CN103881962A

CN103881962A - 建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法

Info

Publication number: CN103881962A
Application number: CN201410138851.2A
Authority: CN
Inventors: 效梅; 安立龙
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明涉及一种建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，属于动物细胞（组织）工程领域。胶原酶消化成年大鼠胰腺组织，Dextron不连续密度梯度离心，RPMI1640有血清培养，胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长，克隆环筛选，上皮样干细胞纯化，胰蛋白酶消化液消化传代，建立细胞系；采用该方法建立的一例大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的特征是细胞贴壁呈多角形上皮样，克隆性生长，是正常的二倍体细胞，在蛋白水平表达增殖细胞核抗原、八聚体转录因子4、干细胞关键蛋白、角蛋白19和神经源性分化因子2，具有多分化潜能，无致瘤性。

Description

建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法

技术领域

本发明涉及建立人类和其它哺乳动物胰腺导管干细胞系的方法，特别涉及一种建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，属于动物细胞（组织）工程领域。

背景技术

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是危害人类健康的重大疾病之一，据统计目前全世界糖尿病患者已达3.46亿(Am J Stem Cells.2012,1(3):196-204.)，而传统的药物及胰岛素替代疗法却不能从根本上医治该病。近十年来，随着移植技术的发展，胰岛移植治疗糖尿病取得了一定的疗效（N Engl J Med.2000,343(4):230-238. Diabetes. 2005, 54(7): 2060-2069. Am J Transplant.2008,8(11):2463-2470. Immune Netw. 2013,13(6):235-239.）。但是，由于供体来源短缺，胰岛移植治疗糖尿病技术的应用受到制约。胰腺导管干细胞是存在于胰腺导管组织中的成体干细胞，能自我更新并具有多分化潜能。体外分离克隆胰腺导管干细胞，诱导其分化形成功能性胰岛，并移植治疗糖尿病是有效解决供体短缺的途径之一。目前，建立胰腺导管干细胞系，研究胰腺导管干细胞分化形成功能性胰岛移植治疗糖尿病已成为焦点。国外，Ramiya等（Nat Med.2000,6(3):278-282. J Hepatobiliary Pancreat Surg.2002,9(6): 704-709.）首先报道胶原酶消化NOD小鼠胰腺组织，手工分离胰腺导管，消化获得单个细胞和细胞团，无糖、高氨基酸培养液扩增培养形成单层；体外诱导，这些细胞产生小而圆的胰岛祖细胞（islet progenitor cells，IPCs），继续培养，这些小细胞进一步形成胰岛（IPC-derived islets）；RT-PCR扩增表明IPCs和IPC-derived islets转录胰岛素Ⅰ、Ⅱ等因子，也表达与胰岛发育和分化有关的因子Pdx1、β-半乳糖苷酶和酪氨酸羟化酶等。葡萄糖刺激，IPC-derived islets释放insulin；将300个IPC-derived islets移植在NOD成年小鼠肾囊内，能降低NOD小鼠血糖，抗糖尿病。Bonner-Weir等（Sci Med.2000,97(14):7999- 8004. Pediatric Diabetes.2004,5(Supppl2):16-22.）采用Ricordi分离法，成人胰腺导管插管，向胰尾组织内注入1～2g/LⅤ型胶原酶（2mL/g胰腺组织），并将胰尾放入30℃Hank′缓冲液中，消化20～30min；0.5mm孔径滤沙过滤，离心，收集组织碎片和细胞；以Histopaque作不连续密度梯度离心，收集位于1.098～1.119g/mL界面间的细胞，分离出胰腺导管上皮细胞；CMRL1066+10%FBS培养液贴壁培养，部分上皮样细胞形成单层后，换用无血清DMEM/F12+1g/LITS（5mg/Linsulin+5mg/L转铁蛋白+5mg/L硒）+2g/L牛血清白蛋白+10mM烟酰胺+10ng/mL角质细胞生长因子+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素培养液扩增培养；免疫化学反应显示上皮样细胞表达CK19，少量散在细胞表达insulin和Pdx1；体外诱导培养，上皮样细胞分化形成双硫腙（dithizone，DTZ）染色阳性，且分泌insulin的胰岛细胞团。Rovira等（Proc Natl Acad Sci USA.2010,107(1):75-80. Development.2005, 132(16):3767-3776.）无菌取成年小鼠完整胰腺，0.2mg/mL胶原酶消化，500μm和105μm孔径滤膜过滤，离心，WaymouthsMB752 +10%FBS +50%RTC+0.1mg/mL胰蛋白酶抑制剂+1μg/mL地塞米松+1000U/mL青霉素+100μg/mL链霉素培养液重悬细胞，置于37°C、5%CO₂培养箱中培养14d；采用ALDH1荧光标记和干细胞鉴定试剂盒，并通过流式细胞仪筛选，获得来源于小鼠胰腺导管末端/泡心部干细胞；PCR检测该干细胞表达Sca-1、Sdf1、c-Met、nestin和Sox9基因；体外定向诱导，干细胞分化形成腺泡细胞，产生淀粉酶；分化形成胰岛细胞，糖刺激，分泌insulin。Huch等（EMBO J.2013,32(20):2708-2721.）