CN110747163A

CN110747163A - 一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法及其专用培养基

Info

Publication number: CN110747163A
Application number: CN201911105157.XA
Authority: CN
Inventors: 马义; 王紫贤
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110747163B

Abstract

本发明公开了一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法及其专用培养基。该培养基包括成脂诱导培养基I和成脂诱导培养基II：成脂诱导培养基I为含有3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、吲哚美辛、地塞米松、胰岛素、甲状腺激素、罗格列酮和PAC1受体激活肽(SEQ ID NO.1)的成脂诱导培养基；成脂诱导培养基II为含有胰岛素、甲状腺激素、罗格列酮和PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基。本发明还提供一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，将脂肪间充质干细胞用成脂诱导培养基I诱导培养3天后，换为成脂诱导培养基II继续诱导培养11～18天。本发明的方法能显著提高ADSCs成脂分化率，减少成脂分化时间，培养体系生物安全性高。

Description

一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法及其专用培养基

技术领域

本发明属于干细胞诱导培养技术领域，特别涉及一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法及其专用培养基。

背景技术

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是指从脂肪组织中分离得到的，并具有分化成骨骼、软骨、以及脂肪潜力的干细胞。ADSCs在体外特定的诱导条件下，可分化成软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、肌腱细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞等多种细胞，在组织工程和再生医学领域具有重要生理学意义。ADSCs的成脂分化是一个精密和而复杂的过程，主要包括以下四个阶段：定向阶段、克隆性扩增阶段、克隆增生终止阶段、特异性功能基因转录和翻译阶段。培养条件如培养基的成分和种类、糖浓度、氧浓度、血清浓度和培养方法等都会影响脂肪干细胞成脂分化能力。在ADSCs向脂肪细胞分化的过程中，细胞形态会由梭形变成圆形，细胞内会积聚大量的脂滴，甘油三酯分泌增加，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)等表达增强。

PACAP作为一种神经肽，属于激素的胰高血糖素超家族，它以PACAP27和PACAP38两种形式存在，其中PACAP27是PACAP38的N末端截短形式。PACAP广泛分布于中枢神经系统和外周组织器官，发挥多种生物学功能，包括促胰岛素释放、促神经递质释放、血管舒张、支气管扩张、免疫调节、细胞增殖和分化等。PACAP对脂代谢也有一定的作用，越来越多的证据表明，PACAP通过其在多个器官中的作用，在葡萄糖和脂质代谢等生理活动中发挥重要功能。目前发现的PACAP受体有两个类型，I型受体PAC1，对PACAP具有较高亲和力；II型受体包括VPAC1和VPAC2，对PACAP和VIP具有相近的亲和力，研究表明PACAP能通过PAC1受体促进脂肪干细胞成脂分化。

脂肪组织工程已经成为再生医学中的一个热门领域，其致力于由于严重烧伤或乳腺肿瘤切除而造成的脂肪缺失。再生医学、组织工程为脂肪填充带来了新的治疗前景，但种子细胞的选择是治疗的关键。脂肪干细胞因其来源丰富、获取容易、可塑性高及增值能力强、并能招募其他细胞参与重建等特点，一直以来都是种子细胞的热门人选。因此，深入研究脂肪干细胞成脂分化和PAC1受体衍生多肽的功能，有望为治疗术后或烧伤后造成的脂肪缺失提供理论基础，为临床脂肪组织填充提供新的思路和方向。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基。

本发明的另一目的在于提供一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法。该方法具有操作简单、无细胞毒性、重复性高、并能满足ADSCs的体外培养以及临床应用的需要等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基，包括成脂诱导培养基I和成脂诱导培养基II；

所述的成脂诱导培养基I为含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、地塞米松、胰岛素、甲状腺激素(T3)、罗格列酮和PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基(ADSCs成脂诱导培养基)；

所述的成脂诱导培养基II为含有胰岛素、甲状腺激素(T3)、罗格列酮和PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基。

所述的成脂诱导培养基为高糖DMEM培养基；优选为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基。

所述的PAC1受体激活肽的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.1)：HSDGLFTDSYSRYRIQIAV。

