CN113215092B

CN113215092B - 一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法

Info

Publication number: CN113215092B
Application number: CN202110575862.7A
Authority: CN
Inventors: 陈义
Original assignee: Guangzhou Fengyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Fengyuan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113215092A

Abstract

本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法。本发明提供的方法包括如下步骤：（1）将脂肪间充质干细胞接种于培养设备中，转染ENSG00000260823基因的沉默剂；（2）添加成脂诱导培养基，对细胞进行成脂分化诱导。通过本发明所提供的方法能够有效的促进脂肪间充质干细胞的快速成脂分化。

Description

一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种快速的骨髓间充质成脂分化方法。

背景技术

人脂肪间充质干细胞是一种成人间充质干细胞，具有高度的自我复制和分化能力，可以分化成多种不同的细胞。在细胞组织工程中，脂肪间充质干细胞相较于其他来源的间充质干细胞具有较多的优势，如易于从脂肪组织中分离，产量高，体外培养容易膨胀等，因此，其在细胞组织工程中被广泛的应用。

脂肪间充质干细胞的成脂分化是脂肪间充质干细胞分化研究中的重要的方向，成脂分化在间充质干细胞的医学美容中具有重要的应用。因此有效的促进脂肪间充质干细胞的成脂分化对于脂肪干细胞的更好应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

首先，本发明提供了一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法，所述方法包括如下步骤：

（1）将脂肪间充质干细胞接种于培养设备中，转染ENSG00000260823基因的沉默剂；

（2）添加成脂诱导培养基，对细胞进行成脂分化诱导。

优选地，所述ENSG00000260823基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述沉默剂为siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID N0.3所示。

优选地，所述成脂诱导培养基为含有10μg/mL胰岛素， 1μmoL /L地塞米松，0. 5mmoL /L异丁基甲基黄嘌呤， 200μmoL /L吲哚美辛,10% FBS的DMEM培养基。

其次，本发明提供了抑制ENSG00000260823基因表达的沉默剂在制备脂肪间充质干细胞成脂分化促进制剂中的应用。

优选地，所述沉默剂为siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

其次，本发明提供了抑制ENSG00000260823基因表达的沉默剂在制备成脂分化相关基因PPARγ基因表达促进制剂中的应用。

最后，本发明提供了抑制ENSG00000260823基因表达的沉默剂在制备成脂分化相关基因C/EBPα基因表达促进制剂中的应用。

本发明的有益效果在于，本发明发现沉默ENSG00000260823基因表达的沉默剂能够有效的促进脂肪间充质干细胞成脂分化，因此可将其用于促进脂肪间充质干细胞的成脂分化。

附图说明

图1为ENSG00000260823基因siRNA的沉默效果检测结果；

图2为ENSG00000260823基因siRNA促进脂肪间充质干细胞成脂分化的检测结果；

图3 为ENSG00000260823基因siRNA促进脂分化相关基因PPARγ表达的检测结果；

图4为ENSG00000260823基因siRNA促进脂分化相关基因C/EBPα表达的检测结果。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。需要指出的是所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

实施例1

ENSG00000260823基因的siRNA的设计和转染

1.siRNA设计

根据siRNA设计的基本原则，针对ENSG00000260823基因转录本（SEQ ID NO.1）设计siRNA（siRNA-1）,siRNA-1的碱基序列如下：

正义链：5’-GCAGGGAAAUUGAAAGUAA-3’,SEQ ID NO.2；

反义链：5’-UUACUUUCAAUUUCCCUGC-3’，SEQ ID NO.3；

NC-siRNA的碱基序列如下：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’,SEQ ID NO.4；

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’,SEQ ID NO.5；

2.转染siRNA-1和NC-siRNA

（1）将脂肪间充质干细胞借助于细胞培养板中，待细胞密度达到60%时进行转染；

（2）将4ul lipfectamine2000加入到50ul opti-MEM培养基中，室温静置5min，得反应液1；

（3）将2ul siRNA加入到50ul opti-MEM培养基中，室温静置5min，得到反应液2；

（4）将反应液1和反应液2混合，充分混匀后，室温静置10min，得到反应液3；

（5）将反应液3加入到细胞培养板中，混匀后培养48h；

3.提取RNA

（1）转染48h后，去除培养基，使用PBS洗涤细胞一遍，加入1ml Trizol充分裂解细胞；

（2）将裂解液收集至1.5ml EP管中，加入200ul氯仿，颠倒混匀之后，室温静置5min，将EP管放入离心机中，4℃离心15min；

（3）将400ul上清吸取至新的EP管中，加入预冷的异丙醇400ul，混匀后将EP管放入离心机中，4℃离心10min；

（4）弃去上清后，使用75%的乙醇清洗沉淀物后，放入离心机中，4℃离心10min；

（5）去除乙醇后，真空干燥5min后，加入30ul DEPC水，得到RNA溶液。

4.逆转录反应

（1）配置如下的反应体系：

反应体系	添加量
		5×gDNA Eraser Buffer	2μl
gDNA Eraser	1μl
		Total RNA	1μg
RNase Free dH2O	up to 10μl

设定的PCR的反应程序如下：42℃ 2min，4℃ forever；

（2）配置如下的反应体系：

试剂	添加量
		步骤（1）反应液	10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1μl
		RT Primer Mix	1μl
5×PrimeScript Buffer	4μl
		RNase Free dH2O	4μl

设定的PCR的反应程序如下：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ forever；

5.荧光定量PCR反应

（1）设计ENSG00000260823基因和GAPDH基因的引物

ENSG00000260823基因

上游引物：5’-GAACTGAAGTTGGGCAGGGA-3’，SEQ ID NO.6;

