CN111944751B - 一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用。一种Abca4基因、Abca4基因编码的蛋白质、或含有Abca4基因重组载体在制备用于干细胞体外培养扩增的相关试剂中的应用。干预Abca4表达为主的相关试剂可应用于提高干细胞体外培养扩增的效率。本发明首次发现并证实Abca4基因具有影响细胞增殖的功能，抑制Abca4基因或蛋白质表达可以明显增加干细胞的增殖效率，为体外培养扩增细胞提供了新的有效方法。本发明提供的Abca4抑制剂可用于制备促进体外培养细胞效率的相关试剂，可以快速提供足够数量的细胞，对于干细胞药物和疗法在多个领域应用具有明显促进作用，应用前景巨大。

Description

一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用。

背景技术

随着全球范围内干细胞治疗技术和产业化快速发展，干细胞相关研究已经成为生命科学领域的重要方向之一，受到国内外的广泛关注。干细胞的应用范围也在迅速扩大，通过将干细胞进行体外培养、定向诱导，培植出全新的组织或器官，将成为移植器官的新来源，使许多患有严重疾病的患者能够绝处逢生。干细胞几乎在全身所有疾病均有应用前景，尤其在心肌梗死、肝硬化、脊髓损伤、多发性硬化、中风、肌萎缩侧索硬化症、老年痴呆症、间质性肺病、克罗恩病、骨关节炎、股骨头坏死、椎间盘退化、系统性红斑狼疮和卵巢早衰等缺乏有效治疗措施的严重疾病表现出潜在治疗价值。

干细胞药物和疗法已经在多个领域展现出了巨大的前景，同时市场需求巨大，随着干细胞基础研究的发展和技术的不断进步，干细胞产业有着巨大的发展空间并将迎来快速发展期，干细胞技术的研究必将给生物医学领域带来深刻的变革。经过基因工程修饰后的干细胞可表达各种细胞营养因子基因，并使其能够分泌营养因子，移植后对于促进移植的干细胞和受体组织内损伤细胞的存活都具有非常重要意义。间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，而且来源广泛、取材方便、低免疫性、可进行自体移植，使其具有很大的应用前景。许多研究已经发现间充质干细胞移植后可以向病变部位的组织渗透融合、替代损伤细胞，同时与宿主细胞间的相互作用可导致一些细胞因子的产生，这些细胞因子对神经功能的恢复发挥积极的作用。干细胞作为种子在组织工程可吸收支架方面也具有广泛的应用价值，随着新材料和新技术的出现，目前可以制造精确的仿生三维组织结构支架。

无论干细胞在哪些领域应用，都离不开体外培养扩增，快速高效获得足够治疗或研究所需细胞数量是干细胞研究与应用的关键。另外许多干细胞经过长期传代会丢失干性，使细胞出现分化迹象，严重影响干细胞继续扩增传代。因此，开发和研究增加干细胞体外扩增效率的新方法具有极其重要意义和广泛应用前景。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用。本发明提供了通过干预Abca4表达增加干细胞体外扩增效能的方法应用，利用此方法可以高效、快速获取足够数量的体外培养扩增的干细胞，用于干细胞相关治疗或研究。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种Abca4基因、Abca4基因编码的蛋白质、或含有Abca4基因重组载体在制备用于干细胞体外培养扩增的相关试剂中的应用。

所述的应用为增加干细胞体外扩增效能方面的应用。

通过干预Abca4表达增加干细胞体外扩增效能的方法应用，利用此方法可以高效、快速获取足够数量的体外培养扩增的干细胞，用于制备干细胞相关治疗药物中的应用。

所述干细胞体外培养扩增的相关试剂包括干预Abca4基因mRNA的试剂，和/或干预Abca4蛋白表达的试剂。

所述干细胞包括人类组织来源的原代干细胞，各种动物组织来源的原代干细胞，各种细胞系。

进一步地，干预Abca4表达为主的相关试剂可应用于提高干细胞体外培养扩增的效率。

更进一步，所述干预Abca4表达的相关试剂可基于使用已知方法来发挥其功能：干预基因mRNA水平表达，或干预蛋白水平表达，或以Abca4为靶向的特异性抑制剂，或以Abca4为靶向的特异性抗体，或以Abca4为靶向的非编码RNA(包括LncRNA、miRNA、circRNA、piRNA等等)，或以Abca4为靶向的转绿调控因子，或Abca4上游调控分子等方式实施分析。

