CN114717242A - Loc107984813在诊断、预测预后、治疗癌症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，具体涉及LOC107984813在诊断、预测预后、治疗癌症中的应用。所述LOC107984813编码的短肽(CTCF‑AS)在癌症患者的样本中高表达，且CTCF‑AS高表达的患者相对于低表达的患者的预后更差。具体地，所述癌症包括食管癌和乳腺癌。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及LOC107984813在诊断、预测预后、治疗癌症中的应用。
背景技术
关于ncRNA的功能研究正处于学术领域的快速增长期，绝大部分ncRNA转录本的功能还未破解。以ncRNA中的主要成分lncRNA为例，目前大部分对于lncRNA的定义还是基于对mRNA编码框的特征性结构的认识基础上的。如与mRNA相比，lncRNA的转录本长度区间大，外显子数目、表达水平和序列保守性通常较低，而组织特异性高等，但这些特征差异都是相对的。实际上，目前仅是用已知的蛋白编码mRNA的一些特征来定义ncRNA，主要标准有开放阅读框完整性、长度、质量，已知蛋白编码序列相似性等。实际上，2015年2月发表在《Cell》杂志上的一篇文章已经证明lncRNA可以以编码功能蛋白的方式进行精确的时空特异性生物进程调控。
随着ncRNA不编码论的退场，我们可以合理地推断，在当前所注释的编码与ncRNA之间存在着一段相当宽的模糊区域，处于这段区域中的所谓ncRNA有一部分可能是可以编码具有重要功能的蛋白分子的。但是，目前生物信息学在ncRNA分析和预测方面尚不成熟，缺少可靠的生物学模型和工具把“真正的ncRNA”(随着科学的进展，这个概念可能也是相对的)和由于认识缺陷而注释为ncRNA的潜在编码RNA区别开来鉴别并认识这些具有潜在编码功能的ncRNA不但是ncRNA科学领域亟需解决的理论问题，也是个体ncRNA分子功能研究中必需考虑到的问题(即ncRNA分子对其他分子的调节功能研究中必须排除功能性小蛋白产物的存在)。在这一思路指导下的研究成果至少会将目前所注释的相当一部分ncRNA重新注释为双功能性RNA(bifunctional RNAs)(即RNA既有编码功能也有非编码功能)。遗憾的是，除了单基因的分子生物学验证，目前尚无法通过现有理论下设计的生物信息学方法准确预测哪些是真正的“ncRNA”，哪些是“具有编码功能的ncRNA”(虽然生物信息学能够找到序列中的潜在ORF，但不能确认这些ORF是否编码，而且也会漏掉含有已知ORF编码系统以外的潜在编码系统的RNA。
因此，如果建立一个能够发现与鉴别ncRNA是否具有潜在编码功能的实验方法与重注释模型，将十分有助于澄清当前ncRNA研究领域的底层科学问题，为后续ncRNA的编码与非编码功能研究提供更多的线索与思路。
核糖体展示(Ribosome profiling)技术的原理是用环己亚胺处理细胞使核糖体较牢固地结合在对应mRNA上，接下来对细胞进行核酸酶处理，没有被核糖体保护的mRNA片段将被水解，而被保护的部分留下来，经从核糖体内释放后进行深度测序，从而获得哪些mRNA的哪些位置容易被核糖体结合的信息。2011年Ingolia等采用该技术在小鼠胚胎干细胞的研究中发现核糖体会结合已知的lncRNA，研究者推测这些lncRNA可能具有编码能力。但是此后Guttman等分析了前者的数据，认为这些lncRNA主要还是作为RNA调控因子起作用。此外，哈佛大学Saghatelian博士的研究团队借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)技术联合RNA-seq方法在人慢性髓性白血病K562细胞中检测短开放读码框编码的多肽(short ORF encoded peptide，SEPs)。他们将K562细胞总蛋白经16％的PAGE胶电泳后进行考马斯亮蓝染色，切取2-5kD、5-10kD、10-15kD三个区域的条带，质谱分析结果表明他们获得了90个SEPs(其中86个是新发现的)。这些SEPs来自于ncRNA和多顺反子mRNAs(multi-cistronic mRNAs)。新发现的SEPs以非AUG起始密码子起始翻译，并且只占lncRNAs的很小比例。2014年该研究组又在乳腺癌MDB-MA-231细胞和乳腺上皮细胞MCF10A细胞中发现了14个SEPs，其中2个SEPs是在乳腺癌细胞中特异表达的，这说明人类蛋白质组远远比先前预计的要复杂的多。
