CN111454953B - 一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂，属于干细胞技术领域。所述成脂转化促进剂为长链非编码RNA LINC01607的基因抑制剂，所述基因抑制剂能够通过促进成脂转化相关基因PPARγ、C/EBPα和aP2的表达来促进骨髓间充质干细胞的成脂转化。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种新的用于骨髓间充质干细胞成脂转化的促进剂，通过该促进剂可以有效的加快骨髓间充质干细胞的成脂转化，从而可以实现骨髓间充质干细胞的快速成脂转化。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂。
背景技术
间充质干细胞是一类在体内和体外具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在特定的诱导条件下，间充质干细胞可以分化为脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞等，是组织工程中理想的种子细胞。由于间充质干细胞经连续传代及低温保存后仍然具有多向分化的潜能，因此，间充质干细胞被广泛的应用于组织工程与再生医学领域。然而，调控间充质干细胞命运（细胞增殖，细胞分化或细胞凋亡）的分子机制目前尚不清楚，因此还有待于进一步的深入研究。
长链非编码RNA是核苷酸长度大于200bp，并且缺少开放阅读框的一类RNA。按照其在基因组上的定位，长链非编码RNA分为：正义长链非编码RNA、反义长链非编码RNA、内含子长链非编码RNA、基因间长链非编码RNA、启动子长链非编码RNA。最初，长链非编码RNA被认为是基因组转录的“噪音”，但是随着研究的不断深入，研究人员发现，长链非编码RNA在细胞的发生发展过程中具有重要的作用，而且长链非编码RNA的表达水平或者是功能异常与众多的疾病紧密联系。最新的研究发现，长链非编码RNA在干细胞多潜能分化中也具有重要的功能，目前对于间充质干细胞脂向分化机制的研究多集中在微小 RNA 上，对于长非编码RNA 在脂向分化过程中的作用尚且知之甚少。因此，研究LINC01607在间充质干细胞中的作用，对于间充质干细胞的进一步开发利用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于促进骨髓间充质干细胞成脂转化的促进剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂，所述促进剂为长链非编码RNALINC01607基因抑制剂。
优选地，所述LINC01607基因抑制剂为shRNA、siRNA或化学修饰siRNA。
优选地，所述LINC01607基因抑制剂为shRNA。
优选地，所述shRNA的正义链为：
5’-CACCGTGCTTTGTGGATGTATTATGCGAACATAATACATCCACAAAGCAC-3’；
所述shRNA的反义链为：
5’- AAAAGTGCTTTGTGGATGTATTATGTTCGCATAATACATCCACAAAGCAC-3’。
5.LINC01607基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因抑制剂为shRNA；所述shRNA的正义链为
5’-CACCGTGCTTTGTGGATGTATTATGCGAACATAATACATCCACAAAGCAC-3’；
所述shRNA的反义链为
5’- AAAAGTGCTTTGTGGATGTATTATGTTCGCATAATACATCCACAAAGCAC-3’。
此外，本发明提供了一种LINC01607基因抑制剂，所述基因抑制剂用于制备骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂。
除此之外，本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC01607；所述LINC01607在骨髓间充质干细胞成脂转化过程中下调；所述LINC01607的基因抑制剂用于制备骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种新的用于骨髓间充质干细胞成脂转化的促进剂，通过该促进剂可以有效的加快骨髓间充质干细胞的成脂转化，从而可以实现骨髓间充质干细胞的快速成脂转化。
附图说明
图1 骨髓间充质干细胞成脂分化过程中LINC01607的表达变化。
图2 LINC01607基因抑制剂的抑制效果。
图3 油红O染色检测结果。
图4 LINC01607基因抑制剂对于PPARγ mRNA表达量的影响。
图5 LINC01607 基因抑制剂对于C/EBPαmRNA表达量的影响。
图6 LINC01607基因抑制剂对于aP2 mRNA表达量的影响。
图7 LINC01607基因抑制剂对于PPARγ、C/EBPα和aP2蛋白表达量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所涉及的技术均为分子生物学或细胞生物学常规技术手段，其中涉及的酶、试剂以及反应条件均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
实施例1
1.成脂诱导分化
