CN113789380B - 一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的应用。本发明首次发现lncRNA JPX在骨肉瘤细胞、骨肉瘤组织和骨肉瘤患者血液中稳定高表达，与成骨细胞、癌旁组织和正常人血液相比具有统计学意义。这表明在骨肉瘤中lncRNA JPX是一种新的骨肉瘤分子标志物。本发明还提供了lncRNA JPX检测试剂在制备骨肉瘤诊断产品和骨肉瘤预后评估产品的应用，将lncRNA JPX作为检测标志物，制备荧光定量PCR检测试剂盒。另外，本发明发现敲减lncRNA JPX能够显著抑制骨肉瘤细胞增殖、细胞活力、迁移、侵袭和转移能力，并且可以通过抑制lncRNA JPX的表达或抑制Wnt/β‑catenin信号通路来抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和转移能力，在制备治疗骨肉瘤药物中具有重要意义。

Description

一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的 应用

技术领域

本发明涉及一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织，是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉瘤是一种罕见的(占全部恶性肿瘤的0.2％)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织，其主要发病人群为10至20岁青少年，具有发病率高、早期转移率高、治愈生存率低等特点。X-射线、断层摄影技术、核磁共振及血管造影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生程度及手术类型判断等。然而，利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的病情延误，错过最佳治疗时期。因此，寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。

近年来，随着测序技术的发展和普及，人们发现了越来越多的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，同时也引起了人们的广泛关注和研究。长链非编码RNA是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白质的RNA。长链非编码RNA参与细胞各种生命活动的不同阶段，几乎涉及生命周期中的每个过程，例如基因转录、mRNA剪接、RNA衰变及翻译等。在一些复杂的疾病中，相关的信号通常来源于基因组的非编码区域。越来越多的研究也表明，长链非编码RNA的异常表达与人类重大疾病密切相关。另外，越来越多的研究结果发现，多种长链非编码RNA参与癌症的发生发展过程。目前，已有研究证实，在众多恶性肿瘤，如乳腺癌、肝癌和前列腺癌等癌症中均出现长链非编码RNA的异常表达，有的显著上调，有的显著下调。因此，长链非编码RNA的研究具有很重要的价值和意义，特别是在临床研究和药物开发等领域。lncRNA不仅可以为肿瘤及心血管等疾病的治疗提供新的依据和靶点，而且有助于人们认识复杂的生命调控过程。针对长链非编码RNA的研究将会是未来生命科学领域的重心与焦点，有助于更透彻地了解人类重大疾病的发病机理，为疾病的早期诊断和及时治疗提供生物标记物及相应的药物作用靶点。

目前，有关lncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的研究依然非常欠缺，因此还需继续探讨lncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面中的作用，同时为后续深入研究提供实验基础及研究方向。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的应用。

本发明的技术方案如下：

一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的应用，所述应用包括lncRNA JPX的检测试剂在制备骨肉瘤诊断产品中的应用、在制备骨肉瘤预后评估产品中的应用或lncRNA JPX的抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用，其中，所述lncRNA JPX的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

根据本发明优选的，所述lncRNA JPX的检测试剂包括实时荧光定量PCR检测试剂和特异性扩增lncRNA JPX的引物对。

根据本发明优选的，所述包括荧光定量PCR检测试剂荧光染料、实时荧光定量PCR反应液；所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和缓冲液，所述荧光染料为SYBR GreenI。

根据本发明优选的，所述特异性扩增lncRNA JPX的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述骨肉瘤诊断产品和骨肉瘤预后评估产品的检测样本选自组织、血浆、或血清。

根据本发明优选的，所述治疗骨肉瘤的药物包括但不限于核酸分子、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽或干扰慢病毒，均为lncRNA JPX的抑制剂。

一种骨肉瘤诊断或预后评估试剂盒，所述试剂盒包括lncRNAJPX的检测试剂。

根据本发明优选的，所述lncRNA JPX的检测试剂包括实时荧光定量PCR检测试剂和特异性扩增lncRNAJPX的引物对；所述特异性扩增lncRNAJPX的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物；所述荧光定量PCR检测试剂包括荧光染料、实时荧光定量PCR反应液；所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和缓冲液，所述荧光染料为SYBR GreenI。

