CN114686418B - 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法 - Google Patents

一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114686418B
CN114686418B CN202210157307.7A CN202210157307A CN114686418B CN 114686418 B CN114686418 B CN 114686418B CN 202210157307 A CN202210157307 A CN 202210157307A CN 114686418 B CN114686418 B CN 114686418B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
liver
pbs
medium
induced
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210157307.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114686418A (zh
Inventor
张雪峰
邵文桂
张阳
窦德虎
程远国
窦金辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Group Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Group Co ltd filed Critical Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Group Co ltd
Priority to CN202210157307.7A priority Critical patent/CN114686418B/zh
Publication of CN114686418A publication Critical patent/CN114686418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114686418B publication Critical patent/CN114686418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法。属于生物医药领域，具体步骤：将人源诱导多能干细胞诱导分化为肝谱系内胚层细胞并进行鉴定；再将肝谱系内胚层细胞诱导分化成肝细胞并进行鉴定。本发明诱导来的肝细胞诱导过程可见细胞形态的改变，对过程中细胞进行相关蛋白或基因表达鉴定可提示诱导是否成功；诱导来的肝细胞具有糖原储存能力，对ICG有摄取和释放作用分泌白蛋白的能力与iPSC相比，增加了九倍以上；肝细胞的尿素产量增加了39倍；利用该方法，可在较短时间内获得具有接近原代肝细胞功能的体外诱导肝细胞，本发明能快速有效将人源诱导多能干细胞定向诱导分化为功能性肝细胞，推动药物的肝脏毒性研究。

Description

一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种将人源诱导多能干细胞(Human inducedpluripotent stem cell,hiPSC)定向分化为功能性肝细胞的方法，具体是涉及快速有效将人源诱导多能干细胞诱导分化为功能性肝细胞的方法和鉴定肝细胞功能的方法。
背景技术
药物性肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)是引起急慢性肝损伤和爆发性肝衰竭的主要因素，同时也是影响新药安全的重要因素；DILI指人体暴露于一定剂量药物后，因药物本身或其代谢产物对肝脏产生的直接毒性，或人体对药物或其代谢产物产生过敏或代谢特异性反应，而导致的肝脏损伤。临床上，DILI可导致急性或者慢性肝病，严重者需进行肝脏移植或可危及生命。
目前，药物肝脏毒性主要采用动物模型评测的技术方法，其结果往往不足以反映人体内出现的内在和特异性肝毒性；而导致肝毒性药物进入临床实验的一个重要原因，是临床前动物模型与人类的种属差异。现有可供选择、公认的药物安全性评价模型主要集中在实验动物水平、体外细胞离体灌注下的组织/器官水平两个方面。
现有的体外肝毒性评价模型包括5大类：1)、异种表达体系，如Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶的酵母、哺乳动物非肝细胞和大肠杆菌等；2)、肝组织切片和整肝灌流；3)、肝脏亚细胞碎片，如微粒体离心物和肝组织匀浆，4)、干细胞诱导来源的肝细胞系统；5)、肝细胞源性原代细胞或肿瘤细胞；其中干细胞诱导来源的肝细胞因其更加接近体内肝细胞的状态，能够快速、可靠地对药物进行临前的安全性评价，是目前使用最广泛的体外肝毒性评价模型。
所述诱导的多能性干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)是指通过重编程使成熟体细胞表达与多能性相关的转录因子，产生具有多向分化潜能的干细胞；其优点是：由于iPSC的多能性，在不同的生化试剂和生长因子作用下可分化成任何类型的细胞，如肝细胞等；其为大量培养均一性的人肝细胞提供了可能；但其缺点是现有所述诱导的多能性干细胞诱导步骤较为繁琐，耗时较长，耗费的细胞因子种类多且数量大；不利于其后续步骤的简便优化及开发。
