重悬细胞后，按10000细胞/孔的密度接种至96孔圆底低吸附培养板(Corning)中，3000rpm离心5分钟后，放入培养箱中培养72小时。

(2)72小时后，将悬浮培养的细胞团块接种到铺有人工细胞外基质Matrigel的培养皿上，将培养液换为心肌细胞诱导液2，放入培养箱中继续培养9天，每2-3天换液。

2.4诱导人人心血管前体细胞向血管平滑肌细胞或血管内皮细胞分化

PBS清洗由长满的人心血管前体细胞后用Accutase溶液消化5分钟，吸取细胞悬液离心后用血管平滑肌细胞诱导液或血管内皮细胞诱导液重悬后，按10000细胞/cm²的密度接种至铺有人工细胞外基质Matrigel的培养板中，放入培养箱中培养12天，每2-3天换液。

3.各标志基因表达的检测

3.1RNA分离和RT-PCR实验用溶液及配制

(1)焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate，DEPC)水的配制：将1ml DEPC加入1升Milli-Q超纯水中，搅拌过夜；高温灭菌15分钟失活DEPC后储存备用。

(2)RNA裂解液：23.6g异硫氰酸胍(guanidinium thiocyanate，GTC)，1.25ml柠檬酸钠(Na-citrate，1mol/L，pH 7.0)，0.5g sarcosyl，加DEPC水到49.5ml后混匀。此溶液应一个月内用完，使用前加入1%的β-巯基乙醇。

(3)3mol/L的醋酸钠，pH 4.0：从上海生工生物有限公司购买。

(4)氯化铯溶液(5.7mol/L)：95.86g氯化铯，0.4ml的0.5mol/L EDTA储存液，0.83ml 3mol/L醋酸钠储存液，加超纯水到100ml，pH值为5.4；称重后高温灭菌，再用灭菌的DEPC水加至灭菌前同等重量。

(5)TE溶液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 7.5，0.22μm滤器过滤备用。

(6)Oligo d(T)(上海生工)：50μmol/L in 10mmol/L Tris-HCl。

(7)Taq DNA合成酶和10×PCR溶液：从上海博亚生物公司购买。

(8)Real time PCR Master Mix试剂盒，从东洋纺公司购买。

(9)10mmol/L dNTP混合液：从上海生工生物有限公司购买。

(10)各PCR引物：将合成的引物多核苷酸用DEPC水配成10mmol/L浓度，-20℃保存。

(11)6×样品溶液：0.25%溴酚兰，30%甘油加水配制。分子量marker：100bp DNA Ladder从上海生工生物有限公司购买。

3.2Total RNA分离提取

(1)样品的准备：在不同的分化阶段，去除细胞培养液后用冷PBS清洗2遍，加入GTC裂解细胞，用移液管上下吹打至细胞完全裂解。收集裂解的细胞液，-70℃保存。

(2)各时间点样品收集后，从-70℃取出复温，加入新GTC裂解液。然后在每个超速离心管的底层先铺上2ml氯化铯，再将各样品细胞裂解液铺在其上，注意不要破坏两液面间的界线。

(3)加入GTC至10ml超速离心管管口1cm处，用天平两两平衡后，放入超速离心机，4℃，30,000rpm离心16～18小时。

(4)离心后，吸弃上层GTC液(注意不要破坏两液面的分界)，然后小心倒弃氯化铯，将超速离心管倒置放在锡箔纸上，倒置20分钟。

(5)用400μl DEPC水清洗超速离心管底，上下至少吹打50次让DEPC水溶解RNA，锡箔纸覆盖管口，静置1小时。

(6)吸取溶有RNA的400μl DEPC水放入新的无RNA酶和DNA酶的Eppendorf管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠混匀后，加入-20℃预冷的纯乙醇至1.5ml左右。

(7)振荡混匀后放入-70℃沉淀30分钟到4个小时，然后-20℃14,000rpm离心20分钟，即可看到管底有RNA析出。

(8)用20～30μl DEPC水溶解RNA，上下吹打40次以上。用TE溶液稀释，分光光度计(Eppendorf)测各样品RNA浓度，-70℃保存，并取RNA电泳检测其质量。

3.3RT-PCR

(1)标记PCR管，加入1μl Oligo d(T)(500μg/ml)，在分别加入样品0.5μg的总RNA，用DEPC水加至10.5μl，70℃处理10分钟后快速冷却；在加入7μlCocktail(4μl 5×第一链缓冲液，2μl 0.1mol/L DTT和1μl 10mmol/L dNTPMix，42℃，2分钟；再加入2μl SuperScript II(40单位)，混匀后42℃处理50分钟，经过70℃处理10分钟后，-20℃保存cDNA。

