CN109749986A - 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法。在由人多能干细胞来源的内胚层细胞向胰腺谱系细胞特化过程中，通过阶段性加入WNT信号通路抑制剂可以提高人多能干细胞向胰腺前体细胞分化效率。本发明在提高胰腺前体细胞分化效率后，进而提高成熟的胰岛β细胞分化效率。该方法适用于不同细胞系的胰腺分化，获得大量胰岛β细胞，为糖尿病细胞治疗、药物筛选、疾病模型等提供有力的支持，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于干细胞和再生医学领域，涉及一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞和胰岛β细胞方法。
背景技术
糖尿病是以血糖升高为特征的代谢性疾病。无论是免疫损伤引起的β细胞缺失导致胰岛素分泌不足(T1D)，或是胰岛素抵抗产生的血糖升高(T2D)，最终都会产生β细胞的损伤(Lam and Cherney,2018)。据世界糖尿病联盟IDF在2017年的报道，现今已有4.25亿的糖尿病患者，而这个庞大的患病人群可能在2045年会增至6.29亿。糖尿病已经不再是一个健康风险问题，它早已成为一个全球性的社会危机。糖尿病不仅会引起血糖升高，同时也伴随着由糖尿病引起的并发症，给其家庭和社会带来种种负担。目前，糖尿病的治疗多数采用口服降糖药物，胰岛素注射，以及胰岛素泵等。传统的治疗手段都只能缓解糖尿病的高血糖症状，并不能从根本上治疗糖尿病。2000年，Shapiro等进行了胰岛分离后移植，再结合适宜的免疫抑制方案，达到了胰岛素非依赖的疗效(Shapiro et al.,2000)，后续观察也取得了非常好的效果(McCall and Shapiro,2012)。胰岛移植的方法可以从根本上治疗糖尿病，但是由于供体极度缺乏该方法并没能成为糖尿病的主要治疗手段。胚胎干细胞，作为一种具有多向分化潜能的干细胞，在体外通过相关的化学小分子和细胞生长因子的诱导，即可得到相对成熟且有功能的组织或器官。利用干细胞定向分化来得到组织和器官的方法同样可以用于糖尿病的治疗，为供体不足提供了新的解决方案。可见，如何获得从胚胎干细胞获得大量的、有功能的胰岛β细胞将极大利于糖尿病的细胞治疗。
特异性标记物的表达水平可用于指示细胞的分化阶段与成熟程度，胰腺前体细胞特征性转录因子标志物为：胰腺十二指肠同源盒1(PDX1)和NK6同源蛋白1(NKX6-1)共表达，PDX1的表达标志着细胞向胰腺方向分化，而PDX1和NKX6-1的表达标志着细胞分化成为胰腺前体细胞，是人胰腺发育过程中的关键标记物。胰岛β细胞的特征行标志物为转录因子PDX1持续表达和胰岛素(INS)，而转录因子PDX1和INS共同表达则标志着胰岛β细胞的成熟。
WNT信号通路是细胞内重要信号传导机制之一。该信号通路的活化可以引起β-catenin在细胞核内积累，β-catenin与TCF等转录因子结合可调节下游基因转录表达，因此影响细胞的增殖，分化，凋亡，迁徙。因此，在早期胚胎发育和器官形成中，WNT信号通路也起到了至关重要的作用。
由于胰腺以及胰岛β细胞分化的复杂性和不同体系之间的差异性，造成难以得到重复性好、高效的胰岛细胞分化方案，不能得到稳定的，大量的胰腺前体细胞。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高效的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞和胰岛β细胞方法。
本发明在定型内胚层向胰腺前体细胞分化阶段抑制WNT信号通路，建立的高效的胰腺前体细胞分化以及进一步胰岛β细胞分化的方案。
本发明阶段性诱导人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法示意图见附图1。
本发明具体技术方案步骤如下：
1)人多能干细胞分化为定型内胚层细胞：
a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人多能干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；
b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；
所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；
所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)，所述浓度均为终浓度。
2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：
配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、WNT信号通路抑制剂(对照组不加入)，所述浓度均为终浓度。
3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：
a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM硫酸锌，所述浓度均为终浓度；
所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(N-cys)，所述浓度均为终浓度。
所述的人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞。
进一步地，步骤2)中所述WNT信号通路抑制剂在实施例中为XAV-939或IWR-1。
进一步地，步骤2)中所述WNT信号通路抑制剂在实施例中的浓度为2μM。
本发明在人多能干细胞向胰腺前体细胞分化过程中，添加WNT信号通路抑制剂(简称WNT抑制剂)后，细胞生长并没有受到影响。经过免疫荧光染色，流式细胞术，荧光定量PCR分析，得到了较为可观的PDX1阳性的胰腺前体细胞，并且胰腺前体细胞的两种转录因子PDX1和NKX6-1表达量明显提高；进一步经过胰岛β细胞分化步骤，得到了表达胰岛素INSΜLIN(缩写INS)的胰岛β细胞，经荧光定量PCR分析，胰岛β细胞的胰岛素基因INS转录水平极大提高，免疫荧光染色可见胰岛β细胞存在PDX1蛋白(核定位)和INS蛋白(胞质定位)共染的情况。DAPI为核染料，用来标记细胞的整体数量。
