CN112063577B - 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。本发明的新型组合培养基是将人羊膜进行液氮研磨、超声匀浆、梯度离心、过滤除菌得到含羊膜提取物的培养基，含羊膜提取物新型组合培养基能有效保护胰岛体外存活及功能。

Description

用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由于自身胰岛细胞破坏导致胰岛素生成不足或受体细胞对胰岛素产生抵抗而使胰岛素的代谢产生缺陷的葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病。自Edmonton Protocol发布以来，胰岛移植由于其相对于成体器官移植来说创伤小、又能取得可靠的移植效果而被视为治疗1型糖尿病和部分2型糖尿病的有效方法之一。
目前，在临床胰岛移植中为了胰岛的进一步纯化、胰岛质量的检测、胰岛的运输转移以及受体的免疫诱导，胰岛从被实验员在供体胰腺中提取出来到被外科医师移植到受体前需要在体外培养24-72小时，大多数移植中心采取的培养时间为48小时。在这段体外培养时间内，有超过20％的胰岛丢失。研究表明，胰岛在体外培养中主要的丢失原因为无血清引发的炎症反应。目前临床上用于体外胰岛培养的培养基为CMRL1066+0.625％HSA,0.625％HSA为胰岛的存活提供一定的渗透压，但缺少血清中的各种有利于胰岛细胞存活的细胞因子。
基础研究表明CMRL1066+10％FBS更适用于体外胰岛培养，但是由于动物源性而不被临床采用。人血清中含有细胞因子，但是同时存在和胰岛细胞发生免疫反应的细胞因子，容易导致胰岛细胞损坏。因此，亟需研究一种新的人胰岛体外培养组合培养基。
发明内容
为此，本发明提供用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种用于胰岛培养的组合培养基，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。
本发明的一个实施例中，所述BSA的质量百分数为0.625％。
本发明的一个实施例中，所述羊膜提取物蛋白的质量浓度为0.1-1.0mg/mL。
本发明还提供一种制备所述的用于胰岛培养的组合培养基的方法，其包括：向所述CMRL1066培养基中添加BSA和羊膜提取物，混合均匀，得到所述组合培养基。
本发明的一个实施例中，所述羊膜提取物的添加方法为：
用含青霉素和链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将清洗后的羊膜切碎研磨成羊膜颗粒，将所述羊膜颗粒加入到CMRL1066基础培养基中，4℃超声匀浆，将超声匀浆物离心，取上清液，将所述上清液过滤后，得到滤液，再向所述滤液中添加BSA后，得到所述组合培养基。
本发明的一个实施例中，所述羊膜颗粒与所述CMRL1066培养基的质量体积比为1:2。
本发明的一个实施例中，所述超声匀浆过程中，匀浆机转速为10000rpm，超声匀浆温度为4℃，超声匀浆时间为1h。
本发明的一个实施例中，所述离心为梯度离心，先4000g离心10min后，提取上清液，将所述上清液再15000g离心5min后，再提取上清液，离心温度为4℃。
本发明的一个实施例中，所述青霉素的浓度为1000IU/ml，所述链霉素的浓度为0.1mg/ml。
本发明实施例中基于以下机理：吖啶橙(Acridine Orange,AO)可以透过活细胞膜，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光；溴乙锭(Ethidium Bromide，EB)不能透过活细胞膜，仅能通过受损的细胞膜，嵌入细胞核DNA或RNA，使之发红色荧光。因此绿色为活细胞，橙色为死细胞。正常胰岛细胞在高糖(16.8mM)刺激下会分泌大量胰岛素，功能受损的细胞胰岛素分泌量下降。
本发明具有如下优点：
本发明的新型组合培养基是将人羊膜进行液氮研磨、超声匀浆、梯度离心、过滤除菌得到含羊膜提取物的培养基，含羊膜提取物新型组合培养基能有效保护胰岛体外存活及功能。且本发明公开的新型组合培养基中含有的羊膜匀浆提取物包含有各种细胞因子，具有低免疫原性的优点，能为胰岛体外培养提供有利于存活的细胞因子的同时降低免疫反应的风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为传统培养基CMRL1066+0.625％BSA培养的胰岛活性；
图2为本发明组合培养基CMRL1066+0.625％BSA+羊膜提取物培养的胰岛活性；
图3为本发明浓度分别为2.8mM和16.8mM葡萄糖刺激胰岛素分泌实验对照图，其中，AME为组合培养基中羊膜提取物；
图4为本发明Stimulation Index图，其为高糖浓度下胰岛分泌的胰岛素量与低糖浓度下胰岛分泌的胰岛素量之比，其中，AME为组合培养基中羊膜提取物。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中所涉及试剂如无特殊说明，均可商业购买获得，所采用的细胞提取、细胞培养、细胞染色及Elisa等实验操作，如无特殊说明，均为常规操作，或按照购买的试剂说明书使用即可。
本发明实施例中，BSA购自于Sigma；CMRL1066购自于Corning。
实施例1、本发明用于胰岛培养的组合培养基的制备
本发明提供培养胰岛的新型组合培养基，包括如下组分CMRL1066培养基、0.625重量％BSA和羊膜提取物。其中，羊膜提取物蛋白在组合培养基中的浓度为0.1-1.0mg/mL。
本发明的用于培养胰岛的新型组合培养基制备方法包括以下步骤：
1、用含有1000IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将羊膜洗净至无血块；
2、将洗净的羊膜切成碎块，并浸入液氮中进行手动研磨，直至羊膜被研磨成羊膜细颗粒；
3、将羊膜细颗粒进行称重，按重量体积比为1：2(1：2wt/vol)加入基础培养基CMRL1066，置于4℃，进行超声匀浆。超声匀浆机设置为10000rpm，超声匀浆时间为1h，得到羊膜匀浆混合物；
4、羊膜匀浆混合物进行梯度离心，4000g离心10min后提取上清液，上清液进行15000g离心5min后，再提取上清液，离心全程在4℃环境下进行；
5、将离心后得到的上清液经过0.22μm的滤网过滤，得到羊膜提取物；
6、将得到的羊膜提取物经过Bradford法进行总蛋白浓度定量后，加入基础培养基CMRL1066，得到含羊膜提取物浓度为0.1-1.0mg/ml的培养基。