有益效果：

1、本发明首次发现lncRNA JPX在骨肉瘤细胞、骨肉瘤组织和骨肉瘤患者血液中稳定高表达。骨肉瘤组织与癌旁组织中lncRNA JPX表达差异有统计学意义，在骨肉瘤组织中表达量显著升高；骨肉瘤患者血液与正常人血液中lncRNA JPX表达差异有统计学意义，在骨肉瘤患者血液中表达量显著升高；骨肉瘤细胞与对照细胞(成骨细胞)中lncRNA JPX表达差异有统计学意义，在骨肉瘤细胞中表达显著升高。此外，过表达lncRNA JPX能够提高骨肉瘤细胞增殖、细胞活力、迁移、侵袭和转移能力；这表明在骨肉瘤中lncRNA JPX是一种新的骨肉瘤分子标志物。本发明还提供了lncRNA JPX检测试剂在制备骨肉瘤诊断产品和骨肉瘤预后评估产品的应用，主要是将lncRNA JPX作为检测标志物，制备相应的荧光定量PCR检测试剂盒，用于诊断骨肉瘤以及预估骨肉瘤患者的预后情况。另外，本发明发现敲减lncRNAJPX能够显著抑制骨肉瘤细胞增殖、细胞活力、迁移、侵袭和转移能力，并且lncRNA JPX通过促进Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤细胞中发挥功能，这说明可以通过抑制lncRNA JPX的表达或抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和转移能力，在制备治疗骨肉瘤药物中具有重要意义。

2、本发明设计了特异性扩增lncRNA JPX的引物对，可特异性有效检测lncRNAJPX。

附图说明

图1是骨肉瘤组织与癌旁组织、骨肉瘤患者血液与正常人血液中lncRNA JPX表达差异统计图。

图2是三种骨肉瘤细胞中lncRNA JPX高表达的柱状图。

图3是转染lncRNA JPX后三种骨肉瘤细胞中lncRNA JPX表达情况统计图。

图4是骨肉瘤细胞过表达lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞增殖的结果图(左)和统计图(右)。

图5是骨肉瘤细胞过表达lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞活力的统计图。

图6是骨肉瘤细胞过表达lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞迁移的结果图(左一至左三)和统计图(右一)。

图7是骨肉瘤细胞过表达lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞侵袭的结果图(左)和统计图(右)。

图8是骨肉瘤细胞过表达lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞转移(左：附着，右：脱离)的统计图。

图9是转染shRNA JPX后骨肉瘤细胞中lncRNA JPX表达情况统计图。

图10是骨肉瘤细胞敲减lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞增殖的结果图(左)和统计图(右)。

图11是骨肉瘤细胞敲减lncRNA JPX后抑制骨肉瘤细胞活力的统计图。

图12是骨肉瘤细胞敲减lncRNA JPX后抑制骨肉瘤迁移的结果图(左一至左三)和统计图(右一)。

图13是骨肉瘤细胞敲减lncRNA JPX后抑制骨肉瘤侵袭的结果图(左)和统计图(右)。

图14是骨肉瘤细胞敲减lncRNA JPX后抑制骨肉瘤转移(左：附着，右：脱离)的统计图。

图15是过表达lncRNA JPX促进Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的westernblot结果图(左)和统计图(右)。

图16是Wnt/β-catenin信号通路参与lncRNA JPX调控骨肉瘤细胞增殖的结果图(左)和统计图(右)。

图17Wnt/β-catenin信号通路参与lncRNA JPX调控骨肉瘤细胞迁移过程的结果图(左)和统计图(右)。

图18Wnt/β-catenin信号通路参与lncRNA JPX调控骨肉瘤细胞侵袭的结果图(左)和统计图(右)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

人源骨肉瘤细胞Saos-2、MG63和U2OS及人源成骨细胞hFOB1.1购于American TypeCulture Collection(ATCC，美国)。

实施例1

本发明人经过前期大量研究发现，如SEQ NO.1所示的lncRNA JPX与骨肉瘤细胞的增殖、细胞活力、迁移、侵袭和转移能力相关，推测其可能作为骨肉瘤诊断、转移和预后评估的标志物。

下面通过实时荧光定量PCR检测lncRNA JPX在待测样本中的表达量来进行验证。

具体实施过程如下：

(1)收集样本：在哈尔滨医科大学附属第一医院骨外科进行骨肉瘤切除手术过程中，收集骨肉瘤患者骨组织样本(n＝5)和癌旁组织样本(n＝5)，此外收集骨肉瘤患者血液样本(n＝10)和健康体检者血液样本(n＝10)，获得哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准；