发明内容
发明目的：本发明的目的是利用人源诱导多能干细胞提供了一种快速有效的肝脏细胞诱导方法；即一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞方法的建立和应用。
技术方案：为获取功能性肝细胞，本发明提供了一种将人源诱导性多能干细胞诱导分化为肝细胞的方法，其具体步骤是：
步骤(1)、将hiPSC用培养基稀释至4×104cells/cm2的浓度，后将其铺设于基质胶培养皿中进行培养；
其中，在其培养至6至7天后进行传代一次；
步骤(2)、首先，在进行诱导的第0天，将进行了消化的hiPSC使用培养基稀释至5×106cells/well的浓度，后将其接种于铺设有基质胶的六孔板中进行培养7天，从而形成肝谱系内胚层；
然后，对形成的肝谱系内胚层进行基因鉴定和纯度分析，确定诱导成为完全内胚层；
步骤(3)、培养7天后，将hiPSC进行消化，进行消化后重新铺板至24孔板中，在24孔板中重新铺板后第15天，进行肝细胞的收集；
步骤(4)、对分化而来的肝细胞进行功能鉴定。
进一步的，在步骤(1)中，所述的培养基主要为干细胞培养基，并添加有干细胞培养添加剂和Y27632。
进一步的，所述步骤(2)具体操作步骤如下：
将步骤(1)中消化后的hiPSC使用培养基稀释至5×106cells/well每孔的浓度接种于铺有基质胶的六孔板中，
其中，所述培养基具体是：
在第0天，所述培养基为RIMP 1640、含B27添加剂、Activin A、CHIR99021及RockInhibitor；
其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、Activin A的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM、Rock Inhibitor的含量是10μM；
在第1天至第3天，所述培养基换为RIMP 1640、含B27添加剂、Activin A、CHIR99021及丁酸钠；
其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、Activin A的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM、丁酸钠的含量是0.5μM；
在第4天至第6天，所述培养基换为RIMP 1640、含B27添加剂、Activin A和CHIR99021，每天换液；
其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、Activin A的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM。
进一步的，在对步骤(2)所得的肝谱系内胚层细胞进行基因和纯度鉴定中，所述的鉴定方法包括流式细胞术检测和RT-PCR；
进一步的，在对步骤(4)所得的肝细胞进行基因和蛋白水平以及肝细胞相关功能鉴定中，
所述的鉴定方法包括显微镜形态学观察、RT-PCR、ELISA以及免疫荧光和PAS染色等；
其中，所述流式细胞术检测的细胞表面标记物为CXCR4、EpCAM和C-KIT；
所述RT-PCR检测的mRNA为OCT4和NANOG，其内胚层细胞相关基因CER1、CXCR4、FOXA2和HNF4A；
所述RT-PCR检测的mRNA包括肝细胞基因和细胞色素P450编码基因；
其中，所述肝细胞基因包括ALB、G6PC、RBP4、TTR和TDO2；
所述细胞色素P450编码基因包括CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4。
进一步的，所述流式细胞术的处理过程为收集第7天的细胞，经PBS洗两遍后，用CXCR4、EpCAM和C-KIT荧光抗体标记细胞，4℃冰箱孵育30分钟，后用PBS清洗两遍，重悬细胞后，在全数字光谱流式仪上进行细胞分析。
进一步的，在步骤(2)中所述RT-PCR法的处理过程为收集所需诱导时间点的细胞，诺唯赞试剂盒提取细胞总RNA并转录成cDNA，利用试剂盒的反应系统进行RT-PCR反应。
进一步的，在步骤(3)中，将hiPSC消化后重新铺板至24孔板；其具体地是：将细胞消化后用HCM/EGM培养基进行重悬，培养基成分为：HCM/EGM、FBS、DeX、OSM，调整密度后，于Corning的24孔板进行铺板，分别在第8、9、10、12、14、16、18、20天进行换液，直到第22天，回收上清并收集肝细胞。
进一步的，在步骤(4)中，对分化而来的肝细胞进行功能鉴定具体包括：
免疫荧光染色检测ALB表达；PAS染色检测肝细胞的糖原储存能力；ICG检测肝细胞的摄取和释放能力；直接比色法进行肝细胞尿素产量分析；CYP3A4酶活分析。
进一步的，所述的免疫荧光染色方法具体步骤如下：用4％的多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗后，用1％Triton X-100进行细胞破膜15分钟，再用PBS漂洗3次，再用3％的BSA室温封闭30分钟，PBS漂洗3次，加入相应的一抗ALB(1:100稀释)，4℃冰箱过夜孵育，PBS漂洗3次，再加入相应二抗(1:500稀释)室温孵育60分钟，加入DAPI后在共聚焦显微镜下拍摄。
