CN103911340A - 一种促胰岛细胞增殖培养液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促胰岛细胞增殖培养液，它以常用细胞培养基为基础培养基，添加本发明化合物1～8中任意一种或者多种化合物。本发明还公开了前述培养液的制备方法，以及化合物1～8在制备促胰岛细胞增殖的培养液中的用途。本发明培养液可以有效促进胰岛细胞增殖，实现了胰岛细胞的体外快速培养，为糖尿病患者的胰岛细胞移植提供了可靠的来源。

Description

一种促胰岛细胞增殖培养液及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物领域，特别涉及一种促胰岛细胞增殖的培养液及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由胰岛素分泌不足导致的慢性代谢疾病，尤其是血糖水平的异常，晚期可导致肾脏、眼底、周围神经系统和血管等组织器官的病变，并伴有失明、肾衰等严重症状的罹患风险。据估计目前全球有超过1.5亿人患有糖尿病，而预计在2025年糖尿病患者将达到3亿。
目前糖尿病主要可分为两种类型：一型糖尿病和二型糖尿病。前者主要是由胰岛素的绝对不足引起的，而胰岛素绝对量的不足则是由于人体中唯一可以分泌胰岛素的细胞——胰岛β细胞的严重不足。目前研究表明，胰岛β细胞缺失的主要原因是T细胞对β细胞的自体免疫攻击。二型糖尿病则的主要病因则是胰岛素的靶器官(肝脏、肌肉等)对胰岛不敏感，而更深层的病因较一型糖尿病更为复杂。二型糖尿病在初期只表现为胰岛素的相对缺乏，并伴随有应激性的胰岛增殖和高胰岛素表现，而在晚期由于长期高血糖导致的胰岛β细胞的大量凋亡，胰岛素水平也大量下降。因此，针对一型和二型糖尿病，胰腺或胰岛移植都是最理想的治疗方案之一。
胰腺器官移植较胰岛移植开展得早，相对而言能提供更长时间的正常胰岛素供给，但是胰腺器官移植手术难度高，风险大，作为糖尿病的治疗手段并不十分理想。目前，供体胰岛的移植是治疗糖尿病的最有效手段，胰岛细胞按其染色和形态学特点，主要分为α细胞、β细胞、γ细胞及PP细胞，α细胞约占胰岛细胞的20%，分泌胰高血糖素（glucagon）；β细胞占胰岛细胞的60%-70%，分泌胰岛素(insulin)；γ细胞占胰岛细胞的10%，分泌“生长抑素”；PP细胞数量很少，分泌胰多肽(pancreatic polyeptide)，其中，胰岛β细胞分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。
目前，临床获得的胰岛来源非常有限，需要在体外将供体来源的少量胰岛充分扩展和增殖。然而，目前采用常用细胞培养基培养胰岛细胞的方式，难以快速、有效的扩增得到大量胰岛细胞。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种促胰岛细胞增殖的培养液以及8种化合物在制备促胰岛细胞增殖的培养液中的用途。
本发明促胰岛细胞增殖培养液，它以常用细胞培养基为基础培养基，添加有如下任意一种或者多种化合物：
化合物1：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-4-羧酸；
化合物2：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-3-羧酸；
化合物3：6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
化合物4：N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺；
化合物5：3-氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺；
化合物6：3-氨基-N-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基；
化合物7：1-(4-甲氧基苄基)-3-(5-硝基噻唑-2-基)尿素；
化合物8：N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺。
常用细胞培养基，是指包含供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质的培养基，如，RPMI-1640培养基（即1640培养基），最低必须培养基（MinimumEssential Medium，MEM）、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基、M-199培养基等等。
所述的培养液添加的化合物的终浓度不低于10nM。优选地，所述化合物的终浓度不低于100nM。进一步优选地，所述化合物的终浓度为100nM～100μM。
所述常用细胞培养基是1640培养基、最低必须培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。
所述培养液中还添加有胰岛素样生长因子、上皮生长因子、青霉素、链霉素、巯基乙醇、葡萄糖或胎牛血清。优选地，所述培养液中含有胰岛素样生长因子和上皮生长因子，其中，胰岛素样生长因子的终浓度为10ng/ml，上皮生长因子的终浓度为10ng/ml。
所述胰岛细胞为胰岛β细胞。胰岛β细胞又叫胰岛B细胞。
