CN114395523B - 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用。该试剂盒包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂的基础培养基；所述第二培养基为含有Activin A的基础培养基；所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的终浓度为6～12μM；所述Activin A在所述第二培养基中的终浓度为1～10ng/mL，不包含10ng/mL。该试剂盒通过小分子化合物GSK3β抑制剂以及低浓度的生长因子Activin A的组合搭配，替换高浓度且昂贵的生长因子Activin A和Wnt3a，在降低成本的同时，可以提高内胚层分化效率、肝细胞的功能、成熟度和质量。

Description

一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，肝脏疾病的发病率在显著增加，肝脏器官移植仍然是治疗末期肝脏疾病首要的方法，然而人类面临着严重的供体肝脏器官短缺的问题。为了有效缓解供体肝脏器官短缺的境况，临床上对肝病患者可以进行肝细胞移植治疗或对于急性肝衰患者可进行生物人工肝治疗。每次进行肝细胞移植治疗或生物人工肝治疗都需要100亿即1010数量级的肝细胞，此外，生物制药也需要大量人源肝细胞进行药物筛选、新药研发和毒理分析，因此如何获得高产以及高质量的肝细胞成为一种迫切社会需求。
目前临床和生物制药市场上，原代人肝细胞(PHH)大多来自于病人手术摘除的肝癌组织或捐赠的肝脏，不仅数量有限，而且难以在体外扩增培养，培养后常常导致原代人肝细胞的功能丧失。即便肝细胞可从其他来源如人肝肿瘤细胞系、永生化的人肝细胞系或猪肝细胞中获取，但是，所有这些细胞应用都受到着许多因素限制，例如培养或移植后功能降低、细胞批次差异以及面临着人畜共患病感染的风险。由于人多能干细胞的巨大的潜力以及广泛的应用，通过人多能干细胞定向分化成肝细胞为细胞移植治疗或人工肝治疗提供了无限的可能。
目前，研究人员们正在进行大量研究，专注于通过人多能干细胞的分化获得稳定来源的功能性肝细胞。人多能干细胞向肝细胞定向分化主要有以下三个阶段：其一是诱导内胚层细胞分化阶段即人多能干细胞分化为内胚层细胞；其二是肝细胞分化阶段即内胚层细胞向肝祖细胞分化；其三是肝细胞成熟阶段即肝祖细胞分化为功能性的肝细胞。
由于二维培养分化体系无法模拟人体内肝脏的三维微环境，通过此分化体系所获得的肝细胞的成熟度以及功能不够高。因此，科研人员尝试发展多种3D悬浮培养条件下的分化方法，包括多种细胞共培养以及聚集体悬浮分化，通过这些分化方法能够获得成熟度更高的肝细胞，进而获得更适用于药物筛选的细胞，通过药物代谢能力真实地反应药物的药代动力学以及毒理作用。许多研究者也证明使用原代肝细胞或分化的肝细胞与肝脏非实质细胞(内皮细胞和星状细胞)共培养将会提高其肝细胞球功能，重现复杂的生物体内微环境。2D贴壁培养分化系统过渡到3D悬浮培养分化系统，不仅增强了肝细胞的功能，同时也促进了它们在人工肝治疗应用中的发展，使用体外人工肝装置能够减轻患肝病者的压力，救治肝衰竭病人的生命。
因此，为了获得大量的功能性以及成熟度高的肝细胞，近年来研究热点聚焦在通过使用小分子化合物替代昂贵的生长因子，如何在3D悬浮培养条件下将多能干细胞定向诱导分化为肝细胞。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的试剂盒的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供一种诱导干细胞为内胚层细胞的方法。
本发明第四方面的目的，在于提供一种诱导干细胞为肝祖细胞的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种诱导干细胞为肝细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂的基础培养基；所述第二培养基为含有Activin A的基础培养基；所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的终浓度为6～12μM；所述Activin A在所述第二培养基中的终浓度为1～10ng/mL，不包含10ng/mL。
优选地，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
优选地，所述第一培养基还包含B27和BSA。
优选地，所述B27在所述第一培养基中的终浓度为1X～2X。
优选地，所述BSA在所述第一培养基中的终浓度为0.1～0.5w/w％。
优选地，所述第二培养基还包含B27和BSA。
优选地，所述B27在所述第二培养基中的终浓度为1X～2X。
优选地，所述BSA在所述第二培养基中的终浓度为0.1～0.5w/w％。
优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有6～12μM GSK3β抑制剂、1X～2X B27和0.1～0.5w/w％BSA的基础培养基；所述第二培养基为含有1～10ng/mL(不包含10ng/mL)Activin A、1X～2X B27和0.1～0.5w/w％BSA的基础培养基。
进一步优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有6μM GSK3β抑制剂、1X B27和0.1w/w％BSA的基础培养基；所述第二培养基为含有1ng/mL Activin A、1X B27和0.1w/w％BSA的基础培养基。
在本发明中，第一培养基和第二培养基用于诱导干细胞分化为内胚层细胞。
优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒还包含：第三培养基，所述第三培养基为含有FGF-4、HGF、BMP2和BMP4的基础培养基；所述FGF-4在所述第三培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述HGF在所述第三培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述BM P2在所述第三培养基中的终浓度为10～20ng/mL；所述BMP4在所述第三培养基中的终浓度为10～20ng/mL。
优选地，所述第三培养基还包含：FBS、L-谷氨酰胺、胰岛素、1-硫代甘油、二甲基亚砜和地塞米松。