进一步的，所述的PAS染色检测肝细胞的糖原储存能力的具体步骤如下：使用碧云天的PAS染色试剂盒，先用PBS洗涤细胞，并在室温(通常是采用15-25℃)下用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤后，细胞用0.5％高碘酸溶液氧化7分钟，PBS洗涤，入Schiff试剂加盖阴暗处孵育15分钟，在亚硫酸钠溶液和PBS先后洗涤细胞，最后再用显微镜观察。
进一步的，所述的ICG检测肝细胞的摄取和释放能力的具体步骤如下：10mg吲哚菁绿(ICG)粉溶解在10ml肝细胞培养基中，获得1mg/ml的原液；细胞在ICG培养基中以37℃培养4h后弃去含有ICG的培养基，PBS洗涤3次，显微镜下观察细胞对ICG的摄取的情况并拍照；再在细胞中加入新鲜的培养基，培养4h，显微镜下观察细胞释放ICG情况。
进一步的，所述肝细胞尿素产量分析中尿素检测试剂盒按照说明书来具体操作。使用P450-Glo-CYP3A4检测试剂盒按照说明书来检测细胞色素P450活性。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点是：本发明中，诱导而来的肝细胞诱导过程可见细胞形态的改变，对过程中细胞进行相关蛋白或基因表达鉴定可提示诱导是否成功。诱导而来的肝细胞具有糖原储存能力，对ICG有摄取和释放作用分泌白蛋白(ALB)的能力上调了，与iPSC相比，增加了九倍以上，更接近于原代肝细胞分泌白蛋白的能力，肝细胞的尿素产量，与hiPSC细胞相比，体增加了39倍，且接近原代肝细胞水平；本发明提供的快速有效诱导hiPSC的方法对推动肝细胞体外诱导和药物肝脏毒性研究具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的制备流程图；
图2是本发明中hiPSC诱导分化为内胚层细胞，再由内胚层细胞分化为肝细胞的过程；代表性图片分别为诱导后第7天、第12天、第17天和第22天。
具体实施方式
定义和技术：
除非另外指明，本发明的实验使用分子生物学、细胞生物学、免疫学和生物化学技术，其属于本领域技术范围。
除非另外说明，本发明中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本发明中使用的一些术语进行了下述定义。
本发明中所述的"人源诱导性多能干细胞"(hiPSC)是通过重编程技术外源转入若干干细胞多能性因子在体外重编程而成；这样的细胞可在胚胎干细胞培养条件下生长和传代。
本发明所述培养基为干细胞培养基、RIMP 1640培养基、和HCM/EGM培养基，所述干细胞培养基为添加有干细胞培养添加剂和Y27632的mTeSRTM1(STEMCELL)多能干细胞培养基，所述RIMP 1640培养基为添加有B27添加剂、Activin A、CHIR99021和Rock Inhibitor,或者添加有B27添加剂、Activin A、CHIR99021和丁酸钠，或者添加有B27添加剂、Activin A和CHIR99021配制而成。
本发明所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，包括流式细胞仪及荧光定量PCR分析干细胞特异基因表达等。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
实施例
本发明中所用技术概述：
除了特别说明，本说明书中提及的各种物质均购自Invitrogen。
市售hiPSC的培养过程如下：
市售hiPSC系DYR0100(iCell)使用mTeSRTM1(STEMCELL)多能干细胞培养基进行培养，培养基中添加干细胞培养添加剂和Y27632，培养时以4×104cells/cm2细胞浓度接种于铺有基质胶的培养皿中，置于37℃、5％CO2孵育箱中，6-7天传代一次。
内胚层和肝细胞的定向分化诱导过程如下：
以六孔板为例，在第0天，将hiPSC用培养基稀释，以5×106cells每孔的浓度接种于铺有基质胶的六孔板中，其中，培养基为RIMP 1640培养基，培养基中添加B27添加剂、Activin A、CHIR99021和Rock Inhibitor；
在第1天至第3天，将培养基换为RIMP 1640培养基，其实添加B27添加剂、ActivinA、CHIR99021和丁酸钠；
在第4天至第6天，将培养基为RIMP 1640培养基，其中添加B27添加剂、Activin A和CHIR99021，每天换液；
在第7天，将细胞消化后用HCM/EGM培养基进行重悬，培养基成分为：HCM/EGM、FBS、DeX、OSM，调整密度后进行铺板，转移进24孔板(Corning)，第8、9、10、12、14、16、18、20天进行换液，每五天收集一次24h上清，直到第22天，回收上清并收集肝细胞。
诱导过程细胞鉴定步骤如下：
在第7天消化并收集细胞后，经PBS洗两遍后，用CXCR4、EpCAM和C-KIT(BDBiosciences)的抗体标记细胞，4℃冰箱孵育30分钟，后用PBS清洗两遍，重悬细胞后，在全数字光谱流式仪上通过流式细胞术进行细胞分析；消化并收集各时间点的细胞，总RNA用诺唯赞试剂盒提取并用同一厂家q-RT试剂盒形成cDNA，RT-PCR用试剂盒(诺唯赞)的反应系统，按照具体说明书方法进行实时PCR检测；基因的表达分析用ΔCT法分析数据，得到各目的基因的相对表达量。
