CN111718995B - 一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记。在本发明中，我们证实了与正常鼻咽上皮细胞NP69相比，circ‑0046263在鼻咽癌细胞系呈高表达。临床组织样本检测结果显示，circ‑0046263在鼻咽癌组织中的表达上调，且与分期成正相关。体外细胞功能实验表明circ‑0046263促进细胞的增殖、迁移和侵袭，而且促进细胞上皮间充质转化。因此,circ‑0046263可以作为生物标记物在制备鼻咽癌转移诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中应用；也可以作为靶点在筛选治疗鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物中应用。抑制circ‑0046263表达的试剂可用于制备鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物。

Description

一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记。

背景技术

鼻咽癌(NPC)发病具有典型地域性，高发于东南亚。与其它头颈部肿瘤不同，鼻咽癌病理类型以低分化或未分化癌为主，恶性程度高，易发生侵袭转移。近年随着调强放疗的应用，鼻咽癌局部控制率获得明显提升，但远处转移率仍居高不下，已成为临床治疗失败、导致死亡的主要原因，是当前阻碍鼻咽癌远期生存率进一步提升的最大瓶颈。目前，人们对NPC转移的潜在分子机制知之甚少。因此，深入探索鼻咽癌侵袭转移的分子机制、寻找新的干预靶点成为该领域的研究热点。

鼻咽癌的病因尚未明确，医学界认为，与下列因素有密不可分的关联：遗传因素、饮食因素、环境因素和EB病毒感染。由于鼻咽位置隐蔽，检查不易，同时鼻咽癌的早期症状比较复杂，缺乏特征，故容易被人忽视，延误诊断和治疗。因此，对鼻咽癌进行早期筛查和诊断，尤其是采用创伤性低、取材方便的体液检查，对进行治疗和提高患者生存率具有重要意义。

环状RNA(circRNA)是一类新近发现的调节RNA，缺乏游离的5'或3'末端，具有结构稳定、高度保守及组织特异表达等性质。其长度大小不一，常见数十到数千碱基对。研究显示，circRNA可作为肿瘤基因表达的主要调节因子，常见的作用方式是充当分子海绵吸附微小RNAs(miRNAs)来调节基因的表达。还可以通过直接调节转录和干扰剪接机制来发挥作用，因而与肿瘤的发生发展关系十分密切。虽然与线性对应物相比丰度较低，但它们通常以组织和发育阶段特异性的方式表达，加上共价闭环结构对RNA酶活性的显著抗性，这使得circRNA作为肿瘤和其他疾病的新型生物标志物显示出巨大的应用前景。但是，大多数circRNA在NPC中的作用和机制尚不完全清楚。

发明内容

本发明提供了一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记及其应用。在本发明中，circ-0046263在鼻咽癌组织和细胞中高表达，能够促进鼻咽癌细胞的迁移、侵袭和肿瘤转移。

本发明的技术方案如下：

circ-0046263作为生物标记物在制备鼻咽癌转移诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用。

检测circ-0046263分子的产品在鼻咽癌转移诊断和/或预后评估中的应用。

一种鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，包括与circ-0046263特异性结合的检测物。

所述检测物优选包括与circ-0046263特异性结合的引物对、探针中的至少一种。

所述引物对序列如下：5’-GGTTGTCCTCTTTAAGAAGCTGG-3’(SEQ ID NO.1)和5’-CCTTGAAGAAGCCGATGACAG-3’(SEQ ID NO.2)所示。

Hsa_circ_0046263作为靶点在筛选治疗鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物中应用。

Hsa_circ_0046263作为治疗靶点在制备治疗鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物中应用。

抑制或干扰circ-0046263表达的试剂在制备治疗鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物中应用。

本发明的有益效果是：

环状RNA(circRNA)作为非编码RNA的亚类，在调节真核生物的基因表达中起重要作用。但是，它们在鼻咽癌中的作用知之甚少。在本发明中，我们证实了与正常鼻咽上皮细胞NP69相比，circ-0046263在鼻咽癌细胞系呈高表达。临床组织样本检测结果显示，circ-0046263在鼻咽癌组织中的表达上调，且与分期成正相关。体外细胞功能实验表明circ-0046263促进细胞的增殖、迁移和侵袭，而且促进细胞上皮间充质转化(EMT)。因此,circ-0046263可以作为生物标记物在制备鼻咽癌转移诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中应用；也可以作为靶点在筛选治疗鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物中应用。抑制或干扰circ-0046263表达的试剂可用于制备鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物。

