CN112575080A - 一种长链非编码rna分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途 - Google Patents

一种长链非编码rna分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种长链非编码RNA分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途。具体地，本发明涉及长链非编码RNA(RP11‑138J23)分子的抑制剂用于制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，另一方面，本发明涉及一种或多种特异地检测长链非编码RNA(RP11‑138J23)表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞癌的试剂中的用途。

Description

一种长链非编码RNA分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途
技术领域
本发明涉及食管鳞癌诊断和/或治疗的技术领域。具体涉及长链非编码RNA(RP11-138J23)分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途。
背景技术
食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一。2018年中国癌症报告显示，食管癌发病率和死亡率在我国癌症中分居第六位和第四位。食管癌有两种病理类型：食管鳞癌与食管腺癌。在我国，90％以上的食管癌为食管鳞癌。尽管诊疗技术有所发展，但食管鳞癌发病隐匿，进展迅速等特点，导致其五年生存率仅为10-30％。因此，揭示食管癌发生发展的分子机制，寻找潜在诊断标志物与治疗靶点，研发新的治疗药物是我国肿瘤研究领域的重要工作。
长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，可在多层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达。近年来研究证实lncRNA与肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中异常表达，影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程，可作为肿瘤诊断和治疗新靶点。
发明内容
本发明第一方面涉及长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂在制备用于治疗和/或预防食管鳞癌的药物中的用途，其中所述长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-GUUUACCUAAUCAAGCCUGGGCAAUGGCGGGUGCCCCUCCUCCAGCCUCGCUGCCGCCUUGCAGUUUGAUCUCAGACUGCUGUGCUAGCAAUCAGCGAGACUCCGUGGGCGUAGGACCCUCUGAGCCAGGUGUGGGAUAUAAUCUCGUGGUGCGCCGUUUUUUAAGCCCGUCGGAAAAGCACAGUAUUCGGGUGGGAGUGACCCGAUUUUCCAGUUUCAAACAUCUUCAAGGCAGAAACGUGUUGUAUUUGCAUGCUGUUUAGAAGGCAGUGUACUGAAUAGUACCAGUUUUUUCAGAGACAAAUAUGGUGUACUUAUUUGAAAAGAAAGGAUGAUACACAUACAUAGCCAUCCAAAAAAUCCUGCAACCAGUAGCAAAUUAUAUUACACAUUGGACACAUCCUAAAUGAUGCAAGGUUGCUAAUUCUCUCUGUUGGUAAUAUCUUUUGAUGCUGUUGUGUCCAGAAUUGAUUCAUUCCUGUGGGUUCUUGGUCUCACUGACUUCAAGAAUAAAGCUGCGGACCCUAGUGUUUCCUGAGGCCUCACUAGAAGCAAAUGCUGGUGCCGUACUUCUUGUACAGCCUGCAAAACUGUGAGUGAAAUAAACCUCUCAUCUUUAU-3’(SEQ ID NO：1)。
所述长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的编码基因定位于5号染色体，含有620个核苷酸，其中长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的编码基因在基因组上的全长显示在第104079911～104080530bp序列，620bp。
在本文中，长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂是指能够降低、抑制、减弱或消除长链非编码RNA(RP11-138J23)分子在细胞内表达的分子。
在一个具体的实施方案中，所述长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂是核酸分子。
在一个更具体的实施方案中，所述长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂是与长链非编码RNA(RP11-138J23)序列中的一个或多个核苷酸互补的反义核酸分子，优选地，与长链非编码RNA(RP11-138J23)序列中的2或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个更多个、14个更多个、15个更多个、16个更多个、17个更多个、18个更多个核苷酸互补的反义核酸分子，优选是小干扰RNA(siRNA)。