结扎成年小鼠部分胰腺导管，制备胰腺导管干细胞增殖修复模型。无菌取胰腺组织，0.3mg/mLXI型胶原酶消化，分离获得单个细胞；筛选去除上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)表达阴性细胞和白细胞分化抗原45、31（cluster of differentiation45、31，CD45、31）表达阳性细胞，筛选去除EpCAM阳性和Zn⁺螯合物TSQ（6-methoxy-8-p-toluenesulfonamido- quilone，TSQ）阳性细胞，再筛选去除insulin启动子表达阳性细胞后，获得纯度>99.6%的胰腺导管上皮样干细胞（EpCAM⁺、TSQ⁻）；体外培养，这些干细胞已扩增10个月；核型分析，细胞染色体数正常；流式细胞术检测表达成体干细胞标记物Lgr5；移植在裸鼠肾囊内，干细胞分化形成胰腺导管细胞和胰岛内分泌细胞。Lee等（Elife.2013 Nov 19;2:e00940. doi:10.7554/eLife.00940.）采用去除胰岛后的剩余人胰腺组织，0.05%胰蛋白酶、1U/mLdispase依次消化，收集细胞，CD133标记，流式细胞术分选；RT-PCR检测分选出的细胞共表达CK19，不表达腺泡细胞和胰岛细胞标记物，证实分离获得人胰腺导管细胞；DMEM/F-12+50ng/mLEGF+500ng/mLSpondinI+ 50ng/mLFGF10+100ng/mLNoggin+10mM尼克酰胺培养液扩增，人胰腺导管细胞呈对数生长，传7代；构建Neurog3腺病毒载体，转染，人胰腺导管细胞转分化形成胰岛细胞，分泌insulin；将诱导胰岛移植在NOD成年小鼠肾囊内，糖刺激，分泌人insulin。国内，效梅等（中国科学C辑:生命科学.2008,38(8):699-707. Science in China Series C: Life Science.2008,51(9):779-788. 分子细胞生物学报.2008,41(6):450-457. 分子细胞生物学报.2008,41(6):457-464. 解剖学报.2009, 40(2):55-58. 中国兽医学报.2009,29(2): 191-195.）报道Ⅳ型胶原酶消化人胎儿胰腺组织20～40min，收集单个细胞和细胞团，低糖DMEM+3.7g/LNaHCO₃+10%FBS+0.08g/L青霉素+0.1g/L链霉素培养液培养。当原代上皮样胰腺干细胞长出后，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，传代。在传代中逐渐消除成纤维样细胞和其他细胞，纯化上皮样胰腺干细胞。采用克隆环筛选出典型的单克隆人胰腺干细胞，培养液中添加10ng/mLEGF扩增培养，建立人胎儿胰腺干细胞系。免疫化学反应和RT-PCR检测该干细胞表达Pdx1、glucagon、nestin及CK19，不表达insulin、CD34、CD44及CD45。β-巯基乙醇体外诱导，分化形成神经细胞，表达NF。烟酰胺诱导，分化形成DTZ染色阳性，分泌insulin和C肽的功能性类胰岛。将单克隆人胰腺干细胞体外诱导胰岛移植在STZ制备的糖尿病大鼠肾囊内，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延长寿命。李娟等（现代生物医学进展.2009,9(11):2024-2026.）胶原酶消化人胰腺组织，Ficoll密度梯度离心，收集细胞，用含10％FBS的CMRL1066培养液培养，7～10d，较纯的鹅卵石样胰腺导管干细胞扩增至单层，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化传代。取2～3代细胞，荧光免疫化学反应和RT-PCR检测分离的人胰腺导管干细胞表达CK19、Pdx1和nestin，不表达insulin和glucagon。陈海燕等（南京医科大学学报:自然科学版.2008,28(3):273-277）V型胶原酶灌注消化成年大鼠胰腺组织，Ficoll密度梯度离心去除胰岛，获得较纯的胰腺导管细胞。采用含10%NBS的RPMI1640培养液培养，0.25％胰蛋白酶消化液消化传代，获得第2代细胞。荧光免疫化学反应显示大鼠胰腺导管细胞表达CKl9、Pdx1和nestin，不表达insulin、glucagon。RT-PCR进一步证实该细胞转录CKl9、Pdx1和nestin基因。陈旭春等（中华器官移植杂志.2012,33(6):371-375.）V型胶原酶消化分离大鼠胰腺组织，不连续密度梯度离心，初步分离胰腺导管细胞与胰岛细胞。采用动力性三维培养技术进行培养，获得胰腺导管来源干细胞，进行扩增培养、连续传代和纯化，建立细胞系。该细胞是单核细胞，成纤维样贴壁生长，表达CD29、CD73、CD90和CD105，不表达CD14、CD19、CD34和CD45，证实该大鼠胰腺导管来源干细胞为间充质干细胞。目前，国内尚无建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的报道，建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法还不成熟。本发明建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，将为进一步建立人类和其它哺乳动物胰腺导管干细胞系及研究其生物学特性提供依据，这对于研究人类和其它哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，为进一步建立人类和其它哺乳动物胰腺导管干细胞系及研究其生物学特性提供依据，这对于研究人类和哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官移植治疗糖尿病具有重要的意义。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，包括如下步骤： 1.大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞分离培养

