CN103184186A - 一种制备胰岛素分泌细胞的方法及其专用培养基组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞的培养基组合物，由培养基A、B和C组成；培养基A的溶质及其浓度如下：4.75-5.25ml/L胎牛血清和4.75-5.25ng/mL activin A；培养基B的溶质及其浓度如下：0.95×10-5-1.05×10-5mol/L维甲酸、19-21ng/ml EGF、19-21ng/ml bFGF、1.9-2.1mmol/L谷氨酰胺、0.95-1.05％非必需氨基酸和1.9-2.1％B27；培养基C的溶质及其浓度如下：4.5-5.5ml/L胎牛血清、19-21ng/ml exendin-4、9.5-10.5ng/ml activin A、9.5-10.5mmol/L尼克酰胺、1.9-2.1％B27和0.95-1.05％N2。本发明的诱导培养方法，适合于各种组织来源的间充质干细胞，该诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备胰岛素分泌细胞的方法及其专用培养基组合物。
背景技术
″糖尿病″是一种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病。国外给它的别名叫″沉默的杀手″(Silent Killer)，特别是″成人型糖尿病″，四十岁以上的中年人染患率特别高，在日本，四十岁以上的人口中占10％，即十人当中就有一位″糖尿病″患者。一旦患上″糖尿病″，将减少寿命十年之多，且可能发生的并发症遍及全身。
多年来，医学界一直致力于对糖尿病的研究。这是因为一旦患上“糖尿病”，人体的麻烦随其而至，因为免疫功能减弱，容易感染由感冒、肺炎、肺结核所引起的各种感染疾病，而且不易治愈。并且选择性地破坏细胞，吞噬细胞。抗癌细胞的防御机能会大大减弱，至使癌细胞活跃、聚集。难怪有这样的说法，一旦得了“糖尿病”，寿命减去十多年。因此许多人对糖尿病谈之而色变，千方百计的治疗。
糖尿病(Diabetes)分1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型的糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占的比例约为95％。
胰岛素是人体胰腺B细胞分泌的身体内唯一的降血糖激素。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗，糖尿病患者早期使用胰岛素和超强抗氧化剂如(注射用硫辛酸、口服虾青素等)有望出现较长时间的蜜月期，胰岛素注射不会有成瘾和依赖性。
干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植的理想细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞，如胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。但在实际应用上却面临伦理的挑战或取材的限制。间充质干细胞(MSC)是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，因其在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，且具有免疫源性低，移植后能形成稳定嵌合等特点，故可作为一种理想的供异基因移植的细胞。因为MSC亚全能干细胞可获得向内胚层组织分化的潜在能力，容易取材，来源更为丰富且不受伦理限制及没有成瘤危险，所以使用间充质干细胞体外诱导获得胰岛素分泌细胞在临床上具有更高的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备胰岛素分泌细胞的方法及其专用培养基组合物。
本发明提供了一种将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞的培养基组合物(培养基组合物甲)，由培养基A、培养基B和培养基C组成；
所述培养基A由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基A中的浓度如下：4.75ml/L-5.25ml/L胎牛血清和4.75ng/mL-5.25ng/mL activin A；
所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基B中的浓度如下：0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸、19ng/ml-21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、1.9mmol/L-2.1mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为0.95％-1.05％的非必需氨基酸和体积浓度为1.9％-2.1％的B27；
所述培养基C由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基C中的浓度如下：4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml-21ng/ml exendin-4、9.5ng/ml-10.5ng/ml activin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酰胺、体积浓度为1.9％-2.1％的B27和体积浓度为0.95％-1.05％的N2。
所述动物细胞基础培养基为高糖DMEM培养基或DMEM/F12培养基。