优选地，所述FBS在所述第三培养基中的终浓度为20～40w/w％。
优选地，所述L-谷氨酰胺在所述第三培养基中的终浓度为2～3mM。
优选地，所述胰岛素在所述第三培养基中的终浓度为0.126～0.252U/mL。
优选地，所述1-硫代甘油在所述第三培养基中的终浓度为0.3～0.4mM。
优选地，所述二甲基亚砜在所述第三培养基中的终浓度为0.5～0.6w/w％。
优选地，所述地塞米松在所述第三培养基中的终浓度为100～150nM。
优选地，所述第三培养基为含有20～40ng/mL FGF-4、20～40ng/mL HGF、10～20ng/mL BMP2、10～20ng/mL BMP4、20～40w/w％FBS、2～3mM L-谷氨酰胺、0.126～0.252U/mL胰岛素、0.3～0.4mM 1-硫代甘油、0.5～0.6w/w％二甲基亚砜和100～150nM地塞米松的基础培养基。
在本发明中，所述第三培养基用于诱导内胚层细胞分化为肝祖细胞。
优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒还包含：第四培养基，所述第四培养基为含有HGF、FGF-4和抑瘤素M的基础培养基；所述FGF-4在所述第四培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述HGF在所述第四培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述抑瘤素M在所述第四培养基中的终浓度为50～100ng/mL。
优选地，所述第四培养基还包含：二甲基亚砜、地塞米松和第一添加剂。
优选地，所述第一添加剂包含以下组分：抗坏血酸、BSA-FAF、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、基因重组人表皮生长因子和GA-1000；进一步优选地，所述第一添加剂由SingleQuots kit内的七种组分组成：0.5mL抗坏血酸、10.5mL BSA-FAF、0.5mL氢化可的松、0.5mL转铁蛋白、0.5mL胰岛素、0.5mL基因重组人表皮生长因子和0.5mL GA-1000，Single Quotskit购自Lonza，货号为CC-4182。
优选地，所述二甲基亚砜在所述第四培养基中的终浓度为0.5～0.6w/w％。
优选地，所述地塞米松在所述第四培养基中的终浓度为100～150nM。
优选地，所述第一添加剂在所述第四培养基中的终浓度为2～3w/w％。
优选地，所述第四培养基为含有20～40ng/mL HGF、20～40ng/mL FGF-4、50～100ng/mL抑瘤素M、0.5～0.6w/w％二甲基亚砜、100～150nM地塞米松和2～3w/w％第一添加剂的基础培养基。
进一步优选地，所述第四培养基为含有20ng/mL HGF、20ng/mL FGF-4、50ng/mL抑瘤素M、0.5w/w％二甲基亚砜、100nM地塞米松和2.6w/w％第一添加剂的基础培养基。
在本发明中，所述第四培养基用于肝细胞成熟。
优选地，所述第一培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。
优选地，所述第二培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。
优选地，所述第三培养基的基础培养基为RPMI1640和IMDM培养基中的至少一种。
优选地，所述第四培养基的基础培养基为肝细胞基础培养基。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的人源干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的人源干细胞为人胚胎干细胞、人孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或脐血干细胞。
本发明的第二个方面，提供第一方面的试剂盒在(1)～(6)中任一项中的应用；
(1)制备内胚层细胞；(2)制备肝祖细胞；(3)制备肝细胞；(4)制备诱导干细胞分化为内胚层细胞的产品；(5)制备诱导干细胞分化为肝祖细胞的产品；(6)制备诱导干细胞分化为肝细胞的产品。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的人源干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的人源干细胞为人胚胎干细胞、人孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或脐血干细胞。
本发明的第三个方面，提供一种诱导干细胞为内胚层细胞的方法，将干细胞在本发明第一方面的试剂盒中的第一培养基中培养12～36h，然后，在本发明第一方面的试剂盒中的第二培养基中培养36～60h，得到内胚层细胞。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的人源干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的人源干细胞为人胚胎干细胞、人孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或脐血干细胞。
优选地，在本发明第一方面的试剂盒中的第二培养基中培养过程中每隔16～32h更换第二培养基。
优选地，在本发明第一方面的试剂盒中的第二培养基中培养过程中更换第二培养基1～2次。
优选地，所述干细胞为干细胞球。
优选地，所述干细胞球的制备方法如下：将干细胞与消化液混合，孵育，弃消化液加入含有Rock抑制剂的mTeSR1培养基重悬，以50～200万/孔的密度接种至含有Rock抑制剂的mTeSR1培养基中，培养12～36h。
优选地，所述干细胞为传代后4～5天时，细胞覆盖率达70％～80％，克隆边缘规整且无分化细胞的干细胞。
优选地，所述Rock抑制剂为Y-27632。
优选地，所述Rock抑制剂在mTeSR1培养基中的终浓度为8～12μM。
本发明的第四个方面，提供一种诱导干细胞为肝祖细胞的方法，包含本发明第三方面的诱导干细胞为内胚层细胞的方法，
所述诱导干细胞为肝祖细胞的方法还包含如下步骤：将内胚层细胞在本发明第一方面的试剂盒中的第三培养基中培养264～312h，得到肝祖细胞。
优选地，在本发明第一方面的试剂盒中的第三培养基中培养过程中每隔16～32h更换第三培养基。
优选地，在本发明第一方面的试剂盒中的第三培养基中培养过程中更换第三培养基10～12次。