附图说明

图1为本发明的circ-0046263在鼻咽癌组织中表达水平上调示意图。

图2为本发明的circ-0046263的一代测序验证头对尾剪切的示意图。

图3为本发明的circ-0046263在cDNA和gDNA中扩增的示意图。

图4为本发明的circ-0046263在RNase R消化后表达水平的检测示意图。

图5本发明的鼻咽癌细胞系的circ-0046263表达明显高于永生化鼻咽癌上皮细胞NP-69的示意图。

图6本发明的circ-0046263与临床分期之间的关系

图7为本发明设计三条circ-0046263的干扰RNA，选择干扰效率最高的si-circ3进行下一步实验。

图8为本发明干扰circ-0046263对5-8F和CNE-2细胞的增殖、集落形成影响的示意图之一。

图9为本发明干扰circ-0046263对5-8F和CNE-2细胞的增殖、集落形成影响的示意图之二。

图10为本发明干扰circ-0046263对5-8F和CNE-2细胞迁移侵袭影响示意图之一。

图11为本发明干扰circ-0046263对5-8F和CNE-2细胞迁移侵袭影响示意图之示意图之二。图12本发明干扰circ-0046263对EMT关键蛋白影响示意图。

图13为本发明选择了SUNE-1细胞进行circ-0046263过表达稳转株构建，过表达circ-0046263在SUNE-1细胞系中的表达的示意图。

图14为本发明circ-0046263过表达则产生相反的作用示意图之一。

图15为本发明circ-0046263过表达则产生相反的作用示意图之二。

图16为本发明circ-0046263过表达则产生相反的作用示意图之三。

图17为本发明circ-0046263过表达则产生相反的作用示意图之四

图18为本发明circ-0046263过表达对EMT关键蛋白影响示意图。

图19为本发明建立鼻咽癌异种移植瘤模型和自发淋巴结转移模型示意图。

图20为本发明circ-0046263敲低或者过表达对异种移植瘤模型肿瘤质量的影响示意图。

图21为本发明circ-0046263敲低或者过表达对异种移植瘤模型肿瘤体积的影响示意图

图22为本发明采用免疫组化(IHC)来评估包括E-cadherin和vimentin在内的EMT相关基因在原发肿瘤表达示意图。

图23为本发明还采用蛋白质印迹来评估EMT相关基因在原发肿瘤表达示意图。

图24为本发明circ-0046263与临床特征相关性示意图。

具体实施方式

为了方便理解本发明的上述技术方案，以下通过具体使用方式上对本发明的技术方案进行详细说明：

下面结合附图对本发明做进一步说明。

实施例1

材料和方法

患者样本

40例鼻咽癌样本均来自江苏省肿瘤医院放疗科，全部病理明确诊断为鼻咽癌。按照赫尔辛基宣言，每位患者均签署书面知情同意书，并得到江苏省肿瘤医院伦理审查委员会的批准。鼻咽癌分期标准为UICC第八版分期。临床资料的采集：纳入标准：①既往未接收过任何治疗；②经病理确诊为鼻咽癌；③无其他肿瘤病史；④临床病理资料完整；⑤年龄大于18周岁。排除标准：①治疗前接受过其他治疗的患者；②非原发性鼻咽癌患者；③患有其他影响放疗的重大疾病的患者；④临床资料不完整，不能随访到的患者。

细胞系

七种人鼻咽癌细胞系(6-10B，CNE-1，CNE-2，SUNE-1,5-8F，HNE-1和c666-1)和一种永久的鼻咽上皮细胞系(NP69)获自江苏省肿瘤医院临床肿瘤研究中心(中国江苏南京)。将人NPC细胞系在补充有10％小牛血清(Gibco，Grand Island，USA)的RPMI-1640培养基(Corning，Manassas，VA，USA)中于37℃在5％CO2的潮湿气氛中培养。NP-69在含有牛垂体提取物(BD Biosciences，San Diego，CA，USA)的角质形成细胞/无血清培养基(Invitrogen)中繁殖，并在37℃下饱和CO2中生长。

