CN110607368B

CN110607368B - miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用

Info

Publication number: CN110607368B
Application number: CN201910889267.3A
Authority: CN
Inventors: 张彦民; 王博; 张东东; 展颖转; 代秉玲; 朱曼; 杨天枫
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110607368A

Abstract

本发明公开了miRNA3926‑1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用，属于生物和疾病诊断领域。该基因标志物核苷酸相对拷贝数与胰腺癌发生率正相关，与胰腺癌患者治疗后的生存期呈负相关。本发明还涉及miRNA3926‑1抑制剂以及血液组织和胰腺癌组织样本中检测miRNA3926‑1的试剂盒、方法和应用。目前市面上没有针对miRNA3926‑1分子检测的应用，也没有针对miRNA3926‑1分子的抑制剂。本发明为肿瘤尤其是胰腺癌的早期诊断及预后治疗和miRNA3926‑1分子的抑制剂开发奠定了坚实的基础，具有良好的应用前景。

Description

miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用

技术领域

本发明属于生物和疾病诊断领域，涉及miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物以及在检测试剂盒中的应用。

背景技术

肿瘤是世界上导致患者死亡的重大疾病。其发病机制复杂，已成为严重威胁人类健康的主要问题，其发病率和死亡率成逐年上升的趋势。目前我国癌症发病率和死亡率已经居于世界第一位。胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，称为万癌之王。一旦到了胰腺癌晚期，预后情况非常差，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，治愈率低，目前尚未有较好治疗药物。胰腺癌的病因尚不十分清楚，涉及到多种基因异常，其发展是多因素的调控过程。

肿瘤分子标志物是反映肿瘤存在的物质。它们肿瘤组织中的含量异常于正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。目前，microRNA(miRNA)已经成为一种新型的肿瘤特异性生物标志物。miRNA是较小(约22bp)的高度保守非编码RNA，在每种细胞类型中进行内源性表达。它通过碱基互补配对使靶标转录本沉默，从而起到调控基因表达的作用。miRNA可以由细胞分泌，在多种体液(包括血液、唾液等)中均可发现，已成为肿瘤的理想候选生物标志物，具有良好应用前景。迄今尚未见到miRNA3926-1及其抑制剂在胰腺癌研究中的相关报道。

发明内容

本发明公开了miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的一种用于胰腺癌诊断和/或疗效检测的生物标志物，所述生物标志物为miRNA3926-1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其是通过TCGA(The CancerGenome Atlas)数据库结合Cox回归与lasso回归分析获得。

本发明还公开了上述miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和/或疗效检测的生物标志物的应用，miRNA3926-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过细胞转染将其在胰腺癌细胞系中过量表达，经过细胞增殖、转移等实验得到验证，同时20例结肠癌的肿瘤组织和癌旁组织对比研究确证。

优选地，miRNA3926-1基因的核苷酸相对拷贝数增高与胰腺癌发生呈正相关；同时，在治疗后miRNA3926-1基因相对拷贝数与患者生存期呈负相关。

优选地，所述的生物标志物miRNA3926-1基因的核苷酸相对拷贝数的降低包括引起的miRNA3926-1表达水平降低或/和靶标蛋白水平的升高或降低。

本发明还公开了上述的miRNA3926-1基因的抑制剂，该miRNA3926-1基因的抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，经过化学合成制备。

本发明还公开了miRNA3926-1基因在制备用于诊断胰腺癌的试剂盒中的应用。诊断胰腺癌试剂盒中含有检测miRNA3926-1和内参RNA剪切体核苷酸U6(以下简称U6)引物对、逆转录cDNA引物序列等。

试剂盒检测miRNA3926-1的方法，包括RNA的提取步骤和cDNA合成，PCR扩增，扩增产物检查判断等。

本发明还公开了一种用于诊断胰腺癌的试剂盒，该试剂盒中含有检测miRNA3926-1基因和内参RNA剪切体核苷酸U6引物对、逆转录cDNA引物以及荧光定量PCR引物；