诱导获得的肝细胞功能检测步骤如下：
人的白蛋白水平使用ELISA试剂盒采用酶联免疫吸附试验来测定；尿素产量使用定量分析尿素检测试剂盒按照说明书来具体操作；使用P450-Glo-CYP3A4检测试剂盒按照说明书来检测细胞色素P450活性。
用4％的多聚甲醛对细胞进行固定30分钟，PBS漂洗后，用1％Triton X-100进行细胞破膜15分钟，再用PBS漂洗3次，每次5分钟，再用3％的BSA室温封闭30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟，加入相应的一抗ALB(1:100稀释)，4℃冰箱过夜孵育，PBS漂洗3次，再加入相应二抗(1:500稀释)室温孵育1h，加入DAPI后在共聚焦显微镜(选用尼康)下拍摄。
根据说明，使用PAS染色试剂盒(碧云天)来检测糖原；用PBS洗涤细胞，并在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤后，细胞用0.5％周期酸溶液氧化7分钟，PBS洗涤，入Schiff试剂加盖阴暗处孵育15分钟；在亚硫酸钠溶液中孵育三轮2分钟后，用PBS洗涤细胞，显微镜观察；将吲哚菁绿(ICG)粉(MCE)(10mg)溶解在10ml肝细胞培养基中，获得1mg/ml的原液；细胞在ICG培养基中以37℃培养4h后弃去含有ICG的培养基，PBS洗涤3次，显微镜下观察细胞对ICG的摄取的情况并拍照；再在细胞中加入新鲜的培养基，培养4h，显微镜下观察细胞释放ICG情况，拍照记录。
本发明先提供了一种先将hiPSC诱导分化为肝谱系内胚层细胞，再将肝谱系内胚层细胞诱导分化成肝细胞的方法；流式细胞术细胞分化表型进行鉴定结果显示有97.3％CXCR4+EpCAM+细胞和93.5％CXCR4+C-KIT+细胞，RT-PCR结果显示细胞迅速下调了干细胞基因OCT4和NANOG，并上调了内胚层的相关基因CER1、CXCR4、FOXA2和HNF4A，且诱导培养22天后，对诱导获得的肝细胞进行功能鉴定发现其在体外有储存糖原且可以摄取并且释放吲哚菁绿的功能，进一步验证，发现其还有产生白蛋白和尿素的能力，证实诱导成的肝样细胞具备正常肝细胞的部分功能；本发明简单高效地将hiPSC诱导分化为肝细胞的方法对药物肝脏毒性的研究和临床应用有着重要的意义。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)、首先，将人源诱导多能干细胞诱导分化为肝谱系内胚层细胞；将hiPSC用培养基稀释至4×104cells/cm2的浓度，后将其铺设于基质胶培养皿中进行培养；
其中，在其培养至6至7天后进行传代一次；
所述的培养基主要为干细胞培养基，并添加有干细胞培养添加剂和Y27632；
(2)、其次，对肝谱系内胚层细胞的功能进行鉴定；首先，在进行诱导的第0天，将进行了消化的hiPSC使用培养基稀释至5×106cells/well的浓度，后将其接种于铺设有基质胶的六孔板中进行培养7天，从而形成肝谱系内胚层；
然后，对形成的肝谱系内胚层进行基因鉴定和纯度分析，确定诱导成为完全内胚层；
将步骤(1)中消化后的hiPSC使用培养基稀释至5×106cells/well每孔的浓度接种于铺有基质胶的六孔板中，
其中，所述培养基具体是：
在第0天，所述培养基为RIMP 1640、含B27添加剂、Activin A、CHIR99021及RockInhibitor；
其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、Activin A的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM、Rock Inhibitor的含量是10μM；
在第1天至第3天，所述培养基换为RIMP 1640、含B27添加剂、Activin A、CHIR99021及丁酸钠；
其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、Activin A的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM、丁酸钠的含量是0.5μM；
在第4天至第6天，所述培养基换为RIMP 1640、含B27添加剂、Activin A和CHIR99021，每天换液；
其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、Activin A的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM；
所述的鉴定方法包括流式细胞术检测和RT-PCR；所述流式细胞术检测的细胞表面标记物为CXCR4、EpCAM和C-KIT；
所述RT-PCR法的处理过程为收集所需诱导时间点的细胞，诺唯赞试剂盒提取细胞总RNA并转录成cDNA，利用试剂盒的反应系统进行RT-PCR反应；
(3)、然后，将肝谱系内胚层细胞诱导分化成肝细胞；培养7天后，将hiPSC进行消化，进行消化后重新铺板至24孔板中，在24孔板中重新铺板后第15天，进行肝细胞的收集；
具体的，将hiPSC消化后重新铺板至24孔板；其具体地是：将细胞消化后用HCM/EGM培养基进行重悬，培养基成分为：HCM/EGM、FBS、DeX、OSM，调整密度后，于Corning的24孔板进行铺板，分别在第8、9、10、12、14、16、18、20天进行换液，直到第22天，回收上清并收集肝细胞；