无菌取大鼠胰腺组织，剪碎至1mm³，0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化20min，Dextron不连续密度梯度离心；收集11%和20%浓度Dextron分离液处细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长（图1）；

2.大鼠胰腺导管上皮样干细胞纯化

打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于胰腺导管上皮样干细胞区域内，在克隆环孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室温消化3min；收集克隆环中的细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长（图2）；生长至80%融合时，呈“铺路石”样（图3）；

3.大鼠胰腺导管上皮样干细胞传代培养

当纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，收集的细胞接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF细胞培养液扩增培养；1例大鼠胰腺导管上皮样干细胞已传80代；

4.大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻保存

冷冻：80%DMEM+10%DMSO+10%NBS细胞冷冻液稀释大鼠胰腺导管上皮样干细胞至1×10⁶个/mL，分装于冷冻管，4℃平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮长期冷冻保存；

解冻：从液氮罐中取出大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37℃水域中解冻，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培养液贴壁培养；台盼蓝染色检测，大鼠胰腺导管上皮样干细胞解冻成活率为92%；

5.大鼠胰腺导管上皮样干细胞形态特征

H·E染色，大鼠胰腺导管上皮样干细胞完全贴壁后，呈多角形上皮样（图4）；Giemsa染色，细胞有一个圆形或椭圆形细胞核，细胞核内有1～3个核仁（图5）；

6.大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长特性

大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长；生长曲线表明细胞接种第1～2d生长缓慢，第3～6d呈对数生长，第7d增殖能力下降（图6）；