核糖体展示技术虽然为编码性LncRNA的筛选提供了可能，但是lncRNA主要还是作为RNA调控因子起作用，单纯具有核糖体占位这一特点不足以将转录本中的编码RNA与ncRNA区分开来。而且，核糖体展示技术也无法提供RNA翻译起、止点的详细信息，无法对RNA中以部分重叠的多顺反子形式存在的编码框进行准确识别。利用质谱分析联合RNA-seq检测ncRNA中具有潜在编码功能RNA这一策略的局限性在于每次质谱检测出来的结果差异比较大；检出的蛋白数目较低，只能针对检测出的蛋白进行验证，无法在组学层面重注释ncRNA。由此可以看出，在回答关于ncRNA是否编码这个问题的实验设计上需要有较好的研究分子作为工具并联合适当的分析技术，而与翻译起点识别和翻译起始核糖体组装密切相关的翻译起始因子复合体(translation initiation complex)所在的位置可能是回答RNA是否能够翻译以及其翻译效率的关键信息，并且还能提供翻译起始位点以及交叉重叠多顺反子编码形式的特征。
发明内容
为探究ncRNA的功能，本发明使用癌细胞进行实验，发现了LOC107984813的编码性，并提供了其在诊断、预测预后、治疗癌症中的应用。
本发明所述LOC107984813中107984813即Gene ID，本领域技术人员皆可以根据Gene ID获得该lncRNA的详细信息。所述“LOC107984813”也可称为“CTCF-DT(CTCFdivergent transcript)”，本发明中也称为“CTCF-AS”。
本发明所述“癌症”包括食管癌、乳腺癌、宫颈癌、精原细胞瘤、睾丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直肠癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱移行上皮癌、白血病、脑瘤、胃癌、腹膜癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、雌性生殖道癌、原位癌、神经纤维瘤、骨癌、皮肤癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤。
更具体地，如本发明实施例所验证的所述癌症包括食管癌和乳腺癌。本发明在食管癌细胞系KYSE410、KYSE450、KYSE30、KYSE150、KYSE70和乳腺癌细胞系MDA-MB-231中验证了LOC107984813诊断、预测预后或治疗癌症中的作用。
本发明第一方面提供了LOC107984813在启动基因表达中的应用。所述“在启动基因表达中的应用”还可理解为作为启动子的应用。
优选地，所述LOC107984813的序列如SEQ ID NO.:1所示。
更优选地，本发明提供了LOC107984813的5’UTR和CDS区域顺序连接后在启动基因表达中的应用。
所述LOC107984813的5’UTR和CDS区域顺序连接后形成的核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
同时，本发明提供了一种具有编码功能的多核苷酸，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
另一方面，本发明提供了检测LOC107984813表达量的试剂在制备诊断癌症、预测癌症患者的预后的产品中的应用。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定lncRNA的表达量。本领域技术人员应当理解，测定lncRNA表达的手段不是本发明的重要方面。
优选地，所述检测LOC107984813表达量的试剂包括LOC107984813的特异性抗体、引物、探针、芯片中的一种或多种。
优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
优选地，所述芯片包括组织芯片或cDNA芯片；更具体地，所述组织芯片是1)食管癌患者的组织芯片(180点来自103个食管癌患者)，其中包括77个患者配对的食管癌组织和正常食管上皮组织；2)乳腺癌患者组织芯片(160点来自80个乳腺癌患者)，其中包括80个正常乳腺上皮组织和80个侵袭癌组织；3)多癌种芯片，共120点，包括人类12种肿瘤组织及其配对的正常组织。所述cDNA芯片是食管癌患者的cDNA芯片，共95个点，其中包括28个食管癌患者配对的食管癌组织的cDNA及正常食管上皮组织的cDNA。
优选地，本发明所述LOC107984813表达量是指针对来自受试者样本进行检测得到的LOC107984813表达量。
本文中使用的术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在涉及人受试者时在本文中可互换地使用。