所述以Abca4为靶向的特异性抑制剂不受限制，只要所述抑制剂能够抑制Abca4或涉及Abca4上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于干细胞体外培养扩增有效的分子即可。

进一步，所述抑制剂包括针对Abca4基因表达的干扰RNA，或者负调控非编码RNA(包括LncRNA、miRNA、circRNA、piRNA等等)、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向分子化合物，抑制型靶向分子化合物的实例如针对Abca4蛋白的抗体。

所述抑制剂可以单独使用，或与其它细胞因子以各种组合使用，以及与其它细胞培养液一起联合使用。

所述抑制剂的剂量不受限制，只要获得期望的细胞增殖效果即可，可以依据干细胞种类和需要扩增的细胞数量等来恰当的确定。

所述Abca4基因、Abca4基因编码的蛋白质、或重组载体在制备干细胞相关治疗药物中的应用。

本发明的“Abca4基因”序列可以在NCBI数据库中进行查询。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现并证实Abca4基因具有影响细胞增殖的功能，抑制Abca4基因或蛋白质表达可以明显增加干细胞的增殖效率，为体外培养扩增细胞提供了新的有效方法。

本发明提供的Abca4抑制剂可用于制备促进体外培养细胞效率的相关试剂，可以快速提供足够数量的细胞，对于干细胞药物和疗法在多个领域应用具有明显促进作用，应用前景巨大。

附图说明

图1是体外培养E12、E15、E18和E21羊水间充质干细胞形态及分化情况。

图2是体外培养E12、E15、E18和E21羊水间充质干细胞表面标志物检测情况。

图3是CCK8和BrdU方法检测体外培养E12、E15、E18和E21羊水间充质干细胞增殖变化情况。

图4是BrdU方法检测体外培养E12和E15羊水间充质干细胞的流式细胞图。

图5是BrdU方法检测体外培养E18和E21羊水间充质干细胞的流式细胞图。

图6是体外培养E12-E21羊水间充质干细胞的全转录组测序结果的PCA和聚类树图。

图7是体外培养E12-E21羊水间充质干细胞的全转录组测序结果的mRNA和microRNA火山图。

图8是体外培养E12-E21羊水间充质干细胞的全转录组测序结果。

图9是体外培养E12-E21羊水间充质干细胞的全转录组测序结果。

图10是定量PCR方法检测Abca4及其上游调控分子miR-351-3p的表达情况。

图11是建立高表达Abca4稳转细胞及其转染后Abca4蛋白质表达情况。

图12是Abca4转染后Abca4 mRNA表达及其对细胞增殖的影响情况。

图13是Abca4 RNA干扰(低表达)及其对Abca4蛋白质表达影响的电泳图。

图14是Abca4 RNA干扰(低表达)对Abca4蛋白质表达影响定量分析及其对细胞增殖的影响情况。

图15是转染miR-351-3p mimic后miR-351-3p表达改变及其对细胞增殖影响。

图16是转染miR-351-3p mimic后其靶基因Abca4表达变化情况。

图17是转染miR-351-3p inhibitor后对细胞增殖影响及其靶基因Abca4表达变化的电泳图。

图18是转染miR-351-3p inhibitor后Abca4表达变化定量分析柱状图及分别高表达miR-351-3p和Abca4对细胞增殖影响的变化情况。

图19是分别高表达miR-351-3p和Abca4后Abca4蛋白表达变化情况。

图20是miR-351-3p和Abca4的结合位点及双荧光素酶检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详细介绍本发明的技术方案和技术效果。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用标本和动物模型均来源于盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室，并获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。

实施例1体外培养E12-E21羊水间充质干细胞形态、分化及表面标志物检测情况。

1、羊水间充质干细胞的分离及培养。

无菌条件下吸取大鼠E12、E15、E18及E21的羊水，4℃离心(1800转)15分钟，PBS清洗2遍，用含10％胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，置于37℃，5％CO2维持湿度的培养箱内。首次换液时间为5天，此后每2-3天换液一次，直至细胞70％汇合度后进行传代操作。细胞传代超过3代认定为提取AF-MSCs成功。