本发明的第五个方面，提供一种诱导干细胞为肝细胞的方法，包含本发明第四方面的诱导干细胞为肝祖细胞的方法，
所述诱导干细胞为肝细胞的方法还包含如下步骤：将肝祖细胞在本发明第一方面的试剂盒中的第四培养基中培养60～84h，得到肝细胞。
优选地，在本发明第一方面的试剂盒中的第四培养基中培养过程中每隔16～32h更换第四培养基。
优选地，在本发明第一方面的试剂盒中的第四培养基中培养过程中更换第四培养基2～4次。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒，通过小分子化合物GSK3β抑制剂以及低浓度的生长因子Activin A的组合搭配，替换高浓度且昂贵的生长因子Activin A和Wnt3a，在降低成本的同时，可以提高内胚层细胞中内胚层特异性基因SOX17、FOXA2和CXCR4的表达量、肝祖细胞中白蛋白(ALB)的表达量、肝细胞核转录因子(HNF4α)的表达量、肝细胞中白蛋白(ALB)、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达量，降低肝细胞中甲胎蛋白(AFP)表达量，即提高内胚层分化效率、肝细胞的功能、成熟度和质量。
本发明提供了一种诱导干细胞分化为肝细胞的方法，通过采用本发明提供的诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒，在降低成本的同时，可以提高内胚层细胞中内胚层特异性基因SOX17、FOXA2和CXCR4的表达量、肝祖细胞中白蛋白(ALB)的表达量、肝细胞核转录因子(HNF4α)的表达量、肝细胞中白蛋白(ALB)、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达量，降低肝细胞中甲胎蛋白(AFP)表达量，即提高内胚层分化效率、肝细胞的功能、成熟度和质量。
进一步地，本发明提供的诱导干细胞分化为肝细胞的方法，采用3D悬浮培养，具有更好地模拟人体三维微环境的优势，从而能够高效获得功能更强的肝细胞，同时，可以节省时间(相比2D培养，节省约15天)。
附图说明
图1是人多能肝细胞向肝细胞定向诱导分化的路线图：其中，A是2D贴壁培养的人多能干细胞向肝细胞定向诱导分化的路线图；B是3D悬浮培养的人多能干细胞向肝细胞定向诱导分化的路线图。
图2是人多能干细胞向内胚层细胞球定向诱导分化的结果图：其中，A是人多能干细胞向内胚层细胞球定向诱导分化的路线图；B是内胚层细胞球中SOX17的细胞流式检测图；C是人多能干细胞向内胚层细胞球定向诱导分化的细胞形态学变化图，比例尺＝100μm；D是内胚层细胞球中SOX17、FOXA2和CXCR4表达量的结果图。
图3是内胚层细胞球向肝祖细胞球定向诱导分化的结果图：其中，A是内胚层细胞球向肝祖细胞球定向诱导分化的路线图；B是内胚层细胞球向肝祖细胞球定向诱导分化的细胞形态学变化图，比例尺＝100μm；C是内胚层细胞球向肝祖细胞球分化阶段各个时间点的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和肝细胞核转录因子(HNF4α)表达量结果图；D是肝祖细胞球中甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的免疫荧光染色图，比例尺＝100μm；E是肝祖细胞球的H&E染色图，比例尺＝400，200μm。
图4是肝祖细胞球向肝细胞球成熟的结果图：其中，A是肝祖细胞球向肝细胞球成熟的的路线图；B是肝祖细胞球向肝细胞球成熟的细胞形态学变化图，比例尺＝100，50，20μm；C是肝细胞球中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表达量结果图；D是第17天肝细胞球培养基上清中白蛋白(ALB)含量的结果图；E是25μM利福平诱导肝细胞球后药物代谢酶CYP3A4和CYP2C9的相对表达量图；F是100μM奥美拉唑诱导肝细胞球后药物代谢酶CYP1A1和CYP1B1的相对表达量图；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
图5是不同人多能干细胞系经实施例1的试剂盒处理得到的内胚层细胞球的SOX17阳性细胞流式检测图。
图6是人多能干细胞经实施例1和对比例1的试剂盒定向诱导分化的结果图：其中，A是人多能干细胞向肝细胞定向诱导分化的不同阶段的细胞球的形态学变化图，比例尺＝100μm；B是经实施例1和对比例1的试剂盒处理得到的内胚层细胞球中SOX17、FOXA2和CXCR4表达量的结果图；C是经实施例1和对比例1的试剂盒处理后肝祖细胞分化阶段的各个时间点的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和肝细胞核转录因子(HNF4α)表达量的结果图；D是经实施例1和对比例1的试剂盒处理得到的肝细胞球中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)表达量的结果图；E是第17天肝细胞球培养基上清中白蛋白(ALB)含量的结果图；*表示P＜0.05，****表示P＜0.0001。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒
一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；
第一培养基为含有B27(Gibco，17504-044)、BSA(牛血清白蛋白，Sigma，SRE0098)、CHIR99021(Selleck，CT99021)的RPMI1640培养基(Gibco，61870036)(B27的终浓度为1X；BSA的终浓度为0.1w/w％；CHIR99021的终浓度为6μM)；
第二培养基为含有B27、BSA、Activin A(重组人激活素-A，Peprotech，120-14)的RPMI1640培养基(B27的终浓度为1X；BSA的终浓度为0.1w/w％；Activin A的终浓度为1ng/mL)；