术语“小干扰RNA(siRNA)”指为双链RNA剂的核酸分子。siRNA通过特异地指导宿主细胞中的酶而发挥作用，从而切割靶标RNA。凭借siRNA序列的特异性，以及其与RNA靶标的同源性，siRNA能够引起靶标RNA链的切割，从而失活靶标RNA分子。在哺乳动物中，siRNA是大约19-25个核苷酸的长度。
本发明另一方面涉及一种或多种特异地检测受试者样本中长链非编码RNA(RP11-138J23)分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断和/或预后食管鳞癌的试剂中的用途。
在一些实施方案中，受试者样本是癌组织样本。在一些实施方案中，受试者样本是食管鳞癌组织。在具体的实施方案中，食管鳞癌组织是通过活检的方式获得的，或者外科切除的食管鳞癌组织。在另一些具体的实施方案中，当用于食管鳞癌的诊断时，样本还包括癌旁组织。癌旁组织是指距离所述癌组织边缘2cm以外的食管鳞癌组织。当所述癌组织中长链非编码RNA(RP11-138J23)的表达水平显著高于所述癌旁组织中长链非编码RNA(RP11-138J23)的表达水平时，指示所述受试者患有所述食管鳞癌。
本领域技术人员结合公知常识，根据长链非编码RNA(RP11-138J23)的核苷酸序列可以自行制备特异性的探针或引物对。
在一个具体的实施方案中，所述引物为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物。
其中，用于长链非编码RNA(RP11-138J23)正义引物的序列如SEQ ID NO：2所示，序列为：
5’-AATCCTGCAACCAGTAGCAAA-3’(SEQ ID NO：2)；
长链非编码RNA(RP11-138J23)反义引物的序列如SEQ ID NO：3所示，序列为：
5’-AGAAGTACGGCACCAGCATT-3’(SEQ ID NO：3)。
在另一方面，本发明提供了一种诊断食管鳞癌的方法，包括步骤：
a)提供来自个体的癌组织和癌旁组织样品；
b)确定样品中长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的表达水平；和
c)比较癌组织和癌旁组织样品中长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的表达水平。
具体地，在本发明的一个实施方案中，检测待测样品的步骤包括：
1)收集癌组织和癌旁组织的标本；
2)转录组测序检测上述标本，筛选与在食管鳞癌中高表达的基因；
3)转录组数据处理：单因素分析所得有统计学差异的lncRNA；
4)转录组数据验证：利用根据筛选的与在食管鳞癌中高表达的基因的基因序列设计的引物qRT-PCR扩增；
5)PCR数据收集及处理：采用18sRNA作为内标，进行归一化处理。
在一个具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。
在另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防哺乳动物食管鳞癌的方法，包括向遭受食管鳞癌的患者给药治疗有效量的长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂。
如本文中所使用的“治疗有效量”指有效预防、缓解、减少或改善疾病症状或延长被治疗患者的生存的一种(或多种化合物)的最低浓度或量。治疗有效量还是治疗有利作用超过试剂的任何有毒或有害作用的量。更具体地，关于癌症治疗，治疗有效量指具有以下作用的量(1)减小肿瘤的尺寸(或优选消除)；(2)抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤转移；(3)在一定程度上抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤生长；和/或，(4)在一定程度上减轻(或优选消除)一种或多种与癌症有关的症状。
附图说明
图1显示了91例食管鳞癌癌组织与配对癌旁标本的转录组测序结果。从转录组测序结果可以看出，长链非编码RNA(RP11-138J23)在食管鳞癌组织中的表达相对于癌旁标本中的表达更高。
图2显示了长链非编码RNA(RP11-138J23)在95例食管鳞癌组织及配对癌旁组织中的表达水平，其中，横坐标代表食管鳞癌患者个体，纵坐标代表RP11-138J23在每个食管鳞癌患者癌组织中的表达相较于其在配对癌旁组织中的表达比值，可以发现长链非编码RNA(RP11-138J23)在食管鳞癌组织中的表达明显高于其在正常癌旁组织中的表达。
图3显示了长链非编码RNA(RP11-138J23)在两株永生化的食管上皮细胞系及八株食管鳞癌细胞系中的表达水平，可以发现长链非编码RNA(RP11-138J23)在食管鳞癌细胞系中的表达明显高于其在永生化食管上皮细胞中的表达。
图4显示了长链非编码RNA(RP11-138J23)的低表达体外抑制细胞的侵袭和迁移能力。图4的A：向KYSE30细胞系分别加入长链非编码RNA(RP11-138J23)的小干扰RNA(si长链非编码RNA(si RP11-138J23))、小干扰RNA对照序列(si lncRNA对照，阴性对照，NC)后，抑制细胞的体外迁移和侵袭能力的细胞染色示意图；图4的B：向YES2细胞系分别加入NC对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，抑制细胞的体外迁移和侵袭能力的细胞染色示意图；图4的C：向KYSE30细胞系分别加入si lncRNA对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，抑制细胞的体外迁移和侵袭能力的柱状示意图；图4的D:向YES2细胞系分别加入silncRNA对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，抑制细胞的体外迁移和侵袭能力的柱状示意图。