(2)先制备14个样品用Cocktail：6μl正向引物，6μl反向引物，30μl 10×PCR缓冲液，6μl dNTP，3μl Taq DNA合成酶，243μl H₂O；PCR管做好标记后分别加入19.6μl Cocktail，再加入0.4μl各cDNA样品。

(3)放入PCR扩增仪(Eppendorf)上进行扩增，扩增步骤简述如下：先95℃处理5分钟后，进入扩增循环(95℃60s，最佳退火温度处理45s，72℃延长合成45s)，各引物的序列和最佳退火温度见表1。

(4)PCR反应终止后，加入4μl上样缓冲液，电泳检测。

表1、RT-PCR引物

AT，退火温度；PS，产物大小；F，正向；R，反向。

3.4定量real-time RT-PCR(参照TOYOBO real time Master Mix使用说明书)

(1)反应体系20μl，其中0.4μl正向引物，0.4μl反向引物，10μl SYBRGreen Realtime PCR Master Mix，7.2μl H₂O，2μl cDNA样品。各引物的序列见表2。

(2)放入ABI PRISM 7900real time PCR扩增仪，扩增步骤简述如下：95℃60s，进入扩增循环(95℃15s，60℃15s，72℃45s)共40个循环。反应完成后，用SDS2.0软件分析实验数据。

表2、实时定量PCR(qPCR)引物

AT，退火温度；PS，产物大小；F，正向；R，反向。

4.流式细胞仪检测各标志基因的表达

4.1材料和试剂

多聚甲醛固定液：4%溶解于PBS中；细胞破膜液：用PBS配制1%的Triton-X 100的细胞破膜液；PBS溶液：2.901g NaH₂PO₄·7H₂O，0.296gNaH₂PO₄·7H₂O，8.5g NaCl，用超纯水配至1000ml，pH值为7.4。

4.2实验步骤

(1)用胰酶细胞消化液将待检测细胞消化至单细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。

(2)取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入49μl含2%胎牛血清的PBS轻轻重悬细胞。

(3)加入各检测抗体，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育30分钟。可以使用铝箔进行避光。

(4)1000g离心5分钟，弃上清，加入含2%胎牛血清的PBS轻轻重悬细胞。

(5)随即进行流式细胞仪检测。

5.免疫荧光染色

5.1材料和试剂

(1)Hoechst 33342：Sigma；

(2)多聚甲醛固定液：4%溶解于PBS中；

(3)封闭液：用PBS配制10%山羊血清的封闭液；

(4)细胞破膜液：用PBS配制0.1%-0.3%的Triton-X 100的细胞破膜液；

(5)0.1mol/L PBS溶液：2.901g Na₂HPO₄·7H₂O，0.296g NaH₂PO₄·7H₂O，8.5g NaCl，用超纯水配至1000ml，pH值为7.4。

5.2实验步骤

(1)将待检测细胞用0.1mol/L PBS清洗3遍，然后用多聚甲醛固定液固定10分钟；

(2)PBS清洗3遍，用0.1%-0.3%的Triton-X 100处理细胞10分钟；

(3)PBS清洗3遍，用封闭液(10%山羊血清或1%-3%牛血清白蛋白)封闭1小时后，加一抗4℃孵育过夜；

(4)PBS清洗3遍，加二抗，室温孵育1小时；

(5)PBS清洗3遍，Hoechst 33342或PI室温孵育15分钟；PBS清洗后即可用激光共聚焦显微镜(Leica SP2)或荧光显微镜观察并摄像。

6.畸胎瘤形成实验

(1)去除待检测细胞培养液后用PBS清洗，加入0.5ml胰蛋白酶-EDTA消化2-3分钟，用2ml培养液终止消化。离心后重悬细胞，吹成单个细胞悬液。

(2)将0.5×10⁵H9hES细胞(4例)和0.5-10×10⁶个P0或P15心血管前体细胞(各18例)注射至免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)大腿肌肉中。

(3)30-90天后，观察其大腿处畸胎瘤的形成。

7.数据分析

所有统计数据显示为mean±S.E.M。数据采用单因素方差分析，如果多组之间的比较则采用Fisher’s protected least significant difference test分析(Sigmaplot，Sigma，USA)。P<0.05则认为具有显著性差异。