2、羊水间充质干细胞体外诱导分化。

1)成脂诱导：选取P5代细胞，消化后进行细胞计数，按1×10⁶/孔接种于6孔板，每组细胞设2个重复孔。24小时后观察细胞达100％汇合度，吸弃培养基，加入wistar大鼠间充质干细胞成脂诱导培养基A液2mL/孔进行成脂诱导，3天后吸弃A液，换为成脂诱导B液2mL/孔诱导1天，再次换回A液诱导3天，A液与B液交替诱导3次后，换B液继续培养4-7天后观察脂滴变大变圆后可终止诱导。吸弃诱导液，加入PBS清洗2遍，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS清洗2遍，加入1mL/孔油红O染料工作液染色30分钟，PBS冲洗3次，在显微镜下拍照。

2)成骨诱导：首先进行6孔板明胶包被，具体步骤为：提早1小时将0.1％明胶500μL/孔滴入6孔板，使之铺满孔底，超净台内静置30分钟，吸弃明胶后，超净台内干燥备用。选取P5代细胞，消化后进行细胞计数，按6×105/孔接种于6孔板，每组细胞2个重复孔。24小时后观察细胞达70％汇合度，吸弃培养基，小心加入预热的wistar大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基2mL/孔进行成骨诱导。每隔3天换用新鲜的成骨诱导培养液，诱导3周后，PBS清洗1次，加入4％多聚甲醛固定30分钟，PBS清洗1遍，加入1mL/孔茜素红染料染色3-5分钟，PBS冲洗3次，在显微镜下拍照。

3)成软骨诱导：选取P5代细胞，消化后进行细胞计数，按7.5×105/管移入15mL离心管，常温离心，250×g，5分钟，弃上清，加入wistar大鼠间充质干细胞成软骨诱导不完全培养基1mL吹打均匀，常温离心150×g，5分钟，弃上清后再次加入wistar大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导不完全培养基1mL清洗细胞，常温离心150×g，5分钟，弃上清后加入wistar大鼠间充质干细胞成软骨诱导完全培养基1mL，吹打均匀后取新15mL离心管，每管0.5mL细胞悬液，常温150×g离心5分钟后，75％酒精消毒离心管，小心拧松管盖，放入37度，5％CO2培养箱培养。每3天换1次新鲜完全培养基，动作轻柔，避免吸出软骨球。诱导21天后，吸弃诱导培养基，加入4％多聚甲醛固定过夜，75％酒精固定4小时，85％酒精固定2小时，95％酒精固定过夜，无水酒精固定20分钟后，二甲苯浸泡20分钟，浸蜡1小时后进行包埋、切片。选取4组细胞的软骨球切片脱蜡处理，具体步骤如下：二甲苯3个缸每缸10分钟，100％乙醇3个缸每缸10分钟，95％、85％、75％乙醇每缸5分钟，最后置入PBS浸泡。此时，选取每组各一个切片进行阿辛利蓝染色，具体方法为用PAP笔在软骨球外画圈，加入一滴阿辛利蓝染色30分钟，流动水冲洗2分钟，ddH2O清洗1次，显微镜下观察染色效果。每组剩余的软骨球切片进行二型胶原染色。

3、流式细胞检测干细胞表面分子标志物。

选取E12，E15，E18，E21共4组的P4代细胞，消化重悬后进行细胞计数，每组收集3管1×10⁶细胞，分别作为阴性对照组、CD29组、CD90组、CD34组及CD45组，细胞总量为3×10⁶，离心后去上清，每管加入100μL PBS重悬细胞，CD29组加入1μL CD29抗体，CD90组加入1μLCD90抗体，CD34组加入5μL CD34抗体，CD45组加入5μL CD45抗体，于4度避光孵育30分钟。离心800转，5分钟后去上清，加入1mL PBS清洗细胞，再次离心800转，5分钟，弃上清后加入400μL PBS吹散细胞后上机检测，先用阴性对照组调节电压并圈选细胞后，依次测量各组CD标志物阳性细胞比率。

4、体外培养E12-E21羊水间充质干细胞形态、分化及表面标志物检测情况。

1)羊水间充质干细胞形态变化情况：成功收集了125只孕鼠的羊水，各胎龄细胞的培养成功率差异很大，E15培养成功率最高，达到100％的定植传代，其次为E21，成功率最低为E12。四组细胞贴壁后出现明显细胞集落的时间也存在显著差异，E12与E15贴壁细胞出现首个集落的时间为1-3天，远远早于E18与E21的7-10天，且形成的集落比较紧实，与E18及E21的散在分布的集落有显著的不同，尤其是E15细胞形成的集落呈现出类胚胎干细胞样生长，提示E15细胞在生物学功能上也有类似胚胎干细胞的增殖及多能分化特性。然而，随着传代，我们观察到这样的类胚胎干细胞的形态逐渐消失，取而代之出现典型MSCs的纺锤型外观，其余各组细胞也呈现较均一的典型MSCs外观，E12与E15的细胞显著小于E18与E21的细胞。持续培养这些不同胎龄来源的AF-MSCs，可以观察到E12与E15细胞可以连续传代超过30代，而E18与E21的细胞大多传代不超过10代，并逐渐出现宽大且不规则的形态，最终停止增殖。