本发明前述培养液的制备方法，步骤如下：按照前述配比取原料，混匀，即可。
如下化合物1～8中任意一种或者多种在制备促进胰岛细胞增殖的培养液中的用途：
化合物1：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-4-羧酸；
化合物2：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-3-羧酸；
化合物3：6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
化合物4：N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺；
化合物5：3-氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺；
化合物6：3-氨基-N-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基；
化合物7：1-(4-甲氧基苄基)-3-(5-硝基噻唑-2-基)尿素；
化合物8：N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺。
所述胰岛细胞为胰岛β细胞。
本发明化合物1～8可以有效促进胰岛β细胞增殖，采用本发明培养液体外培养胰岛细胞，可以快速培养得到大量胰岛β细胞，用于体内移植治疗糖尿病，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1胰岛分离体系示意图；
图2DTZ染色图片，红棕色为胰岛细胞；
图3Annexin-V/PI染色评价原代培养的胰岛的存活率，绿色的Annexin-V荧光（染存活细胞）和红色的PI荧光（染死亡细胞）；
图4免疫荧光染色结果（10nM），胰岛素C-肽绿色荧光染色提示阳性胰岛beta细胞染色，DAPI的蓝色染色提示细胞核染色。红色、黄色、橙色和紫色荧光染色均提示为ki-67阳性染色（ki-67阳性染色本身为红色荧光，红色与胰岛素C-肽的绿色荧光重合显示为黄色和橙色，而红色与DAPI的蓝色荧光重合显示为紫色）。A1,A2:DMSO0.1%；B1,B2:K5010nM；C1,C2:K5210nM；
图5免疫荧光染色结果（100nM），胰岛素C-肽绿色荧光染色提示阳性胰岛beta细胞染色，DAPI的蓝色染色提示细胞核染色。红色、黄色、橙色和紫色荧光染色均提示为ki-67阳性染色（ki-67阳性染色本身为红色荧光，红色与胰岛素C-肽的绿色荧光重合显示为黄色和橙色，而红色与DAPI的蓝色荧光重合显示为紫色）。A1,A2:DMSO0.1%；B1,B2:K50100nM；C1,C2:K52100nM；
图6免疫荧光染色结果（100μM），胰岛素C-肽绿色荧光染色提示阳性胰岛beta细胞染色，DAPI的蓝色染色提示细胞核染色。红色、黄色、橙色和紫色荧光染色均提示为ki-67阳性染色（ki-67阳性染色本身为红色荧光，红色与胰岛素C-肽的绿色荧光重合显示为黄色和橙色，而红色与DAPI的蓝色荧光重合显示为紫色）。A1,A2:DMSO0.1%；B1,B2:K50100μM；C1,C2:K52100μM；
图710nM和100nM的K50和K52对原代培养的大鼠β-胰岛细胞增殖的作用（用ki-67增殖指数表示胰岛细胞增值率，即胰岛beta-细胞增殖分数，ki-67增殖指数为Ki-67阳性染色细胞数占总的C-肽绿色荧光染色细胞的百分率）。数据表示为means±SEM，n=4/组，多样本均数间的比较采用One-wayANOVA检验，组间的两两比较采用Studen-t Newman-Keuls检验,*P<0.05vs.DMSO（1/1000）处理的对照组；
图8100μM的K50和K52对原代培养的大鼠β-胰岛细胞增殖的作用（用ki-67增殖指数表示胰岛细胞增值率，即胰岛beta-细胞增殖分数，ki-67增殖指数为Ki-67阳性染色细胞数占总的C-肽绿色荧光染色细胞的百分率）。数据表示为means±SEM，n=3/组，多样本均数间的比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Studen-t Newman-Keuls检验,*P<0.05vs.DMSO（1/1000）处理的对照组；
图910nM和100nM的K50和K52对大鼠胰岛细胞瘤来源的INS-1细胞系增殖的作用，采用BrdU-ELISA法检测INS-1细胞增殖活性，用酶标仪检测490nm处的ELISA反应产物的吸光度值。数据表示为means±SEM，n=3/组，多样本均数间的比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Studen-t Newman-Keuls检验,*P<0.05vs.DMSO（1/1000）处理的对照组；
图10100nM的K51，K53，K54，K55,K56，K57对大鼠胰岛细胞瘤来源的INS-1细胞系增殖的作用，采用BrdU-ELISA法检测INS-1细胞增殖活性，用酶标仪检测490nm处的ELISA反应产物的吸光度值，数据表示为“mean(SD)”，n=3/组。
具体实施方式
实施例1本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取RPMI-1640培养基，加入1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-4-羧酸至浓度为100nM，混匀，即可。