7.大鼠胰腺导管上皮样干细胞染色体数目

染色体标本显示大鼠胰腺导管上皮样干细胞是正常的二倍体细胞，染色体数目2n=42（图7）；

8.大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达特征

流式细胞术检测和荧光免疫化学反应显示大鼠胰腺导管上皮样干细胞在蛋白水平表达增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA，图8）、八聚体转录因子4（Octamer-binding transcription factor 4，Oct4，图9）、干细胞关键蛋白（Nanog，图10）、角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19，图11）和神经源性分化因子2（Neurogenic differentiation factor 2，NeuroD2，图12），不表达Pdx1、Pax4、Pax6、MafA、Ptf1a、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin；图13是荧光免疫化学反应阴性对照；

9.大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化潜能

大鼠胰腺导管上皮样干细胞具有多分化潜能，体外定向诱导，分化形成神经细胞、脂肪细胞和成骨细胞；

9.1分化形成神经细胞：采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠脑组织提取液体外定向诱导，诱导6d，约有30%大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞（图14），荧光免疫化学反应表达神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）（图15）；

9.2分化形成脂肪细胞：采用DMEM+10%NBS+1umol/L地塞米松+1ug/Linsulin+ 0.5mmol/LIBMX诱导液体外定向诱导，诱导14d，大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞内出现脂滴，脂滴小而分散；21d，约40%多角形上皮样干细胞变为圆形细胞，细胞内脂滴增大、增多；27d，圆形细胞内脂滴明显，油红O染色阳性（图16）；

9.3分化形成成骨细胞：采用RPMI1640+10%NBS+0.1umol/L地塞米松+10mmol/Lβ-磷酸甘油+50ug/mL抗坏血酸盐诱导液体外定向诱导，诱导5d，大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞出现皱缩；10d，皱缩细胞数量增多，细胞分泌增多，并形成基质样结节；15d，形成明显的岛状矿化结节；20d，岛状矿化结节茜素红染色阳性（图17），Vonkossa染色矿化结节呈现黑色（图18）；

10.大鼠胰腺导管上皮样干细胞致瘤性

大鼠胰腺导管上皮样干细胞无致瘤性；大鼠胰腺导管上皮样干细胞接种在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼观未见瘤状物。

上述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法建立的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的保藏号为C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学中国典型培养物保藏中心。

本发明的有益效果是：建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，将为进一步建立人类和其它哺乳动物胰腺导管干细胞系及研究其生物学特性提供依据，这对于研究人类和其它哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病具有重要的意义。

附图说明

本说明书共有18幅附图，其中：

图1 大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长（×200）；

图2 纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长（×100）；

图3 大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长至80%融合，呈“铺路石”样（×200）；

图4 大鼠胰腺导管上皮样干细胞H·E染色形态特征（×200）；

图5 大鼠胰腺导管上皮样干细胞Giemsa染色形态特征（×400）；

图6 大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长曲线；

图7 大鼠胰腺导管上皮样干细胞染色体数目2n=42；

图8 流式细胞术检测，大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达PCNA；

图9 流式细胞术检测，大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达Oct4；

图10 荧光免疫化学反应，大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达Nanog（×200）；

图11 荧光免疫化学反应，大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达CK19（×200）；

图12 荧光免疫化学反应，大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达NeuroD2（×200）；

图13 荧光免疫化学反应阴性对照（×200）；

图14 体外定向诱导，大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞（×200）；

图15 荧光免疫化学反应，大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化形成的神经细胞表达NSE（×200）；

图16 体外定向诱导，大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化形成脂肪细胞，油红O染色阳性（×200）；

图17 体外定向诱导，大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化形成成骨细胞，茜素红染色阳性（×100）；

图18 大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化形成成骨细胞，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色（×100）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞分离培养

无菌取SD成年大鼠胰腺组织，剪碎至1mm³，0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化20min， RPMI1640+10%NBS培养液终止消化。100目孔径滤纱过滤，离心（1000rpm，5min），PBS(-)洗涤2次。25%浓度Dextron分离液重悬细胞，依次加入23%、20%、11%浓度Dextron分离液以及PBS(-)，不连续密度梯度离心（1500rpm，5min），收集11%和20%浓度Dextron分离液处细胞，离心（1000rpm，5min），洗涤。RPMI1640+10%NBS稀释细胞至1×10⁶个/mL，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。3～5d，大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长（图1）。

