CN110938698A - Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用，该应用为定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9的表达水平，Sox9高表达的三阴性乳腺癌患者对THZ1敏感，易受THZ1治疗的影响。本发明筛选出了预测THZ1敏感性的生物标志物，并证明了超级增强子相关转录因子SOX9的高表达与THZ1在TNBC中的敏感性呈正相关。从机制上讲，SOX9可能通过与FOXC1相关的方式使TNBC细胞对CDK7抑制剂THZ1敏感，这表明SOX9可能是THZ1的预测因子。

Description

Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，具体涉及Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种特别具有侵袭性的乳腺癌亚型，其特点是遗传复杂性高，缺乏明显的致癌基因。由于TNBC的肿瘤异质性，靶向治疗的发展很长时间受到了限制。令人惊讶的是，最近的一项研究表明TNBC对新开发的CDK7抑制剂THZ1选择性敏感。最近的研究发现，除了调节细胞周期外，CDK7在促进转录过程中也必不可少。CDK7通过磷酸化RNA聚合酶II(RNAPII)的丝氨酸5和丝氨酸7来调节转录的起始，通过磷酸化RNAPII上的丝氨酸2来调节转录延伸。CDK7抑制剂可以强烈地减少一组特定基因的转录，这些基因在TNBC 中而不在激素受体阳性乳腺癌细胞中过度表达，因此促进TNBC的致癌性和疾病的发展。此外，这个簇中过表达的基因与超级增强子(SE)相关。普遍认为增强子是非编码DNA的区域，它介导相邻基因的转录，充当顺式调节元件。超级增强子是增强子的一个子集，对招募大量的转录因子、辅助因子和染色质调节因子来驱动基因表达具有显著的作用，并且与重要的癌基因如MYC，CCND2和EGFR在各种肿瘤中的表达密切相关。有趣的是，这个簇中的大多数基因与激素受体阳性乳腺癌细胞中的超级增强子无关。CDK7抑制剂有望通过抑制超级增强子相关的癌基因来控制TNBC细胞的增殖。

虽然TNBC对THZ1显示出极高的敏感性，但激素受体阳性乳腺癌对此不敏感，我们发现不同TNBC细胞系之间仍然存在对CDK7抑制剂的不同反应。因此，识别TNBC中预测THZ1效果的因素可能有助于更好地选择TNBC患者进行治疗。先前的研究发现，THZ1主要通过抑制高活性的转录并优先诱导超级增强子相关的癌基因的选择性失活而引起选择性效应。有报道称，转录因子，其中一些在肿瘤的形成和发展中发挥关键的作用，经常与超级增强因子相关。此外，如果某些致癌转录因子与超级增强子相关，则转录因子的恶性潜能将被扩增，这可以在肿瘤中触发许多失去调控的转录过程。因此，本发明聚焦于超级增强子相关的转录因子，并证明SOX9是TNBC细胞中与超级增强子相关的转录因子，它可以预测TNBC对THZ1的敏感性。SOX9在胚胎发生过程中起着关键作用，近年来，其在肿瘤中的作用受到越来越多的关注。一些已发表的研究报道SOX9作为致癌蛋白在各种实体瘤中过表达，诱导癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭。此外，外源性slug和Sox9的共同表达增加了乳腺癌细胞的致癌性和转移能力，并与腺癌患者的不良预后相关。在本研究中，我们证明SOX9的高表达与TNBC 的恶性表型相关。然而，在肿瘤形成和发展过程中SOX9功能的确切机制至今很多仍不清楚。在这里，我们第一次证明了SOX9在TNBC中的作用，以及它在THZ1敏感性中预测作用的可能机制。

发明内容

本发明的目的在于提供Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用。

本发明的目的在于一种预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用。

上述的应用，其在于定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9的表达水平，Sox9高表达的三阴性乳腺癌患者对THZ1敏感，易受THZ1治疗的影响。

Sox9在制备用于预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性试剂盒中的应用。

定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9表达水平的试剂在制备用于预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性试剂盒中的应用。

Sox9表达水平的检测方法为本领域技术人员公知。本发明使用WB和qRT-PCR检测Sox9表达水平。WB用抗SOX9(Ab3697)。qRT-PCR具体实验过程、试剂、引物序列如下：根据制造商的方案，使用Trizol(Invitgen，USA)从培养细胞中提取总RNA。对于qRT-PCR 分析，使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(RR036A，Takara，China)合成cDNA，然后使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Life Technology，USA)进行PCR。GAPDH被用作内参。引物序列如下：SOX9-FORWARD： AGCGAACGCACATCAAGAC和SOX9-REVERSE：CTGTAGGCGATCTCTGTGGGG。