(2)提取总RNA：使用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)分别从骨肉瘤细胞、组织、血液以及正常骨组织、正常人血液和正常细胞中提取总RNA，提取方法严格按照试剂盒说明书内所述步骤进行，使用NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度；

(3)实时定量PCR：使用逆转录试剂盒(ABI公司，美国)进行逆转录合成cDNA，具体按照试剂盒说明书步骤进行，使用Power SYBR^TMGreen PCR预混液(Thermo FisherScientific，4367659)以及本发明中如SEQ NO.2和SEQ NO.3的特异性引物分别进行荧光定量PCR，以GAPDH为内参，使用2^-ΔΔCT方法计算lncRNA JPX相对表达水平，结果如图1～2所示。

其中，引物对的核苷酸序列如下：

上游引物#1：5’-TGCAGTCAGAAGGGAGCAAT-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物#1：5’-CACCGTCATCAGGCTGTCTT-3’(SEQ ID NO.3)

所述逆转录PCR体系和实时荧光定量PCR体系分别按照试剂盒建立。

逆转录PCR程序：95℃10分钟；37℃1小时，85℃5分钟，循环2次；冷却至4℃。

实时荧光定量PCR程序：95℃10分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共计40个循环；72℃5分钟。

本发明首次发现相较于对照组(人源成骨细胞、癌旁组织和正常人血液)，lncRNAJPX在人源骨肉瘤细胞、骨肉瘤组织和骨肉瘤患者血液中稳定高表达。骨肉瘤组织与癌旁组织中lncRNA JPX表达差异有统计学意义，在骨肉瘤组织中表达量显著升高(如图1A)；骨肉瘤患者血液与正常人血液中lncRNA JPX表达差异有统计学意义，在骨肉瘤患者血液中表达量显著升高(如图1B)；人源骨肉瘤细胞与对照细胞(人源成骨细胞)中lncRNA JPX表达差异有统计学意义，在骨肉瘤细胞中表达显著升高(如图2)。

实施例2

lncRNA JPX过表达慢病毒和阴性对照(NC)均购自中国上海GenePharma公司。根据产品说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)试剂，将lncRNA JPX和NC转染至骨肉瘤细胞中，以构建过表达lncRNA JPX的骨肉瘤细胞模型。转染48小时后，细胞将用于进一步分析。然后通过实时荧光定量PCR实验检测lncRNA JPX的表达水平，PCR体系和程序同实施例1。

转染lncRNA JPX后，构建过表达lncRNA JPX的骨肉瘤细胞(Saos-2,MG63和U2OS)模型，lncRNA JPX的表达情况如图3所示，实时荧光定量PCR结果显示，转染lncRNA JPX后，骨肉瘤细胞中lncRNA JPX表达显著升高。

实施例3

对实施例2中lncRNA JPX过表达处理后的骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)进行生物学功能的测定。

1、增殖测定：将密度为5×10²/mL的细胞接种在六孔板(NEST公司，China)中DMEM(Hyclone公司，美国)培养液上并使其生长。每三天更换一次培养基。培养14天后，用甲醇固定细胞15分钟，室温下用1％结晶紫(Biosharp公司，中国)染色30分钟后再次洗涤。最后，在显微镜下观察和计数菌落。

结果如图4所示，克隆形成实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著促进人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)增殖。

2、细胞活力测定：将细胞以5×10⁴/mL的密度接种在96孔(NEST，China)中DMEM(Hyclone公司，美国)培养液上。然后，向骨肉瘤细胞转染过表达lncRNA JPX，48小时后，弃去培养基，将细胞在0.5mg/mL MTT溶液中在37℃温度下孵育4小时。最后，将培养基替换为150μL DMSO溶液。使用酶标仪(TECAN，瑞士)检测490nm波长处的光密度(OD)值。

结果如图5所示，MTT实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著提高人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)活力。

3、迁移测定：将细胞以1×10^6/孔的密度接种到六孔板中DMEM(Hyclone公司，美国)培养液上。应用无菌移液器吸头在细胞上沿直线划线，用PBS洗涤3次去除漂浮细胞后，分别在0h和48h用倒置光学显微镜观察划痕情况，拍照并用分析划痕宽度。

结果如图6所示，划痕实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著提高人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)迁移能力。