其中，内参RNA剪切体核苷酸U6的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示；

逆转录cDNA引物序列如SEQ ID NO：5所示；

荧光定量PCR正向引物序列如SEQ ID NO：6所示；

荧光定量PCR反向引物序列如SEQ ID NO：7所示

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种胰腺癌生物标志物miRNA3926-1及其应用，标志物miRNA3926-1，其序列为uggccaaaaagcaggcagaga，该基因标志物核苷酸相对拷贝数与胰腺癌发生率正相关，与胰腺癌患者治疗后的生存期呈负相关。即miRNA3926-1标志物相对拷贝数越高，胰腺癌发生的可能性越高。患者在治疗后miRNA3926-1标志物相对拷贝数越低，死亡率越低，患者生存期越长。所述的标志物相对拷贝数的降低包括引起的miRNA3926-1表达水平降低或者(和)靶标蛋白水平的升高(降低)，可作为评价胰腺癌发生或胰腺癌患者治疗之后生存率的指标。另外，本发明还涉及miRNA3926-1抑制剂以及血液组织和胰腺癌组织样本中检测miRNA3926-1的试剂盒、方法和应用。发明涉及来源于miRNA3926-1基因及其基因上两端位置新增加的引物序列应用于检测miRNA3926-1的用途。本发明为肿瘤尤其是胰腺癌的早期诊断及预后治疗和miRNA3926-1分子的抑制剂开发奠定了坚实的基础，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1miRNA3926-1与患者的生存时间图。

图2为实施例2胰腺癌Capan-2细胞转染miRNA3926-mimic基因表达量图。

图3为实施例2过量表达miRNA3926对胰腺癌Capan-2细胞增殖的影响。

图4为实施例2过量表达miRNA3926对胰腺癌Capan-2细胞转移的影响。

图5为实施例2胰腺癌Capan-2细胞转染miRNA3926抑制剂(inhibitor)基因表达量图。

图6为实施例2抑制miRNA3926基因表达对胰腺癌Capan-2细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：胰腺癌生物标志物miRNA3926-1的发现

本发明通过对美国国家癌症研究所与美国人类基因组研究所共同发布的TCGA数据库进行深入挖掘，首次在胰腺癌miRNA数据组当中发现miRNA3926-1与胰腺癌的发生有密切联系。本发明通过使用Cox回归与lasso回归分析挑选胰腺癌miRNA表达量与其生存时间之间的关系，获得多个与生存时间有强烈关系的miRNA基因，如图1所示，从图1中可以看出，其miRNA3926-1与患者的生存时间具有显著性差异。

实施例2：胰腺癌miRNA3926-1标志物的确证

本部分通过合成miRNA3926_mimic，正义链引物碱基序列：UGGCCAAAAAGCAGGCAGAGA，反义链引物碱基序列：UCUCUGCCUGCUUUUUGGCCA，并通过细胞转染将其在胰腺癌细胞系Capan-2中过量表达，结果表明转染后细胞内miRNA3926大量表达(通过荧光定量PCR检测miRNA3926成熟体表达量)，同时，胰腺癌细胞由于过量表达miRNA3926而显著促进其增殖，且通过transwell小室迁移实验验证肿瘤细胞的迁移能力得到显著增强。

1.仪器与材料

SW-CJ-1F型超净工作台(苏州市安泰空气技术有限公司)；Ti-U型倒置显微镜(Nikon)；MAC 15AC型二氧化碳恒温培养箱(SANYO)；80-2型台式电动离心机(上海市分析器械厂)；GH隔水式恒温培养箱(北京市科伟永兴仪器有限公司)；移液器(Eppendorf)；UPT-IV-5T超纯水制备机(成都市超纯科技有限公司)；BP211D电子天平(上海光正医疗仪器有限公司)；细胞计数板(上海求精生化试剂有限公司)；培养板(Costar)；转染试剂Exfect2000Transfection(南京诺唯赞生物科技有限公司)；结晶紫(北京化工厂)；噻唑蓝(MTT)(美国Sigma-Aldrich公司)；Transwell小室(8μm，美国Millpore公司)。

2.实验方法

将待转染细胞Capan-2培养至融合度60％-80％时，给予5％血清浓度培养液培养过夜待转染。转染时，使用opti-MEM培养液分别稀释miRNA3926_mimic和转染试剂并静止5min，随后将稀释的miRNA3926_mimic按1:1添加至稀释的转染试剂当中，并室温孵育10min，在之后将混合复合物滴加入细胞中，培育4h后更换正常培养基再培育24h，即可进行相关细胞学实验。

通过MTT实验的方法，检测转染miRNA3926_mimic的细胞Capan-2增殖与正常Capan-2细胞增殖的情况。将处于指数级增长期细胞，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，分别测定再培养24h，48h和96h的细胞增殖情况，在每一个不同的时间点每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃避光孵育4h。然后将各个孔内液体弃去，加入150μl DMSO，震荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490nm波长下测定细胞光密度值。