2.大鼠胰腺导管上皮样干细胞纯化

打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于胰腺导管上皮样干细胞区域内。在克隆环孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室温消化3min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，收集克隆环中的细胞悬液，离心（1000rpm，5min）。RPMI1640+10%NBS培养液重悬细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，继续培养。3～5d，纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长（图2）。生长至80%融合时，呈“铺路石”样（图3）。

3.大鼠胰腺导管上皮样干细胞传代培养

当纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化3min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，离心（1000rpm，5min）。收集的细胞按1×10⁶个/mL细胞密度接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL EGF细胞培养液扩增培养。

4.大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻保存

冷冻：大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长至80% 融合时，PBS（-）清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，离心（1000rpm，5min）。80%RPMI1640+10%DMSO+10%NBS冷冻液稀释细胞至1×10⁶个/mL，分装于冷冻管。4℃平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮长期冷冻保存。

解冻：从液氮罐中取出大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37℃水域中解冻， RPMI1640+10%NBS培养液清洗解冻细胞2～3遍，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培养液贴壁培养。取少量细胞，台盼蓝染色检测，细胞解冻成活率为92%。

采用以上分离、纯化、传代培养及冷冻保存技术，已获得大鼠胰腺导管上皮样干细胞。其中，1例大鼠胰腺导管上皮样干细胞系已稳定扩增1年以上，传80代，冷冻保存100管细胞，约1×10⁸个细胞。

5.大鼠胰腺导管上皮样干细胞形态特征

H·E染色：大鼠胰腺导管上皮样干细胞完全贴壁后，呈多角形上皮样（图4）。染色方法参照司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].世界图书出版公司.2007.略；

Giemsa染色：大鼠胰腺导管上皮样干细胞有一个圆形或椭圆形细胞核，核内有1～3个核仁（图5）。染色方法参照R.I.弗雷谢尼.动物细胞培养-基本技术指南[M].科学出版社.2008.略。 6.大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长特性

大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长。生长曲线表明细胞接种第1～2d生长缓慢，第3～6d呈对数生长，第7d增殖能力下降（图6）。

生长曲线测定方法：解冻复活第20、40、60代大鼠胰腺导管上皮样干细胞，RPMI1640+ 10%NBS+10ng/mLEGF培养液分别稀释细胞至1×10⁴个/mL。取96孔板7个，每个板上分别接种3种不同代数的细胞，每代设6个孔，每孔加100μL细胞悬液，并设阴性对照（基础培养液，无细胞），置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。此时记为0d。每24h取出一块培养板，采用CCK-8法测定细胞吸光度值（OD值），共测7d。测定时，每孔加10μLCCK-8后，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中作用2h，在酶标仪上测定450nm处OD值。以时间（d）为横坐标，吸光度值（OD）为纵坐标，绘制大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长曲线图。

7.大鼠胰腺导管上皮样干细胞染色体数目

染色体标本显示大鼠胰腺导管上皮样干细胞是正常的二倍体细胞，染色体数目2n=42（图7）。

大鼠胰腺导管上皮样干细胞按1×10⁵个／mL细胞密度接种于铺有0.1%明胶的培养皿中，贴壁培养。扩增至80%融合时，加入终浓度为0.1μg/mL秋水仙素，继续培养5h，使多数细胞染色体停于中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室温消化3min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，离心。弃上清，加入0.4%KCl，并置于37℃水域中，低渗30min，离心。弃上清，加甲醇-冰醋酸固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，现用现配），混匀，静置固定20min，离心。如此反复固定2～3次。弃上清，加0.5mL固定液，混匀，制成染色体悬液。取冰冻载玻片，于约80cm高度滴片，火焰干燥。滴加Giemsa染色液，染色10min。普通生物学显微镜下观察染色体标本，照相。