第三培养基为含有FBS(胎牛血清，VISTECH，SE100-B7953)、L-谷氨酰胺(L-glutamine，Gibco，25030081)、重组人胰岛素(Human insulin，Sigma，91077C-11MG)、1-硫代甘油(1-thioglycerol，Sigma，M6145)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4，Peprotech，100-18B-50)、肝细胞生长因子(HGF，Peprotech，100-39)、骨形态发生蛋白2(BMP2，Peprotech，120-02)、骨形态发生蛋白4(BMP4，Peprotech，120-05)、二甲基亚砜(DMSO，MP Biomedical，196055)、地塞米松(Dexamethasone，Sigma，D4902)的IMDM培养基(Gibco，31980030)(FBS的终浓度为20w/w％、L-谷氨酰胺的终浓度为2mM、重组人胰岛素的终浓度为0.126U/mL、1-硫代甘油的终浓度为0.3mM、成纤维细胞生长因子-4的终浓度为20ng/mL、肝细胞生长因子的终浓度为20ng/mL、骨形态发生蛋白2的终浓度为10ng/mL、骨形态发生蛋白4的终浓度为10ng/mL、二甲基亚砜的终浓度为0.5w/w％、地塞米松的终浓度为100nM)；
第四培养基为含Single Quots kit(Lonza，CC-4182，具体包括Ascorbic acid(抗坏血酸)、BSA-FAF、Hydrocortisone(氢化可的松)、Transferrin(转铁蛋白)、Insulin(胰岛素)、rhEGF(基因重组人表皮生长因子)和GA-1000的七种添加组分)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(Oncostatin M，Peprotech，300-10)、二甲基亚砜(DMSO)、地塞米松(Dexamethasone)的肝细胞基础培养基(Hepatocyte BasalMedium，Lonza，CC-3911)(Single Quots kit内所含七种添加组分全部加入(包括0.5mL抗坏血酸、10.5mL BSA-FAF、0.5mL氢化可的松、0.5mL转铁蛋白、0.5mL胰岛素、0.5mL基因重组人表皮生长因子和0.5mL GA-1000)(浓度为2.6w/w％)、肝细胞生长因子的终浓度为20ng/mL、成纤维细胞生长因子-4的终浓度为20ng/mL、抑瘤素M的终浓度为50ng/mL、二甲基亚砜的终浓度为0.5w/w％、地塞米松的终浓度为100nM)。
对比例1 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒
对比例1提供的诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒与实施例1提供的试剂盒相同，区别仅在于：第二培养基中Activin A的终浓度为10ng/mL。
应用实施例1
一种诱导干细胞分化为肝细胞的方法，采用实施例1的试剂盒诱导干细胞分化为肝细胞，路线图如图1所示，包括如下步骤：
S1.单细胞传代hPSC：选取状态良好的hESC3(H9细胞系，根据转让协议第19-W0512号从WiCell研究所-美国威斯康星州麦迪逊购买)一孔(状态良好：在hPSC传代后4～5天时，细胞覆盖率达70％～80％，克隆边缘规整且无分化细胞的hPSC)，吸弃培养基后加入1毫升无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1毫升消化液GCDR(温和细胞解离试剂)，放回二氧化碳培养箱中孵育5分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1毫升含有10微摩尔(μM)的Y-27632(Rocki)的mTeSR1培养基，用移液枪将细胞吹打至掉落单细胞，最终获得单细胞悬液；
S2.细胞接种：吸取20微升单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；使用康宁低粘附六孔培养板，每孔加入3毫升含有10μM的Y-27632(Rocki)的mTeSR1以提高单细胞接种的存活率；吸取约100万单细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中，记为第-1天，次日形成直径50～70微米的人多能干细胞球；
S3.细胞换液(内胚层分化阶段)：在24h后(第0天)每孔用1毫升无钙镁PBS清洗人多能干细胞球，吸弃后加入3毫升第一培养基；在48h后(第1天)每孔用1毫升无钙镁PBS清洗细胞球，吸弃后加入第二培养基，在72h后(第2天)更换第二培养基，培养24h，得到内胚层细胞球(人多能干细胞向内胚层细胞球定向诱导分化的路线图如图2所示)；
S4.细胞换液(肝祖细胞分化阶段)：从第3天(96h后)至第14天，每天每孔用1毫升无钙镁PBS清洗内胚层细胞球(第3天)/肝祖细胞球(第4至14天)，吸弃后加入3毫升第三培养基(内胚层细胞球向肝祖细胞球分化的路线图如图3所示)，余留一组分化细胞样本实施上述步骤至第16天；
S5.细胞换液(肝细胞成熟阶段)：从第15天至第17天，每天每孔用1毫升无钙镁PBS清洗肝祖细胞球，吸弃后加入2毫升第四培养基，得到肝细胞(肝祖细胞球向肝细胞球成熟的路线图如图4所示)。
在第3天时，对内胚层细胞球进行随机取样拍照n张(n＞10)，代表性图像如图2所示：内胚层分化过程中球体尺寸是不断变大的，同时也伴随着较多的细胞脱落；
之后收集内胚层细胞球，自然沉降1分钟，弃上清后加入1毫升PBS清洗内胚层细胞球，自然沉降1分钟，弃上清后加入1毫升0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1毫升含10％胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数，取1百万(1×106)的内胚层细胞进行PE-SOX17的细胞流式检测，具体步骤如下：首先用TrypLETMExpress(Gibco)处理，将内胚层细胞球解离为单个细胞，然后用4％多聚甲醛溶液固定，再用抗体(PE偶联SOX17，1：200，Cat#561591，Biolegend)进行孵育，最后使用BD FACSCelesta十二色高端流式分析细胞仪检测荧光阳性细胞，结果如图2所示：内胚层细胞球SOX17阳性细胞比例为88％；