通过Transwell方法，检测转染miRNA3926_mimic的细胞Capan-2增殖与正常Capan-2细胞转移的情况。将处于指数级增长期细胞，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到8μm Transwell小室中。在培养箱中培养24h，小室内换无血清培养基，同时小室外加入含20％胎牛血清的培养基，再培养24h，取出小室，吸去小室内培养基，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定15-20min，0.2％结晶紫染色15-20min，棉签轻轻拭去小室内面未迁移的细胞，显微镜下观察拍照，同时选取不同视野计算不同浓度药物作用后的迁移细胞数。

3.实验结果

miRNA3926_mimic转染细胞后在胰腺癌Capan-2细胞中高表达(如图2所示)，同时高表达miRNA3926_mimic的细胞增殖和转移速度明显高于正常的胰腺癌细胞Capan-2增殖和转移速度(如图3和图4所示)。结果表明，miRNA3926在体内的表达促进肿瘤细胞的增殖与迁移。

实施例3：制备miRNA3926-1抑制剂

miRNA3926-1抑制剂的核苷酸序列为：

UCUCUGCCUGCUUUUUGGCCA，是经过化学合成制备得到。

2.实验方法

将待转染细胞培养至融合度60％-80％时，给予5％血清浓度培养液培养过夜待转染。转染时，使用opti-MEM培养液分别稀释miRNA3926_inhibitor和转染试剂并静止5min，随后将稀释的miRNA3926_inhibitor按1:1添加至稀释的转染试剂当中，并室温孵育10min，在之后将混合复合物滴加入细胞中，培育4h后更换正常培养基再培育24h(图5)。通过MTT实验的方法，检测转染miRNA3926_inhibitor的细胞增殖的情况。将处于指数级增长期细胞，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，再培养48h，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃避光孵育4h。然后将各个孔内液体弃去，加入150μl DMSO，震荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490nm波长下测定细胞光密度值。

3.实验结果

转染miRNA3926_inhibitor实验结果表明转染后细胞内miRNA3926成熟体表达量降低，如图5所示。miRNA3926_inhibitor转入细胞内，对细胞的增殖有明显的抑制作用，如图6所示。

实施例4：制备胰腺癌诊断试剂盒

胰腺癌诊断试剂盒含有检测miRNA3926-1和内参RNA剪切体核苷酸U6(以下简称U6)引物对、逆转录cDNA引物序列等。试剂盒检测miRNA3926-1的方法，包括RNA提取试剂、RNA的提取步骤、逆转录试剂、cDNA合成、荧光定量试剂以及相关引物。

其中，荧光定量PCR的引物序列为：

正向引物序列：5'-gcgtggccaaaaagcagg-3'；

反向引物序列：5'-agtgcagggtccgaggtatt-3'；

U6内参正向引物序列：ctcgcttcggcagcaca；

U6内参反向引物序列：aacgcttcacgaatttgcgt；

逆转录cDNA引物序列为(本序列将形成特殊茎环结构用于PCR扩增)：5'-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactctctg-3'；

RNA提取试剂包括：细胞裂解液(lysis buffer)、RNA提取柱RNA漂洗液(washbuffer)、RNA洗脱液(elution buffer)；反转录试剂包括：gDNA去除试剂、cDNA合成试剂；定量PCR试剂包括：定量PCR MasterMix、miRNA3926定量PCR引物、U6定量PCR内参引物等。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uggccaaaaa gcaggcagag a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ucucugccug cuuuuuggcc a 21

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactctctg 50

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgtggccaa aaagcagg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtgcagggt ccgaggtatt 20

Claims

1.抑制miRNA3926-1基因表达水平的抑制剂在制备用于抑制胰腺癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述抑制miRNA3926-1基因表达水平的抑制剂的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；所述miRNA3926-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.检测miRNA3926-1基因表达水平的引物在制备用于诊断胰腺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物由逆转录引物和荧光定量PCR引物组成，其中：

逆转录引物序列如SEQ ID NO：5所示；

荧光定量PCR引物的正向引物序列如SEQ ID NO：6所示；

荧光定量PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO：7所示；

所述试剂盒中还包括检测miRNA3926-1基因和内参RNA剪切体核苷酸U6引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示；

miRNA3926-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。