所述的成脂诱导培养基I优选为含有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，150nM吲哚美辛，4μg/ml地塞米松，1μM胰岛素，1nM甲状腺激素(T3)，0.5μM罗格列酮和0.001～10μM PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基。

所述的成脂诱导培养基II优选为含有1μM胰岛素，1nM甲状腺激素(T3)，0.5μM罗格列酮和0.001～10μM PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基。

所述的成脂诱导培养基I中PAC1受体激活肽的浓度优选为0.1～1μmol/L；更优选为0.4～1μmol/L；最优选为1μmol/L。

所述的成脂诱导培养基II中PAC1受体激活肽的浓度优选为0.1～1μmol/L；更优选为0.4～1μmol/L；最优选为1μmol/L。

一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，包括如下步骤：将脂肪间充质干细胞用成脂诱导培养基I诱导培养3天后，换为成脂诱导培养基II继续诱导培养11～18天；其中：

所述的成脂诱导培养基I为含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、地塞米松、胰岛素、甲状腺激素(T3)、罗格列酮和PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基；

所述的脂肪间充质干细胞为通过原代培养和传代培养获得的脂肪间充质干细胞；优选为通过原代培养和传代3次以上的脂肪间充质干细胞；更优选为通过如下方法获得：将分离的脂肪间充质干细胞用成人脂肪间充质干细胞完全培养基于37℃，5％(v/v)CO₂条件下进行培养，每2～3天换液一次，直至细胞基本铺满板底；然后继续在37℃、5％(v/v)CO₂的条件下进行传代培养，待细胞接近长满后重复进行传代操作至三代以上。

所述的分离优选为通过如下方式实现：将脂肪组织剪碎，于1500rpm、4℃条件下离心5min，收集上层脂肪，然后入0.25％(w/v)的I型胶原酶于37℃条件下消化40～60min，离心，弃上清，得到脂肪间充质干细胞。

所述的脂肪组织与I型胶原酶的体积比优选为3:1。

所述的传代培养为通过如下步骤实现：待细胞在培养瓶底部融合成单层，达到90％～100％融合度时，加入含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰酶消化离心后，收集细胞，然后直接接种于成人脂肪间充质干细胞完全培养基中，继续在37℃、5％(v/v)CO₂的条件下进行培养。

所述的传代培养中的传代比例为1:2～3。

所述的脂肪间充质干细胞的接种密度为1×10⁴～2×10⁵cells/ml；优选为：2×10⁵cells/ml。

所述的诱导培养均为在37℃、5％(v/v)CO₂的条件下进行诱导培养。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明针对ADSCs成脂分化效率低的缺陷，通过加入活性多肽优化诱导培养基成分和培养方法，显著提高ADSCs成脂分化率，减少成脂分化时间。

(2)本发明提供的培养基中，各组分安全无细胞毒性、方法操作简便、可操作性强，可以显著提高ADSCs成脂分化效率。

(3)本发明方法涉及的脂肪干细胞来源丰富、获取容易、可塑性高及增值能力强、并能招募其他细胞参与重建等特点，能进一步满足干细胞的临床应用要求。

(4)本发明方法涉及的细胞体系简单、无细胞毒性、且该方法的重复性高。

(5)本发明方法操作简便，可操作性强，培养体系生物安全性高，有望为治疗脂肪缺失提供理论基础，为临床脂肪组织填充提供新的思路和方向。

附图说明

图1为培养第三代(P3)的人脂肪来源的间充质干细胞图(长梭形突起，排列有明显方向性，呈漩涡性生长)。

图2为PAC1受体激活肽对脂肪间充质干细胞的无毒性作用的CCK8结果图。

图3为成脂诱导分化3天和14天细胞形态图(细胞逐渐变圆、细胞内出现小脂滴)；其中，A为成脂诱导分化3天的细胞形态；B为成脂诱导分化14天细胞形态。

图4为PAC1受体激活肽促进脂肪间充质干细胞(ADSCs)成脂肪分化的油红O染色结果图。

图5为PAC1受体激活肽促进ADSCs成脂肪分化的RT-PCR结果图；其中，A为成脂分化因子PPARγ的相对表达量；B为成脂分化因子C/EBPα的相对表达量；C为成脂分化因子AP₂的相对表达量。