在定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化过程中，加入包含WNT信号通路抑制剂在内的多种小分子/生长因子，WNT信号通路抑制剂抑制WNT信号通路，诱导人多能干细胞向胰腺前体细胞的高效分化，进而进一步分化为胰岛β细胞，从而为体外获得胰岛β细胞用于糖尿病的细胞治疗提供了有利方案。
附图说明
图1为本发明阶段性诱导人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法示意图。
图2为本发明实施例1流式细胞术检测PDX1阳性胰腺前体细胞数量结果图：
阴性对照组显示不加一抗的阴性对照；
无WNT抑制剂组为加入一抗不加WNT信号通路抑制剂XAV-939的对照组；
WNT抑制剂组为加入一抗且加入WNT信号通路抑制剂XAV-939的阳性组。
图3为本发明实施例1实时荧光定量PCR分析胰腺前体细胞PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量结果图。
图4为本发明实施例1免疫荧光染色分析胰腺前体细胞PDX1结果图：
图5为本发明实施例1实时荧光定量PCR分析胰岛β细胞INS的mRNA相对表达量结果图。
图6为本发明实施例1免疫荧光染色分析胰岛β细胞PDX1/INS结果图：
图7为本发明实施例2流式细胞术检测PDX1阳性胰腺前体细胞数量结果图：
阴性对照组显示不加一抗的阴性对照；
无WNT抑制剂组为加入一抗不加WNT信号通路抑制剂IWR-1的对照组；
WNT抑制剂组为加入一抗且加入WNT信号通路抑制剂IWR-1的阳性组。
图8为本发明实施例2实时荧光定量PCR分析胰腺前体细胞PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量结果图。
图9为本发明实施例2免疫荧光染色分析胰腺前体细胞PDX1结果图：
图10为本发明实施例2实时荧光定量PCR分析胰岛β细胞INS的mRNA相对表达量结果图。
图11为本发明实施例2免疫荧光染色分析胰岛β细胞PDX1/INS结果图：
图12为本发明实施例3流式细胞术检测PDX1阳性胰腺前体细胞数量结果图：
阴性对照组显示不加一抗的阴性对照；
无WNT抑制剂组为加入一抗不加WNT信号通路抑制剂XAV-939的对照组；
WNT抑制剂组为加入一抗且加入WNT信号通路抑制剂XAV-939的阳性组。
图13为本发明实施例3实时荧光定量PCR分析胰腺前体细胞PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量结果图。
图14为本发明实施例3免疫荧光染色分析胰腺前体细胞PDX1结果图：
图15为本发明实施例3实时荧光定量PCR分析胰岛β细胞INS的mRNA相对表达量结果图。
图16为本发明实施例3免疫荧光染色分析胰岛β细胞PDX1/INS结果图：
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步描述，所提供的实施例仅是对本方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1人胚胎干细胞在WNT信号通路抑制剂XAV-939诱导下分化为胰腺前体细胞和成熟胰岛β细胞
(1)细胞分化
1)人胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞：
a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人胚胎干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；
b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；
所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；
所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)，所述浓度均为终浓度。
2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：
配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、2μM WNT信号通路抑制剂XAV-939(对照组不加入)，所述浓度均为终浓度。
3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：
a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM硫酸锌，所述浓度均为终浓度；
所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(N-cys)，所述浓度均为终浓度。
(2)流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1表达情况
将胰腺前体细胞阶段培养板上培养的贴壁细胞用不含钙、镁离子的PBS(即DPBS)洗3次，去除剩余的培养基，用0.05％胰糜蛋白酶(Trypsin)覆盖细胞，放置于37℃培养箱内，消化10分钟，随后用含有2％的胎牛血清(FBS)的DPBS终止消化，小心吹打成单细胞悬液，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀；用2％FBS的DPBS重悬细胞沉淀，小心吹打混匀后，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀，再重复操作1次；配制细胞转录因子试剂盒中的打孔试剂(现用现配，注意避光)，使用1ml打孔试剂轻轻吹打，重悬细胞沉淀，避光放置于冰上，打孔40分钟；用提前配制的细胞转录因子打孔试剂盒中的洗涤剂1ml终止打孔，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀；向沉淀中加入1ml洗涤剂，重悬细胞，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀，重复操作1次；加入用洗涤剂稀释好的工作浓度一抗，放置于旋转混匀仪上，4℃过夜；次日，从4℃取出，复温30分钟后，用1ml洗涤剂终止一抗，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入洗涤剂1ml，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀，重复操作1次，保留沉淀，每次吸出上清时密切观察，切勿吸到细胞沉淀；加入用洗涤剂稀释好的荧光二抗，室温下放置于旋转混匀仪上，敷育2小时；用1ml洗涤剂终止二抗，3000rpm离心5分钟，去掉上清，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入洗涤剂1ml，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀，重复操作1次，保留沉淀；用200μl的DPBS轻轻吹打细胞沉淀，转移到流式管中；使用FACSCelesta流式细胞分析仪进行样品分析。本研究中用到的一抗如下：人PDX-1/IPF1抗体(AF2419，1:500，RD)；本研究中用到的二抗如下：驴抗山羊PE荧光染料(115-035-003，1:200，Jackson ImmunoResearch)。