下游引物：5’-ATATGGGAGCAGGAGGGACA-3’,SEQ ID NO.7;

GAPDH基因

上游引物：5’-ACATGGCTGAGAACGGGAAG-3’，SEQ ID NO.8;

下游引物：5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’,SEQ ID NO.9；

（2）配置荧光定量PCR反应体系:

反应体系	添加量
		SYBR Green Premix Ex Taq（2×）	10μl
正向引物	0.4μl
		反向引物	0.4μl
cDNA模板	2μl
		ddH2O	7.2μl

设置实时荧光定量PCR仪的反应程序为95℃ 30s；95℃ 15s, 60℃ 30s，72℃15s，40个循环；

（3）使用2^{-△△ CT}法对结果进行分析。

得到的结果如图1，可以看出转染si-RNA-1后，ENSG00000260823基因的表达量显著的降低（沉默效果为77%），且二者存在极显著差异，因此，该结果说明si-RNA-1可以高效的沉默ENSG00000260823基因的表达。

实施例2

油红O检测脂肪间充质干细胞成脂分化

（1）实验分组：

A组：使用10%的DMEM培养；

B组转染NC-siRNA后，使用成脂诱导培养基（含有10μg/mL胰岛素， 1μmoL /L地塞米松+ 0. 5 mmoL /L异丁基甲基黄嘌呤， 200μmoL /L吲哚美辛,10%FBS的DMEM培养基。）处理7天；

C组转染si-RNA-1后，使用成脂诱导培养基处理7天；

（2）培养结束后，去除培养基，使用PBS清洗细胞3次，加入10%多聚甲醛固定30min；

（3）去除多聚甲醛，加入油红O工作液，染色30min；

（4）结束后，去除油红O工作液，使用PBS清洗细胞3次后，将细胞置于倒置显微镜下进行拍照。

实验结果如图2所示，从A组和B组的比较可以看出，成功实现成脂诱导，从B组和C组的比较可以看出，转染si-RNA-1能够有效的促进脂肪间充质干细胞的成脂分化。说明ENSG00000260823基因的沉默剂能够有效的促进脂肪间充质干细胞的成脂分化。

实施例3

荧光定量PCR检测ENSG00000260823基因对于PPARγ和C/EBPα基因表达的影响

（1）实验分组：

A组：使用10%的DMEM培养；

C组转染si-RNA-1后，使用成脂诱导培养基处理7天；

（2）培养结束后，提取RNA，进行逆转录反应得到cDNA；

（3）参照实施例1检测PPARγ和C/EBPα的表达水平；

PPARγ的引物序列如下：

上游引物：AGATGACAGCGACTTGGCAA，SEQ ID NO.10；

下游引物：GGGCTTGTAGCAGGTTGTCT,SEQ ID NO.11；

C/EBPα的引物序列如下：

上游引物：AGAACAGCAACGAGTACCGG，SEQ ID NO.12；

下游引物：GCGGTCATTGTCACTGGTCA,SEQ ID NO.13；

实验结果如图3和图4所示，从图3中，可以看出，B组的PPARγ的相对表达量为3.241±0.215，C组的PPARγ的相对表达量为5.659±0.749，且二者的差异具有显著的统计学意义，说明ENSG00000260823基因的沉默剂能够有效的促进脂肪间充质干细胞中成脂分化基因PPARγ的表达。

从图4中，可以看出，B组的C/EBPα的相对表达量为2.278±0.447，C组的C/EBPα的相对表达量为4.067±0.317，且二者的差异具有显著的统计学意义，说明ENSG00000260823基因的沉默剂能够有效的促进脂肪间充质干细胞中成脂分化基因C/EBPα的表达。

序列表

<110> 山东博森医学工程技术有限公司

<120> 一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> DNA

<213> 人源(Human)

<400> 1

tcaggaagct caggggctgg ggaaacagag aggaggagac cccatccagc ctgggaggag 60

ggagtttggg aaaccggatg tcagattcca gccactgggg agttggattt caccctctgt 120

agtcactttc aagtctaaaa tcccacgaag aactgaagtt gggcagggaa attgaaagta 180

aaagtgagga atggagaagt ttctgtgcca catttgacgt gaaactgaaa gtgatcatgt 240

atgtgtccct cctgctccca tatgatctgg cacagcgcca ttcagtttta cagaagctga 300

agctcagtgc agtagcctgg cttgccagaa tgcactcttt cttaacggct cacatttcca 360

tccacagccc aggtctctgc cctcccagtt caatccctca ccccagtccg ttatttttaa 420

ggcatataaa ggaaaccaga gaca 444

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagggaaau ugaaaguaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uuacuuucaa uuucccugc 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaactgaagt tgggcaggga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atatgggagc aggagggaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acatggctga gaacgggaag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccttctcca tggtggtgaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatgacagc gacttggcaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggcttgtag caggttgtct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaacagcaa cgagtaccgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggtcattg tcactggtca 20

Claims

1.一种快速的脂肪间充质干细胞成脂分化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（2）添加成脂诱导培养基，对细胞进行成脂分化诱导；

所述ENSG00000260823基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示；

所述沉默剂为siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID N0.3所示；

所述成脂诱导培养基为含有10μg/mL胰岛素， 1μmoL /L地塞米松，0. 5 mmoL /L异丁基甲基黄嘌呤， 200μmoL /L吲哚美辛,10% FBS的DMEM培养基。

2.抑制ENSG00000260823基因表达的沉默剂在制备脂肪间充质干细胞成脂分化促进制剂中的应用，其特征在于，所述ENSG00000260823基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示；

所述沉默剂为siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。