实施例2本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取RPMI-1640培养基，加入1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-3-羧酸至浓度为100μM，混匀，即可。
实施例3本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取最低必须培养基，加入6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈至浓度为100μM，混匀，即可。
实施例4本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取最低必须培养基中，加入N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺至浓度为10nM，混，即可。
实施例5本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取M-199培养基，加入3-氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺至浓度为10nM，混匀，即可。
实施例6本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取DMEM-高糖培养基，加入3-氨基-N-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基至浓度为10nM，混匀，即可。
实施例7本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取DMEM-低糖培养基，加入1-(4-甲氧基苄基)-3-(5-硝基噻唑-2-基)尿素至浓度为10nM，混匀，即可。
实施例8本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
取DMEM/F12培养基，加入N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺至浓度为100nM，混匀，即可。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验材料：
SD雄性大鼠，300～500克，购于四川大学实验动物中心；胶原酶Ⅺ，购于美国Sigma公司；Ficoll400购于天津市聚合科贸有限公司；双硫腙（dithizone，DTZ）购于上海试剂三厂；INS-1细胞来源于华西医院再生医学研究所细胞库；Brdu ELISA试剂盒，购于罗氏公司。其余试剂为市售分析纯产品。
所用化合物，均为市售品：
化合物1：k50
1-(3-(3-amino-6-phenylpyrazine-2-carboxamido)pyridin-4-yl)piperidine-4-carboxylic acid
1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-4-羧酸
化合物2：k52
1-(3-(3-amino-6-phenylpyrazine-2-carboxamido)pyridin-4-yl)piperidine-3-carboxylic acid
1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-3-羧酸
化合物3：K51
6-((2-((4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl)amino)ethyl)amino)nicotinonitrile；
6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
化合物4：K53
N-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-2-phenylquinazolin-4-amine
N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺
化合物5：K54
3-amino-N-(4-(4-aminopiperidin-1-yl)pyridin-3-yl)-6-phenylpyrazine-2-carboxamide
3-氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺
化合物6：K55
3-amino-N-(4-((dimethylamino)methyl)pyridin-3-yl)-6-phenylpyrazine-2-carboxamide
3-氨基-N-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基
化合物7：K56
1-(4-methoxybenzyl)-3-(5-nitrothiazol-2-yl)urea
1-(4-甲氧基苄基)-3-(5-硝基噻唑-2-基)尿素
化合物8：K57
N-(3-isopropoxypropyl)-4-(4-methylbenzamido)-1H-pyrazole-3-carboxamide