剩余内胚层细胞进行RNA的提取后用qPCR检测内胚层细胞特异性基因SOX17、FOXA2和CXCR4的表达量，具体步骤如下：使用通用RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取细胞沉淀的总RNA；在NanoDrop显微分光光度计(Thermo Fisher Scientific)上定量后，使用High-Capacity PrimeScriptTMRT cDNA逆转录酶试剂盒(TaKaRa)将1μg RNA反转为cDNA；使用PowerUpTM SYBRTM qPCR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和引物GAPDH(F-5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，SEQ ID NO.1；R-5'-GAAGGTGAAGG TCGGAGTC-3'，SEQ IDNO.2)，SOX17(F-5'-GTGGACCGCACGGAATTTG-3'，SEQ ID NO.3；R-5′-GAGGCCCATCTCAGGCTTG-3′，SEQ ID NO.4)，FOXA2(F-5'-GGGAGCGG TGAAGATGGA-3'，SEQ ID NO.5；R-5′-TCATGTTGCTCACGGAGGAGTA-3′，SEQ ID NO.6)和CXCR4(F-5′-AACCAGCGGTTACCATGGAG-3′，SEQ ID NO.7；R-5′-CACGG AAACAGGGTTCCTTCA-3′，SEQ ID NO.8)在Quant StudioTM 1实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)中进行实时荧光定量PCR，结果如图2所示：内胚层标志性基因SOX17、FOXA2和CXCR4表达量显著提高(H9为未经处理的hESC3，第3天为经过3天内胚层分化的hESC3)。可见，人多能干细胞成功向内胚层细胞球高效分化。
在第6、10、14天，对肝祖细胞球进行随机取样拍照n张(n＞10)，代表性图像如图3所示：细胞球体随着天数的增加从实心内胚层细胞球逐渐变成囊泡状结构的肝祖细胞球，同时也存在少许实心结构的肝祖细胞球。
分别在第6、8、10、12、14、16天收集肝祖细胞球(实验中余留一组分化细胞样本至第16天，取样做检测以确定14天为最佳的肝祖细胞分化时间点)，自然沉降1分钟，弃上清后加入1毫升PBS清洗肝祖细胞球，自然沉降1分钟，弃上清，取一部分肝祖细胞球进行RNA的提取后通过qPCR检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和肝细胞核转录因子(HNF4α)基因的表达量，具体步骤如下：使用通用RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取细胞沉淀的总RNA；在NanoDrop显微分光光度计(Thermo Fisher Scientific)上定量后，使用High-CapacityPrimeScriptTMRT cDNA逆转录酶试剂盒(TaKaRa)将1μg RNA反转为cDNA；使用PowerUpTMSYBRTM qPCR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和引物GAPDH(F-5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，SEQ ID NO.1；R-5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，SEQ ID NO.2)，AFP(F-5′-GGGAGCGGCTGACATTAT-3′，SEQ ID NO.9；R-5′-TGTTTCATCCACCACCAA-3′，SEQ IDNO.10)，ALB(F-5′-GAGACCAGAGGTTGATGTGATG-3′，SEQ ID NO.11；R-5′-AGTTCCGGGGCATAAAAGTAAG-3′，SEQ ID NO.12)和HNF4α(F-5′-GGTGTCCATACGCATCCTTGAC-3′，SEQ ID NO.13；R-5′-AGCCGCTTGATCTTCCCTGGAT-3′，SEQ ID NO.14)在Quant StudioTM1实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)中进行实时荧光定量PCR；将每种条件的循环阈值(Ct)值标准化为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的相应表达，以产生ΔCt；RNA水平被计算为2-ΔΔCt；结果如图3所示：在第14天之前甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)基因表达量随着天数的增加逐渐增高，第14天为甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的表达量最高点，然而甲胎蛋白(AFP)基因表达量在第14天之后降低，白蛋白(ALB)基因表达量稍有降低，而肝细胞核转录因子(HNF4α)基因表达维持在一定水平，由于甲胎蛋白(AFP)为胎肝的重要的标志物，因此，第14天可能是肝祖细胞分化阶段分化成肝祖细胞球的最佳时间点，因此，确定在第14天时进入肝细胞成熟阶段。
在第14天取肝祖细胞球通过免疫荧光染色和单光子共聚焦拍摄检测甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的表达，具体步骤如下：将肝祖细胞球浸泡在4％多聚甲醛(PFA)中孵育15min以固定肝祖细胞球，接着用0.5％TritonX-100(Sigma-Aldrich)穿膜打孔20min；每个步骤之间需要用PBS洗涤3次；洗涤后，将样品放置在10％山羊血清中室温孵育30min；然后将处理过的样品在含有一抗的PBS中4℃下孵育过夜(AFP鼠源，1：100，Cat#MAB1368，R&Dsystems；ALB鼠源，1：100，Cat#ab106582，Abcam)，然后放置在37℃烘箱中复温，并在含有二抗的PBS中(AlexaFluor488偶联的山羊抗小鼠IgG，1：800，Cat#4408S，CST；AlexaFluor594偶联的山羊抗小鼠IgG，1：800，Cat#8890S，CST)，37℃下避光孵育1～2h。最后用DAPI(CellSignaling Technology)进行5min染色，通过抗淬灭剂(S2100，Solarbio)将肝祖细胞球转移至共聚焦小皿，用单光子共聚焦显微镜(Ti-EA1，Nikon)对所制备的样品进行拍照，结果如图3所示：分化体系下的肝祖细胞球体能够被染色，即高表达甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)标记物。