（1）将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，当细胞生长密度达到80%时，将旧培养基弃去，PBS清洗两遍，加入脂肪细胞分化诱导培养基，放入37℃细胞恒温培养箱中；
（2）细胞分化2天后，将脂肪分化诱导培养基换成脂肪细胞分化维持培养基；
（3）在过2天后，将脂肪维持培养基换成完全培养基，之后一直使用完全培养基进行培养。
2.RNA提取
（1）分别在第0天，7天和14天提取RNA，检测LINC01607的表达情况。
（2）去除6孔板中的培养基，用PBS洗涤细胞，每孔加入500μl Trizol裂解液，反复吹打细胞，室温放置5min，使细胞充分裂解；
（3）将Trizol转移至1.5ml离心管中，加入100μl氯仿，将离心管置于涡旋振荡器上混匀15s，冰上放置10min；
（4）4℃离心机，12000g，离心15min；
（5）溶液分为三层，吸取上层水相至新的离心管中，加入1倍体积的预冷异丙醇，放置10min；
（6）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心10min，小心去除上清；
（7）将500μl 75%乙醇加入到沉淀中，颠倒混匀后，将离心管置于低温高速离心机中，8000转，4℃，离心5min；
（8）小心去除上清，静置5-10min至乙醇完全蒸发，加入DEPC水溶解沉淀，测定RNA纯度和浓度。
3.逆转录反应
逆转录反应参照TAKARA反转录试剂盒。
逆转录反应体系：5×PrimeScript RT master mix 2μl；RNA模板 0.5μg；RNaseFree水 to 10μl。
逆转录反应条件：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ 冷却。
4.实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR按照TAKARA qPCR（SYBR）试剂盒进行扩增，反应条件：95 ℃ 120s；95 ℃ 30 s，65 ℃ 15 s, 40 个循环;72℃ 10min。
按照2-△△Ct方法处理实时定量PCR数据，计算LINC01607的表达变化，实验结果如图1所示。
引物序列
LINC01607
Forward primer 5'-TGCAGGCATCAGAATCACCTGGAGGA-3'（SEQ ID NO.1）
Reverse primer 5'-AGAGCCAGGTTTCTCCATCAGCA-3'（SEQ ID NO.2）
GAPDH
Forward primer 5'- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（SEQ ID NO.3）
Reverse primer 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（SEQ ID NO.4）
实验结果
实验结果如图1所示，从图中可以看出，在诱导成脂转化7天时, LINC01607的相对表达量为0.567±0.037，差异具有统计学意义（p < 0.05）；在14天时，LINC01607的相对表达量为0.380±0.023，差异具有统计学意义（p < 0.01）。说明在骨髓间充质干细胞成脂转化的过程中，LINC01607的表达量逐渐下调。
实施例2
LINC01607 shRNA的干扰效果检验
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将空白对照，sh-NC和sh-LINC01607（正义链为5'- CACCGTGCTTTGTGGATGTATTATGCGAACATAATACATCCACAAAGCAC -3'（SEQ ID NO.5），
反义链为5'- AAAAGTGCTTTGTGGATGTATTATGTTCGCATAATACATCCACAAAGCAC -3'(SEQ ID NO.6)；质粒载体为pENTR™/U6）按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）转染6小时后，弃去无血清培养基更换为完全培养基；
（4）转染48h后；弃去培养基，用PBS洗涤3次，提取RNA，检测sh-LINC01607对于LINC01607表达量的抑制情况；RNA提取步骤，逆转录反应步骤，实时荧光定量PCR步骤同实施例1。
实验结果
实验结果如图2所示，从图中，可以看出， sh-LINC01607组的LINC01607相对表达量为0.276±0.048，说明sh-LINC01607能够抑制LINC01607的表达，抑制率为72.4%。
实施例3
油红O染色检测
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将sh-NC和sh-LINC01607按照Lipofectamine2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）转染6小时后，弃去无血清培养基更换为完全培养基；
（4）当细胞生长密度达到80%时，将完全培养基弃去，进行成脂转化培养；
（5）培养7天后，去除培养基，用PBS清洗细胞2-3次，加入10%甲醛固定0.5-1h；
（6）去除甲醛，加入油红O工作液，染色30分钟；
（7）吸出油红O工作液，用PBS洗涤细胞3次，在倒置显微镜下观察并拍照。
实验结果
实验结果如图3所示，从图中可以看出，相较于sh-NC组，转染sh-LINC01607后的细胞，脂滴明显增多，说明LINC01607基因抑制剂能够促进骨髓间充质干细胞的成脂转化。