优选地，所述受试者是人。
优选地，所述受试者是癌症患者或疑似癌症患者。
如本文所用，术语“样本”是指从如本文所述的目的来源获得或衍生的生物样本。优选地，所述样本是组织、细胞、血液或其他来自于受试者的样本。更优选地，所述样品是细胞和/或组织。
优选地，所述癌症是食管癌、乳腺癌。
本发明通过研究发现，与正常食管上皮细胞Het-1A相比，LINC01088在食管癌细胞系KYSE410、KYSE450、KYSE30、KYSE150、KYSE70中呈高表达；且在患者组织中检测到了一致的结果。
本发明通过研究发现，组织水平或RNA水平(cDNA水平)高表达LOC107984813的癌症患者相对于低表达者预后更差。
本发明所述“预后”是指对病人病程发展情况，和它是否有一个恢复机会的预测。所述预后的指标包括总体存活率(Overall survival rate，Overall survival，OS)、客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)、疾病进展时间(time to progress，TTP)、无病生存期(Disease-free survival，DFS)、治疗失败时间(time to treatment failure，TTF)、应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)。
优选地，本发明具体验证了LOC107984813表达量在区分总体存活率高低的者患者中的效果。
另一方面，本发明提供了LOC107984813的抑制剂在制备治疗癌症的产品中的应用。
优选地，所述治疗还可以称为抑制癌细胞增殖、侵袭迁移、克隆形成。
具体地，所述LOC107984813的抑制剂即降低LOC107984813表达量的物质。
优选地，所述LOC107984813的抑制剂包括针对LOC107984813或其表达产物的shRNA、反义寡核苷酸(ASO)、抗体、拮抗剂、阻断剂、siRNA、miRNA。
更具体地，本发明通过使用反义寡核苷酸(ASO)或者shRNA敲低LOC107984813的表达量抑制食管癌细胞的增殖，侵袭迁移，克隆形成，划痕愈合及细胞黏附等恶性表型。
本发明所述反义寡核酸技术是应用反义寡核苷酸类药物通过Waston-Crick碱基配对与细胞内核酸(DNA或RNA)特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术。
本发明所述shRNA和siRNA都属于RNAi技术，是将与mRNA序列对应的正义和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，可以使RNA降解和基因沉默，这种转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)被称为RNAi。
优选地，所述LOC107984813特异性反义寡核苷酸(ASO，所合成的ASO序列是经过特殊化学修饰的单链RNA&DNA杂合体)的序列如SEQ ID NO.:4或SEQ ID NO.:5所示。
优选地，所述LOC107984813特异性shRNA的编码DNA序列如SEQ ID NO.:6(shRNA1)或SEQ ID NO.:7(shRNA2)所示。
优选地，所述癌症是食管癌、乳腺癌。
另一方面，本发明提供了治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物中包括LOC107984813的抑制剂。
具体地，所述LOC107984813的抑制剂即降低LOC107984813表达量的物质。
优选地，所述LOC107984813的抑制剂包括针对LOC107984813或其表达产物的shRNA、反义寡核苷酸(ASO)、抗体、拮抗剂、阻断剂、siRNA、miRNA。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
优选地，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于已经由美国食品和药品管理局或中国食品药品监督管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。所述剂型包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
另一方面，本发明提供了诊断、预测癌症预后的方法，所述方法包括检测受试者LOC107984813的表达量。
在诊断癌症时，LOC107984813的表达量高则诊断为患病；在预测患者预后时，LOC107984813的表达量高则预后较差。