在第14天取肝祖细胞球用琼脂糖包埋、切片后H&E染色观察肝祖细胞球的结构，具体步骤如下：用10％中性福尔马林缓慢振荡悬浮固定细胞球1h，静置沉淀5min后吸干上清液后滴加少许伊红标记细胞球，45℃水浴中加热10min离心管后滴加少许融化的琼脂，摇动离心管使琼脂与细胞球混匀充分，冷却后琼脂凝固，将离心管底部置于水浴中5～10s，倒置离心管后轻轻敲击使琼脂块掉出，将琼脂块切成适宜大小，用包埋纸包埋琼脂块，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后放入包埋机包埋成块，使用切片机切5μm厚度的切片，展片、捞片、烤片；随后进行H&E染色，步骤为：二甲苯脱蜡，梯度降浓度乙醇水化，用Harris苏木素液染色15min，0.5％盐酸酒精分色30s，水洗蓝化20min，80％乙醇2min进行伊红染色前处理，伊红液染胞浆5s，80％乙醇进行2min伊红染色后漂色，梯度乙醇脱水，透明，滴加中性树胶封片，阴凉通风处自然晾干，用数字病理扫描系统进行切片扫描，结果如图3所示：分化的肝祖细胞球存在实心和空心的结构。
在第17天，对肝细胞球进行拍照，结果如图4所示：肝细胞球依然是囊泡状的结构，肝细胞球表面呈现清晰的多边形细胞形状即肝细胞的紧密排列，同时也存在少许实心的肝细胞球。
在第17天收集肝细胞球，自然沉降1分钟，收集培养基上清，向沉降的细胞球加入1毫升0.25％胰酶，室温消化10分钟后加入1毫升含10％胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数，而培养基上清用ELISA试剂盒进行白蛋白(ALB)分泌量的检测，具体步骤如下：用1000g离心20min后取上清，可将标本放于-80℃保存；ELISA(ALB)试剂盒(Bethyl，E88-129)采用双抗体夹心法进行酶联免疫吸附试验(具体方法参见说明书)；预先在微孔中包被白蛋白捕获抗体，依次加入样品、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育后彻底洗涤；用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转变为蓝色后在酸的作用下最后转变为黄色；颜色的深浅和样品中的白蛋白的含量呈正相关；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，随后计算样品浓度，结果如图4所示：该分化体系下每48h分泌约6000ng白蛋白，每百万的肝细胞每天分泌约15μg的白蛋白。
在第17天取肝细胞球，自然沉降1分钟，弃上清后加入1毫升PBS清洗肝细胞球，自然沉降1分钟，弃上清，肝细胞球进行RNA的提取后通过qPCR检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)基因的表达量，具体步骤如下：使用通用RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取细胞沉淀的总RNA；在NanoDrop显微分光光度计(Thermo FisherScientific)上定量后，使用High-Capacity PrimeScriptTMRT cDNA逆转录酶试剂盒(TaKaRa)将1μg RNA反转为cDNA；使用PowerUpTM SYBRTM qPCR Green Master Mix(ThermoFisher Scientific)和引物GAPDH(F-5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，SEQ ID NO.1；R-5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，SEQ ID NO.2)，AFP(F-5′-GGGAGCGGCTGACATTAT-3′，SEQ IDNO.9；R-5′-TGTTTCATCCACCACCAA-3′，SEQ ID NO.10)，ALB(F-5′-GAGACCAGAGGTTGATGTGATG-3′，SEQ ID NO.11；R-5′-AGTTCCGGGGCATAAAAGTAAG-3′，SEQ IDNO.12)和A1AT(F-5′-TCGCTACAGCCTTTGCAATG-3′，SEQ ID NO.15；R-5′-TTGAGGGTACGGAGGAGTTCC-3′，SEQ ID NO.16)在Quant StudioTM 1实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)中进行实时荧光定量PCR；将每种条件的循环阈值(Ct)值标准化为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的相应表达，以产生ΔCt；RNA水平被计算为2-ΔΔCt，结果如图4所示：代表不成熟肝细胞的甲胎蛋白(AFP)基因表达在下降(与图2相比)，代表成熟肝细胞的白蛋白(ALB)和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的肝细胞标志性基因表达量较高；可见，肝祖细胞成功向肝细胞球成熟转变。
在第17天取肝细胞球，自然沉降1分钟，弃上清后加入1毫升PBS清洗肝细胞球，自然沉降1分钟，弃上清，肝细胞球进行药物诱导药物代谢酶表达实验，具体步骤如下：设置添加诱导物(25μM(终浓度)的利福平和100μM(终浓度)的奥美拉唑药物)为实验组，无任何添加物为对照组；实验组每天分别更换含诱导物的第四培养基，对照组每天更换不含诱导物的第四培养基，整个过程维持3天；诱导结束后收获肝细胞球，利用RT-qPCR检测利福平实验组和对照组的药物代谢酶CYP3A4(F-5′-TCTGTGCCTGAGAACACCAGAG-3′，SEQ ID NO.17；R-5′-TGCATGTACAGAATCCCCGGTT-3′，SEQ ID NO.18)和CYP2C9(F-5′-AGGAAAAGCACAACCAACCATC-3′，SEQ ID NO.19；R-5′-TTCAGCAGGAGAAGGAGAGCAT-3′，SEQ IDNO.20)基因的表达，同时也检测奥美拉唑实验组和对照组的药物代谢酶CYP1A1(F-5′-AGGCTTTTACATCCCCAAGG-3′，SEQ ID NO.21；R-5′-GCAATGGTCTCACCGATACA-3′，SEQ IDNO.22)和CYP1B1(F-5′-CACCAAGGCTGAGACAGTGA-3′，SEQ ID NO.23；R-5′-GCCAGGTAAACTCCAAGCAC-3′，SEQ ID NO.24)基因的表达，数据结果与新鲜分离24h的人原代肝细胞(从广州市第一人民医院肝胆外科获取)中药物代谢酶基因的表达进行对比，结果如图4所示：与未处理的对照组相比，作为诱导物的药物诱导使得代谢酶基因表达量显著上调，其中奥美拉唑诱导后CYP1A1和CYP1B1基因的表达量、利福平诱导后CYP3A4和CYP2C9基因的表达量比新鲜分离的人原代肝细胞表达还高，表明得到的肝细胞球能对药物的诱导和刺激产生反应，具有良好的药物代谢功能，可以成为药物筛选的模型。