实施例4
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将sh-NC和sh-LINC01607按照Lipofectamine2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）转染6小时后，弃去无血清培养基更换为完全培养基；
（4）当细胞生长密度达到80%时，将完全培养基弃去，进行成脂转化培养；
（5）培养7天后，提取RNA，检测PPARγ、C/EBPα和aP2的mRNA表达，
RNA提取，逆转录，和荧光定量PCR步骤同实施例1。
引物序列
PPARγ
Forward primer 5'-GCTGACCAAAGCAAAGGCG-3'（SEQ ID NO.7）
Reverse primer 5'-GCCCTGAAAGATGCGGATG-3'（SEQ ID NO.8）
C/EBPα
Forward primer 5'- ACAAGGCCAAGCAGCGCAAC -3'（SEQ ID NO.9）
Reverse primer 5'- TTCGCGGCTCAGCTGTTCCA -3'（SEQ ID NO.10）
aP2
Forward primer 5'-AGGAAAGTGGCTGGCATGGC-3'（SEQ ID NO.11）
Reverse primer 5'-TCGTCAAATTCCTGGCCCAGT-3'（SEQ ID NO.12）
实验结果
实验结果如图4-6所示， sh-LINC01607组的PPARγ的相对表达量为2.280±0.115，差异具有统计学意义（p < 0.01）；sh-LINC01607组的C/EBPα相对表达量为3.426±0.151，差异具有统计学意义（p < 0.001）；sh-LINC01607组的aP2的相对表达量为1.883±0.130，差异具有统计学意义（p < 0.01）；说明LINC01607的基因抑制剂能够促进PPARγ,C/EBPα和aP2的mRNA水平表达，从而促进骨髓间充质干细胞的成脂转化。
实施例5
Western Blot检测成脂转化相关蛋白PPARγ、C/EBPα和aP2的表达情况
（1）转染前24h将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）弃去培养基，加入无血清培养基，将sh-NC和sh-LINC01607按照Lipofectamine2000说明书进行转染，每组设置3个重复；
（3）转染6小时后，弃去无血清培养基更换为完全培养基；
（4）当细胞生长密度达到80%时，将完全培养基弃去，进行成脂转化培养；
（5）培养7天后，每孔加入100μL PIPA裂解液，细胞充分裂解后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞收集至离心管中；
（5）冰上放置30min，使细胞完全裂解；
（6）4℃，12000g离心20分钟，吸取上清，使用BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为2μg/ml，100℃煮5min，即得到蛋白样品；
（7）配置10% SDS-PAGR胶，每孔加入10μL蛋白样品；
（8）恒压90V电泳，待电泳条带完全的跑出浓缩胶时，将电压调整至130V，直至溴酚蓝完全跑出分离胶；
（9）按照海绵-滤纸-分离胶-NC膜-滤纸-海绵的模型放置转膜夹，250mA电转1.5h；
（10）电转结束后，将NC膜取出置于5%的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；
（11）按照蛋白大小，将PPARγ、C/EBPα、aP2和β-actin蛋白条带剪下，孵育相应的一抗，4℃，摇床封闭过夜；
（12）使用TBST洗膜3次，每次10min，孵育二抗，室温摇床孵育60min；
（13）使用TBST洗膜3次，每次10min，洗好后，进行曝光，得到的结果如图7所示。
实验结果
实验结果如图7所示，从图中可以看出，相较于sh-NC组，sh-LINC01607组中PPARγ、C/EBPα和aP2蛋白的表达量均出现明显的上调，说明LINC01607基因抑制剂能够促进成脂转化相关蛋白PPARγ、C/EBPα和aP2的表达，从而促进骨髓间充质干细胞的成脂转化。
综上所述，LINC01607在骨髓间充质干细胞成脂转化的过程中随着培养时间的延长逐渐下调；LINC01607基因抑制剂能够显著的促进骨髓间充质干细胞的成脂转化，因此，LINC01607可以用于制备骨髓间充质干细胞成脂转化的促进剂来实现骨髓间充质干细胞的快速成脂转化。
序列表
<110> 山东殷氏干细胞有限公司
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Claims (1)
1.LINC01607基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂中的用途，其特征在于，所述基因抑制剂为shRNA；所述shRNA的正义链为：
5’-CACCGTGCTTTGTGGATGTATTATGCGAACATAATACATCCACAAAGCAC-3’；
所述shRNA的反义链为：
5’- AAAAGTGCTTTGTGGATGTATTATGTTCGCATAATACATCCACAAAGCAC-3’。
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