8.大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达特征

流式细胞术检测和荧光免疫化学反应显示大鼠胰腺导管上皮样干细胞在蛋白水平表达增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA，图8）、八聚体转录因子4（Octamer-binding transcription factor 4，Oct4，图9）、干细胞关键蛋白（Nanog，图10）、角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19，图11）和神经源性分化因子2（Neurogenic differentiation factor 2，NeuroD2，图12），不表达Pdx1、Pax4、Pax6、MafA、Ptf1a、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin。图13是荧光免疫化学反应阴性对照。

8.1流式细胞术检测

根据所购特异性抗体是否带荧光标记，采用直接免疫荧光标记法或间接免疫荧光标记法检测。

8.1.1直接免疫荧光标记法

直接免疫荧光标记法检测大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达增殖细胞核抗原（PCNA），不表达MafA、CD117、CD15、CD34和CD45。

PBS（-）洗涤大鼠胰腺导管上皮样干细胞2次，稀释细胞至1×10⁶个/mL。取EP管7个，分别加入1mL细胞悬液，离心（1000rpm，5min）。弃上清，分别加入200uL含1%BSA 的PBS（-）稀释的荧光素标记抗体（5uL/100uL稀释的小鼠抗人PCNA荧光抗体、0.25ug/100uL稀释的金黄地鼠抗小鼠MafA荧光抗体、5uL/100uL稀释的小鼠抗人CD117荧光抗体、5uL/100uL稀释的小鼠抗人CD15荧光抗体、5uL/100uL稀释的小鼠抗人CD34荧光抗体或5uL/100uL稀释的小鼠抗人CD45荧光抗体，均购自eBioscience公司），阴性对照加PBS（-），混匀，4℃孵育30min，离心（1000rpm，5min）。弃上清，PBS（-）洗涤细胞2次，离心（1000rpm，5min），以除去未结合的多余抗体。每管分别加0.5mLPBS（-）重悬细胞，流式细胞仪（FACS CantoⅡ，BD，美国）检测阳性细胞比例。实验重复3次。

8.1.2间接免疫荧光标记法

间接免疫荧光标记法检测大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达八聚体转录因子4（Oct4）不表达Pax4和Pax6。

PBS（-）洗涤大鼠胰腺导管上皮样干细胞2次，稀释细胞至1×10⁶个/mL。取EP管4个，分别加入1mL细胞悬液，离心（1000rpm，5min）。弃上清，分别加入200uL含1%BSA 的PBS（-）稀释的无荧光素标记的一抗（1：100稀释的兔抗人Oct4和1：500稀释的兔抗大鼠Pax6，购自Epitomics公司；1：50兔抗人Pax4，购自Abgent公司），阴性对照加PBS（-），混匀，4℃孵育30min，离心（1000rpm，5min）。弃上清，PBS（-）洗涤细胞2次，离心（1000rpm，5min），以除去未结合的多余抗体。弃上清，加入200uL含1 %BSA的PBS（-）稀释的荧光素标记二抗（1：100稀释的羊抗兔荧光二抗，购自Epitomics公司），阴性对照加PBS（-），混匀，4℃孵育30min，离心（1000rpm，5min）。弃上清，PBS（-）洗涤细胞2次，离心（1000rpm，5min），以除去未结合的多余抗体。每管分别加0.5mLPBS（-）重悬细胞，流式细胞仪（FACS CantoⅡ，BD，美国）检测阳性细胞比例。实验重复3次。

8.2荧光免疫化学反应

对于购买不到流式细胞术检测的抗体，则购买荧光免疫化学反应抗体检测。

荧光免疫化学反应显示大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达干细胞关键蛋白（Nanog）、细胞角蛋白19（CK19）和神经源性分化因子2（NeuroD2），不表达Pdx1、Ptf1a、Ngn3、nestin、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin及secretin。