一种预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性的方法，定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9的表达水平，Sox9高表达的三阴性乳腺癌患者对THZ1敏感，易受THZ1 治疗的影响。

本发明的有益效果：

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性疾病，死亡率高，但目前尚无TNBC有效的靶向生物学药物治疗。一项最近的研究和我们的数据都表明，与激素受体阳性的乳腺癌相比，TNBC 对新发现的细胞周期蛋白依赖性激酶7(CDK7)抑制剂THZ1特别敏感，但我们的数据发现，不同的TNBC细胞株具有显著不同的IC50值，表明TNBC对THZ1的敏感性可能存在异质性。为了寻找提示THZ1敏感性的生物标志物，我们重新分析了现有技术中用THZ1处理的乳腺癌细胞的mRNA谱，并证明了超级增强子相关转录因子SOX9的高表达与THZ1在TNBC中的敏感性呈正相关。我们还证实了SOX9促进细胞增殖，迁移，干细胞性，上皮间质转化，以及预测不良的预后。此外，基于278例患者的组织阵列和来自TCGA数据的900多个样本，证实了SOX9在TNBC中的表达显著高于激素受体阳性乳腺癌。此外，THZ1显著抑制了SOX9与 TNBC必须的转录因子FOXC1附近增强子的结合，Chip-Sequence和Chip-qPCR证实了这一点。我们还证明了SOX9蛋白和FOXC1蛋白相互作用，可能对TNBC中的MYC信号通路起协同和共调节作用。从机制上讲，SOX9可能通过与FOXC1相关的方式使TNBC细胞对CDK7抑制剂THZ1敏感，这表明SOX9可能是THZ1的预测因子。通过本发明的研究筛选出了提示THZ1 敏感性的生物标志物SOX9，及其在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用。

附图说明

图1 SOX9增强TNBC细胞对THZ1的敏感性。

(A)用CCK8法分析用指示浓度的THZ1处理72h后的8株TNBC细胞的剂量-效应曲线。(n＝3，均值±SD)。

(B)指示浓度的THZ1处理6小时后在BT549，MDA-468，T47D和ZR-75-1乳腺癌细胞中超级增强子相关转录因子mRNA水平的热图。

(C)用50nM或100nM的THZ1处理MDA-468和BT549 24小时后，qRT-PCR检测 SOX9、MYC和RUNX1 mRNA的表达。(n＝3，mean±SD，***P<0.001)。

(D)MDA-468和BT549分别用50nM或100nM的THZ1处理6h或24h。处理后进行western blot检测SOX9、MYC和RUNX1蛋白的表达。

(E)用western blot测定了8个TNBC细胞系中SOX9表达的基线水平。

(F)在8个TNBC细胞系中，SOX9基因表达与THZ1的IC50值之间存在Pearson相关性。(n＝8，r＝-0.82，P＝0.013)。

(G)用指定浓度的THZ1处理SOX9基因敲除的MDA-468、BT549和SOX9过表达的MDA-157细胞72h，用CCK8比色法分析细胞活力。(n＝3，均值±SD，**P<0.001，**P<0.01)。

图2 SOX9促进TNBC中的细胞增殖、细胞迁移和维持乳腺癌的起始和EMT潜能。

(A)显示了SOX9敲除的MDA-468和BT549的克隆形成图像和定量数据。(n＝3，均值± SD，*P<0.05)

(B)显示了SOX9敲除的MDA-468和BT549以及SOX9过表达的MDA-157划痕试验的图像和定量数据。(n＝3，均值±SD，*P<0.05，**P<0.01)。

(C)显示了SOX9敲除的MDA-468和BT549以及SOX9过表达的MDA-157的Transwell分析结果及迁移能力的定量数据。(n＝3，均值±SD，**P<0.01，*P<0.001)。

(D)显示了SOX9敲除的MDA-468和BT549以及SOX9过表达的MDA-157中的肿瘤3D形成图像及其定量数据。(n＝3，均值±SD，*P<0.05)。

(E)Western blot分析检测SOX9敲除的MDA-468和BT549细胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白水平，以及SOX9过表达的MDA-157中E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白水平。