4、侵袭测定：使用带有24孔transwell室(Corning，美国)和包被基质胶的8μm大小的孔膜检测骨肉瘤细胞侵袭能力。将1×10⁵个细胞接种在上室，并加入100μL无血清培养基，下室装满600μL正常培养基。培养细胞48小时并获得侵袭的细胞，用于侵袭能力的测定。在室温条件下用4％PFA固定下室中已通过膜迁移的细胞，30分钟后清洗，并用1％结晶紫(Biosharp公司，中国)染色30分钟。最后，在显微镜下观察和分析侵袭细胞的数量。

结果如图7所示，transwell实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著提高人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)侵袭能力。

5、转移测定：

a、细胞附着测定，将细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种到24孔板(NEST，China)中DMEM(Hyclone公司，美国)培养液上，60分钟后，弃掉未附着的细胞。并在胰蛋白酶消化后检测和评估贴壁细胞的数量，分析附着细胞与总细胞相比的百分比。

b、细胞脱离测定，将细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种到24孔板(NEST，China)中DMEM(Hyclone公司，美国)培养液上，24小时后，加入0.05％胰蛋白酶，3分钟使细胞脱落。然后，加入DMEM培养液中和胰蛋白酶，并收集分离的细胞，剩余的细胞用0.25％胰蛋白酶处理并计数细胞，计算分离的细胞占总细胞的百分比。

结果如图8所示，细胞附着实验和脱离实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著促进人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)附着，而抑制其脱落。

实施例4

lncRNA JPX特异性shRNA(shRNA JPX)和阴性对照(NC)均购自中国上海GenePharma公司。根据产品说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)试剂，将shRNA JPX和NC转染至骨肉瘤细胞中，以构建敲减lncRNA JPX的骨肉瘤细胞模型。转染48小时后，细胞将用于进一步分析。然后通过实时荧光定量PCR实验分析确认lncRNA JPX的表达水平。

转染shRNA JPX后，构建敲减lncRNA JPX的骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)模型，lncRNA JPX的表达情况如图9所示，实时荧光定量PCR结果显示，转染shRNA JPX后，骨肉瘤细胞中lncRNA JPX表达显著降低。

实施例5

对实施例4中lncRNA JPX敲减处理后的骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)进行生物学功能的测定，测定方法同实施例3。

增殖测定结果如图10所示，克隆形成实验结果表明，敲减lncRNA JPX显著抑制人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)增殖。

细胞活力测定结果如图11所示，MTT实验结果表明，敲减lncRNA JPX显著抑制人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)活力。

迁移测定结果如图12所示，划痕实验结果表明，敲减lncRNA JPX显著抑制人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)迁移。

侵袭测定结果如图13所示，transwell实验结果表明，敲减lncRNA JPX显著降低人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)侵袭能力。

转移测定结果如图14所示，细胞附着实验和脱离实验结果表明，敲减lncRNA JPX显著抑制人骨肉瘤细胞(Saos-2，MG63和U2OS)附着，而促进其脱落。

实施例6

lncRNA JPX通过促进Wnt/β-catenin信号通路调控骨肉瘤增殖、迁移和侵袭过程。

为了揭示lncRNA JPX调节骨肉瘤细胞生物学行为的潜在机制，我们选择了MG63细胞进行进一步分析。为了研究lncRNA JPX是否通过Wnt/β-catenin通路调节骨肉瘤细胞的生物学功能，我们向MG63细胞转染lncRNA JPX，48小时后检测Wnt/β-catenin信号通路中关键基因(β-catenin、MYC、Axin2和Cyclin D1)的表达水平，并应用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Wiki4，检测Wnt/β-catenin信号通路是否介导lncRNA JPX调控骨肉瘤细胞生物学功能。

然后对上述处理后的MG63细胞进行生物学功能的测定，测定方法同实施例3。

结果如图15所示，western blot实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著提高骨肉瘤细胞MG63细胞中β-catenin、MYC、Axin2和Cyclin D1蛋白的表达，表明Wnt/β-catenin通路被lncRNA JPX激活。

结果如图16所示，克隆形成实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著提高骨肉瘤细胞MG63细胞增殖能力，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Wiki4能够阻断这一过程，表明Wnt/β-catenin通路参与lncRNA JPX促进骨肉瘤细胞增殖过程。