实施例1、高效转化人多能干细胞(hPSCs)为均一同质的CVPCs

为了将hPSCs诱导向心血管的命运，本发明人筛选了中胚层形成和随后的心肌分化过程中重要的信号转导通路，包括Wnt，GSK3，FGF，BMP和Activin/Nodal。为了使条件均一化，本发明人在单层培养系统的基础上使用基于单细胞的分化方法，并在第一天分化中添加Rho激酶抑制剂Y27632，以提高细胞的存活。经过一系列系统的尝试，本发明人发现，联合加入25ng/mlBMP4，50μg/ml AA和3μM GSK3抑制剂CHIR99021(CHIR)(这些联合试剂的混合物命名为CIM)，可以在3天内高效地将未分化的人胚胎干细胞系H9转换成均一同质的细胞类群，这个细胞类群大部分(88.9±1.8%)表达最近确定的人CVPCs表面标记SSEA1(Leschik,J.等(2008).Nat.Protoc.3,1381-1387；Blin,G.等(2010b)J.Clin.Invest 120,1125-1139)(图1A和1B)。撤除任意一种CIM成分或用细胞团分化都会导致SSEA1的表达和CVPCs细胞产率(图1B)大大降低。

分化的细胞在整个分化过程中表现出均匀的上皮细胞形态(图2A)。免疫组化分析显示，这些细胞在分化第3天普遍表达CVPC关键标记MESP1，该基因是脊椎动物中细胞进入心血管命运的标志(Bondue,A.and Blanpain,C.(2010).；Circ.Res.107,1414-1427)，并表达其它CVPC的标志物，包括MEF2C，GATA4，ISL1(图1C)，而不表达内胚层标记SOX17(图2B)。定量RT-PCR(qPCR)和荧光激活细胞分选(FACS)分析还表明，CIM处理使多能性标志物OCT4(图1D)和SSEA4(图1E)急剧下降，以及内胚层标志物SOX17和神经外胚层标记物PAX6短暂微量的表达，但明显激活早期中胚层基因T，以及CVPC特定转录因子MESP2，PDGFRA，NKX2-5，和ISL1(图1D)，并且大部分细胞逐步在分化第3天诱导表达CVPC的标记蛋白SSEA1和MESP1(图1E)。在不同的HPSC细胞系，包括人类胚胎干细胞系H1和H9和人诱导多能性干细胞系(图1F)中都能观察到类似的诱导效率。

综上所述，本发明人开发出一种可以快速、高效的使hPSCs转换为均一同质的CVPCs简单分化系统。

实施例2、长期维持hPSC衍生CVPCs的自我更新

CVPCs的增殖和谱系决定受精细的微环境和层次复杂的多个信号转导通路的调控，其中包括Wnt，FGF，BMP，Notch，Hedgehog，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，MEK，维甲酸(RA)，以及Activin/Nodal。因此在体外的特定条件下，一般很难维持CVPCs的自我更新和扩增。本发明人假设，如果诱导CVPC分化的条件被协同消除，则其应可以保持基态的自我更新和持续增殖。为了验证它，本发明人选择了9种信号通路抑制剂连同GSK3抑制剂CHIR(CHIR99021)(表3)，验证其刺激CVPC扩增的作用。H9派生的CVPCs在分化第3天无论被种在基础培养基和含有单一抑制剂的培养基中，均未观察到克隆形成。在这些条件下的细胞会迅速分化和失去增殖的能力。与此相反，通过使用10种信号通路抑制剂，CVPCs形成圆形的克隆，扩增7-8代。但在这种条件下细胞凋亡相对比较高，晚期传代时细胞逐渐退化(图3A，右图)。

为确定10种抑制剂在维持CVPC自我更新的作用，本发明人连续地从库(表3)中删除单个组分。缺乏Notch，Hedgehog，VEGF，PDGF和RA抑制剂的库，并不影响CVPC克隆的形成和增殖。进一步除去FGF和其下游靶MEK的抑制剂，CVPC克隆的未分化的形态没有改变(图3B)。有趣的是，加入FGF2(FGF/MEK信号通路的配体)，没有进一步促进CVPC增殖但是却迅速诱导其分化(图3B)，说明FGF信号在CVPC增殖和特化过程中有着复杂的调节作用。在含有GSK3抑制剂CHIR99021，BMP的抑制剂Dorsomorphin(DOR)，以及Activin/Nodal抑制剂A83-01的培养基中，CVPCs可以稳定地自我更新并保持CVPC标记物MESP1的高水平表达(图4A)，本发明人将这些联合试剂的混合物命名为CPM。然而，无论是从CPM中去除任何一种抑制剂都会导致CVPCs明显的分化和MESP1表达的显著降低(图4A)，并且CVPC的扩增被显著抑制(图4B)。RT-PCR分析还显示，当CPM中任意一种组分被去除后，伴随着未分化的CVPC的标记SSEA1和MESP2的表达下降，心血管谱系转录产物KDR，心脏标志物TBX5、NKX2-5和TNNT2、平滑肌标记ACTA2和MYH11，以及内皮细胞的特定基因PECAM1和CDH5均被诱导表达(图4C)。这些数据进一步证实了GSK3，BMP和Activin/Nodal的抑制对于CVPC的维持起着至关重要的作用，并且是最基本限度的需求。