流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1表达情况，结果如附图2显示，与未加WNT信号通路抑制剂的对照组相比，加入WNT信号通路抑制剂XAV-939后PDX1阳性胰腺前体细胞明显增多。
(3)实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量，检测成熟胰岛β细胞阶段的INS的mRNA相对表达量
1)细胞总RNA提取
收集24孔板中培养的细胞，首先用500μl DPBS清洗2遍，用200μl胰糜蛋白酶(Trypsin)覆盖细胞，放置于37℃，消化5分钟，观察细胞是否成片飘起，用500μl DMEM/F12培养基终止消化，离心1000rpm离心3分钟，去除上清，收集细胞沉淀加入新的无RNA酶的离心管中。使用总RNA快速小量抽提试剂盒中裂解液，每管加入350μl裂解液后使用移液枪混匀(避免过度吹打产生气泡)，或使用漩涡混匀器打散细胞，以使细胞充分裂解；室温下，14,000×g离心5分钟；取离心后液体加入等体积的提前加入无水乙醇的RNA结合剂至每个离心管中，移液枪吹打5次，将吹打混匀的液体转移到高纯化RNA柱子并装在2ml收集管中12,000×g离心1分钟；倒弃滤液，把柱子放回到收集管中，加入500μl试剂盒洗涤剂1至柱子上，12,000×g离心1分钟，倒弃滤液，把柱子放回到收集管中，加入500μl试剂盒洗涤剂2(已用乙醇稀释)，随后使用12,000×g离心1分钟，重复加入500μl试剂盒洗涤剂2的操作一次；倒弃滤液，把柱子装回收集管，12,000×g离心2分钟；将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl无RNA酶的水至柱子膜中央，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，重复上述操作一次，以便提高RNA洗脱效率。弃去柱子，把RNA保存于-80℃超低温冰箱。
2)cDNA的制备
上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度(A260/A280吸光度比率>1.8)，使用Biotool厂家的逆转录试剂盒获取cDNA：取出总的RNA放置于冰上，并且根据浓度计算出反转录1μg RNA需要的体积，加入相应体积的RNA；随后加入4μl的5×qRT反转录混合剂，其余部分用无RNA酶的水补足，得到20μl总体积的反转录混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离至1.5ml离心管底部，使用普通Bio-rad的PCR仪进行反转录，反应条件为：25℃10min，42℃ 30min，85℃ 5min，之后-20℃条件保存。
3)SYBR Green实时荧光定量PCR检测PDX1、NKX6-1和INS的mRNA相对表达情况
取50ng上述反转录得到的cDNA，加入2×SYBR Green qPCR混合物5μl，上游引物5μM，下游引物5μM，其余部分用无RNA酶的水补足10μl总体积；使用CFX384Bio-rad型号的定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 30s，重复39个循环，95℃ 15s，65℃ 15s结束。实验结果使用△△CT方法对比管家基因GAPDH进行分析。本研究中用到的引物：GAPDH前向引物AATGAAGGGGTCATTGATGG，反向引物AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA；PDX1前向引物TTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTT，反向引物GGCCACTGTGCTTGTCTTCA；NKX6-1前向引物AGACCCACTTTTTCCGGACA，反向引物CCAACGAATAGGCCAAACGA；INSΜLIN前向引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC，反向引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA。
实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量，结果如附图3所示：在由定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化阶段中，胰腺前体细胞的标记物PDX1和其下游基因NKX6-1的mRNA在WNT信号通路抑制剂XAV-939作用后有显著提高；
实时荧光定量PCR检测成熟胰岛β细胞阶段的INS的mRNA相对表达量，结果如附图5所示：在由胰腺前体细胞向成熟胰岛β细胞进一步分化过程中，成熟胰岛β细胞阶段的胰岛素基因INS的转录水平极大提高。
(4)免疫荧光检测胰腺前体细胞阶段PDX1蛋白和成熟胰岛β细胞阶段PDX1/INS蛋白表达情况