N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺
实施例1本发明培养液诱导体外原代培养的大鼠胰岛细胞
1、实验方法
1.1胰岛细胞的获得
a)取2只大鼠麻醉后，腹部常规消毒去毛，作腹正中切口及双侧肋缘下切口，显露肝门，切除剑状软骨。用棉签将大鼠小肠推至腹腔左侧，暴露胆管远端。
b)在胆总管汇入十二指肠的入口处结扎，缝合时避免接触胰腺。于胆管近心端使用穿刺针原位插管，并结扎胆总管近心端。
c)动物处死，经胆总管缓慢注入0.5mg/mL胶原酶Ⅺ溶液10mL，使胰腺原位缓慢膨胀。沿肠壁分离胰腺，切取后立即置入37℃水浴静止消化约15min；取出剧烈振摇1min分散胰腺，使呈细沙状，立即加入10倍体积的4℃预冷Hank’s液（含0.1%牛血清白蛋白）终止消化。
d)60目网筛过滤，用50mL注射器15G针头从筛上喷过，冲洗网上组织。于4℃离心（以离心半径15cm，1000r/min离心1min）；弃上清；同法离心3min；Hank’s液重悬组织，80目网筛过滤，同法离心后收集沉淀。以上步骤均在超净台中进行。
e)胰岛的纯化：首先配制Euro-Ficoll分离液，即Euro-collin保存液：含15mmol/L KCl、15mmol/L KH2PO4、43mmol/L K2HPO4、10mmol/LNaHCO3、200mmol/L葡萄糖，pH7.2；Euro-Ficoll液：将不同比例的Ficoll400溶解于Euro-collin中，得到不同比重（D）的分离液，如图1所示，（F1：D=1.132，F2：D=1.108，F3：D=1.096，F4：D=1.069，F5：D=1.023），4℃避光保存。在50mL离心管中加入12mL F1铺底，10mL F2重悬沉淀组织并小心加至F1上，注意防止气泡混入影响细胞重悬效果。依次小心加入F4和F5各6mL。以离心半径15cm，2000r/min于4℃缓慢升降离心20min，收集位于F1和F2界面的胰岛，Hank’s液离心洗涤3次，备用。
f)胰岛特异性计数：将DTZ工作液50μL与纯化后的胰岛约100μL混合5min，显微镜下计数DTZ染为猩红色的细胞团数量。
g)胰岛活性鉴定：Annexin-V/PI溶液10μL与100μL胰岛制备物混合10min，在荧光显微镜下分别用490nm和510nm激发光可分别见到绿色的Annexin-V荧光（存活细胞）和红色的PI荧光（死亡细胞）。用CCD成像系统采集图像。
1.2胰岛细胞的体外扩增
原代培养的胰岛均匀接种于6孔板中，在培养基中稳定24h，略为贴壁后，分别取K50和K52加入1640培养基（含IGF10ng/ml,EGF10ng/ml），使化合物的终浓度分别达10nM、100nM和100μM。以含0.1%DMSO的1640培养基作为对照组培养基。
药物刺激72h后，收取细胞涂片进行普通步骤的免疫荧光染色。分别使用抗大鼠胰岛素，抗大鼠ki-67抗体进行双染，最后细胞核复染DAPI。在激光共聚焦显微镜下成像，根据胰岛素阳性（绿色）的细胞中，出现ki-67阳性（红色）占总β-细胞（绿色）的百分率测定细胞增殖率。
Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，可以标记细胞增殖状态其中，具有Ki67多肽的细胞为新增殖细胞，因此，通过检测细胞是否表达Ki67多肽即可确定其是否为新增殖细胞。
2、实验结果
如图1～3所示，本发明分离得到了胰岛细胞，纯度在80%以上，成活率达90%以上。
如图4～8所示：
与对照组（1640培养基中加DMSO）相比，在1640培养基中加入10nM的K50或K52（图4和图7）后，细胞增殖速度加快，说明终浓度为10nM的K50或K52可以促进大鼠胰岛β细胞的增殖；
与对照组（1640培养基中加DMSO）相比，在1640培养基中加入100nM的K50或K52（图5和图7）后，细胞增殖速度明显加快（P<0.05，n=4），说明终浓度为100nM的K50和K52可以促进大鼠胰岛β细胞的增殖；
与对照组（1640培养基中加DMSO）相比，在1640培养基中加入100μM的K50或K52（图6和图8）后，细胞增殖速度明显加快（P<0.05，n=3），说明终浓度为100μM的K50或K52可以促进大鼠胰岛β细胞的增殖；
如图7和图8所示，随着K50或K52浓度的增加，它们的促胰岛细胞增殖作用增强。
实验结果说明，本发明K50或者K52可以促进大鼠胰岛β细胞增殖，浓度大于等于100nM时，效果明显。
实施例2本发明培养液诱导INS-1细胞
1、实验方法
取购买的胰岛β细胞株INS-1，快速解冻后分装入60mm培养皿中，加入含100mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养基(含青霉素100kU/L、链霉素100mg/L、50μmol/L巯基乙醇、10mmol/L葡萄糖)，单层培养和孵化于50mL/L CO2培养箱中、37℃、950mL/L湿度条件下培养。细胞融合率90%左右以消化液（含0.25%Trypsin、0.53mM EDTA）消化，接种于96孔板，细胞密度为7000个/孔，培养至融合率为70%～80%，使用无血清培养基饥饿24h。