另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者施用LOC107984813的抑制剂、或前述药物组合物。
附图说明
图1是本发明的实验流程图。
图2是CLIP-seq实验结果：eIF3b和IgG在LncRNA上的结合峰。
图3是CLIP-seq实验结果：A和B是eIF3b在基因组不同区域上的结合峰的百分比；C和D是IgG在基因组不同区域上的结合峰的百分比
图4是CLIP-seq实验结果：eIF3b在mRNA的转录起始位点，转录终止位点，翻译起始密码子及翻译终止密码子附近的结合强度。
图5是CLIP-seq实验结果：eIF3b在LncRNA的转录起始位点及转录终止位点附近的结合强度。
图6是CLIP-seq实验结果：A是eIF3b在LncRNA上结合的特征性motif，B是IgG在LncRNA上结合的特征性motif。
图7是验证LOC107984813编码性的分子实验。
图8是LOC107984813编码的多肽的抗原表位分析
图9是利用特异性抗体对不同细胞系中LOC107984813的表达量进行检测的结果图。
图10是利用特异性抗体对不同细胞系中LOC107984813在细胞核/细胞质的表达量进行检测的结果图，A是western blot的检测结果，B是显微镜下的图像，C是荧光显微镜下的图像。
图11是使用LOC107984813抑制剂后检测细胞特性的结果图，A是细胞增殖情况，B是细胞划痕愈合情况，C是细胞增殖情况。
图12是外源表达LOC107984813编码的多肽后，肿瘤细胞的划痕愈合情况。
图13是使用不同ASO后，对细胞克隆形成进行测量的统计结果图和实物图。
图14是使用不同shRNA后，进行transwell实验并对细胞数量进行统计的结果图。
图15是使用不同shRNA后，对细胞体内成瘤后肿瘤体积进行测量的结果图。
图16是肿瘤细胞经尾静脉注射后的肺转移情况。
图17是LOC107984813在食管癌患者组织中的表达情况。A是TCGA数据中配对的食管癌组织及正常食管上皮组织中的LOC107984813的表达量；B是TCGA数据库中LOC107984813的RNA表达水平与食管癌患者生存的关系；C是TCGA数据库中LOC107984813在泛癌种中表达水平的分析；D是LOC107984813编码的多肽在食管癌患者组织芯片中的表达水平。
图18是LOC107984813在食管癌患者组织中的表达情况。A是LOC107984813编码的多肽在食管癌患者组织及正常食管组织中的表达；B是LOC107984813的cDNA在食管癌患者的cDNA芯片中的表达水平；C是LOC107984813的cDNA表打水平与食管癌患者生存的关系
图19是LOC107984813在不同癌症中的检测结果图。
图20是LOC107984813在三阴性乳腺癌患者组织中的表达情况。A是LOC107984813编码的多肽的免疫组化图片；B是免疫组化评分的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、LOC107984813的编码性及其在食管癌中的应用
1、实验材料
eIF3b抗体捕获正在启动翻译的RNA以及iTRAQ质谱等技术具有普适性，进一步选取了食管癌细胞(KYSE410)进行实验。
2、实验方法
CLIP-seq(cross-linking immunoprecipitation-high-throughputsequencing)技术是将样品进行紫外交联后，通过与RNA相互作用的蛋白的抗体捕获与蛋白相互作用的RNA(理论上包括可能存在与该蛋白相互作用的各种RNA)，经RNA酶处理后，只有受复合体中蛋白分子保护的RNA片段不会被降解并保留下来。以放射性磷酸标记RNA片段的末端；该蛋白与RNA片段复合体经变性SDS-PAGE分离并放射显影后，可切取放射性片段所在的条带；经蛋白酶K消化蛋白-RNA复合体的蛋白成分，提取RNA片段进行高通量测序。通过这一技术，我们将鉴定出eIF3b蛋白在各种RNA上的准确结合位点，获得其靶基因RNA的种类和序列特征。
iTRAQ操作方法大体为：提取食管癌细胞总蛋白，分别进行蛋白酶水解，采用不同标记对酶解片段进行标记后混合，使用液质联用进行一级质谱，多个不同来源组的同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰，对加入标记的肽段进行二级质谱，二级质谱可对不同样品的同一个肽段进行区分，该区分为离子信号报告，报告离子峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值。最后将该质谱所得的数值结果进行相应的生物信息学系统分析，然后结合RNA-seq结果，确认候选的具有潜在编码功能的ncRNA是否存在蛋白产物。获得eIF3b在RNA上结合的靶标位置，分析其在非编码区的序列是否具有AUG序列及其他关键特征。将eIF3b-CLIP-seq数据与RNA-seq数据进行整合，重点关注非编码区序列，鉴定新的潜在编码ncRNA；最后整合蛋白质组数据，验证新注释的编码ncRNA是否能够翻译成蛋白或多肽，并进行候选ncRNA与肿瘤相关性的研究和细胞生物学分子生物学功能的验证。