构建过表达circ-0046263的稳定细胞系

准备目的细胞SUNE-1从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。完全解冻后，1300rpm，离心3min，75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。吸去冻存液上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL完全培养基的大皿中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO²培养箱，24h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80％左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成6×10⁴个/mL细胞悬液。取500μl细胞悬液接种至48孔板中(共铺8个孔)，继续培养。铺板第二天，换液，在8个孔中分别加入终浓度为0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的puromycin。加puromycin 48小时后显微镜下观察细胞状态(未加药组细胞密度在60％～90％之间)，此时，高浓度puromycin组细胞应死亡殆尽(如果第一次未筛选到有效杀伤浓度，需重新设计药物梯度筛选，如果设计的最低浓度也将细胞全部杀伤，最好也重新设计浓度)。通过观察细胞状态，将最低导致细胞死亡殆尽的浓度，确定为该细胞puromycin筛选的最佳浓度。处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×10⁴细胞悬液，并1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30％左右。感染72h后，观察细胞状态和感染效率。要求细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证NC组与实验组细胞状态相当。加入合适浓度的抗生素，筛选至少48h。如病毒载体带有荧光标记，荧光效率需要达到100％后，降低抗生素维持浓度(相较之前的药筛浓度，浓度减至之前浓度的1/2～1/4或更低)继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，同时收集细胞进行下游qPCR检测。加入抗生素维持浓度的细胞继续进行扩增。通过应用嘌呤霉素选择稳定过表达circ-0046263的细胞，然后使用qRT-PCR验证，待qPCR检测结果过表达后进行冻存。

琼脂糖凝胶电泳实验

取TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。称取适当琼脂糖，用锥形瓶盛装，在瓶中加约70ml的TBE稀释缓冲液，在微波炉里加热，边加热边观察。加热器期间可拿出来摇动，使的琼脂糖颗粒充分混匀。胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃，而后到入制胶模具(预先插上样品梳子)中，待胶完全凝固后拨出梳子，取出胶块，放入加有TBE电泳缓冲液的电泳槽内。取8μl DNA样品与2μl载样液混匀，小心加入样品槽中。合上电泳槽盖，接通电源。控制电压保持在100V，电流在40mA以上。电泳方向由负极向正极，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。首先把电泳胶板放在紫外灯下观察。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。观察时注意戴上防护眼镜。

Sanger测序

由广州锐博生物科技有限公司设计circRNA跨剪切位点的背向引物，PCR扩增的产物由擎科生物科技有限公司进行Sanger测序，Jellyfish软件比对序列，确认测序结果与back-splice junction序列吻合，辅证qRT-PCR引物特异性。

核质分离实验

准备①2×lysis/Binding solution中加入415μl二疏基乙醇。②Wash solution2/3加入64μl无水乙醇。③Fractional Buffer、Distruption Buffer置于冰上。④用RNA-free EP管加热洗脱液200μl至95℃。消化细胞低速离心成团吸去上清，PBS清洗细胞沉淀一遍，放置于冰上。每管加入300μl预冷的Fractional Buffer，轻弹试管使细胞松动，轻柔的涡旋或吹打以重悬细胞。冰上孵育5-10min，4℃，500g离心1-5min。吸取上清放置于新的RNA-free管中，做好细胞质的标记。观察沉淀，如果第(5)步吸取上清时沉淀松解，加入Fractional Buffer轻柔弹EP管后，4℃，500g离心1min。若无松动，加入同FractionalBuffer等体积的Distruption Buffer，剧烈涡旋或用力吹打以裂解细胞核。细胞质和细胞核中各加入300μl 2×lysis/Binding solution。每管加入300μl的无水乙醇轻柔吹打以混匀。将混合液加入新的有滤过柱的EP管，每次不超过700μl，12000g离心1min后弃滤液。700μl Wash Solution 1清洗1遍，12000g离心15s弃滤液。500μl Wash Solution 2/3清洗2遍，12000g离心15s弃滤液。继续离心10-30s以除去残留的Wash Solution 2/3。将50μl预热的Elation Solution加入到滤柱中，12000g离心30s。重复一次洗脱，收集约100μl样品。使用NanoDrop检测RNA浓度和纯度，记录数据，进行下一步逆转录实验，剩下的RNA置于-80℃冰箱保存。荧光原位杂交