2)体外诱导分化情况：经体外诱导21天，来源于胚胎发育4个不同阶段的羊水间充质干细胞可分化为软骨、脂肪和骨。2型胶原免疫荧光染色及阿辛利蓝染色均提示诱导分化软骨成功,油红O染色可见红色脂滴，提示诱导成脂分化成功，茜素红染色可见红色钙化结节，提示成骨诱导成功。

3)干细胞表面分子标志物鉴定情况：利用流式细胞仪检测AFMSCs的CD90与CD29阳性标志物及CD34与CD45阴性指标的表达情况，进行3次生物学重复。4组细胞CD90的阳性率分别为97.66±2.00％、96.02±3.93％、98.91±1.50％和98.76±1.05％,CD29的阳性率分别为98.49±1.66％、99.28±0.57％、98.28±2.14％和98.30±2.16％。而各组细胞CD34的比率分别为0.02±0.01％、0.00±0.00％、0.19±0.16％与0.02±0.03％，CD45阳性细胞所占比率分别为0.005±0.01％、0.00±0.00％、0.005±0.01％及0.005±0.01％。这符合国际细胞治疗协会对MSCs表面标志物的定义。

分离培养E12-E21天的羊水间充质干细胞，体外诱导向成脂、成骨和成软骨分化，验证干细胞的多向分化潜能，并利用流式细胞仪检测间充质干细胞的表面分子标志物，检测分离培养的羊水间充质干细胞的纯度，如图1-2所示。

实施例2CCK8和BrdU方法检测体外培养E12-E21羊水间充质干细胞增殖变化情况。

1、CCK-8细胞增殖曲线。

取P4代AF-MSCs进行CCK-8增殖曲线检测。显微镜下观察细胞达90％汇合度以上，将4组胎龄AF-MSCs细胞消化后进行细胞计数，按1.5×10⁴/孔接种于96孔板,每孔加入100μL细胞悬液，每个胎龄AFMSCs均作4个复孔，无细胞培养基作为对照组放于第一列也设置4个复孔，共接种5板96孔板，置于37度培养箱培养。第24小时取一板细胞，每孔加入10μL CCK-8，于培养箱孵育2小时后，使用酶标仪测量450nm处的吸光度，4组胎龄测量值均用对照组测量值矫正后记录为第24小时细胞吸光度。此后每隔24小时记录一次吸光度，直至第5天。为减少误差，此实验重复4次，取4次吸光度的平均值做曲线图，观察不同胎龄细胞的增长趋势。

2、BrdU检测。

选取P5代细胞进行BrdU的检测，4次生物学重复。4组细胞铺种于6孔板，每组细胞铺2个孔，一孔为阴性对照孔，另一孔为检测孔，当细胞达70-80％汇合度时，检测孔加入20μL 1-mM BrdU溶液于培养箱内孵育4小时，阴性对照孔无需处理，4小时后各孔均弃去培养液，用PBS漂洗1次，0.25％胰酶消化，离心后使用试剂盒中的Cytofix/Cytoperm缓冲液100μL固定细胞，室温静置20分钟后加入Perm/Wash缓冲液1mL清洗，离心300g，5分钟，弃液，加入Cytoperm Permeabilization缓冲液100μL破膜，于冰上孵育10分钟后再次加入Perm/Wash缓冲液1mL清洗，离心300g，5分钟，弃液，重复Cytofix/Cytoperm缓冲液100μL固定细胞5分钟，清洗后离心300g，5分钟，弃液，加入100μL DNA酶暴露BrdU结合位点，于培养箱中孵育1小时后清洗并离心，加入50μL Perm/Wash缓冲液重悬细胞，1μL抗BrdU抗体室温避光孵育20分钟，重复清洗，最后加入20μL 7-AAD溶液室温避光孵育20分钟后再次清洗，用PBS 400μL重悬细胞后上机检测。用阴性对照组调节电压并圈选细胞后，依次测量4组细胞样本。