所述培养基A由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下：5ml/L胎牛血清和5ng/mL activin A。
所述培养基B由DMEM/F12培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基B中的浓度如下：10-5mol/L维甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为1％的非必需氨基酸和体积浓度为2％的B27。
所述培养基C由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基C中的浓度如下：5ml/L胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、10mmol/L尼克酰胺、体积浓度为2％的B27和体积浓度为1％的N2。
所述B27为购自GIBCO公司，产品目录号为17504-044的产品。所述N2为购自GIBCO公司，产品目录号为17502-048的产品。所述非必需氨基酸为GIBCO公司，产品目录号为11140的产品。
维甲酸购自Sigma公司，产品目录号为R2625。人活化素A(Activin A)：英国Pepro Tech公司，产品目录号为120-14。EGF(epidermal growth factor，表皮细胞生长因子)：Pepro Tech公司，产品目录号为100-15。bFGF(basic fibroblast growthfactor，碱性成纤维细胞生长因子)：Sigma公司，产品目录号为F0291。exendin-4：Sigma公司，产品目录号为E7144。
本发明还提供了一种将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞方法，是将间充质干细胞依次用所述培养基A、所述培养基B和所述培养基C进行培养，得到胰岛素分泌细胞。
所述方法可包括如下步骤：
(1)将间充质干细胞接种于所述培养基A中，培养4-6天(具体可为5天)；
(2)将完成步骤(1)的细胞转接于所述培养基B中，培养6-8天；
(3)将完成步骤(2)的细胞转接于所述培养基C中，培养7-10天(具体可为8天)，得到胰岛素分泌细胞。
所述步骤(1)中，所述间充质干细胞在所述培养基A中的初始浓度可为2×105个/ml-1×106个/ml(具体可为5×105个/ml)。
所述方法中，整个培养过程的培养条件可为：在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养。
所述培养基组合物甲在将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种将限定性内胚层细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞的培养基，为以上任一所述培养基B。所述培养基在将限定性内胚层细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞的培养基组合物(培养基组合物乙)，由以上任一所述培养基A和以上任一所述培养基B组成。所述培养基组合物乙在将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种将限定性内胚层细胞诱导为胰岛素分泌细胞的培养基组合物(培养基组合物丙)，由以上任一所述培养基B和以上任一所述培养基C组成。所述培养基组合物丙在将限定性内胚层细胞诱导为胰岛素分泌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
以上任一所述的间充质干细胞具体可为脐带来源的间充质干细胞。
以上任一所述的间充质干细胞具体可为人间充质干细胞。
以上任一所述的间充质干细胞具体可为第3代间充质干细胞。
所述间充质干细胞为细胞因子CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Flk-1和HLA-ABC均为阳性，细胞因子CD34、CD106、CD117和HLA-DR均为阴性的细胞。
所述限定性内胚层细胞为Foxa2和Sox17表达量高于所述间充质干细胞的细胞。
所述胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞为Pdx1、Ngn3和Pax4表达量高于所述间充质干细胞的细胞。
所述胰岛素分泌细胞为Insulin、C-peptide和Glut-2表达量高于所述间充质干细胞的细胞。
间充质干细胞经过三步诱导法可在体外一次获得限定性内胚层细胞，胰腺干/祖细胞及胰岛素分泌细胞，各阶段细胞可表达相应的特异性基因，并且最后获得的胰岛素分泌细胞具有胰岛素分泌功能及对葡萄糖的反应性。
本发明的诱导培养方法，适合于各种组织来源的间充质干细胞，该诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率高。首先培养得到的限定性内胚层细胞表达限定性内胚层标志Foxa2，Sox17，获得效率能够达到90％以上；随后培养得到的胰腺干/祖细胞表达胰腺干/祖细胞标志Pdx1，Ngn3，Pax4，获得效率能够达到70％以上；最后培养得到的胰岛素分泌细胞(表达B细胞标志胰岛素，C-肽)，获得效率能够达到95％以上，并且获得的细胞在体外具有胰岛素分泌功能及对葡萄糖的应答功能。本发明方法得到的胰岛素分泌细胞可应用于体内治疗糖尿病导致的胰腺损伤，重建胰岛功能，为治疗糖尿病提供了实验依据和临床研究证据，为细胞移植治疗提供了新的途径。
附图说明
图1为人间充质干细胞(胰岛素分泌细胞的种子细胞)的形态。
图2为人间充质干细胞(胰岛素分泌细胞的种子细胞)的免疫表型检测结果。
图3为人间充质干细胞体外分化得到的限定性内胚层细胞的形态。