将培养板中的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3分钟；用4％的多聚甲醛室温固定细胞20分钟，在用PBS洗涤3次，每次3分钟；预先配置封闭液：向9ml DPBS中加入终浓度为0.3％曲拉通，加入终浓度为10％驴血清，混匀；使用上述配制好的封闭液，室温封闭打孔2小时；吸干封闭液后加入封闭液配制的工作浓度一抗，室温放置30分钟后，放入4℃冰箱过夜；次日用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入驴血清的荧光二抗，室温孵育2小时；同样的方法，用PBS洗涤3次，每次3分钟；用核染料DAPI工作液室温孵育10分钟后，用PBS洗涤3次，每次3分钟；使用荧光显微镜观察并收集数据。本研究中用到的一抗如下：人PDX-1/IPF1抗体(AF2419，1:1000，RD)；Anti-PDX1(ab47267，1:200，Abcam)；Anti-PDX1(ab47383，1:1000，Abcam)；胰岛素抗体(SC-29062，1:100，SantaCruz)。本研究中用到的荧光二抗如下：驴抗山羊TRITC荧光染料(705-025-147，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗山羊FITC荧光染料(705-095-003，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗山羊488荧光染(705-545-147，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗兔TRITC荧光染料(711-025-152，1:200，JacksonImmunoResearch)；驴抗兔488荧光染料(705-095-152，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗鼠FITC荧光染料(715-095-150，1:200，Jackson ImmunoResearch)；核染料：DAPI(罗氏，USA)。
免疫荧光检测胰腺前体细胞阶段PDX1蛋白表达情况，结果如附图4显示：可见添加WNT信号通路抑制剂后未影响细胞生长情况，PDX1阳性的胰腺前体细胞在加入WNT信号通路抑制剂XAV-939后显著增加；
免疫荧光检测成熟胰岛β细胞阶段PDX1/INS蛋白表达情况，结果如附图6显示：可见在胰腺前体细胞阶段WNT信号通路抑制剂XAV-939作用后，成熟胰岛β细胞阶段胰岛素INS阳性和PDX1共染的胰岛β细胞数量明显增加。
结果表明，引入本发明提供的阶段性WNT信号通路抑制剂，可以大大提高成熟胰岛β细胞数量。
实施例2人胚胎干细胞在WNT信号通路抑制剂IWR-1诱导下分化为胰腺前体细胞和胰岛β细胞
(1)细胞分化
1)人胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞：
a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人胚胎干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；
b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；
所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；
所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)，所述浓度均为终浓度。
2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：
配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、2μM WNT信号通路抑制剂IWR-1(对照组不加入)，所述浓度均为终浓度。
3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：
a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM硫酸锌，所述浓度均为终浓度；
所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(N-cys)，所述浓度均为终浓度。
(2)流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1表达情况
将胰腺前体细胞阶段培养板上培养的贴壁细胞用不含钙、镁离子的PBS(即DPBS)洗3次，去除剩余的培养基，用0.05％胰糜蛋白酶(Trypsin)覆盖细胞，放置于37℃培养箱内，消化10分钟，随后用含有2％的胎牛血清(FBS)的DPBS终止消化，小心吹打成单细胞悬液，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀；用2％FBS的DPBS重悬细胞沉淀，小心吹打混匀后，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀，再重复操作1次；配制细胞转录因子试剂盒中的打孔试剂(现用现配，注意避光)，使用1ml打孔试剂轻轻吹打，重悬细胞沉淀，避光放置于冰上，打孔40分钟；用提前配制的细胞转录因子打孔试剂盒中的洗涤剂1ml终止打孔，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀；向沉淀中加入1ml洗涤剂，重悬细胞，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀，重复操作1次；加入用洗涤剂稀释好的工作浓度一抗，放置于旋转混匀仪上，4℃过夜；次日，从4℃取出，复温30分钟后，用1ml洗涤剂终止一抗，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入洗涤剂1ml，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀，重复操作1次，保留沉淀，每次吸出上清时密切观察，切勿吸到细胞沉淀；加入用洗涤剂稀释好的荧光二抗，室温下放置于旋转混匀仪上，敷育2小时；用1ml洗涤剂终止二抗，3000rpm离心5分钟，去掉上清，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入洗涤剂1ml，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀，重复操作1次，保留沉淀；用200μl的DPBS轻轻吹打细胞沉淀，转移到流式管中；使用FACSCelesta流式细胞分析仪进行样品分析。本研究中用到的一抗如下：人PDX-1/IPF1抗体(AF2419，1:500，RD)；本研究中用到的二抗如下：驴抗山羊PE荧光染料(115-035-003，1:200，Jackson ImmunoResearch)。