3、E12-E21羊水间充质干细胞增殖变化情况。

使用BrdU及CCK-8对来源于胚胎发育4个不同阶段的AF-MSCSs的增殖能力进行评估。E12与E15的AF-MSCs增殖能力明显强于E18及E21来源的细胞，在BrdU试验中我们可以观察到E12与E15具有更高的S期比率，提示这两个样本有更多的细胞进入DNA合成期，细胞分裂更活跃。CCK-8增殖曲线也可以看出E12,E15与E18,E21有着显著差异的曲线斜率，E12与E15增殖明显快于E18与E21。

利用CCK-8增殖曲线和BrdU检测，明确体外培养E12-E21羊水间充质干细胞增殖变化情况，如图3-5所示。

实施例3体外培养E12-E21羊水间充质干细胞的全转录组测序及生物信息学分析结果。

1、羊水间充质干细胞全转录组测序。

本研究选择4组AF-MSCs样本(E12,E15,E18和E21)，每组样本3个生物学重复，共12个样本，送华大基因进行全转录组测序。首先将提取好的total RNA使用生物素标记的特异性探针(Ribo-ZeroTM rRNA Removal Kit)去除核糖体rRNA。在纯化之后，将RNA片段化，随后使用

Stranded kit中随机引物和反转录酶合成cDNA一链，然后使用DNA聚合酶I和RNaseH来合成双链的cDNA。双链的cDNA产物随后进行了加“A”碱基和接头连接。连接产物扩增纯化后即得到了最终的cDNA文库。最后将构建好的测序文库利用Illumina HiSeq测序平台进行测序。

small RNA(sRNA)的建库步骤如下：1)RNA片段选择：将Total RNA使用PAGE电泳切胶分离成18-30nt的RNA。2)3’接头连接：使用5-adenylated，3-blocked的单链DNA接头连接到上一步RNA的3’端。3)逆转录引物退火：将RT引物加入上一步体系中，与连接在RNA上的3’接头杂交，并与多余的游离3’接头杂交。4)5’接头连接：5’接头连接至上一步中产物的5’端，由于接头优先连接于单链分子，而不与3’接头和RT引物的杂交链连接，极大减少了接头自连。5)一链cDNA合成：以○3中RT引物进行逆转录延伸，合成一链cDNA。6)PCR扩增：使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3’接头和5接头的cDNA，放大文库产量。7)文库片段选择:：使用PAGE电泳分离100-120bp范围PCR产物，有效去除了引物二聚体等副产物。8)文库定量及pooling环化。最后使用BGISEQ-500测序平台进行sRNA测序。

2、生物信息学分析。

测序所得数据称为raw reads，先过滤掉rRNA、低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。使用比对软件HISAT将clean reads比对到参考基因组Rnor 6.0，之后用软件StringTie、Cufflinks对clean reads进行转录本组装，对于组装得到的新转录本，用三款软件CPC、txCdsPredict和CNCI及一个数据库pfam对新转录本进行编码能力预测，区分出已知的lncRNA和mRNA、新的lncRNA和新的mRNA。这些新的lncRNA和mRNA将与已知的lncRNA和mRNA一起进行后续的分析。使用软件Bowtie2将cleanreads比对到基因参考序列，然后统计基因的覆盖情况。使用软件Bowtie2将clean reads比对到参考序列，之后再使用软件RSEM计算基因和转录本的表达量。使用差异分析软件DEGseq进行组间差异分析，显著差异基因的过滤条件为Fold Change≥2.00及AdjustedPvalue≤0.001。对于sRNA测序所得49nt序列，通过以下步骤处理：去除测序质量较低的tag、去除有5’接头污染的tag、去除没有3’接头序列的tag、去除没有插入片段的tag、去除包含polyA的tag、去除小于18nt的tag，统计小RNA片段的长度分布，最终得到clean reads。使用比对软件AASRA将clean reads比对到参考基组和其他小RNA数据库(除了Rfam是用cmsearch进行比对)。为了使每个unique sRNA有唯一的注释，按照:miRNA>piRNA>snoRNA>Rfam>other sRNA的优先级顺序将sRNA遍历注释。基于miRNA的前体能够形成发夹二级结果，使用miRDeep2进行新的miRNA预测。使用TPM[40]标准化sRNA的表达水平，标准化后的数据可以直接用于后续差异比较分析。对于鉴定得到的miRNA进行靶基因预测和对靶基因的GO功能注释以及KEGG pathway注释。

mRNA通过翻译成蛋白质而发挥其功能，因此，研究不同胚胎发育阶段AF-MSCs的差异机制重点关注了mRNA的差异变化及其上游调控microRNA。对mRNA测序数据进行层次聚类及主成分分析，发现数据可以明显的分为两组，与第一部分的生物学特点类似，因此将第一部分的细胞增殖曲线与测序数据的表达量进行了速度曲线拟合，从而筛选出的与增殖速率相关的差异表达mRNA与microRNA，并用两种靶基因预测软件(miRanda与TargetScan)同时预测差异表达的miRNA在差异表达的mRNA的可能的靶点，并取交集。