细胞置于六孔板中培养，待细胞长到80％左右，用PBS清洗后，加入4％多聚甲醛，室温下固定30min，然后回收甲醛PBS清洗，加入预冷的通透液，置于4摄℃冰箱中静置10min。用准备好探针存储液，配置预杂交液和杂交液。每孔中加入200μl的预杂交液，37℃下封闭30min，在杂交液中避光加入目的基因或内参探针存储液。吸出预杂交液，加入杂交液。37℃下避光过夜。次日，40℃下避光下，用洗液清洗细胞，然后用PBS清洗3遍细胞。避光条件下用DAPI染色细胞核，然后用PBS清洗3遍，把细胞爬片固定到载玻片上，用显微镜观察拍照。细胞转染

根据制造商的方案，5μl的Lipofectamin2000和10μl siRNA/si-NC、mimic/mimic-NC或者inhibitor/inhibitor-NC加入到250μl的opti-MEM进行稀释，并在冰上静置5min。将稀释好的Lipofectamin 2000与siRNA/si-NC、mimic/mimic-NC或者inhibitor/inhibitor-NC进行混合，轻柔吹匀，在冰上静置20min。将混匀的转染试剂以每孔500μl加入到六孔板中，轻轻摇晃，放置温箱中培养。6h后将无血清培养基opti-MEM换成含FBS的培养基，48-72h转染成功后进行后续实验

细胞活力测定和菌落形成测定

应用细胞计数试剂盒-8(Beyotime，China)研究稳定转染细胞的生长曲线。在96孔板中以每孔1.5×103个细胞的密度一式三份接种NPC细胞。通过使用ELX800分光光度板读数器(Bio-Tek，Winooski，VT，USA)在24,48和72小时后在490nm记录吸光度。在菌落形成实验中，稳定转染的细胞在6孔板中以每孔500个细胞的速度接种，在培养基中培养7-12天。采用结晶紫染色法观察菌落。用ImageJ对菌落进行计数，计数结果为细胞数>50。

侵袭和迁移测试

Transwell插入物(8μm孔；Corning，New York，USA)在24孔板中用于检测细胞迁移和侵袭能力。将在200μl无血清RPMI-1640培养基中培养的总共1×10 5个细胞加入上室(用于侵袭测定)或不用(用于迁移测定)基底膜基质(BD Biosciences，New York，USA)。然后，将500μl含有20％FBS的完全培养基加入下室中。将细胞在37℃下培养24或48小时。通过使用棉签除去残留在上室底部的非迁移细胞，并且用4％甲醛固定通过上室底部侵入或迁移的细胞并用结晶紫染色。观察每个孔中的五个随机视野并在显微镜下以×200放大倍数计数。计算平均细胞数。

伤口愈合测定

伤口愈合测定用于检测细胞迁移能力。将NPC细胞在六孔板中孵育48小时直至90％汇合。然后，使用200μl移液管产生人造平行划痕，并使用PBS洗去自由漂浮的细胞。在伤害后0和24小时在光学显微镜下以×100放大率捕获图像。