在铺有0.1 %明胶的培养皿中放入盖玻片，大鼠胰腺导管上皮样干细胞按1×10⁵个／mL细胞密度接种在放有盖玻片的培养皿中。当细胞生长至80%融合，4%多聚甲醛室温固定细胞爬片15min。PBS（-）洗涤细胞爬片2次，1%Triton-X100穿孔30min，1%BSA封闭45min。洗掉多余封闭液，加含1%BSA的PBS（-）稀释的一抗（1：100稀释的兔抗人Nanog、1：300稀释的兔抗大鼠NeuroD2、1：100稀释的兔抗人Sox2或1：100稀释的兔抗人somatostatin，均购自Epitomics公司；20μg/mL稀释的小鼠抗人CK19或20μg/mL稀释的小鼠抗人Pdx1，购自eBioscience公司；3μg/mL稀释的小鼠抗人Ptf1a、1：100稀释的小鼠抗人Ngn3、5μg/mL稀释的小鼠抗人ghrelin或1：100稀释的兔抗人secretin，均购自Abcam公司；1：500稀释的小鼠抗大鼠insulin或1：500稀释的兔抗大鼠glucagon，购自Boster公司；1：300稀释的小鼠抗大鼠nestin，购自Novus公司），阴性对照加PBS(-)，4℃过夜。PBS（-）洗涤3次，每次3min。加含1%BSA的PBS（-）稀释的荧光二抗（1：1000稀释的羊抗小鼠荧光二抗，购自Novu公司或1：100稀释的羊抗兔荧光二抗，购自Epitomics公司），阴性对照加PBS(-)，37℃孵育1h。PBS（-）漂洗3次，每次3min，甘油封片。荧光显微镜下观察，照相。

9.大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化潜能

大鼠胰腺导管上皮样干细胞具有多分化潜能，体外定向诱导，分化形成神经细胞、脂肪细胞和成骨细胞。

9.1分化形成神经细胞

分化形成神经细胞：采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠脑组织提取液体外定向诱导，诱导6d，约有30%大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞（图14），荧光免疫化学反应表达神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）（图15）。

大鼠胰腺导管上皮样干细胞按1×10⁵个／mL细胞密度接种，RPMI1640+10%NBS+ 10ng/mLEGF培养液扩增培养。当细胞生长至80%融合时，换DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠脑组织提取液定向诱导培养，隔天换液。诱导6d，约有30%大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞，荧光免疫化学反应表达NSE。

9.2分化形成脂肪细胞

分化形成脂肪细胞：采用DMEM+10%NBS+1umol/L地塞米松+1ug/Linsulin+0.5mmol/L IBMX诱导液体外定向诱导，诱导14d，大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞内出现脂滴，脂滴小而分散；21d，约40%多角形上皮样干细胞变为圆形细胞，细胞内脂滴增大、增多；27d，圆形细胞内脂滴明显，油红O染色阳性（图16）。

大鼠胰腺导管上皮样干细胞按1×10⁵个／mL细胞密度接种，RPMI1640+10%NBS+ 10ng/mLEGF培养液扩增培养。当细胞生长至80%融合时，换DMEM+10%NBS+1umol/L地塞米松+1ug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX诱导液定向诱导培养，隔天换液。诱导14d，大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞内出现脂滴，脂滴小而分散；21d，约40%多角形上皮样干细胞变为圆形细胞，细胞内脂滴增大、增多；27d，圆形细胞内脂滴明显，油红O染色阳性。

9.3分化形成成骨细胞

分化形成成骨细胞：采用RPMI1640+10%NBS+0.1umol/L地塞米松+10mmol/Lβ-磷酸甘油+50ug/mL抗坏血酸盐诱导液体外定向诱导，诱导5d，大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞出现皱缩；10d，皱缩细胞数量增多，细胞分泌增多，并形成基质样结节；15d，形成明显的岛状矿化结节；20d，岛状矿化结节茜素红染色阳性（图17），Vonkossa染色矿化结节呈现黑色（图18）。