图4为人间充质干细胞体外分化得到的限定性内胚层细胞的免疫细胞荧光染色检测结果。
图5为人间充质干细胞体外分化得到的限定性内胚层细胞的实时定量PCR检测结果。
图6为限定性内胚层细胞体外分化得到的胰腺干细胞/胰腺祖细胞的形态。
图7为限定性内胚层细胞体外分化得到的胰腺干细胞/胰腺祖细胞的免疫细胞荧光检测结果。
图8为限定性内胚层细胞体外分化得到的胰腺干细胞/胰腺祖细胞实时定量PCR检测结果。
图9为胰腺干细胞/胰腺祖细胞体外分化得到的胰岛素分泌细胞的形态。
图10为胰腺干细胞/胰腺祖细胞体外分化得到的胰岛素分泌细胞的免疫细胞荧光染色检测结果。
图11为胰腺干细胞/胰腺祖细胞体外分化得到的胰岛素分泌细胞的实时定量PCR检测结果。
图12为胰腺干细胞/胰腺祖细胞体外分化得到的胰岛素分泌细胞的胰岛素分泌总量检测结果。
图13为胰腺干细胞/胰腺祖细胞体外分化得到的胰岛素分泌细胞的胰岛素释放情况检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
青霉素、链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自GIBCO公司。Trizol购自美国Invitrogen公司，Oligo dT、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制剂购自日本Takara公司。
小鼠抗人foxa2单克隆抗体、小鼠抗人Insulin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。山羊抗人Sox17单克隆抗体、小鼠抗人pdx1单克隆抗体、小鼠抗人ngn3单克隆抗体购自美国R&D公司。兔抗人C-肽多克隆抗体购自英国ABcam公司。异硫氰酸标记的山羊抗小鼠IgG、罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG、罗丹明标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司。罗丹明标记的小鼠抗山羊IgG：购自北京中杉金桥公司。
KRBH缓冲液：120mM NaCl、5mM KCl、2.5mM CaCl2、1.1mM MgCl2、25mM NaHCO3、0.1％(质量百分含量)BSA，其余为10mM HEPES缓冲液。
实施例1、培养基的制备
DMEM/F12培养基(又称DF12培养基)和高糖DMEM培养基购自GIBCO公司。胎牛血清(FCS)购自GIBCO公司。尼克酰胺均购自Sigma公司。谷氨酰胺：GIBCO公司，产品目录号为25030-081。维甲酸购自Sigma公司，产品目录号为R2625。人活化素A(Activin A)：英国Pepro Tech公司，产品目录号为120-14。EGF(epidermal growthfactor，表皮细胞生长因子)：Pepro Tech公司，产品目录号为100-15。bFGF(basicfibroblast growth factor，碱性成纤维细胞生长因子)：Sigma公司，产品目录号为F0291。exendin-4：Sigma公司，产品目录号为E7144。B27：GIBCO公司，产品目录号为17504-044。N2：GIBCO公司，产品目录号为17502-048。非必需氨基酸：GIBCO公司，产品目录号为11140。
培养基由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下：5ml/L胎牛血清和5ng/mL activin A。
培养基B由DMEM/F12培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基B中的浓度如下：10-5mol/L维甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为1％的非必需氨基酸和体积浓度为2％的B27。
培养基C由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基C中的浓度如下：5ml/L胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、10mmol/L尼克酰胺、体积浓度为2％的B27和体积浓度为1％的N2。
实施例2、人胰岛素分泌细胞的序贯诱导培养(培养基组合甲的应用)
一、制备第3代间充质干细胞
1、无菌收集离体脐带(来源为人)，在生物安全柜中剪取约10cm长的脐带，用细胞洗涤液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2条脐静脉和1条脐动脉，得到华尔通氏胶(动静脉之间的胚胎粘液样结缔组织)。
2、将华尔通氏胶剪碎成肉糜状，转移到离心管中，用0.75g/LII型胶原酶消化2-3小时，用100目筛网过滤并收集滤液，室温1200rpm离心10分钟，收集细胞。
3、将步骤2的细胞在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中进行培养，当细胞达70％-80％汇合时，用1g/L胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1∶3进行传代，得到第1代间充质细胞。
4、将第1代间充质细胞在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中国进行培养，达70％-80％汇合，用D-Hank’s液洗2遍，用1g/L胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1∶3进行传代，得到第2代间充质细胞。