体内转移试验

为了研究circ-0046263是影响体内NPC转移，本发明构建了一种新的异种移植肿瘤模型并检测了自发淋巴结转移率。复苏鼻咽癌细胞5-8F和circ-0046263过表达的稳转株细胞SUNE-1-OE及SUNE-1-OENC，进行细胞培养并调整细胞状态至最佳，消化后制成细胞悬液。细胞悬液注射裸鼠后肢足垫，每只接种2×106细胞，接种20μl。整个操作过程在超净工作台中完成。5-8F细胞悬液注射裸鼠后肢足垫，待肿瘤生长至100mm3左右时，将动物按平均肿瘤体积分成2组，每组6只，并给予G1，G2组注射相应的敲低试剂。G3组：每只裸鼠后肢足垫接种2×106个SUNE-1-OENC细胞，接种量为20μl，共接种6只。G4组：每只裸鼠后肢足垫接种2×106个SUNE-1-OE细胞，接种量为20μl，共接种6只。体重称量：注射肿瘤细胞后即开始对动物体重进行监测，每周2次称量小鼠的体重并记录。肿瘤大小测量：每次给药前用游标卡尺盲法定人测量肿瘤最大径a和与其垂直的最大径b，根据公式v＝ab2/2计算出近似肿瘤体积。绘制肿瘤生长曲线。实验终点选择：当动物出现恶病质，或者造模时间达到60天结束实验。标本收集：颈椎脱臼法处死动物，完整剥离瘤块，天平称量肿瘤重量。观察转移情况，特别是腘窝淋巴结、腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结是否出现转移。拍摄典型照片。取原发肿瘤和转移灶，一半置于4％甲醛中，一半置于-80℃保存。所有动物实验方案均符合中国南京原生物科学动物委员会的规定。

RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR)

TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于提取总RNA。将RiboBio(中国广州)设计的circ-0046263背向引物和miR-133a-5p特异性RT引物或IGFBP3随机引物(Promega)用于逆转录qRT-PCR。qRT-PCR在ABI7500实时PCR仪(Applied Bio-systems)中进行。特异性背向引物5’-GGTTGTCCTCTTTAAGAAGCTGG-3’(SEQ ID NO.1)和5’-CCTTGAAGAAGCCGATGACAG-3’(SEQ ID NO.2)用于Hsa_circ_0046263，5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’和5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’用于β-肌动蛋白；2-ΔΔCt方法用于计算Hsa_circ_0046263表达的倍数变化。

蛋白样品提取

准备若干1.5ml的RNA-free的EP管，高速离心机预冷至4℃。配置裂解液，磷酸酶抑制剂：PMSF：RIPA＝1：1：100。弃培养基，用冰PBS清洗3遍。每小皿加入配置好的裂解液300μl(六孔板每孔加200μl)，使用细胞刮将细胞刮下(冰上操作)。将裂解液吸入到EP管中，置预冷高速离心机中13200rpm/min，离心30min。离心结束后，将上清转移至新的EP管中，做好标记，放置于-80℃冰箱中保存。

统计分析

数据采用SPSS23.0和Graphpad 7.0软件进行数据分析及绘图，所得数据结果以均数±标准差(mean±SD)表示。使用t检验比较两组之间差异，使用One-way ANOVA比较多组之间差异。相关性分析采用Person’s相关系数进行评价。假设检验水准按α＝0.05判定，当P<0.05认为有统计学意义，P值＜0.05(*)、P值＜0.01(**)P值＜0.001(***)。

实施例1

Circ-0046263在鼻咽癌组织和细胞中表达上调

与正常组织相比，circ-0046263在鼻咽癌组织中的表达水平上调(图1,P<0.05)，且circ-0046263表达与鼻咽癌临床病理分期呈正相关(图6)。与此类似，鼻咽癌细胞系中circ-0046263表达明显低于永生化鼻咽癌上皮细胞NP-69(图5)。Sanger测序进一步证实了头对尾的剪接(图2)。然而，头对尾剪接不仅可以是反式剪接，也可以是基因组重排的结果。为了区分这两种可能性，设计了circ-0046263mRNA的正向引物，序列如下：ForwardPrimer，5′-GCAGTTTTTGCAGGCAGCAG-3′，Reverse Primer，5′-CTGGTATTTGGAGAACACGTCAC-3′和circ-0046263的特异性反向引物，5’-GGTTGTCCTCTTTAAGAAGCTGG-3’(SEQ ID NO.1)和5’-CCTTGAAGAAGCCGATGACAG-3’(SEQ ID NO.2)。从5-8F细胞中提取cDNA和gDNA并进行核酸电泳检测。结果表明，仅在cDNA中检测到circ-0046263，gDNA中未检测到circ-0046263(图3)。进一步使用RNase R消化实验证实circ-0046263的稳定性。正如预期的，宿主基因P4HB的线性转录物被RNase R降解，而circ-0046263的环状转录物对RNase R处理具有抗性(图4)。这些数据证实了cir-c0046263的存在并且可能在鼻咽癌中发挥肿瘤促进功能。