大鼠胰腺导管上皮样干细胞按1×10⁵个／mL细胞密度接种，RPMI1640+10%NBS+ 10ng/mLEGF培养液扩增培养；当细胞生长至80%融合时，换RPMI1640+10%NBS+0.1umol/L地塞米松+10mmol/Lβ-磷酸甘油+50ug/mL抗坏血酸盐诱导液定向诱导培养，隔天换液。诱导5d，大鼠胰腺导管多角形上皮样干细胞出现皱缩；10d，皱缩细胞数量增多，细胞分泌增多，并形成基质样结节；15d，形成明显的岛状矿化结节；20d，岛状矿化结节茜素红染色阳性，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色。

10.大鼠胰腺导管上皮样干细胞致瘤性

大鼠胰腺导管上皮样干细胞无致瘤性。大鼠胰腺导管上皮样干细胞接种在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼观未见瘤状物。

在6只裸鼠背部皮下分别注射大鼠胰腺导管上皮样干细胞，剂量为1×10⁶个/0.2mL/site，3只裸鼠背部皮下注射0.2mL细胞培养液RPMI1640作为对照，正常饲养管理30d。结果，6只实验裸鼠和3只对照裸鼠均存活至实验结束，解剖观察，均未见瘤状物。

Claims

1.建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞分离培养

无菌取大鼠胰腺组织，剪碎至1mm³，胶原酶消化，Dextron不连续密度梯度离心，收集Dextron分离液处细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长；

（2）大鼠胰腺导管上皮样干细胞纯化

打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于胰腺导管上皮样干细胞区域内，在克隆环孔中消化，收集克隆环中的细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长；当细胞生长至80%融合时，呈“铺路石”样；

（3）大鼠胰腺导管上皮样干细胞传代培养

当纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长至80%融合，加入胰蛋白酶消化液消化，收集的细胞接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，细胞培养液扩增培养；1例大鼠胰腺导管上皮样干细胞已传80代；

（4）大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻保存

冷冻：用细胞冷冻液稀释大鼠胰腺导管上皮样干细胞，分装于冷冻管，平衡，投入液氮长期冷冻保存；

解冻：从液氮罐中取出大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37℃水域中解冻，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培养液贴壁培养；台盼蓝染色检测，大鼠胰腺导管上皮样干细胞解冻成活率为92%。

2.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：

步骤（1）所述的胶原酶消化是指加入0.1%Ⅳ型胶原酶，在37℃条件下，消化20min。

3.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：步骤（1）所述的收集Dextron分离液处细胞是指收集11%和20%浓度Dextron分离液处细胞。

4.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：步骤（2）所述的消化是指加入0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA消化液，室温消化3min。

5.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：步骤（3）所述的细胞培养液是指RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF。

6.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：

步骤（4）所述的细胞冷冻液是指80%DMEM+10%DMSO+10%NBS。

7.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：

步骤（4）所述的平衡是指4℃平衡30min，液氮面上悬浮2h。

8.根据权利要求1所述的方法建立的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的保藏号为C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

9.根据权利要求8所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系形态特征为：大鼠胰腺导管上皮样干细胞贴壁呈多角形上皮样，细胞核为圆形或椭圆形，细胞核内有1～3个核仁。

10.根据权利要求8所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长特性为：大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长；细胞接种第1～2d生长缓慢，第3～6d呈对数生长，第7d增殖能力开始下降。

11.根据权利要求8所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞染色体数目为：大鼠胰腺导管上皮样干细胞是正常的二倍体细胞，染色体数目2n=42。

12.根据权利要求8所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞表达特征为：大鼠胰腺导管上皮样干细胞在蛋白水平表达增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、八聚体转录因子4（Octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、干细胞关键蛋白（Nanog）、角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）和神经源性分化因子2（Neurogenic differentiation factor 2，NeuroD2），不表达Pdx1、Pax4、Pax6、MafA、Ptf1a、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin。

13.根据权利要求8所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化潜能为：大鼠胰腺导管上皮样干细胞具有多分化潜能，体外定向诱导，大鼠胰腺导管上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞，表达NSE；分化形成含有脂滴的脂肪细胞，油红O染色阳性；分化形成成骨细胞，产生矿化结节，茜素红染色阳性，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色。

14.根据权利要求8所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺导管上皮样干细胞致瘤性为：大鼠胰腺导管上皮样干细胞无致瘤性。