3、全转录组测序结果情况。

12个样本进行转录组测序，每个样本平均产出12.67Gb数据，基因组的平均比对率为87.26％。总共检测到61678个转录本表达，其中新的lncRNA为7106个，新的mRNA为7,210个，已知的lncRNA为4966个，已知的mRNA为42396个。将全部mRNA数据进行PCA主成份分析，发现在PC1部分E12、E15与E18、E21显著分成左右两部分，同时也进行了聚类分析，发现在层次聚类图中E12和E15聚集于为一组，而E18与E21聚集为一组。这样的分类结果与观察到的细胞增殖的趋势是一致的，因此，推测合并后两组之间一定存在着影响AF-MSCs增殖的差异基因调控方式。然后进行了如下分析：将mRNA及microRNA测序数据按上述方法分成两组{早期组(E12与E15)与后期组(E18与E21)}，筛选出了这些数据中显著差异表达的mRNA共604个及差异表达microRNA共74个。随后，用两种靶基因预测软件miRanda与TargetScan同时预测差异表达的74个microRNA在差异表达604个mRNA的3’UTR上可能的靶点，然而没有任何可靠靶点发现。换了一种筛选办法：将细胞增殖曲线的吸光度与转录组表达量做速度曲线拟合分析，通过线性回归得到88个差异表达mRNA与15个差异表达microRNA集合，我们在88个差异mRNA中进行了15个microRNA的靶基因预测，然而依旧未预测出两个集合基因在3’UTR区的结合位点，发现CDS区也同样可以作为microRNA的结合区域，因此为了更好的筛选目标基因，进行了CDS区靶位点的预测，发现共有14个microRNA(除了miR-1b)在mRNA上具有结合位点，Abca4(ID 310836)是三个含有最多结合位点的mRNA之一，并具有最低平均结合能且最高平均分数的mRNA。将Abca4与预测的在CDS区有结合位点的microRNA再次进行线性回归分析，Abca4/miR-351-3p为拟合度最好(p＝0.0173)的调控基因对。

体外培养E12-E21羊水间充质干细胞的全转录组测序及生物信息学分析结果，如图6-9所示。

实施例4显示定量PCR方法检测Abca4及其上游调控分子miR-351-3p的表达情况。

根据实施例3分析结果，将E12-E21四组羊水间充质干细胞根据聚类情况合并为两组(早期组和晚期组)，分别利用定量PCR方法检测Abca4及其上游调控分子miR-351-3p的表达情况，如图10所示。

1、mRNA PCR检测。

采用二步法实时荧光定量PCR法。1)去基因组DNA，10μL反应体系，反应条件为42℃孵育2分钟，4℃保存。2)反转录，20μL反应体系，反应条件为37℃孵育15分钟，85℃持续5秒，4℃保存。3)RT-qPCR反应体系，反应条件为：95℃预变性30秒，PCR反应95℃5秒，58℃45秒，40个循环，溶解曲线阶段95℃5秒，60℃30秒。

2、microRNA PCR检测。

采用二步法实时荧光定量PCR法。1)180μL加A尾反应体系，37℃水浴30分钟。2)加入等体积的三氯甲烷，充分混均，12000转/分，4℃离心15分钟。3)吸上清至新EP管中，加入等量异丙醇，4℃静置60分钟，12000转/分，4℃离心15分钟。4)弃上清，加入70％乙醇纯化RNA，12000转/分，4℃离心15分钟。5)弃上清，加入10μL无RNA酶灭菌用水溶解RNA后，使用NanoDrop2000检测RNA含量。6)去基因组DNA，10μL反应体系，反应条件为：42℃孵育2分钟，4℃保存。7)反转录20μL反应体系，反应条件为37℃孵育15分钟，85℃持续5秒，4℃保存。8)RT-qPCR反应体系，反应条件为：95℃预变性30秒，PCR反应95℃5秒，60℃45秒，40个循环，溶解曲线阶段95℃5秒，60℃30秒。β-actin与U6作为内参基因，相对表达量使用2^-ΔΔCT计算，其中ΔCT(cycle threshold)＝CTtarget-CTβ-actin或U6，ΔΔCT＝ΔCT(a targetsample)-ΔCT(a reference sample)。