图5显示了用长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂敲降长链非编码RNA(RP11-138J23)后体外抑制细胞的增殖能力。图5分别为向KYSE30细胞系分别加入silncRNA对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，抑制细胞的体外增殖能力的示意图(左侧)；和向YES2细胞系分别加入si lncRNA对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，抑制细胞的体外增殖能力的示意图(右侧)。
图6显示了用长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂敲降长链非编码RNA(RP11-138J23)后体外抑制细胞的克隆形成能力。图6的A和B：向KYSE30、YES2细胞系分别加入si lncRNA对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，体外抑制细胞的克隆形成能力的示意图；图6的C和D：向KYSE30(图6的C)和YES2(图6的D)细胞系分别加入si lncRNA对照，si长链非编码RNA(si RP11-138J23)后，体外抑制细胞的克隆形成能力的柱状示意图。
具体实施方式
本发明人运用转录组测序及qRT-PCR技术对食管鳞癌及配对的癌旁组织进行了研究。本发明人出人意料的发现，长链非编码RNA(RP11-138J23)在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于配对癌旁组织中的表达(参见图1)。在另外独立的患者组织标本中再次予以检测，得到了一致的结果(参见图2)。
在本发明的一个实施方案中，使用能够特异性地检测长链非编码RNA(RP11-138J23)分子表达水平的引物和/或探针，可快速地诊断哺乳动物包括人的食管鳞癌，从而对食管鳞癌治疗模式的改变具有划时代意义。
在本发明的另一个具体实施方案中描述了本发明涉及的检测方法，其主要包括标本收集并提取RNA、转录组测序、qRT-PCR、生长曲线、克隆形成及transwell等。转录组测序主要用于筛选在食管鳞癌组织中高表达的基因，筛选出的基因通过qRT-PCR进行结果验证。鉴于发明人已经找到在食管鳞癌中高表达的基因，在今后临床应用中，仅运用提取标本中的RNA及qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。
在本发明的另一个具体实施方案中还描述了检测待测样品中长链非编码RNA(RP11-138J23)表达的方法，其包括如下步骤：
1)收集食管鳞癌组织和配对的癌旁组织标本，
2)转录组测序检测上述标本，筛选在食管鳞癌组织中高表达的基因，
3)转录组测序数据处理：单因素分析所得有统计学差异的lncRNA，
4)转录组测序数据验证：利用根据筛选的在食管鳞癌组织中高表达的基因的基因序列设计的引物qRT-PCR扩增，
5)PCR数据收集及处理：采用18s RNA作为内标，进行归一化处理。
在本发明的另一个具体实施方案中，本发明人研究了长链非编码RNA(RP11-138J23)对食管鳞癌细胞系体外侵袭迁移和增殖能力的影响。结果表明用长链非编码RNA(RP11-138J23)的抑制剂处理食管鳞癌细胞可抑制食管鳞癌细胞的体外迁移、侵袭和生长能力。因此，本发明所述的长链非编码RNA(RP11-138J23)的抑制剂可用于治疗患有食管鳞癌的患者。
本发明将利用下述实施例进行进一步的描述，但本发明并不局限于这些实施例。
在下述实施例中，若非特别说明，所用的试剂均为分析纯度，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另外指明，本发明实施例中涉及的RT-PCR、PCR等操作均按照“分子克隆实验指南(第三版)”(科学出版社，2002[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)及厂商说明书进行，细胞培养、细胞传代、细胞复苏及冻存、细胞转染及免疫荧光测定等操作均按照“动物细胞培养--基本技术指南(第四版)”(科学出版社，2000，[英]弗雷谢尼(R.I.)著，章静波等译)及厂商说明书进行操作。
实施例1：检测长链非编码RNA(RP11-138J23)基因在食管鳞癌及癌旁组织中的表达
1、Trizol法提取组织总RNA
(1)样本来源
食管鳞癌及癌旁组织样本均来源于河北医科大学第四医院，新鲜组织保存在液氮，以便获得充足完整的基因，有完备的医学书写记录和随访记录。将其分成两组进行转录组测序，筛选在食管鳞癌中高表达的基因。选择另外独立的食管鳞癌组织和配对的癌旁组织，验证转录组测序结果。
(2)样本处理
在铝箔中将1cm2大小左右的组织样本敲碎，移至已加入钢珠的Eppendorf管中，使用研磨仪(30 1/s，8min)进行研磨，此步操作应尽可能在低温液氮环境下操作，细菌、细胞样本不用研磨；
(3)在研磨后的Eppendorf管中加入1ml Trizol(Invitrogen，15596-026)，振荡混匀；
(4)将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；
(5)离心：4℃，12000rpm，15min；
(6)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；
(7)离心：4℃，12000rpm，15min；
(8)倒掉上清液，加入1ml 75％乙醇，振荡混匀；
(9)离心：4℃，7500rpm，5min；
(10)倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；
