CN112391386B - 一种间充质干细胞迁移促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞迁移促进剂，属于干细胞技术领域。本发明提供的间充质干细胞迁移促进剂是指对LINC01773表达有抑制效果的分子；所述抑制剂为siRNA，所述siRNA包括正义链和反义链，所述正义链序列如SEQ ID NO 1所示，所示反义链序列如SEQ ID NO 2所示。本发明所提供的间充质干细胞迁移促进剂能够提高间充质干细胞的迁移能力，从而使间充质干细胞快速的转移至损伤组织去有效的提高间充质干细胞的治疗效果。

Description

一种间充质干细胞迁移促进剂
技术领域
本发明涉及间充质干细胞技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞迁移促进剂。
背景技术
间充质干细胞是一种具有较强增殖和多向分化潜力的细胞。由于间充质干细胞来源广泛、取材方便、便于自体移植和免疫原性低等优点，因此间充质是细胞移植治疗的种子细胞。然而，尽管间充质干细胞能够用于治疗心脑血管，神经损伤，创伤等疾病，但是现有的研究表明经静脉、动脉、局部注射途径给予患者间充质干细胞治疗时，只有少部分的间充质干细胞转移到损伤组织，影响了细胞移植的临床治疗效果。因此，研究促进间充质干细胞快速迁移的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于促进间充质干细胞迁移的促进剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明第一方面提供了用于间充质干细胞迁移的基因，所述基因为非编码RNALINC01773，所述LINC01773的RNA核酸序列为XR_001737677.1。
本发明第二方面提供了靶向 LINC01773的抑制剂在制备间充质干细胞迁移促进剂中的应用。
优选地，所述抑制剂是指对LINC01773表达有抑制效果的分子。
优选地，所述抑制剂为降低LINC01773表达量的siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA。
优选地，所述抑制剂为siRNA，所述siRNA包括正义链和反义链，所述正义链序列如SEQ ID NO 1所示，所示反义链序列如SEQ ID NO 2所示。
优选地，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞，脐血间充质干细胞，脂肪间充质干细胞。
本发明第三方面提供了一种用于促进间充质干细胞迁移的促进剂，其特征在于，所述促进剂为LINC01773的siRNA。
优选地，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO 1所示，siRNA的反义链序列如SEQID NO 2所示。
本发明第四方面提供了靶向LINC01773的siRNA在制备促进骨髓间充质干细胞趋化因子受体-4表达促进剂中的应用。
优选地，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO 1所示，siRNA的反义链如SEQ IDNO 2所示。
本发明的有益效果是：
本发明发现敲减LINC01773能够有效的促进骨髓间充质干细胞的细胞迁移能力，并且能够有效的促进骨髓间充质干细胞中的趋化因子受体-4的表达，因此可将LINC01773的抑制剂用于制备促进骨髓间充质干细胞细胞迁移促进剂和骨髓间充质干细胞趋化因子受体-4表达促进剂中的应用。本发明所提供的间充质干细胞迁移促进剂能够提高间充质干细胞的迁移能力，从而使间充质干细胞快速的转移至损伤组织去有效的提高间充质干细胞的治疗效果。
附图说明
图1 LINC01773 siRNA抑制效果的荧光定量PCR检测结果。
图2 LINC01773 siRNA转染后细胞划痕实验的检测结果。
图3 LINC01773 siRNA转染后Transwell小室实验的检测结果。
图4 LINC01773 siRNA转染后趋化因子受体-4的免疫荧光强度变化结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
实时荧光定量PCR检测siRNA敲减效果
（1）设计靶向LINC01773的siRNA序列LINC01773 siRNA，由上海吉玛公司合成，NCsiRNA由吉玛公司提供，LINC01773 siRNA序列如下：
Figure 55096DEST_PATH_IMAGE001
（2）将骨髓间充质干细胞接种于细胞培养板中，分为未处理组，LINC01773 siRNA转染组和NC siRNA，按照Lipofectamine2000说明书转染细胞；
（3）转染48h后，按照Trizol RNA提取试剂说明书提取RNA；
（4）按照TAKARA反转录试剂盒得到cDNA；
（5）按照SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应，引物序列如下：
Figure 972236DEST_PATH_IMAGE002
（6）95℃ 预变性 5min；95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。
结果如图1所示，LINC01773 siRNA有效抑制了骨髓间充质干细胞中的LINC01773的mRNA表达，与未处理组相比，LINC01773 siRNA的抑制率达到了80.9%。
实施例2