结果如图17所示，划痕结果表明，过表达lncRNA JPX显著促进骨肉瘤细胞MG63细胞迁移，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Wiki4能够阻断这一过程，表明Wnt/β-catenin通路参与lncRNA JPX促进骨肉瘤细胞迁移过程。

结果如图18所示，transwell实验结果表明，过表达lncRNA JPX显著提高骨肉瘤细胞MG63细胞侵袭能力，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Wiki4能够阻断这一过程，表明Wnt/β-catenin通路参与lncRNA JPX促进骨肉瘤细胞侵袭过程。

以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种长链非编码RNA lncRNA JPX作为骨肉瘤分子标志物的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1696

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctatgcccta gggctagtgg aagacttaag atggcggcgt ttgcacggag tgcaatcact 60

gcgtccttac gggggttgca aggcgtccga agtatgagtc cactaacaaa agtccagaaa 120

ctcgccagtt aatagtattg tgtctcttca aaatatcgga gaataatttc tttctcgctg 180

atcgcctaac ttctactgac gaagcttgga agttgcagaa gatggagttc gctcttgttg 240

cccaggctgg aatgcaatgg catgaccttg gctcactgca acctctgcct ccccagttca 300

agtggttctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgagatta cagaaaccac aataaaggct 360

ctcgcccaca ttcttccctc accctctgcc tcctgactga cactggtgct ttcctgggtg 420

aaccctgacg gtgtggcatg cctcttcttg tgatctattg ttcactgttg gcatatagaa 480

acactactga tgcctcagag atgaccatga tggtgttctg gtgtcaggag aatagcaatg 540

cctgggagtc caccaccacc ataatctcct gtgatcccac ggagctgcag tcagaaggga 600

gcaatgacaa gaaataagtg ctgagcagtt gtcatatggt gctggaagac atgctacttt 660

tccctgaggg cggaagacag cctgatgacg gtggtacaat caatgacatc tctgtgctgg 720

gagtgacctg cttgggggcc caggctgatc atttcacaca gacacccctg gatcctggaa 780

gccaagtcct ggtctgggta gactgggagt ggaggtttga ccacatgcag cagcattaaa 840

ggcagcatct catcacagca gttgctgatt atctgtttga gttaaagaca acatcatggg 900

agttagggaa atttcggagt gtgatgctgg aaagcccctc tgtgaatgca gagaaaataa 960

ccgccactga aaagagtgtc aataaaaata tcagagatca gctgctcaac aaagtatgag 1020

aactgagcct gaatgatcct gaggcggagc aggtgagagg ctggggcctg ccagatgatc 1080

atgctgggcc cattggaatt gttaccatca agggtgttga ttccaacatg tgctgtggga 1140

tccccatgag caatctccgt gactttccag tcattaagat taggcaccga gaagaggaaa 1200

aggaataaaa tcaaactgat atttctggct gggaaccaga tgctgaaatg gatgaagaga 1260

agtcatgaaa ctgaaagagc actgaatcac tctgcttaag tgtggagcag aggatcacat 1320

ggaagcagtg aaaaagctcc agaatgtagc caggcatggt ggctactgcc tgtaatccca 1380

gcactttggg aggccgaggc gggcagatca cgaggtcagg agatcgagac catcctggct 1440

aacacggtga aaccccgtct ctactaaaaa tataaaaaat tagctgggcg tgtggcgggc 1500

gcctgtagtc ctagctactt gggaggctga ggcaggagaa tggcgtgaac ccaggaggtg 1560

gaacttgcag tgagctgaga tcacgccact gcactccagc ctgggcgaca gagcgagact 1620

ctgtctctaa ataaataaat aaataaataa ataaataaat aaataaataa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa aaaaaa 1696

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcagtcaga agggagcaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccgtcatc aggctgtctt 20

Claims (7)

1.检测长链非编码RNA lncRNA JPX表达量的试剂在制备骨肉瘤诊断产品中的应用，所述lncRNA JPX的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测长链非编码RNA lncRNA JPX表达量的试剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR检测试剂包括荧光染料、实时荧光定量PCR反应液和特异性扩增lncRNA JPX的引物对。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTPs、MgCl₂、Taq DNA聚合酶和缓冲液；所述荧光染料为SYBR GreenI。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增lncRNA JPX的引物对为SEQID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

6.长链非编码RNA lncRNA JPX的抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用，所述lncRNAJPX的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述lncRNA JPX的抑制剂为shRNA、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽或干扰慢病毒。

Images