7、将所述含羊膜提取物的培养基中，加入0.625重量％BSA，制备得到所述用于培养胰岛的新型组合培养基。
实施例2、不同浓度羊膜提取物对C57/BL6小鼠原代胰岛细胞活性的影响
取超低黏附6孔板，将正常提取的小鼠原代胰岛按照每孔75个胰岛进行分组，分为对照组和实验组，对照组培养基成分为CMRL1066+0.625％BSA,实验组背包发明的组合培养基组成成分为CMRL1066+0.625重量％BSA+羊膜提取物，其中，组合培养基中，羊膜提取物蛋白质浓度为0.5mg/mL，每孔加培养基2mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48h。培养结束后，将AO/EB按照每毫升培养液加20μl AO/EB 1：1混合液的比例加入含胰岛的培养孔中，混合后3-5min内进行荧光显色，结果如图1-2所示，中绿色为活细胞，橙色为死细胞，图1中橙色较多，其死细胞较多，图2中，橙色较少，甚至没有，其死细胞较少。
实施例3、不同浓度羊膜提取物对C57/BL6小鼠原代胰岛细胞功能的影响
取超低黏附6孔板，将正常提取的小鼠原代胰岛按照每孔75个胰岛进行分组，分为对照组和实验组，对照组培养基成分为CMRL1066+0.625％BSA,实验组本发明的组合培养基组成成分为CMRL1066+0.625％BSA+羊膜提取物，其中，组合培养基中，羊膜提取物蛋白浓度为0.1-1.5mg/mL，每孔加培养基2mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中，培养48h。
培养结束后，每组随机取10个胰岛进行ELISA实验检测胰岛分泌的胰岛素。选取的胰岛置于含2.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-bicarbonate buffer(KRBB)溶液中培养30min，弃上清；然后将胰岛置于1mL含2.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-bicarbonate buffer(KRBB)溶液中培养1h，收集上清；最后，将胰岛置于1mL含16.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-bicarbonate buffer(KRBB)溶液中培养1h，收集上清。所收集的含胰岛素的上清稀释10倍进行下述ELISA实验。实验中，使用的ELISA试剂盒为小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(10-1249-01,Mercodia,Sweden)。按照试剂盒操作指南准备好1X的酶标抗体工作液，1X的清洗缓冲液以及样品。
将25μl的校准样品、实验组以及对照组的样品加入微孔板中，然后每孔加100μl的1X的酶标抗体工作液，室温置于摇床上(700-900rpm)孵育2h。倒置微孔板弃掉工作液，加入350μl的1X清洗缓冲液，弃掉清洗缓冲液，重复清洗5次。每孔加入200μl的底物TMB液，室温下静置孵育15min，然后每孔加入50μl的终止液并置于摇床上5s以保证充分混合。最后在30min内用酶标仪在450nm峰处进行读数。所得吸光度进行数据处理，即可得实验组和对照组中胰岛分泌的胰岛素含量，Stimulation Index为高糖浓度下，胰岛分泌的胰岛素量与低糖浓度下胰岛分泌的胰岛素量之比，实验结果如图3-4所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种组合培养基用于培养人胰岛的培养的方法，其特征在于，所述方法为，将胰岛接种于培养基中，置于37℃、5%CO2 的细胞培养箱中培养，即得人胰岛；
所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA 以及羊膜提取物；
所述羊膜提取物蛋白的质量浓度为0.1-1.0mg/mL；
所述培养基的制备方法为：向所述 CMRL1066培养基中添加BSA 和羊膜提取物，混合均匀，得到所述组合培养基；
所述羊膜提取物的添加方法为：用含青霉素和链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将清洗后的羊膜切碎研磨成羊膜颗粒，将所述羊膜颗粒加入到CMRL1066基础培养基中，4℃超声匀浆，将超声匀浆物离心，取上清液，将所述上清液过滤后，得到滤液，再向所述滤液中添加BSA后，得到所述组合培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述BSA的质量百分数为0.625% 。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述超声匀浆过程中，匀浆机转速为10000 rpm，超声匀浆温度为4℃，超声匀浆时间为1h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述离心为梯度离心，先4000 g离心10min后，提取上清液，将所述上清液再15000 g离心5 min后，再提取上清液，离心温度为4℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述青霉素的浓度为1000 IU/ml，所述链霉素的浓度为0.1mg/ml。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述羊膜提取物与所述CMRL1066培养基的质量体积比为1:2。
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Inventor after: Lin Jianzhen

Inventor after: Li Feng

Inventor after: Zhang Chengshuo

Inventor before: Yang Zhaoming

Inventor before: Zhang Jialin

Inventor before: Guo Tingwei

Inventor before: Lin Jianzhen

Inventor before: Li Feng

Inventor before: Zhang Chengshuo

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GR01 Patent grant
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