(11)加入40～60μl DEPC H2O，65℃5min助溶；
(12)-20℃冷冻保存。
2、总RNA质量检测
(1)NanoDrop(Gene Company Limited)测定总RNA浓度(2μl总RNA上样)，
(2)1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量
Figure BDA0002219561390000061
上样总体积约为6～8μl。
甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml 1×TBE缓冲液中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。
电泳条件：120～130V，15～20min。
3、RNA逆转录：(采用的试剂盒，公司，货号)
(1)逆转录反应体系
Figure BDA0002219561390000062
Figure BDA0002219561390000071
(2)逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃冷藏待用。
4、lncRNA实时PCR反应
(1)lncRNA实时PCR反应体系(SYBR Premix Ex TaqTMII,TaKaRa,RR820A)
模版(cDNA) 上述逆转录反应体系20μl中的1μl
MgCl2 1.6μl
引物lncRNA正义引物 0.6μl(10μM)
对于长链非编码RNA(RP11-138J23):SEQ ID NO：2
反义引物 0.6μl(10μM)
对于长链非编码RNA(RP11-138J23):SEQ ID NO：3
DNA Master SYBR Green I MIX 2μl
加无核酸酶H2O 至20μl
(2)lncRNA实时PCR程序(CFX96、Biorad)
Figure BDA0002219561390000072
共40个循环，
熔解曲线75～95℃。
(3)lncRNA实时PCR产物1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测
lncRNA实时PCR产物 2～4μl
2×加样缓冲液 4μl
总体积约为6～8μl。
非变性琼脂糖凝胶：80ml 1×TBE缓冲液中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μl EB(原液)混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。
电泳条件：100V，25～30min。
5、数据收集及处理：
采用18rRNA作为内标，进行归一化处理。
结果参见图1至图2：长链非编码RNA(RP11-138J23)在食管鳞癌组织中相较于癌旁正常组织高表达。
实施例2：使用长链非编码RNA(RP11-138J23)分子的抑制剂处理食管鳞癌细胞抑制其侵袭迁移和增殖的生物学作用研究
1、实验步骤
(1)细胞培养
人食管鳞癌细胞系：KYSE30、YES2、KYSE140、KYSE150、KYSE410、KYSE180、KYSE510、Colo680(京都大学Shimada Y教授馈赠)，RPMI1640培养基(Gibco)，含10％胎牛血清(FBS，Gibco)，37℃、5％CO2培养。
人正常食管上皮细胞系：NE2、NE3，dKSFM培养基与EpiLife培养基1:1混合培养基(Gibco)混合，37℃、5％CO2培养。
(2)细胞瞬时转染
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen、货号11668019)试剂，进行siRNA和质粒转染。
si lncRNA瞬时转染：
si长链非编码RNA(si RP11-138J23)的序列
5'-GCAACCAGUAGCAAAUUAU-3'(SEQ ID NO：4)，在Invitrogen公司合成。
(I)si lncRNA配制：在20nmol的双链si lncRNA中加入1000μl 1×通用缓冲液(DEPC水，用DEPC处理去离子水后高压灭菌获得)，得到浓度为20μM的si lncRNA母液，置-20℃保存。
(II)取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于60mm培养皿中(不加抗生素)，转染时细胞密度达到30％左右。
(III)准备以下复合体：A液：将适当浓度的si lncRNA稀释于500μl无血清培养基中，轻轻混匀；B液：取10μl Lipofectamine 2000(用前轻柔混匀)稀释于500μl无血清培养基中，混匀。室温孵育5min。
(IV)将稀释的脂质体与稀释的si lncRNA混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟(复合体于室温6小时内会保持稳定)。
(V)将混合后的复合物1000μl加入细胞培养皿内，加无血清培养基至5ml，轻轻混匀。6小时后弃去原培养基，换含10％血清的培养基。
(3)总RNA提取–Trizol法提取细胞总RNA
(I)取生长状态良好的细胞，待细胞密度达到80％-90％时，倾出瓶中的培养液，用PBS洗2次；
(II)加入1mL Trizol，轻轻晃动，置于冰上15分钟；
(III)将混匀后溶液移至经DEPC处理的Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；
(IV)离心：4℃，12000rpm，15min；
(V)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；
(VI)离心：4℃，12000rpm，15min；
(VII)倒掉上清液，加入1ml 75％乙醇，振荡混匀；
(VIII)离心：4℃，7500rpm，5min；