图6为PAC1受体激活肽促进ADSC成脂肪分化的western blotting结果图。

图7为PAC1受体激活肽促进ADSCs成脂肪分化的甘油三酯含量检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明实施例中涉及的培养基如下：

成脂诱导培养基I：在ADSCs成脂诱导培养基(含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基)的基础上添加3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、地塞米松、胰岛素、甲状腺激素(T3)、罗格列酮以及PAC1受体激活肽；其具体组成成分为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100μg/ml链霉素、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、150nM吲哚美辛、4μg/ml地塞米松、1μM胰岛素、1nM甲状腺激素(T3)、0.5μM罗格列酮和1μM PAC1受体激活肽的高糖DMEM培养基(Gibco)；

成脂诱导培养基II：在ADSCs成脂诱导培养基(含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基)的基础上添加胰岛素、甲状腺激素(T3)、罗格列酮和PAC1受体激活肽；其具体组成成分为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100μg/ml链霉素、1μM胰岛素、1nM甲状腺激素(T3)、0.5μM罗格列酮和1μM PAC1受体激活肽的高糖DMEM培养基(Gibco)；

上述PAC1受体激活肽的序列为：HSDGLFTDSYSRYRIQIAV，由吉尔生化(上海)有限公司合成。

实施例1

脂肪间充质干细胞(ADSCs)的分离提取、原代培养和传代培养。

(1)胶原酶消化法提取脂肪来源的ADSCs。从医院获取经抽脂手术提取的无菌脂肪组织，剪碎，1500rpm，4℃，离心5min收集上层脂肪。加入0.25％(w/v)的I型胶原酶(Invitrogen)(脂肪：胶原酶＝3：1，v/v)，37℃消化40～60min。离心弃上清并加入10mlOriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)终止消化，20μm筛网过滤。离心弃上清液(动作要轻)，保留下层细胞沉淀加入OriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)重悬，置于37℃，5％(v/v)CO₂的恒温细胞培养箱中培养。3天后更换OriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)，培养皿中贴壁细胞即为脂肪干细胞，形态如图1所示。

(2)脂肪间充质干细胞(ADSCs)传代培养。在倒置显微镜下观察，培养瓶中细胞达到90％～100％融合时进行传代。弃掉旧培养基，并用无菌PBS缓冲液清洗，然后加入含0.25％EDTA(乙二胺四乙酸)的胰酶溶液消化2min至细胞变圆。加入含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的OriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)终止消化，无菌滴管将细胞吹打分散后离心，收集的细胞直接接种于OriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)中，继续在37℃和5％(v/v)CO₂的条件下进行培养，待细胞接近长满后重复进行传代操作(传代比例为1:2～3)。

实施例2

CCK8测PAC1受体激活肽对脂肪干细胞的毒性作用。

取P3代(3次传代)细胞，胰酶消化并用OriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)调节细胞浓度到1×10⁴个/ml，以每孔100μl体积接种于96孔板中培养24h。待细胞贴壁后，弃去旧培养基，更换为含有不同浓度(0.001，0.01，0.1，1，10μM)PAC1受体激活肽的OriCellTM成人脂肪间充质干细胞完全培养基(Cyagen:HUXMD-90011)100μl继续培养，以加入相应体积的PBS缓冲液为对照。48h后，加入CCK8溶液，37℃孵育1h，最后使用酶标仪测定OD₄₅₀处吸光度。实验结果如图2所示，PAC1受体激活肽对脂肪干细胞生长无明显毒性作用。

实施例3

ADSCs诱导成脂分化并鉴定。

(1)设置2个对照组和1个实验组，ADSCs经过3次传代后，待细胞长满后消化、重悬并以2×10⁵个/ml接种于6孔板中培养2天至细胞接触抑制。去掉旧培养基，加入诱导培养基(表1)，然后置于5％(v/v)CO₂培养箱37℃培养，每3天换一次液。表1为各组所采用的诱导培养基的配方。