5、将第2代间充质细胞在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中进行培养，达70％-80％汇合，用D-Hank’s液洗2遍，然后用1g/L的胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化，室温1200rpm离心6分钟，收集细胞。
6、将步骤5的细胞在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养4-6小时，待细胞贴壁后弃除培养基，用D-Hank’s洗2遍，记作第3代间充质干细胞。
二、采用培养基组合甲进行诱导培养
1、第一阶段的培养
(1)在6孔板中加入培养基A，每孔2000微升。
(2)在步骤(1)的6孔板中接种第3代间充质干细胞(使其在培养基中的浓度为5×105个/ml)，在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养5天(每2天吸弃上清并加入2000微升新的培养基A)。
2、第二阶段的培养
吸弃步骤1的6孔板中的上清，加入培养基B，每孔2000微升，在37℃、50ml/LCO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养6天(每2天吸弃上清并加入2000微升新的培养基B)。
3、第三阶段的培养
吸弃步骤2的6孔板中的上清，加入培养基C，每孔2000微升，在37℃、50ml/LCO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养8天(每2天吸弃上清并加入2000微升新的培养基C)，室温1200rpm离心6分钟，收集细胞(沉淀)。
三、诱导效果的鉴定
1、第3代间充质干细胞的免疫表型测定
步骤一得到的第3代间充质干细胞的细胞形态见图1。
用间接免疫荧光法检测第3代间充质干细胞的表型，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106，CD117、Flk-1、HLA-ABC和HLA-DR抗体(抗体均购自BD公司)标记后进行流式检测，流式细胞仪为ACCURI C6(Becton Dickinson)。
结果见图2，横坐标表示细胞荧光强度，纵坐标表示细胞数；P2表示所选细胞群体。表型结果显示，第3代间充质干细胞的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Flk-1和HLA-ABC均为阳性，CD34、CD106、CD117和HLA-DR分子均为阴性。
2、人间充质干细胞诱导分化为限定性内胚层细胞的鉴定
(1)形态鉴定
在培养基A中培养6天后细胞达80％-90％汇合，培养过程中细胞的形态变化如下：培养1-2天，细胞基本为梭形，少数呈鹅卵石样上皮细胞形态，梭形细胞的百分比大于90％；培养4-6天后，细胞体积明显增大，排列紧密，梭形细胞比例减少，多数细胞呈现鹅卵石样上皮细胞形态，鹅卵石样细胞的百分比大于90％，在培养基A中培养4天的细胞见图3。
(2)免疫荧光染色鉴定
将步骤二的1中培养5天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行免疫荧光染色，检测限定性内胚层标志Foxa2和Sox17的表达情况。
检测Foxa2的具体方法如下：细胞以80％冰乙醇固定，PBS清洗后以含1％BSA的PBST缓冲液封闭；然后用小鼠抗人Foxa2单克隆抗体(工作浓度为1∶50稀释)作为一抗室温孵育1小时；用PBS缓冲液清洗后，再以异硫氰酸(绿色荧光)标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗室温孵育30分钟；用PBS缓冲液清洗后用Hoechst 33342染色液(Sigma)复染细胞核(兰色荧光)，在荧光显微镜下观察(Olympus)。第3代间充质干细胞均不显示绿色荧光，为阴性结果。采用培养基A诱导培养后的细胞90％以上显示绿色荧光。
检测Sox17的具体方法同Foxa2的具体方法，差别仅在于采用山羊抗人Sox17单克隆抗体(工作浓度为1∶100稀释)作为一抗，采用罗丹明(红色荧光)标记的小鼠抗山羊IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果。采用培养基A诱导培养后的细胞90％以上显示红色荧光。
结果见图4(A为采用培养基A诱导培养后的细胞，B为第3代间充质干细胞)。结果表明，采用培养基A诱导培养后大部分细胞为Foxa2和Sox17阳性。
(3)实时定量PCR分析
取步骤二的1中培养5天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)，提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时定量PCR鉴定Foxa2基因和Sox17基因的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下：
用于扩增Foxa2基因的引物为：
上游引物：5’-CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA-3’；
下游引物：5’-CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT-3’。
用于扩增Sox17基因的引物为：
上游引物：5’-GCATGACTCCGGTGTGAATCT-3’；
下游引物：5’-TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT-3’。
用于扩增GAPDH的引物为：
上游引物：5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’；