(IX)倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；
(X)加入40～60μl DEPC H2O，65℃5min助溶；
(XI)-20℃冷冻保存。
(4)总RNA质量检测
(I)NanoDrop测定总RNA浓度(2μl总RNA上样)，
(II)1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，
Figure BDA0002219561390000091
总体积约为6～8μl
甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml 1×TBE缓冲液中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。
电泳条件：120～130V，15～20min。
(5)lncRNA逆转录：
逆转录反应体系参见表1。
表1：逆转录反应体系
总RNA 100ng
lncRNA反转录引物 1μl(1μM)
DEPC H<sub>2</sub>O至12.3μl
65℃变性5min，冰浴5min
5×1<sup>st</sup>缓冲液 4μl
0.1M DTT 2μl
dNTPs 0.5μl(各10mM)
RNase抑制剂 0.2μl(40U/μl)
M-MLV 1μl(200U/μl)
共20μl体系
逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃。
(6)lncRNA实时PCR反应
lncRNA实时PCR反应体系参见表2，lncRNA实时PCR程序参见表3.
表2：lncRNA实时PCR反应体系
Figure BDA0002219561390000101
表3：lncRNA实时PCR程序
酶激活 95℃，10min
扩增反应 95℃，15s 变性
60℃，30s 退火、延伸
74℃，3s 荧光检测
共40个循环
溶解曲线 75～95℃
lncRNA实时PCR产物1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测。lncRNA实时PCR产物2～4μl。
2×加样缓冲液4μl
总体积约为6～8μl
非变性琼脂糖凝胶：80ml 1×TBE缓冲液中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μl EB(原液)混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。
电泳条件：100V，25～30min。
(7)细胞侵袭能力分析
原理是根据肿瘤细胞侵袭时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞接触基质面后会通过一系列机制向某一个方向运动。
a)对于KYSE30和YES2细胞，分别稀释基质胶(Matrigel)(BD Biosciences、356234)至500μg/mL，将100μL加在8μm孔聚碳酯膜的transwell小室上室，37℃5％CO2培养箱中孵育1h，吸去水相备用，
b)取转染后48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，
c)分别将200μL含有15×104或者10×104个细胞的KYSE30或者YES2细胞悬液种植于每个transwell小室上室，向下室中加入800μL含10％血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养12小时，
d)取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，
e)以70％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，
f)以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗，
g)显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。
(8)肿瘤细胞迁移分析
原理是根据肿瘤细胞迁移时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞会通过一系列机制向某一个方向运动。
a)取转染后48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，
b)分别将200μL含有15×104或者10×104个细胞的KYSE30或者YES2细胞悬液种植于每个transwell小室上室，向下室中加入800μL含10％血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养10小时，
c)取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，
d)以70％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，
e)以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗，
f)显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。
(9)细胞增殖能力分析
实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time Cellular Analysis)原理是将微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物学信息，包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等。