图3 SOX9与TNBC患者的不良预后相关。

(A)SOX9高表达和低表达乳腺癌组织的典型免疫组织化学染色图像。

(B)Kaplan-Meier曲线显示肿瘤组织高表达和低表达SOX9两组TNBC患者的OS。 (P＝0.0337)。

(C)TCGA数据库中的原发性TNBC肿瘤组织、HR+乳腺癌组织和正常邻近组织中SOX9mRNA水平如图所示。(***P<0.001)。

(D)分析来自TCGA数据库的原发性TNBC肿瘤组织、HR+乳腺癌组织和正常邻近组织的 SOX9基因甲基化水平。(***P<0.001)。

(E)GSEA指出SOX9高TNBC肿瘤相比于SOX9低肿瘤(由-log(P)确定)中的前10个信号通路。

(F)比较TCGA数据集中SOX9高和SOX9低TNBC样本的RNA聚合酶II转录前事件信号通路的GSEA结果；

(G)热图显示SOX9表达水平高与低两组患者之间各基因的表达。

图4 THZ1抑制SOX9与SE相关转录因子FOXC1增强子的结合。

(A)MDA-468中SOX9 ChIP-seq数据的峰值分布；

(B)基于MDA-468³中的超级增强子序列数据和SOX9结合位点的chip-seq数据的分析表明，与对照细胞相比，25nM THZ1处理24h后，SOX9与MDA-468中的超级增强子结合减少。

(C)对照组MDA-468和25nM THZ1处理24h后的MDA-468中SOX9结合位点富集的基序被显示。

(D)由-log(P)确定的SOX9结合位点相关基因的基因本体(GO)分析。

(E)25nM THZ1处理24小时后，ChIP-seq发现SOX9在靠近超级增强子相关转录因子的几个增强子上的结合消失。

(F)CHIP-seq结果显示在顶部。基于图4E中的结果，ChIP-qPCR用于检测SOX9与FOXC1、E2F3、HIVEP1和FOXQ1附近的假设增强子元件的结合。PCR靶标由其附近的转录因子基因命名。qPCR实验显示在底部。(***P<0.001)

(G)THZ1处理的MDA-468和对照组MDA-468中SOX9结合位点的FOXC1基序的E值。E值是次要基序的任何间距的最低p值乘以次要基序的数量。它估计具有观察到的最小p值或更小的随机二级基序的预期数量。

图5 SOX9和FOXC1相互作用并促进了TNBC

(A)TCGA微阵列数据中137例TNBC肿瘤SOX9和FOXC1的表达水平。每个点代表一个肿瘤。显示了线性趋势线和Pearson相关系数(r和p)。

(B)用FOXC1抗体在TNBC细胞中进行CHIP检测。用9组SOX9启动子引物对FOXC1免疫共沉淀产物进行PCR扩增。

(C)Western blot检测SOX9敲除后TNBC细胞中SOX9、FOXC1和MYC的表达水平。

(D)western blot检测FOXC1敲除后TNBC细胞中FOXC1、SOX9和MYC的表达水平。

(E)SOX9和FOXC1的分子对接。

(F)采用免疫共沉淀实验研究SOX9和FOXC1蛋白在TNBC细胞中的相互作用。

(G)GSEA结果表明SOX9-和FOXC1-应答基因富集了原癌基因MYC和乳腺癌的发生途径。

图6 TNBC中SOX9-FOXC1模型方案

Sox9通过结合其增强子来激活FOXC1转录。然后，SOX9和FOXC1协同激活致癌基因调控程序。THZ1可通过抑制CDK7从而抑制SOX9与FOXC1附近的增强子的结合

具体实施方式

一、材料与方法

1.细胞培养，细胞活力测定和克隆形成试验

MDA-157，MDA-468和BT549细胞系于2016-2017年购买自中国科学院委员会培养收集细胞库(中国上海)。这些细胞系的真实性由中国科学院培养收集细胞库在购买前通过STR DNA分型方法完成。MDA-157和BT549细胞在添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI1640中生长，MDA-468细胞在添加10％(v/v)FBS的DMEM中生长。所有培养基均含有100unit/ml青霉素和100unit/ml链霉素，均在37℃、5％CO₂气氛中培养。对于细胞活性分析，细胞以4000至6000个/孔的密度培养于96孔板中。次日，细胞用不同浓度的试剂处理，并在处理 72小时后，根据推荐指南(KeyGEN Biotech，中国南京)，使用细胞计数试剂盒-8评估细胞存活。克隆形成试验如前所述进行¹。