流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1表达情况，结果如附图7所示，与未加WNT信号通路抑制剂的对照组相比，加入WNT信号通路抑制剂IWR-1后PDX1阳性胰腺前体细胞明显增多。
(3)实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量，检测成熟胰岛β细胞阶段的INS的mRNA相对表达量
1)细胞总RNA提取
收集24孔板中培养的细胞，首先用500μl DPBS清洗2遍，用200μl胰糜蛋白酶(Trypsin)覆盖细胞，放置于37℃，消化5分钟，观察细胞是否成片飘起，用500μl DMEM/F12培养基终止消化，离心1000rpm离心3分钟，去除上清，收集细胞沉淀加入新的无RNA酶的离心管中。使用总RNA快速小量抽提试剂盒中裂解液，每管加入350μl裂解液后使用移液枪混匀(避免过度吹打产生气泡)，或使用漩涡混匀器打散细胞，以使细胞充分裂解；室温下，14,000×g离心5分钟；取离心后液体加入等体积的提前加入无水乙醇的RNA结合剂至每个离心管中，移液枪吹打5次，将吹打混匀的液体转移到高纯化RNA柱子并装在2ml收集管中12,000×g离心1分钟；倒弃滤液，把柱子放回到收集管中，加入500μl试剂盒洗涤剂1至柱子上，12,000×g离心1分钟，倒弃滤液，把柱子放回到收集管中，加入500μl试剂盒洗涤剂2(已用乙醇稀释)，随后使用12,000×g离心1分钟，重复加入500μl试剂盒洗涤剂2的操作一次；倒弃滤液，把柱子装回收集管，12,000×g离心2分钟；将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl无RNA酶的水至柱子膜中央，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，重复上述操作一次，以便提高RNA洗脱效率。弃去柱子，把RNA保存于-80℃超低温冰箱。
2)cDNA的制备
上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度(A260/A280吸光度比率>1.8)，使用Biotool厂家的逆转录试剂盒获取cDNA：取出总的RNA放置于冰上，并且根据浓度计算出反转录1μg RNA需要的体积，加入相应体积的RNA；随后加入4μl的5×qRT反转录混合剂，其余部分用无RNA酶的水补足，得到20μl总体积的反转录混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离至1.5ml离心管底部，使用普通Bio-rad的PCR仪进行反转录，反应条件为：25℃10min，42℃ 30min，85℃ 5min，之后-20℃条件保存。
3)SYBR Green实时荧光定量PCR检测PDX1、NKX6-1和INS的mRNA相对表达情况
取50ng上述反转录得到的cDNA，加入2×SYBR Green qPCR混合物5μl，上游引物5μM，下游引物5μM，其余部分用无RNA酶的水补足10μl总体积；使用CFX384Bio-rad型号的定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 30s，重复39个循环，95℃ 15s，65℃ 15s结束。实验结果使用△△CT方法对比管家基因GAPDH进行分析。本研究中用到的引物：GAPDH前向引物AATGAAGGGGTCATTGATGG，反向引物AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA；PDX1前向引物TTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTT，反向引物GGCCACTGTGCTTGTCTTCA；NKX6-1前向引物AGACCCACTTTTTCCGGACA，反向引物CCAACGAATAGGCCAAACGA；INSΜLIN前向引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC，反向引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA。
实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量，结果如附图8显示，在由定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化阶段中，胰腺前体细胞的标记物PDX1和其下游基因NKX6-1的mRNA在WNT信号通路抑制剂IWR-1作用后有显著提高；
实时荧光定量PCR检测成熟胰岛β细胞阶段的INS的mRNA相对表达量，结果如附图10显示，在其后由胰腺前体细胞向成熟胰岛β细胞进一步分化过程中，成熟胰岛β细胞阶段的胰岛素基因INS的转录水平极大提高。
(4)免疫荧光检测胰腺前体细胞阶段PDX1蛋白和成熟胰岛β细胞阶段PDX1/INS蛋白表达情况
将培养板中的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3分钟；用4％的多聚甲醛室温固定细胞20分钟，在用PBS洗涤3次，每次3分钟；预先配置封闭液：向9ml DPBS中加入终浓度为0.3％曲拉通，加入终浓度为10％驴血清，混匀；使用上述配制好的封闭液，室温封闭打孔2小时；吸干封闭液后加入封闭液配制的工作浓度一抗，室温放置30分钟后，放入4℃冰箱过夜；次日用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入驴血清的荧光二抗，室温孵育2小时；同样的方法，用PBS洗涤3次，每次3分钟；用核染料DAPI工作液室温孵育10分钟后，用PBS洗涤3次，每次3分钟；使用荧光显微镜观察并收集数据。本研究中用到的一抗如下：人PDX-1/IPF1抗体(AF2419，1:1000，RD)；Anti-PDX1(ab47267，1:200，Abcam)；Anti-PDX1(ab47383，1:1000，Abcam)；胰岛素抗体(SC-29062，1:100，SantaCruz)。本研究中用到的荧光二抗如下：驴抗山羊TRITC荧光染料(705-025-147，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗山羊FITC荧光染料(705-095-003，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗山羊488荧光染(705-545-147，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗兔TRITC荧光染料(711-025-152，1:200，JacksonImmunoResearch)；驴抗兔488荧光染料(705-095-152，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗鼠FITC荧光染料(715-095-150，1:200，Jackson ImmunoResearch)；核染料：DAPI(罗氏，USA)。