从H1和H9胚胎干细胞的和人iPS细胞衍生的CVPCs在CPM中可稳定传至15代以上，同时保持均一同质的祖细胞的表型并且均表示原始CVPC的标记，包括SSEA1，MESP1和ISL1(图4D和4E)。细胞培养常规按1:3的比例，并在传了15代后扩增了大于10⁷倍(图4F)。在早期(3代)和晚期的代数(15代)的H1和H9-衍生CVPCs的倍增时间并没有显著不同的，而hiPSC派生的一株在晚代数时略微有点长(图4G)。

最后，为了确定CPM中出现的CVPC克隆是否是克隆，本发明人进行了细胞剂量反应实验，发现集落发展的数目细胞的起始数目密切相关(图4H)，支持CVPC克隆的起源从单个细胞，而不是细胞聚集体的概念。

实施例3、CVPCs的致瘤性测试

hPSCs移植后形成畸胎瘤的倾向仍然是细胞治疗所要面对的主要的安全问题。为了确定本发明制备的CVPCs在诱导初期和长期扩增后是否保留致瘤性的潜力，本发明人采用肌肉注射的方式将P0和P15代的H9-的衍生CVPCs(0.5-10×10⁶个细胞)，和它们的亲本H9胚胎干细胞(0.5×10⁶个细胞)移植到的免疫抑制的小鼠。4周后，所有注射H9的胚胎干细胞的4只小鼠形成了畸胎瘤(图5A左侧图)，而没有任何一只注射了CVPCs的小鼠(P0和P15的CVPCs，共18只)注射部位表现出肿瘤形成的迹象(图5A右侧图，5B)。

因此，和胚胎干细胞相比，无论是新鲜分离的还是长期扩增后CVPCs致瘤性都要低。

实施例4、CVPCs在体外具有多种心血管谱系分化的潜能

接下来，本发明人通过检测CVPCs产生三个主要的心血管谱系的能力来测试CVPCs是否保持了多种心血管分化的潜能。如果没有说明，代表数据均源自P15代的H9-的衍生CVPCs。为了诱导心脏特化，CVPCs在无血清培养基中被离心聚集成团块(Ng，E.S.等(2008)；Nat.Protoc.3,768-776；Burridge,P.W.等(2011)；PLoS.One.6,e18293)，并用BMP4和FGF2的联合刺激3天，然后与Wnt信号的拮抗剂IWR-1处理(图6A)。使用这种方法，CVPC团块能够高效和可重复地以均匀的尺寸生成(图6B中，左上图)，在分化第7天开始跳动(未分化的胚胎干细胞被定义为第0天)，在第11天全部跳动(图6B中，左上图)。免疫染色分析心肌myofilamental蛋白α-Actinin和cTnT显示在15天CVPC衍生的心肌细胞显示了横纹形成(图6B，左下图)，这表明这些细胞已具有肌节结构。根据之前的文献(Yang,L.等(2008).Nature 453,524-528；Blin,G.等(2010b).J.Clin.Invest 120,1125-1139)，为了使CVPCs分别向平滑肌和内皮细胞的分化，本发明人分别用PDGF-BB和TGFβ1、VEGF加上FGF2联合处理(图6A，中，下图)。分化的细胞表现出平滑肌或内皮细胞的形态，并表达平滑肌细胞的标志物(α-SMA和SM-MHC，图6B中，右上图)以及内皮细胞标志物(PECAM1，CDH5和CD34，图6B中，右下图)，说明CVPCs分别走向了平滑肌和内皮细胞命运。