a)转染后24小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，
b)以每孔1000个细胞接种于xCELLigence RTCA MP E-plate 96孔板(Roche、5232368001)，以4h为细胞贴壁时间，对得到的生长曲线用RTCA Software 1.2.1进行细胞指数标准化分析细胞的增殖情况。
(10)细胞克隆形成能力分析
转染24h后收集各组细胞，于每皿1000个细胞接种于35mm培养皿中，37℃，5％CO2孵箱中培养14天，每隔5～6天换液一次，形成肉眼可见的细胞集落。1×PBS漂洗3次，甲醇固定10min，用0.5％结晶紫染色20min，冲洗干燥，照相并统计克隆数。
(11)统计学分析
实验数据采用SPSS10.0软件包(SPSS,Chicago,IL)进行双侧Student’s t检验，p<0.05为差异具有显著性。
2、结果
(1)用化学合成成熟si lncRNA转染食管鳞癌细胞系以低表达目的lncRNA
采用lipofectamine 2000，单独转染时以终浓度为10μM的si长链非编码RNA(siRP11-138J23)或lncRNA-NC对KYSE30或者YES2细胞进行瞬时转染；转染后48小时收集细胞。通过实时PCR检测长链非编码RNA(RP11-138J23)表达水平。转染之后长链非编码RNA(RP11-138J23)的表达在KYSE30、YES2细胞系中降低为对照的42.3％±9.0％、25.6％±6.4％，结果表明转染之后长链非编码RNA(RP11-138J23)在KYSE30和YES2细胞系中表达水平显著降低，表明转染程序及体系适合进行lncRNA低表达的相应研究。
(2)长链非编码RNA(RP11-138J23)低表达对KYSE30和YES2细胞系的体外迁移能力的影响
采用Transwell迁移实验进行肿瘤细胞体外迁移能力的研究。转染后48小时，将KYSE30或者YES2细胞消化，用无血清的RPMI1640重悬，分别以15×104和10×104的数量种植于Transwell小室上室，将800μl含有10％血清的RPMI1640加入小室下室，37℃培养10小时，细胞进入8μm孔聚碳酯膜的下层。0.5％结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞(图4的A和B)，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算转染si长链非编码RNA(RP11-138J23)后的KYSE30、YES2细胞穿过膜的细胞数分别为对照的22.3％±3.4％、65.0％±16.1％。结果表明，与对照细胞相比，长链非编码RNA(RP11-138J23)低表达的KYSE30和YES2细胞体外迁移能力明显减弱(图4的C和D)，经统计学分析，差异具有显著性。
(3)长链非编码RNA(RP11-138J23)的低表达对KYSE30和YES2细胞系的体外侵袭能力的影响
采用Transwell侵袭实验进行肿瘤细胞体外侵袭能力的研究。转染后48小时，将KYSE30或者YES2细胞消化，用无血清的RPMI1640重悬，分别以15×104和10×104的数量种植于含100μL基质胶的Transwell小室上室，将800μl含有10％血清的RPMI1640加入小室下室，37℃培养12小时，细胞进入8μm孔聚碳酯膜的下层。0.5％结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞(图4的A和B)，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算转染si长链非编码RNA(RP11-138J23)后的KYSE30、YES2细胞穿过膜的细胞数分别为对照的8.0％±0.4％，66.0％±6.9％。结果表明，与对照细胞相比，长链非编码RNA(RP11-138J23)低表达的KYSE30和YES2细胞体外侵袭能力明显减弱(图4的C和D)，经统计学分析，差异具有显著性。
(4)长链非编码RNA(RP11-138J23)的低表达对KYSE30和YES2细胞系增殖能力的影响
采用xCELLigence RTCA MP系统进行肿瘤细胞增殖能力的研究。转染后24小时，将KYSE30或者YES2细胞消化，用10％血清的RPMI1640重悬，以每孔1000个细胞接种于xCELLigence RTCA MP E-plate 96孔板，以4h为细胞贴壁时间，对得到的生长曲线用RTCASoftware 1.2.1进行细胞指数标准化分析细胞的增殖情况。结果表明，与对照细胞相比，长链非编码RNA(RP11-138J23)低表达的KYSE30和YES2细胞体外增殖能力明显减弱(图5)，经统计学分析，差异具有显著性。
采用种植平板克隆实验进行肿瘤细胞克隆形成能力的研究。转染后24h小时，将KYSE30或者YES2细胞消化，用10％血清的RPMI1640重悬，于每皿1000个细胞接种于35mm培养皿中，37℃，5％CO2孵箱中培养14天，每隔5～6天换液一次，形成肉眼可见的细胞集落。1×PBS漂洗3次，甲醇固定10min，用0.5％结晶紫染色20min，冲洗干燥，照相并统计克隆数(图6的A和B)。经过计算转染si长链非编码RNA(RP11-138J23)后的KYSE30、YES2细胞克隆数分别为对照的60.0％±16.1％，42.0％±6.8％。结果表明，与对照细胞相比，长链非编码RNA(RP11-138J23)低表达的KYSE30和YES2细胞体外克隆形成能力明显减弱(图6的C和D)，经统计学分析，差异具有显著性。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> 一种长链非编码RNA分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途