下游引物：5’-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3’。
采用ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。以第3代间充质干细胞的foxa2基因(或sox17基因)的表达量为1，计算采用培养基A诱导培养后的细胞中各个基因的相对表达量。采用培养基A诱导培养后的细胞中，foxa2基因的相对表达量为10.80，sox17基因的相对表达量为4.77。结果见图5。
以上鉴定结果表明，采用培养基A诱导培养后的细胞主要为人限定性内胚层细胞(表达限定性内胚层细胞的特异性标志基因，并显示限定性内胚层细胞的形态)。
3、限定性内胚层细胞分化为胰腺干细胞、胰腺祖细胞和β前体细胞的鉴定
(1)形态鉴定
在培养基B中培养6天，培养过程中细胞的形态变化如下：细胞逐渐变小并呈团状聚集状态。在培养基B中培养6天的细胞见图6。
(2)免疫荧光染色鉴定
将步骤二的2中培养6天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行免疫荧光染色，分别检测胰腺干细胞标志Pdx1和胰腺内分泌祖细胞标志Ngn3的表达情况。
检测Pdx1的具体方法同Foxa2的具体方法，差别仅在于采用小鼠抗人Pdx1单克隆抗体(工作浓度为1∶100稀释)作为一抗。第3代间充质干细胞均不显示绿色荧光，为阴性结果。采用培养基B诱导培养后的细胞70％以上显示绿色荧光。
检测Ngn3的具体方法同Foxa2的具体方法，差别仅在于采用小鼠抗人Ngn3单克隆抗体(工作浓度为1∶100稀释)作为一抗。第3代间充质干细胞均不显示绿色荧光，为阴性结果。采用培养基B诱导培养后的细胞70％以上显示绿色荧光。
结果见图7(A为采用培养基B诱导培养后的细胞，B为第3代间充质干细胞)。结果表明，采用培养基B诱导培养后大部分细胞为Pdx1和Ngn3阳性。
(3)实时定量PCR分析
取步骤二的2中培养6天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)，提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时定量PCR分别鉴定Pdx1基因、Ngn3基因和Pax4基因(胰腺内分泌祖细胞标志)的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下：
用于扩增Pdx1的引物为：
上游引物：5’-TACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGC-3’；
下游引物：5’-AGGGAGCCTTCCAATGTGTATGGT-3’。
用于扩增Ngn3的引物为：
上游引物：5’-TAAGAGCGAGTTGGCACTGAGCAA-3’；
下游引物：5’-TTTGAGTCAGCGCCCAGATGTAGT-3’。
用于扩增Pax4的引物为：
上游引物：5’-AATTCCCTGGACTCAGGACTGCTT-3’；
下游引物：5’-TTCCAAGCCATACAGTAGTGGGCA-3’。
用于扩增GAPDH的引物为：
上游引物：5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’；
下游引物：5’-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3’。
采用ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。以第3代间充质干细胞的Pdx1基因(或Ngn3基因或Pax4基因)的表达量为1，计算采用培养基B诱导培养后的细胞中各个基因的相对表达量。采用培养基B诱导培养后的细胞中，pdx1基因的相对表达量为10.72，ngn3基因的相对表达量为14.07，pax4基因的相对表达量为5.18。结果见图8。结果表明，采用培养基B培养后，人间充质干细胞来源的限定性内胚层细胞表达胰腺干细胞基因Pdx1、胰腺内分泌祖细胞基因Ngn3和胰腺内分泌祖细胞基因Pax4。以上鉴定结果表明，采用培养基B诱导培养后呈团状聚集状态的细胞即为胰腺干细胞/胰腺祖细胞(该细胞表达胰腺干细胞/胰腺祖细胞特异性标志基因，并显示出团状聚集状态，且该细胞进一步诱导可获得胰岛素分泌细胞)。
4、胰腺干细胞和胰腺祖细胞体外分化为胰岛素分泌细胞的鉴定
(1)形态鉴定
在培养基C中培养8天后细胞呈团状聚集状态更加明显，见图9。
(2)免疫荧光染色鉴定
将步骤二的3中培养8天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行免疫荧光染色，检测胰岛素分泌细胞标志Insulin和C-peptide的表达情况。
检测Insulin的具体方法同Foxa2的具体方法，差别仅在于采用小鼠抗人Insulin单克隆抗体(工作浓度为1∶50稀释)作为一抗，采用罗丹明(红色荧光)标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果。采用培养基C诱导培养后的细胞95％以上显示红色荧光。
检测C-peptide的具体方法同Foxa2的具体方法，差别仅在于采用兔抗人C-peptide多克隆抗体(工作浓度为1∶100稀释)作为一抗，采用罗丹明(红色荧光)标记的山羊抗兔IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果。采用培养基C诱导培养后的细胞95％以上显示红色荧光。
结果见图10(A为采用培养基C诱导培养后的细胞，B为第3代间充质干细胞)。结果表明，采用培养基C诱导培养后大部分细胞为Insulin和C-peptide阳性。
(3)实时定量PCR分析