3、实验结果及讨论
为了筛选有哪些lncRNA影响患者生存以编码多肽的方式，我们期望寻找一个更强有力的分子工具来富集处于翻译过程中的转录本。在翻译起始(translation initiation)过程会形成翻译起始复合物，翻译起始因子是最重要的调控因子，其中真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF3)是最复杂且重要的真核翻译起始因子。已报道，EIF3在翻译起始复合物的组装过程中及起始AUG密码子的选择中发挥作用。EIF3的亚基eIF3b含有与RNA链结合的motif，因此，我们推测，eIF3b可能是一个相对优化的分子工具，能够最大程度地捕获正在启动翻译核糖体组装的RNA，所以我们拟采用eIF3b的抗体通过CLIPseq技术富集正在翻译的RNA。待收集到与EIF3B结合的编码RNA或非编码RNA之后，我们需要从蛋白层面进一步验证其编码性或非编码性，所以我们又同期做了同位素标记相对和绝对定量质谱即iTRAQ质谱，iTRAQ质谱技术能够最大限度地克服其他常规质谱检测中对低丰度蛋白和小分子量蛋白的检测不敏感的问题。然后综合分析CLIP-seq数据和iTRAQ质谱数据利用TPP，确认候选的具有潜在编码功能的ncRNA是否存在蛋白产物(见图1)。
CLIP-seq结果显示，eIF3b不仅在mRNA上有结合，在LncRNA上也有结合，但其在mRNA的结合数量显著多于与LncRNA，这与已报道eIF3b的功能相符，主要参与mRNA的翻译过程，但CLIP-seq结果还指示部分LncRNA可能具有潜在编码性，且这部分LncRNA可以由eIF3b富集(见图2)。进一步分析CLIP-seq数据，将基因组分成以下5个区域：3‘UTR区，CDS区，内含子区，基因间区，5‘UTR区，分区域做peak calling发现，eIF3b主要结合在基因组的CDS区域(见图3A和B)，而IgG主要结合在内含子区和基因间区等非编码区(见图3C和D)；而且，IF3b在5’UTR区结合比例明显增多，以上结果表明eIF3b有足够的能力捕获正在翻译的RNA。将eIF3b的结合peak匹配回基因组后，我们发现，eIF3b在mRNA转录起始位点附近及翻译起始密码子均有显著的结合，仔细分析发现，eIF3b并非在mRNA的转录起始位点处结合强度达到峰值，而是在TSS的下游几十到几百bp处达到峰值，这与eIF3b在mRNA的翻译起始密码子处达到结合峰值是一致的(见图4)。eIF3b在LncRNA的转录起始位点也发现了相似的结合趋势，以上结果表明eIF3b具有富集编码性LncRNA的潜在能力(见图5)。eIF3b在LncRNA上结合的peak的长度普遍短于其结合在mRNA上的peak的长度，IgG结合的RNA均较短，且无上述趋势，表明eIF3b主要结合mRNA，与前述其在mRNA上的结合peak数量多于LncRNA趋势相符；且eIF3b与两者的结合均有特异性的motif(见图6)。
经过TPP的筛选流程，且利用ORF finder和getORF进一步预测编码性LncRNA的开放阅读框，并结合TCGA数据库中的食管癌患者的转录组测序数据，我们最终选择了编码性LncRNA-LOC107984813，其序列如SEQ ID NO.:1所示，进行表达验证和功能探索，因为ORFfinder和getORF均预测该LncRNA存在一个ORF可以编码15KD的多肽，且搜库结果中该LncRNA对应的多肽与预测结果吻合。
为了验证LncRNA CTCF-AS(LOC107984813)的编码性，我们将其5’UTR和CDS序列(5’UTR和CDS序列如SEQ ID NO.:2所示)插入到EGFP起始密码子缺失的pEGFPN1突变载体中，若LncRNA CTCF-AS的翻译起始密码子是有活性的，那么其便可以启动后续的EGFP的表达。与预期结果一样，转入pEGFPdel-N1的食管癌细胞检测不到GFP的荧光信号，但是转入了5-UTR-ORF-pEGFPdel-N1的食管癌细胞可以检测到荧光回复，这表明LncRNA CTCF-AS是具有编码能力的(图7)。