(4)、最后，对诱导分化成的肝细胞的功能进行鉴定；
所述的鉴定方法包括显微镜形态学观察和RT-PCR；
其中，所述流式细胞术检测的细胞表面标记物为CXCR4、EpCAM和C-KIT；
所述RT-PCR检测的mRNA为OCT4、NANOG、CER1 CER1、CXCR4、FOXA2和HNF4A；
所述RT-PCR检测的mRNA包括肝细胞基因和细胞色素P450编码基因；
所述肝细胞基因包括ALB、G6PC、RBP4、TTR和TDO2；
所述细胞色素P450编码基因包括CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4；
所述流式细胞术的处理过程为收集第7天的细胞，经PBS洗两遍后，用CXCR4、EpCAM和C-KIT荧光抗体标记细胞，4℃冰箱孵育30分钟，后用PBS清洗两遍，重悬细胞后，在全数字光谱流式仪上进行细胞分析；
具体包括：
免疫荧光染色检测ALB表达；PAS染色检测肝细胞的糖原储存能力；ICG检测肝细胞的摄取和释放能力；直接比色法进行肝细胞尿素产量分析；CYP3A4酶活分析；
所述的免疫荧光染色方法具体步骤如下：用4％的多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗后，用1％Triton X-100进行细胞破膜15分钟，再用PBS漂洗3次，再用3％的BSA室温封闭30分钟，PBS漂洗3次，加入相应的一抗ALB，4℃冰箱过夜孵育，PBS漂洗3次，再加入相应二抗室温孵育60分钟，加入DAPI后在共聚焦显微镜下拍摄；
所述的PAS染色检测肝细胞的糖原储存能力的具体步骤如下：使用碧云天的PAS染色试剂盒，先用PBS洗涤细胞，并在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤后，细胞用0.5％高碘酸溶液氧化7分钟，PBS洗涤，入Schiff试剂加盖阴暗处孵育15分钟，在亚硫酸钠溶液和PBS先后洗涤细胞，最后再用显微镜观察；
所述的ICG检测肝细胞的摄取和释放能力的具体步骤如下：10mg吲哚菁绿粉溶解在10ml肝细胞培养基中，获得1mg/ml的原液；细胞在ICG培养基中以37℃培养4h后弃去含有ICG的培养基，PBS洗涤3次，显微镜下观察细胞对ICG的摄取的情况并拍照；再在细胞中加入新鲜的培养基，培养4h，显微镜下观察细胞释放ICG情况。
CN202210157307.7A 2022-02-21 2022-02-21 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法 Active CN114686418B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210157307.7A CN114686418B (zh) 2022-02-21 2022-02-21 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210157307.7A CN114686418B (zh) 2022-02-21 2022-02-21 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114686418A CN114686418A (zh) 2022-07-01
CN114686418B true CN114686418B (zh) 2024-04-02

Family

ID=82136855

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210157307.7A Active CN114686418B (zh) 2022-02-21 2022-02-21 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114686418B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101962628A (zh) * 2009-07-24 2011-02-02 北京大学 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101962628A (zh) * 2009-07-24 2011-02-02 北京大学 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Highly Synchronized Expression of Lineage-Specific Genes during In Vitro Hepatic Differentiation of Human Pluripotent Stem Cell Lines;Nidal Ghosheh等;Stem Cells International;8648356 *
Human liver organoids generated with single donor-derived multiple cells rescue mice from acute liver failure;Stem Cell Research & Therapy;Stem Cell Research & Therapy;第9卷(第5期);1-12 *