免疫荧光检测胰腺前体细胞阶段PDX1蛋白表达情况，结果如附图9显示，可见添加WNT信号通路抑制剂后未影响细胞生长情况，PDX1阳性的胰腺前体细胞在加入WNT信号通路抑制剂IWR-1后显著增加；
免疫荧光检测胰成熟胰岛β细胞阶段PDX1/INS蛋白表达情况，结果如附图11显示，可见在胰腺前体细胞阶段WNT信号通路抑制剂IWR-1作用后，成熟胰岛β细胞阶段胰岛素INS阳性和PDX1共染的胰岛β细胞数量明显增加。
结果表明，引入本发明提供的阶段性WNT信号通路抑制剂，可以大大提高成熟胰岛β细胞数量。
实施例3人诱导多能干细胞在WNT信号通路抑制剂XAV-939诱导下分化为胰腺前体细胞和成熟胰岛β细胞
(1)细胞分化
1)人诱导多能干细胞分化为定型内胚层细胞：
a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人诱导多能干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；
b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；
所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；
所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)，所述浓度均为终浓度。
2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：
配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、2μM WNT信号通路抑制剂XAV-939(对照组不加入)，所述浓度均为终浓度。
3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：
a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM硫酸锌，所述浓度均为终浓度；
所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(N-cys)，所述浓度均为终浓度。
(2)流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1表达情况
将胰腺前体细胞阶段培养板上培养的贴壁细胞用不含钙、镁离子的PBS(即DPBS)洗3次，去除剩余的培养基，用0.05％胰糜蛋白酶(Trypsin)覆盖细胞，放置于37℃培养箱内，消化10分钟，随后用含有2％的胎牛血清(FBS)的DPBS终止消化，小心吹打成单细胞悬液，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀；用2％FBS的DPBS重悬细胞沉淀，小心吹打混匀后，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀，再重复操作1次；配制细胞转录因子试剂盒中的打孔试剂(现用现配，注意避光)，使用1ml打孔试剂轻轻吹打，重悬细胞沉淀，避光放置于冰上，打孔40分钟；用提前配制的细胞转录因子打孔试剂盒中的洗涤剂1ml终止打孔，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀；向沉淀中加入1ml洗涤剂，重悬细胞，3000rpm离心5分钟，去除上清，留下细胞沉淀，重复操作1次；加入用洗涤剂稀释好的工作浓度一抗，放置于旋转混匀仪上，4℃过夜；次日，从4℃取出，复温30分钟后，用1ml洗涤剂终止一抗，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入洗涤剂1ml，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀，重复操作1次，保留沉淀，每次吸出上清时密切观察，切勿吸到细胞沉淀；加入用洗涤剂稀释好的荧光二抗，室温下放置于旋转混匀仪上，敷育2小时；用1ml洗涤剂终止二抗，3000rpm离心5分钟，去掉上清，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入洗涤剂1ml，3000rpm离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀，重复操作1次，保留沉淀；用200μl的DPBS轻轻吹打细胞沉淀，转移到流式管中；使用FACSCelesta流式细胞分析仪进行样品分析。本研究中用到的一抗如下：人PDX-1/IPF1抗体(AF2419，1:500，RD)；本研究中用到的二抗如下：驴抗山羊PE荧光染料(115-035-003，1:200，Jackson ImmunoResearch)。
流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1表达情况，结果如附图12所示，与未加WNT信号通路抑制剂的对照组相比，加入WNT信号通路抑制剂XAV-939后PDX1阳性胰腺前体细胞明显增多。
(3)实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量，检测成熟胰岛β细胞阶段的INS的mRNA相对表达量
1)细胞总RNA提取