2.抗体和试剂

抗FOXC1(#8758)，小鼠IgG(#7076)，兔IgG(#7074)和GAPDH 267(#5174)的抗体购自 Cell Signaling Technologies公司；抗SOX9(Ab3697)，抗c-myc 268(Ab32072)，抗RUNX1(Ab138377)，抗Snail(Ab53519)，抗E-cadherin(Ab133597)，抗N- cadherin(Ab76011)和抗Vimentin(Ab92547)来自Abcam；在制造商建议的稀释度下使用抗体。THZ1从MedChem Express获得，并在DMSO中稀释。

3.临床样本

由Outdo Biotech(中国上海)提供了含有HBRE-Duc140Sur-03(139例癌症病例)和HBRE- Duc140Sur-01(138例癌症病例)的乳腺癌组织切片。根据“赫尔辛基宣言”，金陵医院伦理委员会批准了这项实验。组织学参数根据世界卫生组织的标准来决定。病理分期由现行的国际抗癌联盟肿瘤-淋巴结转移分类确定。

4.免疫组化

乳腺肿瘤组织样品的免疫组织化学方法如先前所述进行²。SOX9阳性细胞的百分比按0 到3的等级评分：0-5％(0)，6-25％(1)，25-50％(2)，51-100％(3)。染色强度从0 到3评分如下：0(阴)，1(弱)，2(中)和3(强)。通过将阳性细胞百分比的分数乘以染色强度的分数(范围为0至9(0、1、2、3、4、6和9))来计算每种情况的免疫反应性分数(IS)。该评分系统的临界值分配如下：Sox9高表达定义为IS≥6(6和9)；低表达被定义为IS小于6(0、1、2、3和4)。使用显微镜(Aiovert 200；Carl Zeiss) 扫描免疫染色的切片。

5.质粒和慢病毒转染

将人的SOX9转录本序列：NM_000346.4克隆到pFLAG-CMV表达载体(HanbioBiotechnology；中国上海)中，并在转染前进行测序分析验证。用脂质体2000(Invitgen，USA)将空载体或pFLAG-CMV-SOX9转染MDA157细胞后按照制造商的方案用2μg/ml嘌呤霉素(Gibco)筛选。用含有shRNA序列的质粒pGLV转染的慢病毒由GenePharma(上海，中国) 生产。shRNA序列如下：shSOX9-1：CCACCTTCACCTACATGAA，shSOX9-2： CAGCGAACGCACATCAAGA，shFOXC1-1：ACAAGAAGATCCCTGAA，shFOXC1-2：AGAGGATCGGCTTGAACAA和shNC：AGTGCACGTGCATGTCCTA。按照GenePharma的标准程序将慢病毒载体转染细胞。转染72h后，用嘌呤霉素进行筛选48h并进一步传代。

6.RNA分离和定量RT-PCR

根据制造商的方案，使用Trizol(Invitgen，USA)从培养细胞中提取总RNA。对于qRT- PCR分析，使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(RR036A，Takara，China)合成cDNA，然后使用Power SYBR Green PCR Master Mix(LifeTechnology，USA)进行PCR。GAPDH被用作内参。引物序列如下：SOX9-FORWARD：AGCGAACGCACATCAAGAC和REVERSE：CTGTAGGCGATCTCTGTGGGG；RUNX1-FORWARD：TCTTCACAAACCCACCGCAA和REVERSE：CTGCCGATGTCTTCGAGGTTC；MYC-FORWARD：CGTCTCCACATCAGCACAA和REVERSE：CACTGTCCAACTGACCCTTCTTG；GAPDH-FORWARD:AAATCAAGTGGGGCGATGCTG and REVERSE:GCAGAGATGATGACCCTTTTG.用2-ΔΔCt法测定SOX9、FOXC1和myc的相对表达量。

7.Western Blot

指示处理后的细胞(步骤5中筛选的转染pFLAG-CMV-SOX9质粒和慢病毒载体后的细胞) 用PBS洗涤三次，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中溶解；用BCA试剂盒(所有试剂盒来自中国南京KeyGEN Biotech)测定蛋白质浓度。使用上述抗体进行 Western blot分析，Western blot试验如前述所进行^1,2。

8.ChIP-Seq和ChIP-PCR

如前所述，使用抗SOX9抗体进行chip-Seq³。在苯酚提取后纯化免疫沉淀的DNA，并将基因组文库测序至50bp以用于Illumina Hi-Seq2000(Illumina)。使用MACS2软件根据输入调用CHIP-SEQ窄峰(Feng等人。2012；Zhang等人。2008)(版本2.0.9，p值阈值＝1e- 5)。所有的motifs都通过沿着峰顶延伸250bp进行搜索。使用Homer包来发现motif。并且我们使用Homer的峰注释功能来注释出所谓的峰。在ChIP-PCR分析中，为SOX9启动子设计了以下引物序列。为SOX9启动子区域合成了9组引物，每个引物约300bp(见表1)。