应用实施例2
使用三种人多能干细胞系(3株人胚胎干细胞，hESC1-H1，hESC2-SHES，hESC3-H9，hESC1-H1和hESC3-H9细胞系是根据转让协议(第19-W0512号)从WiCell研究所(美国威斯康星州麦迪逊)购买，hESC2-SHES(已在文章：Cell research 2016，26(6),743-746中公开)由李劲松实验室实验室赠予进行内胚层分化效率对比，方法与应用实施例1中步骤S1相同。结果如图5所示：采用实施例1的试剂盒和应用实施例1的分化方法处理不同的多能干细胞系，得到的内胚层细胞球SOX17阳性细胞的比例均保持在较高水平：其中hESC1的SOX17阳性细胞比例为95.5％，hESC2的SOX17阳性细胞比例为94％，hESC3的SOX17阳性细胞比例为88％。可见，本实施例提供的试剂盒及应用实施例提供的方法适用于多种人多能干细胞系分化。
应用对比例1
一种诱导干细胞分化为肝细胞的方法，与应用实施例1相同，区别仅在于：分别采用实施例1和对比例1的试剂盒进行处理。
分别采用实施例1和对比例1的试剂盒进行处理后，两组的各个分化阶段的细胞球形态学变化无显著差异，选取代表性图像如图6所示：两组的2D贴壁培养的人多能干细胞均转变成3D悬浮培养的人多能干细胞球，随后分化成内胚层细胞球，逐渐变成囊泡状的结构与实心的肝祖细胞球，最后转变成具有典型多边形肝细胞的肝细胞球。
内胚层分化结束的内胚层细胞球中SOX17、FOXA2和CXCR4的qPCR检测结果如图6所示：实施例1的试剂盒处理后的内胚层细胞球中内胚层特异性基因SOX17、FOXA2和CXCR4的表达量显著高于对比例1的试剂盒处理后的内胚层细胞球，可见，实施例1的试剂盒处理后的内胚层分化效率高于对比例1的试剂盒。
第3、5、7、9、11、13天的肝祖细胞球中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和肝细胞核转录因子(HNF4α)基因表达量的的qPCR检测结果如图6所示：实施例1的试剂盒处理后的肝祖细胞球中白蛋白(ALB)的表达量高于对比例1的试剂盒，肝细胞核转录因子(HNF4α)的表达量也较高于对比例1的试剂盒，由于白蛋白(ALB)是指示肝细胞成熟和功能的标志物，且肝细胞核转录因子(HNF4α)是肝祖细胞和肝细胞的标志物，可见，实施例1的试剂盒所分化的肝细胞功能更好。
第17天的肝细胞球中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)基因表达量的qPCR检测结果如图6所示：实施例1的试剂盒处理后的肝细胞球中甲胎蛋白(AFP)表达量显著低于对比例1的试剂盒，白蛋白(ALB)、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的表达量显著高于对比例1的试剂盒，可见，实施例1的试剂盒所分化的肝细胞功能更好、更成熟。
第17天的肝细胞球的培养基上清中白蛋白(ALB)分泌量的ELISA检测结果如图6所示：实施例1的试剂盒处理后的肝细胞球的培养基上清中白蛋白(ALB)分泌量高于对比例1的试剂盒。
可见，实施例1的试剂盒分化的肝细胞球的功能、成熟度和质量优于对比例1的试剂盒，且其中Activin A的浓度降低了约100倍(相比文献：Duan Y,Ma X,Zou W,etal.Differe ntiation and characterization of metabolically functioninghepatocytes from human embryonic stem cells[J].Stem Cells,2010,28(4):674-86.；Ma X,Duan Y,Tschudy-Seney B,et al.Highly efficient differentiation offunctional hepatocytes from human induced pluripotent stem cells[J].StemCells Transl Med,2013,2(6):409-19.中的2D分化方法，路线图如图1所示)，极大地降低了成本。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用
<130>
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagatggtg atgggatttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggaccgca cggaatttg 19
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<212> DNA
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<400> 4
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<400> 6
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aaccagcggt taccatggag 20
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cacggaaaca gggttccttc a 21
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gggagcggct gacattat 18
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tgtttcatcc accaccaa 18
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gagaccagag gttgatgtga tg 22
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agttccgggg cataaaagta ag 22