然后换为分别含10nM和100nM的K50和K52的RPMI1640培养基继续培养22h，以含0.1%DMSO的1640培养基作为对照组培养基，加入Brdu继续培养2h，然后按照BrdU ELISA试剂盒说明书进行实验，即细胞加核酸酶溶液于37℃孵育30min，以PBS冲洗细胞3次，用过氧化物酶标记BrdU抗体，37℃孵育30min。PBS冲洗细胞3次，以过氧化物酶底物室温染色15min。用酶标仪检测样本在490nm处的吸光度值。
用同样的方法对100nM的K51，K53，K54，K55，K56，K57进行试验，观察药物对INS-1细胞增殖的影响。
2、实验结果
如图9所示，与对照组（1640培养基中加DMSO）相比，在1640培养基中加入10nM的K50或K52后，INS-1胰岛β细胞增殖速度加快，加入100nM的K50或K52时，细胞增殖速度明显更快（P<0.05，n=3）；
如图10所示，与对照组（1640培养基中加DMSO）相比，在1640培养基中加入100nM的K51，K53，K54，K55，K56或K57后，INS-1胰岛β细胞增殖速度明显加快（P<0.05，n=3）。
实验结果说明，本发明K50、K51、K52、K53，K54，K55，K56，K57均可以促进胰岛β细胞的增殖。
综上，本发明化合物1～8可以有效促进胰岛细胞增殖，采用本发明培养液培养胰岛细胞，细胞增殖速度快，可快速得到大量胰岛细胞，为糖尿病患者的胰岛移植打下了良好的基础。

Claims (10)

1.一种促胰岛细胞增殖培养液，其特征在于：它以常用细胞培养基为基础培养基，添加有如下任意一种或者多种化合物：
化合物1：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-4-羧酸；
化合物2：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-3-羧酸；
化合物3：6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
化合物4：N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺；
化合物5：3-氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺；
化合物6：3-氨基-N-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基；
化合物7：1-(4-甲氧基苄基)-3-(5-硝基噻唑-2-基)尿素；
化合物8：N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：添加的化合物的终浓度不低于10nM。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于：所述化合物的终浓度不低于100nM。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于：所述化合物的终浓度为100nM～100μM。
5.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述常用细胞培养基是1640培养基、最低必须培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。
6.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述培养液中还添加有胰岛素样生长因子、上皮生长因子、青霉素、链霉素、巯基乙醇、葡萄糖或胎牛血清。
7.根据权利要求6所述的培养液，其特征在于：所述培养液中含有胰岛素样生长因子和上皮生长因子，其中，胰岛素样生长因子的终浓度为10ng/ml，上皮生长因子的终浓度为10ng/ml。
8.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述胰岛细胞为胰岛β细胞。
9.权利要求1～8任意一项所述培养液的制备方法，其特征在于：步骤如下：按照权利要求1～8任意一项所述配比取原料，混匀，即可。
10.如下化合物1～8中任意一种或者多种在制备促进胰岛细胞增殖的培养液中的用途：
化合物1：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-4-羧酸；
化合物2：1-（3-（3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基）吡啶-4-哌啶-3-羧酸；
化合物3：6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
化合物4：N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺；
化合物5：3-氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺；
化合物6：3-氨基-N-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基；
化合物7：1-(4-甲氧基苄基)-3-(5-硝基噻唑-2-基)尿素；
化合物8：N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺；
优选地，所述胰岛细胞为胰岛β细胞。
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