<130> 390210CG
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 620
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
guuuaccuaa ucaagccugg gcaauggcgg gugccccucc uccagccucg cugccgccuu 60
gcaguuugau cucagacugc ugugcuagca aucagcgaga cuccgugggc guaggacccu 120
cugagccagg ugugggauau aaucucgugg ugcgccguuu uuuaagcccg ucggaaaagc 180
acaguauucg ggugggagug acccgauuuu ccaguuucaa acaucuucaa ggcagaaacg 240
uguuguauuu gcaugcuguu uagaaggcag uguacugaau aguaccaguu uuuucagaga 300
caaauauggu guacuuauuu gaaaagaaag gaugauacac auacauagcc auccaaaaaa 360
uccugcaacc aguagcaaau uauauuacac auuggacaca uccuaaauga ugcaagguug 420
cuaauucucu cuguugguaa uaucuuuuga ugcuguugug uccagaauug auucauuccu 480
guggguucuu ggucucacug acuucaagaa uaaagcugcg gacccuagug uuuccugagg 540
ccucacuaga agcaaaugcu ggugccguac uucuuguaca gccugcaaaa cugugaguga 600
aauaaaccuc ucaucuuuau 620
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 正义引物
<400> 2
aatcctgcaa ccagtagcaa a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> 反义引物
<400> 3
agaagtacgg caccagcatt 20
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(19)
<223> siRNA
<400> 4
gcaaccagua gcaaauuau 19

Claims (10)

1.如SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子的抑制剂在制备用于治疗和/或预防有需要的受试者中食管鳞癌的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述如SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子的抑制剂是降低、抑制、减弱或消除SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子在细胞内表达的分子，优选为核酸分子。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述如SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子的抑制剂由与SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子中的一个或多个核苷酸互补的核苷酸组成，优选是siRNA，更优选地，为SEQ ID NO：4所示的siRNA。
4.一种或多种特异地检测受试者样本中SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子的表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞癌的试剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述受试者样本是癌组织样本。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选是人。
7.一种用于治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的如SEQ IDNO：1所示的长链非编码RNA分子的抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂，优选地，所述抑制剂由与SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子中一个或多个核苷酸互补的核苷酸组成，优选是siRNA，更优选地，为SEQ ID NO：4所示的siRNA。
8.一种用于诊断食管鳞癌的试剂盒，其包含特异地检测受试者样本中SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子表达水平的引物和/或探针，优选地，其包含如SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示的引物。
9.一种分离的核酸分子，其由与SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA分子中一个或多个核苷酸互补的核苷酸组成。
10.一种siRNA分子，其如SEQ ID NO：4所示。
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