收集24孔板中培养的细胞，首先用500μl DPBS清洗2遍，用200μl胰糜蛋白酶(Trypsin)覆盖细胞，放置于37℃，消化5分钟，观察细胞是否成片飘起，用500μl DMEM/F12培养基终止消化，离心1000rpm离心3分钟，去除上清，收集细胞沉淀加入新的无RNA酶的离心管中。使用总RNA快速小量抽提试剂盒中裂解液，每管加入350μl裂解液后使用移液枪混匀(避免过度吹打产生气泡)，或使用漩涡混匀器打散细胞，以使细胞充分裂解；室温下，14,000×g离心5分钟；取离心后液体加入等体积的提前加入无水乙醇的RNA结合剂至每个离心管中，移液枪吹打5次，将吹打混匀的液体转移到高纯化RNA柱子并装在2ml收集管中12,000×g离心1分钟；倒弃滤液，把柱子放回到收集管中，加入500μl试剂盒洗涤剂1至柱子上，12,000×g离心1分钟，倒弃滤液，把柱子放回到收集管中，加入500μl试剂盒洗涤剂2(已用乙醇稀释)，随后使用12,000×g离心1分钟，重复加入500μl试剂盒洗涤剂2的操作一次；倒弃滤液，把柱子装回收集管，12,000×g离心2分钟；将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl无RNA酶的水至柱子膜中央，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，重复上述操作一次，以便提高RNA洗脱效率。弃去柱子，把RNA保存于-80℃超低温冰箱。
2)cDNA的制备
上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度(A260/A280吸光度比率>1.8)，使用Biotool厂家的逆转录试剂盒获取cDNA：取出总的RNA放置于冰上，并且根据浓度计算出反转录1μg RNA需要的体积，加入相应体积的RNA；随后加入4μl的5×qRT反转录混合剂，其余部分用无RNA酶的水补足，得到20μl总体积的反转录混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离至1.5ml离心管底部，使用普通Bio-rad的PCR仪进行反转录，反应条件为：25℃10min，42℃ 30min，85℃ 5min，之后-20℃条件保存。
3)SYBR Green实时荧光定量PCR检测PDX1、NKX6-1和INS的mRNA相对表达情况
取50ng上述反转录得到的cDNA，加入2×SYBR Green qPCR混合物5μl，上游引物5μM，下游引物5μM，其余部分用无RNA酶的水补足10μl总体积；使用CFX384Bio-rad型号的定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 30s，重复39个循环，95℃ 15s，65℃ 15s结束。实验结果使用△△CT方法对比管家基因GAPDH进行分析。本研究中用到的引物：GAPDH前向引物AATGAAGGGGTCATTGATGG，反向引物AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA；PDX1前向引物TTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTT，反向引物GGCCACTGTGCTTGTCTTCA；NKX6-1前向引物AGACCCACTTTTTCCGGACA，反向引物CCAACGAATAGGCCAAACGA；INSΜLIN前向引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC，反向引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA。
实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6-1的mRNA相对表达量，结果如附图13显示：在由定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化阶段中，胰腺前体细胞的标记物PDX1和其下游基因NKX6-1的mRNA在WNT信号通路抑制剂XAV-939作用后有显著提高；
实时荧光定量PCR检测成熟胰岛β细胞阶段的INS的mRNA相对表达量，结果如附图15显示：在其后由胰腺前体细胞向成熟胰岛β细胞进一步分化过程中，成熟胰岛β细胞阶段的胰岛素基因INS的转录水平极大提高。
(4)免疫荧光检测胰腺前体细胞阶段PDX1蛋白和成熟胰岛β细胞阶段PDX1/INS蛋白表达情况
将培养板中的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3分钟；用4％的多聚甲醛室温固定细胞20分钟，在用PBS洗涤3次，每次3分钟；预先配置封闭液：向9ml DPBS中加入终浓度为0.3％曲拉通，加入终浓度为10％驴血清，混匀；使用上述配制好的封闭液，室温封闭打孔2小时；吸干封闭液后加入封闭液配制的工作浓度一抗，室温放置30分钟后，放入4℃冰箱过夜；次日用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入驴血清的荧光二抗，室温孵育2小时；同样的方法，用PBS洗涤3次，每次3分钟；用核染料DAPI工作液室温孵育10分钟后，用PBS洗涤3次，每次3分钟；使用荧光显微镜观察并收集数据。本研究中用到的一抗如下：人PDX-1/IPF1抗体(AF2419，1:1000，RD)；Anti-PDX1(ab47267，1:200，Abcam)；Anti-PDX1(ab47383，1:1000，Abcam)；胰岛素抗体(SC-29062，1:100，SantaCruz)。本研究中用到的荧光二抗如下：驴抗山羊TRITC荧光染料(705-025-147，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗山羊FITC荧光染料(705-095-003，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗山羊488荧光染(705-545-147，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗兔TRITC荧光染料(711-025-152，1:200，JacksonImmunoResearch)；驴抗兔488荧光染料(705-095-152，1:200，Jackson ImmunoResearch)；驴抗鼠FITC荧光染料(715-095-150，1:200，Jackson ImmunoResearch)；核染料：DAPI(罗氏，USA)。
免疫荧光检测胰腺前体细胞阶段PDX1蛋白表达情况，结果如附图14显示：可见添加WNT信号通路抑制剂后未影响细胞生长情况，PDX1阳性的胰腺前体细胞在加入WNT信号通路抑制剂XAV-939后显著增加。
免疫荧光检测成熟胰岛β细胞阶段PDX1/INS蛋白表达情况，结果如附图16显示：可见在胰腺前体细胞阶段WNT信号通路抑制剂XAV-939作用后，成熟胰岛β细胞阶段胰岛素INS阳性和PDX1共染的胰岛β细胞数量明显增加。