为进一步验证LncRNA CTCF-AS的内源编码性，我们针对CTCF-AS的氨基酸序列，预测其抗原表位(见图8)，定制了抗体(序列如SEQ ID NO.:3所示)，并在多种食管癌细胞系及正常食管上皮细胞系HET-1A中检测到了CTCF-AS的内源表达，并且我们发现CTCF-AS在食管癌系细胞系中的表达量均明显高于HET-1A中的表达量(图9)。进一步分析其蛋白定位，我们发现CTCF-AS的定位存在细胞异质性，CTCF-AS主要表达于KYSE410的细胞质当中，在KYSE450的核质当中均检测到了CTCF-AS的表达，类似的在HET-1A中检测到了微量的CTCF-AS(图10A)。组织学水平，我们在食管癌患者的组织当中也检测到了CTCF-AS的表达，而且核质均有表达，与细胞学水平实验结果一致(图10B和C)，这为CTCF-AS的功能的发挥提供了空间上的可能性。
食管癌细胞系中外源表达CTCF-AS蛋白(具体是将SEQ ID NO.:8所示DNA构建在表达载体上进行表达)，可以显著促进食管癌细胞的增殖，划痕愈合及克隆形成能力。相反地，当我们用ASO或者shRNA敲降CTCF-AS，均能显著抑制食管癌细胞的增殖(见图11A和C)，划痕愈合(见图11B和图12)克隆形成(见图13)及侵袭迁移(见图14)等恶性表型。体内实验结果显示，抑制CTCF-AS可以显著抑制食管癌细胞的体内成瘤能力(见图15)和肺转移能力(见图16)。
更具体的，本发明所述LOC107984813特异性反义寡核苷酸(ASO)的序列如SEQ IDNO.:4或SEQ ID NO.:5所示。所述LOC107984813特异性shRNA的序列如SEQ ID NO.:6(shRNA1)或SEQ ID NO.:7(shRNA2)所示。
为更好的探究CTCF-AS的功能，我们对高/低表达CTCF-AS的正常组织和食管癌组织进行转录组测序，筛选得到983个差异表达基因，GO聚类分析结果显示这些差异表达基因被显著富集于粘附相关的信号通路。
类似的，我们在161例食管癌患者的癌组织测序结果中筛选出1689个与CTCF-AS共表达的编码蛋白基因，GO分析结果显示共表达的基因可以显著被富集到细胞黏附相关的生物学过程中。此外，我们将构建的CTCF-AS敲降的细胞系进行转录组测序，两种细胞系中筛选的到DEG均被显著富集于粘附相关信号通路。因此我们在体内和体外分别检测了CTCF-AS表达水平与食管癌细胞系转移能力的关系。结果显示，敲降CTCF-AS后可以显著增强食管癌细胞的粘附能力，抑制其转移能力，体内体外结果一致。另外，整合分析21种食管癌细胞的转录组测序数据和体内转移器官偏好性，我们发现CTCF-AS的表达水平与食管癌细胞的肺转移能力呈正相关。
为探究CTCF-AS的临床意义，我们分析了其在174例癌组织和癌旁组织中的表达量(其中癌162例，癌旁12例)，结果发现CTCF-AS在癌组织中的表达水平整体高于癌旁组织中的表达量，其中8对配对的样本中也同样检测到了这一趋势(图17A)。同时，肿瘤病例分级越高，CTCF-AS的表达水平越高，且高表达CTCF-AS的患者生存整体较差(图17B)。不仅仅是食管癌，CTCF-AS的表达水平在其它多种肿瘤组织和对应正常组织中也均有明显的差异，且在大部分癌种中是肿瘤组织中的表达量高于对应正常组织中的表达量(图17C)。为进一步深入研究CTCF-AS在食管癌患者组织中的表达量，我们检测了一张食管癌患者的组织芯片(180点来自103个食管癌患者)，其中包括77个患者配对的食管癌组织和正常食管上皮组织。结果发现CTCF-AS在75％患者的食管癌组织中的表达量显著高于配对的正常组织(58/77)(图17D和图18A)。
此外，为进一步探究CTCF-AS是否在RNA水平也有相似的趋势，我们又检测了一张食管癌患者的cDNA芯片，结果发现CTCF-AS在68％患者的食管癌组织中的表达量显著高于配对的正常组织(11/16)，同样高表达CTCF-AS的患者生存较差(图18B和C)。
我们在多癌种的组织芯片中也检测到了不同程度的CTCF-AS的表达，这一方面表明CTCF-AS的表达具有保守性，但是在不同的癌种中具有抑制性，暗示着其功能的丰富多样(图19)。
实施例2、LOC107984813的编码性及其在乳腺癌中的应用
我们用LncRNA CTCF-AS编码蛋白的多克隆抗体对已经获取的三阴性乳腺癌组织切片进行免疫组化染色，观察其表达及形态学分布情况，发现LncRNA-CTCF-AS在细胞核和细胞浆都有表达，且其在正常乳腺组织中的表达量显著低于其在乳腺癌组织中的表达量，这提示CTCF-AS的表达可能与乳腺的恶性表型相关。(图20A和B)。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> LOC107984813在诊断、预测预后、治疗癌症中的应用