Circ-0046263在体外对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移调控

为了探索circ-0046263的体外生物学功能，我们选择了表达水平较高的5-8F，CNE-2和表达水平较低的SUNE-1细胞株进行后续的功能实验。siRNA可以稳定地敲低大多数细胞中circ-0046263的表达，我们设计了3种si，序列如下：Si1：GTCCTCTTTAAGAAGCTGG。Si2：CTTTAAGAAGCTGGCAGAG。Si3：CTCTTTAAGAAGCTGGCAG，我们选择敲低效率最高的si3进行进一步研究(图7)。与对照组相比敲低circ-0046263的表达在体外显著抑制了鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移(图8-11)。但是，circ-0046263的过表达增加了SUNE-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力(图13-17)。进一步对与肿瘤转移高度相关上皮间充质转化(EMT)相关蛋白分析。蛋白质印迹分析表明，在下调表达的circ-0046263细胞中E-cadherin的表达水平显着增加，而N-cadherin、vimentin表达水平显着下降(图12)。而在稳定过表达circ-0046263的细胞中产生相反的作用(图18)。

实施例2 Circ-0046263在体内对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移调控

根据体外研究结果，进一步验证circ-0046263在体内对肿瘤生长的影响。我们建立了裸鼠异种移植肿瘤模型，将敲低试剂或过表达circ-0046263的细胞接种到雄性裸鼠的足底。结果表明，敲低circ-0046263显着抑制了肿瘤的生长，肿瘤体积较小，而过表达circ-0046263处理的小鼠则有较大的肿瘤重量和体积(图20-21)。注射4-6周后，处死小鼠，观察腹股沟淋巴结转移。与各自的对照相比，si-circ-0046263组中具有淋巴结转移的小鼠数量少，而circ-0046263过表达组中则增加(图19)。从肿瘤中提取总蛋白质，Western印迹显示EMT相关蛋白质表达水平的变化(图23)。此外，进一步采用IHC来评估EMT相关蛋白和IGFBP3在肿瘤中的表达。与相应对照组相比，si-circ-0046263组中E-cadherin蛋白显着增加，而circ-0046263过表达组中IGFBP3、N-cadherin和vimentin蛋白增加(图22)。这些数据证实，circ-0046263可能在促进体内鼻咽癌的增殖和转移中起关键作用。

在本发明中，我们检测circ-0046263在鼻咽癌组织和几种鼻咽癌细胞系中显着上调，这表明circ-0046263有可能是鼻咽癌中潜在的癌症相关基因。进一步我们在体内外对circ-0046263的功能进行了探究。发现circ-0046263的敲低抑制了鼻咽癌细胞在体外和体内的生长、侵袭、迁移和EMT进程移，表明circ-0046263在鼻咽癌中具有促进癌症发展作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 江苏省肿瘤医院

<120> 一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记

<141> 2020-06-05

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttgtcctc tttaagaagc tgg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttgaagaa gccgatgaca g 21

Claims (4)

1.检测Hsa_circ_0046263表达的试剂在制备鼻咽癌转移诊断试剂和/或预后评估试剂中的应用。

2.如权利要求1所述的检测Hsa_circ_0046263表达的试剂在制备鼻咽癌转移诊断试剂和/或预后评估试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包括与Hsa_circ_004626特异性结合的引物对、探针中的至少一种。

3.如权利要求2所述的检测Hsa_circ_0046263表达的试剂在制备鼻咽癌转移诊断试剂和/或预后评估试剂中的应用，其特征在于，所述引物对序列如下：5’-GGTTGTCCTCTTTAAGAAGCTGG-3’和5’-CCTTGAAGAAGCCGATGACAG-3’。

4. 抑制或干扰circ-0046263表达的试剂在制备治疗鼻咽癌或鼻咽癌转移的药物中应用；所述试剂选自：Si1：GTCCTCTTTAAGAAGCTGG；

Si2：CTTTAAGAAGCTGGCAGAG或

Si3：CTCTTTAAGAAGCTGGCAG。

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