结果表明，引入本发明提供的阶段性WNT信号通路抑制剂，可以大大提高成熟胰岛β细胞数量。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgaagggg tcattgatgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggtgaagg tcggagtcaa 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaggatgtg gacgtaattc ctgtt 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccactgtg cttgtcttca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agacccactt tttccggaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaacgaata ggccaaacga 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagcctttg tgaaccaaca c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccccgcacac taggtagaga 20
Claims (6)
1.一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述的方法步骤为：
1)人多能干细胞分化为定型内胚层细胞：
a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人多能干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；
b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；
所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；
所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)，所述浓度均为终浓度；
2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：
配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、WNT信号通路抑制剂，所述浓度均为终浓度；
3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：
a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；
所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM硫酸锌，所述浓度均为终浓度；
所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(N-cys)，所述浓度均为终浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人胚胎干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人诱导多能干细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的WNT信号通路抑制剂为XAV-939或IWR-1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的WNT信号通路抑制剂为XAV-939。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的WNT信号通路抑制剂浓度为2μM。
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Application publication date: 20190514 Assignee: Harbin Beike Health Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN BEIKE BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Contract record no.: X2023440020002 Denomination of invention: A kind of pancreatic precursor cells and islets derived from human pluripotent stem cells b Cell method Granted publication date: 20210402 License type: Common License Record date: 20230116 |
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Effective date of registration: 20230802 Address after: 518063 North Science Building 1502, No. 59 Gaoxin South 9th Road, Gaoxin Community, Yuehai Street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Province Patentee after: Shenzhen Beikeyuan Cell Technology Co.,Ltd. Address before: 518057 16th floor, Beike building, No. 59, Gaoxin South ninth Road, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Patentee before: SHENZHEN BEIKE BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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