3、Abca4及其上游调控分子miR-351-3p的表达情况。

使用RT-qPCR的方法对差异基因进行验证，可以观察到Abca4及miR-351-3p的表达量趋势与转录组的趋势一致，Abca4在羊水间充质干细胞早期组低表达，在晚期组高表达，而miR-351-3p在羊水间充质干细胞早期组高表达，在晚期组低表达。

实施例5干预Abca4基因表达对细胞增殖的影响情况。

1、细胞转染。

使用lipofiter3.0作为转染试剂，具体转染步骤如下：1)提前1天将AF-MSCs铺6孔板，按5×10⁵/孔接种，使之第2天达到50-60％汇合度。2)转染前将培养基换为1mL/孔无血清DMEM/F12后配制转染混合液。3)转染预混液的配置：按每孔4μL的lipofiter3.0用250μL无血清DMEM/F12稀释，质粒2μg Abca4过表达质粒或Abca4 siRNAs终浓度100nM用250μL无血清DMEM/F12稀释，分别室温孵育5分钟后，将上述两种稀释液轻柔混合，继续室温孵育20分钟。4)将转染预混液500μL/孔加入6孔板，37℃培养箱孵育6小时后，更换为含10％胎牛血清的DMEM/F12继续培养。

2、PCR检测。

采用二步法实时荧光定量PCR法。1)去基因组DNA，10μL反应体系，反应条件为42℃孵育2分钟，4℃保存。2)反转录，20μL反应体系，反应条件为37℃孵育15分钟，85℃持续5秒，4℃保存。3)RT-qPCR反应体系，反应条件为：95℃预变性30秒，PCR反应95℃5秒，58℃45秒，40个循环，溶解曲线阶段95℃5秒，60℃30秒。

3、Western Blot检测。

1)灌胶：首先配置10％分离胶，加入玻璃板中，高度至距离玻璃板上缘2.5cm，加水压平，室温放置约30分钟后，观察分离胶与上层水有明显分界线后倒掉上层水。接着配置5％浓缩胶，将配制好的浓缩胶迅速加入玻璃板中，插上梳子，待胶凝固后可进行电泳。

2)电泳：首先配制10×电泳缓冲液，电泳时加去离子水稀释成1×电泳液，将上一步骤配好的胶固定于电泳槽中，加入1×电泳液，按40μg蛋白上样，恒流10mA/板，大约50分钟蛋白跑至浓缩胶与分离胶交界处，改成恒流15mA/板，继续电泳直至蛋白跑到玻璃板下缘，总时间约2小时。

3)转膜：首先配置10×转印缓冲液，然后配置1×转印缓冲液，将电泳后的胶按照海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序制作转膜三明治，放入转印槽中，加入1×转印缓冲液，恒压85V，转印2小时。

4)封闭：首先配制10×TBS，然后配制1×TBST，最后配制5％脱脂牛奶封闭液，将转印好的PVDF膜用1×TBS漂洗1次，放入5％脱脂牛奶封闭液中常温封闭2小时。1×TBST漂洗3遍，每遍5分钟。

5)一抗孵育：用一抗稀释稀释兔抗大鼠Abca4(1:2000)，小鼠抗大鼠GAPDH(1:10000)，4℃过夜孵育。

6)二抗孵育：1×TBST漂洗3遍，每遍5分钟，加入稀释好的二抗，羊抗兔IgG(1:5000)，羊抗小鼠IgG(1:5000)，室温孵育2小时。1×TBST漂洗3遍，每遍5分钟。

7)显影成像：PVDF膜上滴加配制好的ECL发光液，使用发光仪采集图像并分析。

4、Abca4具有抑制羊水间充质干细胞增殖的功能

构建Abca4过表达质粒，建立稳转细胞系，Abca4的转染率为81.71±16.03％，对照质粒GV657转染率为83.07±9.13％，western blot可见稳定转染后Abca4蛋白的表达显著增高，PCR检测提示过表达细胞中Abca4 mRNA表达量显著增加，提示稳转细胞构建成功。使用稳转细胞进行CCK-8检测，我们发现Abca4过表达显著抑制了细胞生长。此外，我们设计了Abca4的3条siRNA，通过PCR实验筛选出第1条siRNA敲减效果最好，因此选择其用于后续实验。Western blot实验再次证实了Abca4敲减成功，使用CCK-8实验证实了敲减Abca4有效的促进了AF-MSCs的增殖。