Production and cryopreservation of definitive endoderm from human pluripotent stem cells under defined and scalable culture conditions;Anais Sahabian等;NATURE PROTOCOLS;第16卷;1581–1599 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114686418A (zh) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10370638B2 (en) Primitive gut endoderm cells and method for producing same
Kwok et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single‐use bioreactors
EP2956538B1 (en) Bioengineered liver constructs and methods relating thereto
US20170009203A1 (en) Method Of Differentiation From Stem Cells To Hepatocytes
US9476030B2 (en) Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells and methods of use thereof
CN107099499B (zh) 将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合、重编程试剂盒
JPWO2009017254A1 (ja) 心筋細胞の細胞塊作製方法及び当該心筋細胞塊の用途
CN110713973B (zh) 一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法
EP3868870A1 (en) Method for producing stem/precursor cells, by using low molecular weight compound, from cells derived from endodermal tissue or organ
CN114395523B (zh) 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用
US20160046904A1 (en) Method For Culturing Hepatoblast-Like Cells And Culture Product Thereof
Knöspel et al. Periodic harvesting of embryonic stem cells from a hollow‐fiber membrane based four‐compartment bioreactor
CN114561335A (zh) 一种外周血单个核细胞制备肝脏类器官的方法
CN114686418B (zh) 一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法
CN114207118A (zh) 多能细胞聚集体及其用途
Zhang et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell (iPSC) line from a 72 year old male patient with later onset Alzheimer's disease
JP6486619B2 (ja) 薬物評価用細胞及び薬物評価方法
KR102218549B1 (ko) 인간 타액선 세포의 배양 방법
JP2020162551A (ja) 肝前駆細胞を含む細胞集団を製造する方法
WO2023162950A1 (ja) 肝オルガノイド由来培養肝細胞
Roche et al. Insulin-producing cells from embryonic stem cells experimental considerations
CN116333971A (zh) 一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法和用途
Heiberger In vitro direct reprogramming of mouse biliary epithelial cells towards an insulin-producing state
Owens Engineering a three-dimensional culture system for the directed differentiation of pluripotent stem cells toward a hepatocyte-like cell fate

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant