CN116333971A - 一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法和用途 - Google Patents

一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，其包括以下步骤：(1)体外获取并诱导2型糖尿病(T2DM)患者特异性尿源性干细胞的iPSCs(hUSCs‑iPSCs)；(2)获取正常人成熟胰岛细胞外泌体；(3)在hUSCs‑iPSCs体系中添加上述外泌体混合培养，诱导hUSCs‑iPSCs分化为高效产胰岛素的胰岛样细胞(ILCs)。本发明的方法简便，其中hUSCs‑iPSCs来源丰富、取材便利、临床操作无创性且便于制备，同时，正常胰岛细胞外泌体提取方法成熟，具备良好的易于临床转化的优点，从而为T2DM患者进行自体干细胞治疗提供了优质数量充足的细胞，为T2DM的治疗提供了有前景的治疗方案。

Description

一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛 素细胞分化效率的方法和用途
技术领域
本发明涉及一种高效获取胰岛样细胞的方法及其用途，尤其是一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化的方法及其用途。
背景技术
2型糖尿病(T2DM,Type 2Diabetes Mellitus)在全球患病率居高不下，其给患者带来的精神心理以及经济负担已成为当下迫切需要解决的社会医疗问题之一。T2DM患病是由于机体无法利用胰岛素或者胰岛素分泌相对或绝对不足，从而引起糖、脂肪、蛋白质等能量代谢紊乱性疾病。临床上，部分早期T2DM及难治性T2DM多采用规律皮下注射胰岛素治疗方法，但只能延缓、无法挽救疾病进程。细胞治疗将会是这部分T2DM患者的理想治疗策略。近几年，胰岛细胞移植相关研究已经取得一定突破，亦在部分临床实践中见到一些疗效，但其仍然受来源和免疫排斥等难题的限制。如何破解这些限制将是细胞治疗的关键问题。
发明内容
本发明的目的为基于上述技术背景而提供一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化的方法，该方法不存在临床伦理问题、能够拥有稳定且足够数量的细胞来源、破解了免疫排斥限制，并且具有高效的诱导效率。其在未来有希望为临床提供稳定且高效产胰岛素的胰岛样细胞，提高临床2型糖尿病疗效。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种诱导人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化的方法，所述方法包括以下步骤：(1)体外获取并诱导2型糖尿病(T2DM)患者特异性尿源性干细胞的iPSCs(hUSCs-iPSCs)；(2)获取正常人成熟胰岛细胞外泌体；(3)在hUSCs-iPSCs体系中添加上述外泌体混合培养，诱导hUSCs-iPSCs分化为高效产胰岛素的胰岛样细胞(ILCs)。为对上述技术方案步骤进一步改进和完善，所述步骤(1)中疾病特异性尿源性干细胞源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的体外提取方法为利用条件培养基筛选T2DM患者尿液并构建hUSCs-iPSCs。
为对上述技术方案步骤进一步改进和完善，所述步骤(1)中hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的方法为病毒逆转录转染法，逆转录病毒为包含Klf4、Sox2、Oct3/4、Nanog基因的质粒。
为对上述技术方案步骤进一步改进和完善，所述步骤(1)中hUSCs-iPSCs鉴定方法为细胞免疫荧光、RT-PCR、碱性磷酸酶染色或畸胎瘤实验。
为对上述技术方案步骤进一步改进和完善，所述步骤(3)所述外泌体刺激hUSCs-iPSCs方式为在全营养培养基体系中混合培养。
为对上述技术方案步骤进一步改进和完善，所述步骤(3)中将诱导hUSCs-iPSCs分化为高效产胰岛素的胰岛样细胞(ILCs)的鉴定方法为GSIS、放射免疫测定法、细胞免疫荧光、RT-PCR、western blot、流式分选。
另外，本发明还公开一种上述所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化的方在治疗T2DM中的用途。本发明的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化的方法，利用hUSCs-iPSCs来源丰富、取材便利、临床操作无创性且便于制备，同时，正常胰岛细胞外泌体提取方法成熟，因此具备良好的易于临床转化的优点。从而为T2DM患者进行自体干细胞治疗提供了优质且数量充足的细胞，为T2DM的治疗提供了有前景的治疗方案。
附图说明
图1本发明所述人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法的整体技术路线图；
图2本发明实施1所述特异性尿源性干细胞的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的获取、鉴定技术路线图；
图3本发明实施2所述人正常胰岛细胞外泌体提取的技术路线图；
图4本发明实施3所述外泌体与hUSCs-iPSCs混合培养以及Transwell共培养体系示意图。
图5本发明结果中所述经过尿细胞重编程得到的细胞株为多潜能干细胞
图6本发明结果中所述超高速离心得到的颗粒经鉴定为外泌体；
图7分化最后阶段免疫荧光检测到有PDX1和NKX6.1蛋白表达(蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为PDX1，红色荧光为NKX6.1；3D细胞培养；A-E分别为实验分组1-5)；
图8本发明结果中所述western bolt检测到PDX1、OCT3/4蛋白表达(PDX1为β细胞成熟标志，OCT3/4为β细胞祖源性标志物，β-actin为稳定表达蛋白起内参作用)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施1特异性性尿源性干细胞的iPSCs(hUSCs-iPSCs)系获取
hUSCs-iPSCs的获取的技术路线如附图2所示，其具体步骤如下：
(一)体外提取并扩增2型糖尿病患者的尿源性干细胞(hUSCs)
无菌条件下留取2型糖尿病患者尿液，离心，弃上清液，PBS清洗。用细胞计数仪计数细胞并测定细胞活力。以500个细胞/孔的浓度细胞种植于24孔板，特殊培养基培养。细胞贴壁稳定后用CCK8试剂盒连续检测细胞增殖。
(二)hUSCs鉴定
用不同方法鉴定hUSCs，包括表面标志物、相关蛋白表达、染色体稳定性方面。具体检测方法和指标如下：
1)流式细胞术分选鉴定hUSCs表面标志物，包括CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD117、CD133、SSEA4等；
2)细胞免疫荧光及western bolt鉴定hUSCs相关蛋白表达，如、尿溶蛋白Ia、CK7、CK13、α-SM actin、calponin、c-Kit、myosin、vimentin等。
3)hUSCs染色体稳定性用核型分析鉴定。
(三)hUSCs-iPSCs系的构建和培养
1)逆转录病毒质粒载体的准备
构建Oct3/4，Sox2，Nanog和Klf4四个基因的逆转录病毒质粒及参照质粒，使用感受态DH5α细菌进行无抗性培基扩增，扩增后混匀，均匀涂在抗性LB培养基以挑选单一菌株。单一菌株扩增培养，用大抽试剂盒分别抽提逆转录病毒质粒，并用Nano Drop检测浓度，待用。
2)构建载体转染细胞株
复苏并培养病毒包被细胞Human iPS Plat-A，贴壁后继续培养至细胞长到90％左右融合度。按1：3的比例将细胞接种到新平皿，待Plat-A贴壁且增长状态良好，用4ml0.05％胰酶/0.53mM EDTA消化，全培养基重悬计数，将8×106个细胞接种于10cm培养皿，孵箱孵育至细胞融合度达70％-80％。
准备数个1.5ml离心管，均加入0.5ml DMEM、10μl的lipo3000转染试剂，轻柔吹打混匀，室温下静置孵育5min。向上述离心管逐滴加入9μgpMXs质粒DNA(编码有Oct3/4，Sox2，Klf4和Nanog)，轻柔吹打混匀，室温下静置孵育15min。取出Plat-A细胞平皿，将DNA/lipo3000/DMEM混合液逐滴入，37℃、5％ CO2孵箱孵育过夜。同时高转染效率是诱导hUSCs-iPSCs系的关键，为监测转染效率，用pMXs逆转录病毒载体GFP荧光蛋白作为监测指标，我们常规得到的转染效率>80％。。
连续监测GFP荧光表达情况，适合状态下用10ml无菌一次性注射器收集病毒液，并用0.22μm孔径醋酸纤维酯膜过滤。每10ml含病毒液中加5μl8mg/ml的聚凝胺，混匀。分别取等体积含Oct4、Sox2、Klf4、Nanog逆转录病毒的病毒液至同一15ml离心管，吹打混匀。
将(一)(二)步骤中提取培养完成的hUSC，提前培养在10cm培养皿，并培养至大约90％融合度。取出hUSC培养皿，弃去上清，加入上述聚凝胺/逆转录病毒培养基，于37℃，5％CO2孵育，并及时换液传代。待hUSCs-iPSCs细胞克隆大到能够被顺利挑取，全程约20天。
3)将挑选出的hUSCs-iPSCs细胞，接种于96孔板，培养体系为每孔含20μl 0.25％胰酶和1mM EDTA。37℃，5％ CO2下孵育15min。每个孔加180μlES培养基，并吹打细胞成单细胞悬液。将悬液转移到24孔板，加1.5ml ES培养基，37℃，5％ CO2孵育，待细胞融合度到70-80％，传代到6孔板中扩大培养。
(四)hUSCs-iPSCs的鉴定
用不同方法鉴定hUSCs-iPSCs，包括表面标志物、相关基因及蛋白表达、多向分化潜能方面。具体检测方法和指标如下：
1)用免疫荧光法检测hUSCs-iPSCs表面标志物：4％多聚甲醛固定hUSCs-iPSCs细胞1h，0.2％TritonX-100打孔15min，PBS冲洗。孵育SSEA3、Nanog、TRA-1-60一抗，4℃孵育过夜。弃去一抗，PBS冲洗，荧光二抗37℃恒温共同孵育1h。PBS冲洗，DAPI染核10min，PBS冲洗后即可用抗荧光淬灭剂封片。待干片后，在尼康共聚焦显微镜下观察表面标志物表达情况。
2)用RT-QPCR及RT-PCR检测hUSCs-iPSCs基因表达：Trizol法抽提总RNA，以NADPH作为内参。取部分RNA逆转，配制QPCR体系，用BIO-RAD荧光定量PCR仪进行RT-PCR，用CT值Nanog、Sox2、Oct4及Dppa5评估mRNA表达的相对量。取部分RNA进行一般PCR，取扩增产物5μl，进行琼脂凝胶电泳分析，成像后分析灰度值，分析mRNA表达的相对量。
3)用western bolt检测hUSCs-iPSCs蛋白表达：提取hUSCs-iPSCs细胞样本蛋白，进行电泳、转膜、抗体孵育、显影后灰度值分析，分析蛋白表达的相对量。
4)用IACUC批准的方法进行畸胎瘤性分析hUSCs-iPSCs多向分化潜能的证实：收集大约2×106个hUSCs-iPSCs细胞，重悬于完全营养培养基，肌肉注射于2-3月龄免疫缺陷小鼠后肢。上述注射后4-6周畸胎瘤的形成，取下肿瘤做病理切片，进行HE染色及显微镜下观察，最后进行组织学分析。
实施2人胰岛细胞外泌体的提取
采集脑死亡器官供者胰腺，分离纯化胰岛，1500IQ接种于d10cm培养皿中24小时，取培养基；预冷离心机，300g转速，离心10min。吸上清液至新1.5ml离心管，2000g转速，离心10min。仔细吸取上清液，转移至超高速离心机，配平，10000g转速离心30min，吸取上清液。再用超高速离心机40000g超速离心90min。下层沉淀即为外泌体。弃去上清，用PBS洗涤并重悬，超高速离心机140000g离心90min。50μL PBS重悬，冻存备用。
实施3比较hUSCs-iPS cells与胰岛细胞、外泌体、化学因子混合或共培养分化为 胰岛样细胞效率
(一)实验分组
①：hUSCs-iPS五步法分化
②：hUSCs-iPS七步法分化
③：hUSCs-iPS+人源胰岛细胞共培养七步法分化
④：hUSCs-iPS+外泌体七步法分化
⑤：hUSCs-iPS+外泌体五步法分化
(二)hUSCs-iPS外泌体悬液、人源胰岛细胞、化学因子共培养方法
将hUSCs-iPSC接种于12孔板底层，将transwell小室放置于对应孔板。外泌体悬液或人源胰岛细胞接种于transwell小室内，令其与hUSCs-iPSC形成物理隔离，但外泌体和胰岛细胞分泌物可以自由通过半透膜与下层hUSCs-iPSC相互作用(如附图5所示)。期间培养传代，共培养20天，到达刺激hUSCs-iPSC向胰岛样细胞转化目的。RT-PCR检测基因C-peptide的表达，从而初步分析经上述刺激得到的胰岛样细胞性质。
(三)hUSCs-iPS cells与外泌体悬液混合培养方法
将hUSCs-iPSC接种于12孔板底层，待细胞贴壁融合至70％密度，将外泌体以10^3particles/cell加入到想用孔板内，期间培养传代，共培养20天，到达刺激hUSCs-iPSC向胰岛样细胞转化目的。RT-PCR检测基因C-peptide的表达，从而初步分析经上述刺激得到的胰岛样细胞性质。
(四)化学因子诱导hUSCs-iPS cells分化为胰岛样细胞方法
1)将hUSCs-iPS cells种植在基质胶包被的6孔板，培基培养4天，细胞贴壁后加入化学因子mlactivin A100 ng和wortmannin1μM诱导hUSCs-iPS cells成内胚层细胞。诱导结束后RT-PCR检测Oct3/4基因，验证得到内胚层细胞。
2)得到内胚层细胞后更换F12/IMDM培养基，并加入诱导因子2μMRA、20ng/ml FGF7及50ng/ml NOGGIN诱导4天。RT-PCR检测基因Pdx1、Nkx6-1表达，验证hUSCs-iPS从胰岛祖细胞转化为胰岛内分泌细胞。
3)更换高糖DMEM完全培养基，扩增培养。细胞状态稳定后，加入促进胰岛内分泌细胞成熟因子1％ ITS、bFGF、nicotinamide、Exendin-4和BMP2培养10天。RT-PCR检测基因C-peptide的表达，从而初步分析经上述刺激得到的胰岛样细胞性质。
(五)诱导后胰岛样细胞的检测
用不同方法鉴定诱导后胰岛样细胞，包括细胞形态、细胞增殖、分泌能力、特殊标志基因表达情况方面。具体检测方法和指标如下：
1)通过CCK8测定诱导后胰岛样细胞增殖曲线。
将胰岛样细胞接种培养于96孔板，细胞融合度达80％，加入0.1mlCCK8试剂，放于37℃孵育1h，酶标仪在450nm波长处检测吸光度，得到细胞第一天OD值。弃去CCK8试剂，更换新培养基，培养24h，重复上述CCK8试剂添加及OD值检测，共重复4天。绘制胰岛样细胞的增殖曲线。
2)通过相差显微镜观察诱导后胰岛样细胞的细胞形态学
在尼康高内涵倒置相差显微镜下，观察细胞形态并采集照片。
3)通过ELISA法检测诱导后胰岛样细胞分泌胰岛素及C-肽功能
将上述经不同诱导方法诱导后胰岛样细胞铺板孵育，更换Krebs缓冲液孵育1h。冲洗之后，向每种诱导方法得到的细胞孔板内分别加入基础培养基或含16.7mM葡萄糖的刺激性培养基，在37℃孵育1h，取上清，离心取上清。分别通过abcam的ELISA试剂盒检测，C肽总含量、胰岛素分泌量，并根据ILCsDNA含量进行标准化。
4)通过免疫荧光检测β细胞特殊标志基因Sox17、Pdx1、Nkx6-1、Glut2、Insulin、amylase、glucogan和C-肽的表达
将上述经不同诱导方法诱导后胰岛样细胞铺板孵育。细胞状态良好后，用4％多聚甲醛固定30min，Triton-X100透化处理细胞30min，BSA封闭细胞30min。将细胞置于一抗4℃过夜，滴加荧光标记的二抗，孵育1h。抗淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜观察拍照。
5)用western bolt检测上述Sox17、Pdx1、OCT3/4蛋白表达：提取上述细胞样本蛋白，进行电泳、转膜、抗体孵育、显影后灰度值分析，分析蛋白表达的相对量。
结果
(一)用小分子化合物和自体细胞饲养优化从UCs产生iPSC的优化方法
我们优化了低增殖hUC的重编程方法。由cyclic pifithrin-a(a P53inhibitor),A-83-01,CHIR99021,thiazovivin,NaB以及PD0325901组成的复合混合物显著提高了hUC的重编程效率(170倍以上)(图5)。
此外，我们还发现用自体hUC饲养细胞替代Matrigel可以克服由于大量细胞死亡导致重编程的失败。
(二)成功从人胰岛细胞培养基中提取外泌体
我们将原代人胰岛细胞体外培养24小时后取其培养基进行超高速离心，得到纳米大小颗粒，经过Nanoparticle tracking analysis(NTA)和western blot检测方法鉴定为外泌体。成功获得从原代人胰岛细胞的外泌体(图6)。
(三)不同诱导方法对IPSCs分化成IPCs的差异。
我们将采用传统的五步以及目前效率较高的七步化学因子方法对IPSCs进行诱导分化，并且增加人胰岛细胞及其分离纯化得到的外泌体分别与IPSCs共培养，同时应用上述两种方法进行诱导分化，最后阶段检测胰岛beta细胞标志PDX1、NKX6.1蛋白的表达。结果发现两者蛋白均有表达(图7)，提示我们诱导分化成功，得到的为胰岛样细胞。此外，外泌体与IPSCs共培养组(图7D)两者蛋白荧光最多，比与人胰岛细胞共培养组略高，且该组干细胞标志蛋白OCT3/4的表达最少(图7)，说明与人胰岛细胞共培养的IPSCs在诱导分化过程中实际起作用的可能为人胰岛细胞分泌的外泌体。经此，我们初步建立一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)体外获取并诱导2型糖尿病(T2DM)患者特异性尿源性干细胞的iPSCs(hUSCs-iPSCs)；
(2)获取正常人成熟胰岛细胞外泌体；
(3)在稳定的hUSCs-iPSCs体系中添加上述外泌体混合培养，诱导hUSCs-iPSCs分化为高效产胰岛素的胰岛样细胞(ILCs)。
2.如权利要求1所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，所述步骤(1)中T2DM的hUSCs-iPSCs提取构建。
3.如权利要求1所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，所述步骤(1)中将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的方法为病毒逆转录转染法，逆转录病毒为包含Klf4、Sox2、Oct3/4、Nanog基因的质粒。
4.如权利要求1所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，所述步骤(1)中hUSCs-iPSCs鉴定方法为细胞免疫荧光、RT-PCR、碱性磷酸酶染色或畸胎瘤实验。
5.如权利要求1所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，所述步骤(3)外泌体与hUSCs-iPSCs在全营养培养基体系中混合培养。
6.如权利要求1所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法，所述步骤(3)中将诱导hUSCs-iPSCs分化为高效产胰岛素的胰岛样细胞(ILCs)的鉴定方法为GSIS、放射免疫测定法、细胞免疫荧光、RT-PCR、western blot、流式分选。
7.一种如权利要求1～6任意一项所述的人成熟胰岛细胞共培养提高人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞分化效率的方法在治疗T2DM中的用途。
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