取步骤二的3中培养8天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)，提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时定量PCR鉴定Insulin基因和Glut-2基因的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下：
用于扩增Insulin基因的引物为：
上游引物：5’-AGAGGCCATCAAGCAGATCACTGT-3’；
下游引物：5’-CACAGGTGTTGGTTCACAAAGGCT-3’。
用于扩增Glut-2基因的引物为：
上游引物：5’-AGCTGCATTCAGCAATTGGACCTG-3’；
下游引物：5’-ATGTGAACAGGGTAAAGGCCAGGA-3’。
用于扩增GAPDH的引物为：
上游引物：5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’；
下游引物：5’-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3’。
采用ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。以第3代间充质干细胞的Insulin基因(或Glut-2基因)的表达量为1，计算采用培养基C诱导培养后的细胞中各个基因的相对表达量。采用培养基C诱导培养后的细胞中，insulin基因的相对表达量为6.31，Glut-2基因的相对表达量为7.80。结果见图11。结果表明，采用培养基C培养后，脂肪间充质干细胞来源的胰腺干/祖细胞表达胰腺内分泌功能细胞相关基因Insulin和Glut-2。
(4)胰岛素分泌功能检测
①胰岛素测定
将步骤二的3中培养8天的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行如下实验：
针对每个细胞孔，取所有培养上清，并对该孔内的细胞进行计数。将培养上清2000rpm离心10min，取上清液并用胰岛素ELISA检测试剂盒(EZHIASF-14K，MILLIPORE)检测胰岛素含量(具体操作按照试剂盒说明书进行)。
每5×105个采用培养基C诱导后的细胞分泌得到的胰岛素总量为(346.3739±32.51489)μU/ml，第3代间充质干细胞分泌得到的胰岛素总量为(17.69±1.462954)μU/ml(P＜0.01)。结果见图12(A为采用培养基C-1诱导培养后的细胞，B为第3代间充质干细胞)。
②细胞C-肽分泌功能测定
将步骤二的3中培养8天的细胞进行如下实验：
将5×105个细胞用PBS缓冲液洗涤3遍后，在1mL KRBH缓冲液中孵育6小时(3-6小时均可)，然后将细胞置于1mL含5.5mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育1小时，收集上清液(溶液甲)，再然后将细胞置于1mL含22mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育1小时，收集上清液(上清液乙)。
使用C-肽ELISA试剂盒(EZHCP-20K，MILLIPORE)分别检测溶液甲和溶液乙中C-肽的含量(具体测定方法参考试剂盒说明书)。
上清液甲中C-肽释放水平为(195.10±8.88)pmol/L/h(P＜0.01)，该水平代表胰岛素从头合成量。上清液乙中C-肽释放水平达到(340.99±7.91)pmol/L/h(P＜0.01)。结果见图13。结果表明，采用培养基C-1诱导后的细胞在体外具有对葡萄糖应答的胰岛素分泌功能。结果表明，采用培养基C-1诱导培养后的细胞为胰岛素分泌细胞(该细胞表达胰岛素分泌细胞特异性标志基因，并显示出体外分泌胰岛素的能力及对葡萄糖的反应性)。
Claims (10)
1.将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞的培养基组合物，由培养基A、培养基B和培养基C组成；
所述培养基A由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基A中的浓度如下：4.75ml/L-5.25ml/L胎牛血清和4.75ng/mL-5.25ng/mL activin A；
所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基B中的浓度如下：0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸、19ng/ml-21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、1.9mmol/L-2.1mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为0.95％-1.05％的非必需氨基酸和体积浓度为1.9％-2.1％的B27；
所述培养基C由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基C中的浓度如下：4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml-21ng/ml exendin-4、9.5ng/ml-10.5ng/ml activin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酰胺、体积浓度为1.9％-2.1％的B27和体积浓度为0.95％-1.05％的N2。
2.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于：