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ggtgtccata cgcatccttg ac 22
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agccgcttga tcttccctgg at 22
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ttgagggtac ggaggagttc c 21
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tctgtgcctg agaacaccag ag 22
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tgcatgtaca gaatccccgg tt 22
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aggaaaagca caaccaacca tc 22
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aggcttttac atccccaagg 20
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caccaaggct gagacagtga 20
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<400> 24
gccaggtaaa ctccaagcac 20

Claims (17)

1.一种试剂盒，包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂的基础培养基；所述第二培养基为含有Activin A的基础培养基；所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的终浓度为6μM；所述Activin A在所述第二培养基中的终浓度为1ng/mL；所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：第三培养基，所述第三培养基为含有FGF-4、HGF、BMP2和BMP4的基础培养基；所述FGF-4在所述第三培养基中的终浓度为20～40 ng/mL；所述HGF在所述第三培养基中的终浓度为20～40 ng/mL；所述BMP2在所述第三培养基中的终浓度为10～20 ng/mL；所述BMP4在所述第三培养基中的终浓度为10～20 ng/mL。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：第四培养基，所述第四培养基为含有HGF、FGF-4和抑瘤素M的基础培养基；所述FGF-4在所述第四培养基中的终浓度为20～40 ng/mL；所述HGF在所述第四培养基中的终浓度为20～40 ng/mL；所述抑瘤素M在所述第四培养基中的终浓度为50～100ng/mL。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一培养基还包含B27和BSA。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第二培养基还包含B27和BSA。
6.根据权利要求2～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第三培养基还包含：FBS、L-谷氨酰胺、胰岛素、1-硫代甘油、二甲基亚砜和地塞米松。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述第四培养基还包含：二甲基亚砜、地塞米松和第一添加剂；
所述第一添加剂包含以下组分：抗坏血酸、BSA-FAF、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、基因重组人表皮生长因子和GA-1000。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第二培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。
10.根据权利要求2～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第三培养基的基础培养基为RPMI1640和IMDM培养基中的至少一种。
11.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述第四培养基的基础培养基为肝细胞基础培养基。
12.权利要求1～11中任一项所述的试剂盒在（1）～（6）中任一项中的应用；
（1）制备内胚层细胞；（2）制备肝祖细胞；（3）制备肝细胞；（4）制备诱导干细胞分化为内胚层细胞的产品；（5）制备诱导干细胞分化为肝祖细胞的产品；（6）制备诱导干细胞分化为肝细胞的产品；
所述干细胞为人胚胎干细胞。
13.一种诱导干细胞为内胚层细胞的方法，将干细胞在权利要求1～11中任一项所述的第一培养基中培养12～36 h，然后，在权利要求1～11中任一项所述的第二培养基中培养36～60 h，得到内胚层细胞；
所述干细胞为人胚胎干细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述干细胞为干细胞球。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述干细胞球的制备方法如下：将干细胞与消化液混合，孵育，弃消化液加入含有Rock抑制剂的mTeSR1培养基重悬，以50～200万/孔的密度接种至含有Rock抑制剂的mTeSR1培养基中，培养12～36 h。
16.一种诱导干细胞为肝祖细胞的方法，包含权利要求13～15任一项所述的方法，
所述诱导干细胞为肝祖细胞的方法还包含如下步骤：将内胚层细胞在权利要求2～11中任一项所述的第三培养基中培养264～312 h，得到肝祖细胞。
17.一种诱导干细胞为肝细胞的方法，包含权利要求16所述的方法，
所述诱导干细胞为肝细胞的方法还包含如下步骤：将肝祖细胞在权利要求3～11中任一项所述的第四培养基中培养60～84 h，得到肝细胞。
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