通过划痕实验检测敲减LINC01773对于骨髓间充质干细胞迁移的影响
（1）将骨髓间充质干细胞接种于细胞培养板中，转染LINC01773 siRNA和NCsiRNA；
（2）当细胞密度达到90%时，轻轻的使用200ul移液器的枪头垂直的画出一条直线，使用PBS漂洗掉脱落下来的细胞；
（3）PBS漂洗后，加入2ml无血清的培养基，进行第一次拍照；
（4）培养24h后，进行第二次拍照。
结果如图2所示，相较于NC siRNA组，LINC01773 siRNA组中间的距离显著的缩小，说明敲减LINC01773能够有效的存进骨髓间充质干细胞的迁移。
实施例3
通过Treanswell实验进一步检测敲减LINC01773对于骨髓间充质干细胞迁移的影响
（1）将转染LINC01773 siRNA和NC siRNA的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化，离心后使用无血清培养基制成单细胞悬液，并进行细胞计数并调整细胞浓度为1×104；
（2）将Transwell小室放于24孔板中，在孔中加入600ul DMEM/F12完全培养基，在Transwell小室的上层加入200ul细胞悬液，将24孔板置于细胞培养箱中培养24h；
（3）取出Transwell小室，弃去上室中的培养基，使用PBS轻轻的清洗Transwell小室；
（4）将小室置于加有4%多聚甲醛的孔中，固定30min；
（5）取出Transwell小室，吸干固定液，Transewell小室置于加有结晶紫染色液的孔中，染色30min；
（6）使用PBS清洗Transwell小室，使用棉签擦去上室底部膜上的细胞，在倒置显微镜下对小室进行拍照。
实验结果如图3所示，相较于NC siRNA组，LINC01773 siRNA组的细胞数量明显增多，该结果进一步证明了敲减LINC01773能够有效的促进骨髓间充质干细胞的细胞迁移。
实施例4
多种趋化因子、生长因子及黏附分子对干细胞具有趋化作用，引导其向损伤区及其邻近组织迁移，即干细胞归巢。其中，趋化因子受体-4（CXCR4）在干细胞迁移中发挥重要作用。因此，我们使用免疫荧光检测了敲减LINC01773能否促进CXCR4的表达水平。
（1）将转染NC siRNA和LINC01773 siRNA接种于放置有无菌爬片的24孔板中，进行细胞爬片；
（2）将已经爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
（3）用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
（4）使用0.5% Triton X-100室温通透细胞20min；
（5）使用PBS浸洗玻片3次，每次3min，使用吸水纸吸干PBS，在玻片的中央滴加山羊血清，室温封闭30min；
（6）使用吸水纸吸掉封闭液，加入稀释好的CXCR4一抗，4℃孵育过夜；
（7）去除一抗，使用PBS浸洗爬片3次，每次3min，用吸水纸吸干爬片后，滴加稀释好的二抗，室温避光孵育1h；
（8）去除二抗，使用PBS浸洗爬片3次，每次3min，滴加DAPI避光孵育5min；
（9）去除DAPI，使用PBS浸洗3次，每次5min，使用抗荧光猝灭剂进行封片，在荧光显微镜下进行观察和拍照。
实验结果如图4所示，可以看出，LINC01773 siRNA组的CXCR4的表达量明显升高，说明敲减LINC01773能够显著的促进骨髓间充质干细胞中CXCR4的表达，从而有效的促进骨髓间充质干细胞迁移。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型或替换也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 梁树卷
<120> 一种间充质干细胞迁移促进剂
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaguauaau guuaaauaag u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuauuuaaca uuauacuucu a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatcctgaga gggacccagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttgccctg tgtctgcaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acatggctga gaacgggaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccttctcca tggtggtgaa 20

Claims (2)

1.靶向 LINC01773的抑制剂在制备骨髓间充质干细胞迁移促进剂中的应用，所述抑制剂为siRNA，所述siRNA包括正义链和反义链，所述正义链序列如SEQ ID NO 1所示，所述反义链序列如SEQ ID NO 2所示。
2.靶向LINC01773的siRNA在制备促进骨髓间充质干细胞趋化因子受体-4表达促进剂中的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO 1所示，siRNA的反义链如SEQID NO 2所示。
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