<141> 2022-05-20
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 899
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gcucgugggc ucugccggcg ccgcggcguc cuggcucccg cugggugggg cuuccugggc 60
ggaggccgcc gccccugggc ggugccggau ccaguccgcu ugaccuuauu cccuagcugc 120
ugucuccggc ccccugaacc cguacagggu uggggaagug gggguggcug gaggaagcgc 180
gcgcggggca agccaguggg gcugaggagg cucccgggcc cggccccgcc cagucuccgc 240
cccagccagg cccgacccgc ccuccgaaug ucuuacagcu gcccgcccca gaguaaggcc 300
cggucgguuc ccgcgcgcuc ccagcuccgu gcccgcgagc gacgacugga agggcugucc 360
uugcucagcg gcuuuuggug aucucuccgc ccuagaagag ggccaccuaa aagcgggugc 420
gagaggagag ugggagggcc uccucuuggu guccccaggc caccucagcc cggagaggug 480
gcggaaaacc agacuugaug cuuuaacacg uucauagcaa ucgcuuuuua cugaaaggag 540
uuucuguauu uagcgcugug uaauucugug gaaacgugca uuucuugucu uugcgggaga 600
gcuguucucu gugggcggag accuucaguc ccaccccucc ccaggaggcg ccugcggacc 660
cuucccaacc ugcagucaag uugaccaaga acugacugca aggugcuggu ggcucuggga 720
ugagagccuu uugguacuua cagggaauau gacucuuccc uuagauauca aauggaccca 780
auaucuaggg agcagcuucu ucuccaucca ucugaccguu ccguugugag aaugcuggcc 840
caauaacaua cucuuuuuuu uuccccuaaa ggaauaaaaa aaucuguauu uuuaagaug 899
<210> 2
<211> 378
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gctcgtgggc tctgccggcg ccgcggcgtc ctggctcccg ctgggtgggg cttcctgggc 60
ggaggccgcc gcccctgggc ggtgccggat ccagtccgct tgaccttatt ccctagctgc 120
tgtctccggc cccctgaacc cgtacagggt tggggaagtg ggggtggctg gaggaagcgc 180
gcgcggggca agccagtggg gctgaggagg ctcccgggcc cggccccgcc cagtctccgc 240
cccagccagg cccgacccgc cctccgaatg tcttacagct gcccgcccca gagtaaggcc 300
cggtcggttc ccgcgcgctc ccagctccgt gcccgcgagc gacgactgga agggctgtcc 360
ttgctcagcg gcttttgg 378
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Lys Arg Ala Arg Gly Lys Pro Val Gly Leu Arg Arg Leu Pro Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
gcuagggaat aaggtcaagc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
acagagaaca gctctcccgc 20
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