所述培养基A由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下：5ml/L胎牛血清和5ng/mL activin A；
所述培养基B由DMEM/F12培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基B中的浓度如下：10-5mol/L维甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为1％的非必需氨基酸和体积浓度为2％的B27；
所述培养基C由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基C中的浓度如下：5ml/L胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、10mmol/L尼克酰胺、体积浓度为2％的B27和体积浓度为1％的N2。
3.将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞方法，是将间充质干细胞依次用权利要求1或2所述的培养基组合物中的所述培养基A、所述培养基B和所述培养基C进行培养，得到胰岛素分泌细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将间充质干细胞接种于所述培养基A中，培养4-6天；
(2)将完成步骤(1)的细胞转接于所述培养基B中，培养6-8天；
(3)将完成步骤(2)的细胞转接于所述培养基C中，培养7-10天，得到胰岛素分泌细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述间充质干细胞在所述培养基A中的初始浓度为2×105个/ml-1×106个/ml。
6.权利要求1或2所述的培养基组合物在将间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞中的应用。
7.将限定性内胚层细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞的培养基，为培养基B；所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基B中的浓度如下：0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸、19ng/ml-21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、1.9mmol/L-2.1mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为0.95％-1.05％的非必需氨基酸和体积浓度为1.9％-2.1％的B27。
8.将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞的培养基组合物，由培养基A和培养基B组成；
所述培养基A由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基A中的浓度如下：4.75ml/L-5.25ml/L胎牛血清和4.75ng/mL-5.25ng/mL activin A；
所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基B中的浓度如下：0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸、19ng/ml-21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、1.9mmol/L-2.1mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为0.95％-1.05％的非必需氨基酸和体积浓度为1.9％-2.1％的B27。
9.将限定性内胚层细胞诱导为胰岛素分泌细胞的培养基组合物，由培养基B和培养基C组成；
所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基B中的浓度如下：0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸、19ng/ml-21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、1.9mmol/L-2.1mmol/L谷氨酰胺、体积浓度为0.95％-1.05％的非必需氨基酸和体积浓度为1.9％-2.1％的B27；
所述培养基C由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在所述培养基C中的浓度如下：4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml-21ng/ml exendin-4、9.5ng/ml-10.5ng/ml activin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酰胺、体积浓度为1.9％-2.1％的B27和体积浓度为0.95％-1.05％的N2。
10.权利要求7所述培养基在将限定性内胚层细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞中的应用，或，权利要求8所述培养基组合物在将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞和/或胰腺祖细胞中的应用，或，权利要求9所述培养基组合物在将限定性内胚层细胞诱导为胰岛素分泌细胞中的应用。
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