通过Abca4转基因(高表达)和Abca4 RNA干扰(低表达)方法，观察体外培养干细胞增殖的影响，进一步明确Abca4基因功能，如图11-14所示。

实施例6miR-351-3p对Abca4调控机制及其对细胞增殖影响的结果。

1、细胞转染。

使用lipofiter3.0作为转染试剂，具体转染步骤如下：转染前将培养基换为1mL/孔无血清DMEM/F12后配制转染混合液。转染预混液的配置是按每孔4μL的lipofiter3.0用250μL无血清DMEM/F12稀释，质粒2μg miR-351-3p的mimics或inhibitors终浓度100nM。将转染预混液500μL/孔加入6孔板，37℃培养箱孵育6小时后，更换为含10％胎牛血清的DMEM/F12继续培养。

2、PCR检测。

采用二步法实时荧光定量PCR法。1)去基因组DNA，10μL反应体系，反应条件为42℃孵育2分钟，4℃保存。2)反转录，20μL反应体系，反应条件为37℃孵育15分钟，85℃持续5秒，4℃保存。3)RT-qPCR反应体系，反应条件为：95℃预变性30秒，PCR反应95℃5秒，58℃45秒，40个循环，溶解曲线阶段95℃5秒，60℃30秒。

3、Western Blot检测。

首先配置10％分离胶，加入玻璃板中，接着配置5％浓缩胶，待胶凝固后可进行电泳。电泳时加1×电泳液，恒流10mA/板，大约50分钟蛋白跑至浓缩胶与分离胶交界处，改成恒流15mA/板，继续电泳直至蛋白跑到玻璃板下缘，总时间约2小时。将电泳后的胶按照海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序制作转膜三明治，放入转印槽中，加入1×转印缓冲液，恒压85V，转印2小时。放入5％脱脂牛奶封闭液中常温封闭2小时。用一抗稀释稀释兔抗大鼠Abca4(1:2000)，小鼠抗大鼠GAPDH(1:10000)，4℃过夜孵育。加入稀释好的二抗，室温孵育2小时。1×TBST漂洗3遍，每遍5分钟。PVDF膜上滴加配制好的ECL发光液，使用发光仪采集图像并分析。

4、miR-351-3p对Abca4调控机制及其对细胞增殖影响的结果。

为了证实miR-351-3p与Abca4的调控关系，分别进行miR-351-3p的mimic与inhibitor细胞转染。转染了mimic后可以看到miR-351-3p的表达量显著升高，提示miR-351-3p转入成功。接着通过CCK-8实验证实了转染miR-351-3p促进了AF-MSCs的增殖，且在蛋白水平抑制了Abca4的表达，与之相反的，转染miR-351-3p的inhibitor后，观察到敲减miR-351-3p可以抑制AF-MSCs的增殖且在蛋白水平增加了Abca4的表达，提示它们之间存在调控关系。为了进一步证实它们之间的互作关系，进行挽救实验，从CCK-8实验中可见观察到miR-351-3p挽救了Abca4对细胞增殖的抑制作用，且miR-351-3p恢复了过表达Abca4的蛋白含量。将结合位点序列野生型与突变型构建入双萤光素酶报告基因载体，通过双萤光素酶活性检测可以看见miR-351-3p下调野生型双萤光素酶报告基因的萤光值，而对突变型双萤光素酶报告基因的萤光强度无显著下调作用，进一步证实了miR-351-3p与Abca4通过CDS区域结合从而下调了Abca4的表达。

通过转染miR-351-3p mimics或inhibitors改变miR-351-3p表达，观察其下游靶基因Abca4表达及对细胞增殖影响情况，并提供双荧光素酶报告基因实验明确miR-351-3p与Abca4的结合位点，进一步明确miR-351-3p与Abca4调控机制及其对细胞增殖的影响，如图15-20所示。

Claims (1)

1.一种Abca4基因抑制剂在制备用于促进干细胞体外培养扩增效率的试剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为靶向Abca4的siRNA，所述干细胞为羊水间充质干细胞。

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