aattcaaaaa agcttgacct tattccctag cttctcttga aagctaggga ataaggtcaa 60
gcg 63
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
aattcaaaaa agatgcttta acacgttcat agtctcttga actatgaacg tgttaaagca 60
tcg 63
<210> 8
<211> 348
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
ctggctcccg ctgggtgggg cttcctgggc ggaggccgcc gcccctgggc ggtgccggat 60
ccagtccgct tgaccttatt ccctagctgc tgtctccggc cccctgaacc cgtacagggt 120
tggggaagtg ggggtggctg gaggaagcgc gcgcggggca agccagtggg gctgaggagg 180
ctcccgggcc cggccccgcc cagtctccgc cccagccagg cccgacccgc cctccgaatg 240
tcttacagct gcccgcccca gagtaaggcc cggtcggttc ccgcgcgctc ccagctccgt 300
gcccgcgagc gacgactgga agggctgtcc ttgctcagcg gcttttgg 348
Claims (10)
1.一种具有编码功能的多核苷酸，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
2.LOC107984813在启动基因表达中的应用；
优选地，所述LOC107984813是指其5’UTR和CDS区域，所述LOC107984813的5’UTR和CDS区域顺序连接后形成的核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
3.检测LOC107984813表达量的试剂在制备诊断癌症、预测癌症患者的预后的产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，所述癌症包括食管癌和乳腺癌。
5.如权利要求3所述的应用，所述检测LOC107984813表达量的试剂包括LOC107984813的特异性抗体、引物、探针、芯片中的一种或多种。
6.如权利要求5所述的应用，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
7.LOC107984813的抑制剂在制备治疗癌症或抑制癌细胞增殖、侵袭迁移、克隆形成的产品中的应用；
优选地，所述癌症包括食管癌和乳腺癌。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述LOC107984813的抑制剂包括针对LOC107984813或其表达产物的shRNA、反义寡核苷酸、抗体、拮抗剂、阻断剂、siRNA、miRNA；
优选地，所述LOC107984813特异性反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.:4或SEQ IDNO.:5所示；
优选地，所述编码LOC107984813特异性shRNA的序列如SEQ ID NO.:6或SEQ ID NO.:7所示。
9.治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物中包括LOC107984813的抑制剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述LOC107984813的抑制剂包括针对LOC107984813或其表达产物的shRNA、反义寡核苷酸、抗体、拮抗剂、阻断剂、siRNA、miRNA；
优选地，所述LOC107984813特异性反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.:4或SEQ IDNO.:5所示；
优选地，所述LOC107984813特异性shRNA的序列如SEQ ID NO.:6或SEQ ID NO.:7所示；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220708 |
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