表1 培养基成分

(2)实验组先加入成脂诱导培养基I(含有10％(v/v)胎牛血清FBS、100μg/mL青霉素、100μg/ml链霉素)培养3天。倒置显微镜下观察细胞逐渐变圆、细胞内出现小脂滴，然后换成成脂诱导培养基II(含有10％(v/v)胎牛血清FBS、100μg/mL青霉素、100μg/ml链霉素)继续培养11～18天。如图3所示，图3a为成脂诱导3天，图3b为成脂诱导14天细胞形态图。

(3)油红O染色检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的积聚以表征ADSCs的成脂分化程度，细胞铺板后加入诱导培养基(表1)进行诱导培养21天，即对照组1和对照组2直接诱导培养21天，实验组用成脂诱导培养基I培养3天，换成成脂诱导培养基II继续培养18天，均为每3天换液一次。培养21天后进行染色。首先用1ml 4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS缓冲液清洗2遍，每孔加入1ml 60％(v/v)异丙醇分化至间质清晰，然后加入1ml油红O染色工作液(Solarbio)染色30min，PBS缓冲液清洗2遍。于倒置显微镜下进行观察，并拍照。实验结果如图4所示，与对照组2相比，添加PAC1受体激活肽组的实验组可显著提高ADSCs自分化所形成的脂滴数目，提示新成脂方式可促进ADSCs向脂肪细胞分化。

(4)荧光定量PCR(RT-PCR)检测成脂分化因子C/EBPα、PPARγ和AP₂的相对表达量，其中所需引物序列如下表1所示。细胞铺板后加入诱导培养基(表1)进行诱导培养14天，即对照组1和对照组2直接诱导培养14天，实验组用成脂诱导培养基I培养3天，换成成脂诱导培养基II继续培养11天，均为每3天换液一次。ADSCs成脂诱导14天后，按Trizol试剂盒说明书进行细胞总RNA提取，然后采用反转录试剂盒获得cDNA。按SYBR Green定量PCR试剂盒对C/EBPα、PPARγ和AP₂表达水平进行检测，以GAPDH为内参基因，以2^-ΔΔCt法进行定量分析，结果如图5所示。

实验结果表明，细胞成脂诱导14天后，与对照组1相比，对照组2和实验组成脂标记基因C/EBPα、PPARγ和AP₂表达水平均有极显著升高(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。而与对照组2比较，实验组C/EBPα、PPARγ和AP₂基因表达水平分别提高了约1.6、1.25、1.35倍(**P﹤0.01)，说明含有PAC1受体激活肽的新成脂方式可以促进人脂肪间充质干细胞(ADSCs)向成脂分化的作用。

表2 RT-PCR引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		GAPDH-F	CAGGAGGCATTGCTGATGAT
GAPDH-R	GAAGGCTGGGGCTCATTT
		PPARγ-F	TTGTCACGGAACACGTGCA
PPARγ-R	GGAGCGGGTGAAGACTCATG
		C/EBPα-F	CCCTCAGCCTTGTTTGTACTGTATG
C/EBPα-R	TTCGTGTTCCTAGGCAATGCT
		AP<sub>2</sub>-F	TGTGCAGAAATGGGATGGAAA
AP<sub>2</sub>-R	ACTAGCTGGTCCACATCTCCAAG

(5)Western blot检测PPARγ和C/EBPα在蛋白水平的变化。收集各组成脂诱导分化14后的细胞，PBS洗2遍，加入细胞裂解液，4℃裂解细胞30min。12000rpm 4℃离心25min，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量。取20ug蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，经10％SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上，含5％(w/v)脱脂奶粉室温封闭1h。4℃过夜孵育一抗，用TBST洗膜5次，加入二抗室温孵育1h，再用TBST洗膜5次，ECL化学发光显影，实验结果如图6所示。

结果表明，与对照组1相比，各诱导组PPARγ和C/EBPα蛋白表达水平显著提高，并且加有PAC1受体激活肽的实验组的蛋白水平显著高于成脂诱导组(MDI)，证实新成脂方式对ADSCs向脂肪细胞分化具有促进作用(**P<0.01，***P<0.001)。