为了评估CVPCs分化成不同的细胞类型的效率，诱导未分化CVPCs(P0和P15)在不同谱系分化的条件下分化，用流式细胞仪分析具体的谱系标志。在分化第15天，约15-20%的细胞表达心肌细胞标记物cTnT在(图6C中，左侧图)，而约90%的细胞为α-SMA阳性的平滑肌细胞或PECAM1阳性的内皮细胞(图6C，中间和右侧图)。这些标志物很少在CVPCs中观察到，而且P0和P15的CVPCs的分化效率没有显著差异(图6C)。这些结果进一步支持RT-PCR分析结果(图6D)，并说明即使经过长期体外扩增，CVPCs依然保持了向心血管谱系体外分化的能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种制备心血管前体细胞的方法，包括：以抗坏血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制剂诱导多能干细胞，使之分化为心血管前体细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗坏血酸的工作浓度为20-100μg/ml；

所述的骨形成蛋白4的工作浓度为10-80ng/ml；或

所述的糖原合成酶激酶3抑制剂的工作浓度为1-6μM。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多能干细胞用含有Rho激酶抑制剂的CIM培养基培养15-30小时；之后用不含Rho激酶抑制剂的CIM培养基继续培养40-60小时；

其中，所述的CIM培养基是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：

0.8-5%v/v B27添加物，

0.3-3%v/v L-谷氨酰胺，

0.3-3%v/v青-链霉素，

100-800μM α-硫代甘油，

20-100μg/ml抗坏血酸，

10-80ng/ml骨形成蛋白4，和

1-6μM糖原合成酶激酶3抑制剂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂包括CHIR99021。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多能干细胞包括：胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；或

所述的多能干细胞是人多能干细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，获得心血管前体细胞之后，还包括步骤：稳定培养心血管前体细胞，包括：在心血管前体细胞的培养基中加入BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂，使之稳定生长或传代。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的BMP抑制剂是dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021；且

所述dorsomorphin的工作浓度为0.5-8μM；

所述的A83-01的工作浓度为0.1-2μM；

所述的CHIR99021的工作浓度为0.8-8μM。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，稳定培养心血管前体细胞的培养基是CPM培养基，其是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：

0.8-5%v/v B27添加物，

0.4-3%v/v N2添加物，

0.3-3%v/v L-谷氨酰胺，

0.3-3%v/v非必需氨基酸储存液，

0.3-3%v/v青-链霉素，

0.05-0.3mM β-巯基乙醇

100-800μM α-硫代甘油，

0.5-8μM dorsomorphin，

0.1-2μM A83-01，和

0.8-8μM CHIR99021。

9.一种稳定培养心血管前体细胞的方法，包括：在心血管前体细胞的培养基中加入BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂，使之稳定生长或传代。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的BMP信号通路抑制剂是dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021；且

所述dorsomorphin的工作浓度为0.5-8μM；

所述的A83-01的工作浓度为0.1-2μM；

所述的CHIR99021的工作浓度为0.8-8μM。

11.一种用于制备心血管前体细胞的培养基，其特征在于，其是DMEM/F12培养基，且包括：

20-100μg/ml抗坏血酸，

10-80ng/ml骨形成蛋白4，和

1-6μM糖原合成酶激酶3抑制剂。

12.如权利要求11所述的用于制备心血管前体细胞的培养基，其特征在于，还包括：

2%v/v B27添加物，

0.3-3%v/v L-谷氨酰胺，

0.3-3%v/v青-链霉素，

100-800μM α-硫代甘油。

13.如权利要求11所述的用于制备心血管前体细胞的培养基，其特征在于，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂包括CHIR99021。

14.权利要求11-13任一所述的培养基的用途，用于诱导多能干细胞分化为心血管前体细胞。

15.一种用于稳定培养心血管前体细胞的培养基，其特征在于，其是DMEM/F12培养基，且包括：

BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂。

16.如权利要求15所述的培养基，其特征在于，所述的BMP信号通路抑制剂是dorsomorphin，所述的Activin/Nodal抑制剂是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021；且

所述的dorsomorphin的浓度为0.5-8μM，

所述的A83-01的浓度为0.1-2μM A83-01，

所述的CHIR99021的浓度为0.8-8μM CHIR99021。

17.如权利要求15或16所述的用于稳定培养心血管前体细胞的培养基，其特征在于，还包括：

2%v/v B27添加物，

1%v/v N2添加物，

0.3-3%v/v L-谷氨酰胺，

0.3-3%v/v非必需氨基酸储存液，

0.3-3%v/v青-链霉素，

0.05-0.3mM β-巯基乙醇，

100-800μM α-硫代甘油。

18.权利要求15-17任一所述的培养基的用途，用于稳定培养心血管前体细胞。

19.一种含心血管前体细胞的细胞群，其通过权利要求1-10任一所述的方法制备获得。

20.权利要求19所述的含心血管前体细胞的细胞群的用途，用于制备心肌细胞、血管平滑肌细胞或血管内皮细胞。

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