(6)采用组织甘油三酯酶法测定试剂盒(组织细胞)检测细胞甘油三酯含量，按照试剂盒说明书，配制工作液和标准品。PBS缓冲液清洗诱导14天后细胞两次，加入裂解液并转入1.5ml离心管中，离心取上清进行酶学测定。在96孔板中每孔加入2.5ml的样品或标准品，再加入250ul的工作液，37℃条件下反应10min。在OD₅₁₀处测定吸光度。根据试剂盒说明书计算样品中甘油三酯含量。结果如图7所示，含PAC1受体激活肽的实验组甘油三酯含量明显高于对照组1和对照组2。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法及其专用培养基

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAC1激活肽

<400> 1

His Ser Asp Gly Leu Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gln

1 5 10 15

Ile Ala Val

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH-F

<400> 2

caggaggcat tgctgatgat 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH-R

<400> 3

gaaggctggg gctcattt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PPARγ-F

<400> 4

ttgtcacgga acacgtgca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PPARγ-R

<400> 5

ggagcgggtg aagactcatg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C/EBPα-F

<400> 6

ccctcagcct tgtttgtact gtatg 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C/EBPα-R

<400> 7

ttcgtgttcc taggcaatgc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AP2-F

<400> 8

tgtgcagaaa tgggatggaa a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AP2-R

<400> 9

actagctggt ccacatctcc aag 23

Claims

1.一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于：包括成脂诱导培养基I和成脂诱导培养基II；

所述的成脂诱导培养基I为含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、地塞米松、胰岛素、甲状腺激素、罗格列酮和PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基；

所述的成脂诱导培养基II为含有胰岛素、甲状腺激素、罗格列酮和PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基；

所述的PAC1受体激活肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于：

所述的成脂诱导培养基I为含有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，150nM吲哚美辛，4μg/ml地塞米松，1μM胰岛素，1nM甲状腺激素，0.5μM罗格列酮和0.001～10μM PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基；

所述的成脂诱导培养基II为含有1μM胰岛素，1nM甲状腺激素，0.5μM罗格列酮和0.001～10μM PAC1受体激活肽的成脂诱导培养基；

所述的成脂诱导培养基为高糖DMEM培养基。

3.根据权利要求2所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于：

所述的成脂诱导培养基为含有10％(v/v)胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基；

所述的成脂诱导培养基I中PAC1受体激活肽的浓度为0.1～1μmol/L；

所述的成脂诱导培养基II中PAC1受体激活肽的浓度为0.1～1μmol/L。

4.根据权利要求3所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于：

所述的成脂诱导培养基I中PAC1受体激活肽的浓度为0.4～1μmol/L；

所述的成脂诱导培养基II中PAC1受体激活肽的浓度为0.4～1μmol/L。

5.根据权利要求1所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于：

所述的成脂诱导培养基I中PAC1受体激活肽的浓度为1μmol/L；

所述的成脂诱导培养基II中PAC1受体激活肽的浓度为1μmol/L。

6.一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：将脂肪间充质干细胞用成脂诱导培养基I诱导培养3天后，换为成脂诱导培养基II继续诱导培养11～18天；其中：

所述的PAC1受体激活肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于：

所述的成脂诱导培养基为高糖DMEM培养基。

8.根据权利要求7所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于：

9.根据权利要求6所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于：

所述的脂肪干细胞的接种密度为1×10⁴～2×10⁵cells/ml；

10.根据权利要求6所述的提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于，所述的脂肪间充质干细胞为通过原代培养和传代培养获得的脂肪间充质干细胞；具体为：

将分离的脂肪间充质干细胞用成人脂肪间充质干细胞完全培养基于37℃，5％(v/v)CO₂条件下进行培养，每2～3天换液一次，直至细胞基本铺满板底；然后继续在37℃、5％(v/v)CO₂的条件下进行传代培养，待细胞接近长满后重复进行传代操作至三代以上；

所述的传代培养为通过如下步骤实现：待细胞在培养瓶底部融合成单层，达到90％～100％融合度时，加入含EDTA的胰酶消化离心后，收集细胞，然后直接接种于成人脂肪间充质干细胞完全培养基中，继续在37℃、5％(v/v)CO₂的条件下进行培养。