表1. ChIP-PCR分析中为SOX9启动子设计了以下引物序列

9.TCGA数据分析

样本的mRNA数据和甲基化数据分别通过TCGA数据门户(https： //ancergenome.nih.gov)和DiseaseMeth(http：//www.bio- bigdata.com/diseasemeth/index.html)下载。Sox9高表达肿瘤被定义为TCGA数据中具有正z得分肿瘤的前75％。相反，SOX9低表达肿瘤被定义为TCGA数据中具有负z得分阴性肿瘤的前75％。

10.免疫共沉淀试验

为了研究SOX9和FOXC1蛋白的相互作用，在MDA-468和BT-549中进行了免疫共沉淀。将SOX9的人全长cDNA序列克隆到表达载体pCMV-Flag中，将FOXC1的人全长cDNA序列克隆到表达载体pCMV-HA中(Hanbio Biotechnology；中国上海)。将细胞转染所指示的质粒24小时后制备核提取物。将上清液转移到新的试管中，并在恒定搅拌下于4℃与抗HA-琼脂糖珠或抗Flag亲和凝胶(Sigma)孵育过夜。。通过免疫印迹进一步分析这些样品。通过在 4℃下5000g离心3分钟收集免疫沉淀的蛋白质，用裂解缓冲液洗涤三次，在50ul的2× SDS样品缓冲液中重新悬浮。用免疫印迹技术和适当的抗体(Sigma)对免疫共沉淀和全细胞裂解产物进行分析。单独转染空载体的细胞作为对照。

11.分子对接

使用预测生物信息学工具，如Phyre2和Swiss-model，预测SOX9和FOXC1的蛋白质3D 结构。使用ZDOCK server(http://zdock.umassmed.edu/).)进行蛋白质对接模拟。本地服务器用于处理和美化对接数据文件。

12.统计分析

所有统计测试均使用GraphPad Prism6.0版本进行。使用Student’s t检验和单因素方差分析对数据进行分析。除非另有说明，否则数据以三个独立实验的平均值±SD表示。P 值<0.05被认为具有统计学意义。*P<0.0 5或**P<0.0 1或***P<0.001。

二、结果分析

1.SOX9预测了TNBC细胞对THZ1的敏感性

我们证明经THZ1处理确实对TNBC细胞株显示出了强烈的细胞毒性，这与先前发表的研究一致，但我们也观察到一些TNBC细胞株，如BT-20和MDA-157，对THZ1不敏感(图1A)。值得注意的是，最不敏感细胞系的IC50值平均比敏感细胞系的IC50值高出近10倍(图 1A)，这暗示着可能存在一些因素影响THZ1对TNBC细胞的效果。我们根据用THZ1处理的两个TNBC细胞系和两个HR+乳腺癌细胞系的微阵列数据(图1B)，分析了与超级增强子相关的转录因子的基因表达值。与激素受体阳性乳腺癌细胞相比，TNBC细胞中理性预测因子被确定为升高，并且被THZ1治疗高度抑制。因此，我们选择SOX9，RUNX1和MYC进行进一步的研究，并表明THZ1处理在mRNA和蛋白质水平上都降低了SOX9，RUNX1和MYC的表达(图 1C和D)。由于在THZ1处理后SOX9的抑制作用比其他两个因素更为显着(图1D)，因此我们将重点放在尚未在TNBC中得到深入研究的SOX9。此外，在一组SOX9表达水平不同的 TNBC细胞系中，SOX9表达水平与IC50值呈负相关，并且SOX9扩增的细胞对THZ1具有高敏感性，这表明SOX9将是THZ1敏感性的预测因子(图1E和1F)。接下来，我们在MDA-468和 BT549中沉默SOX9，但在SOX9基线表达水平相对较低的MDA-157中过表达SOX9。我们发现 SOX9的敲低增加了MDA-468和BT549对THZ1的IC50值，而SOX9在MDA-157细胞中过表达增加了细胞对THZ1的敏感性(图1G)。这些结果表明SOX9表达水平与TNBC细胞对THZ1的敏感性呈正相关。

2.SOX9促进TNBC细胞的恶性特性

尽管许多研究已经研究了SOX9在前列腺癌和结肠直肠癌中的作用，但很少研究SOX9在乳腺癌中的分子功能。为了充分了解SOX9和CDK7抑制剂之间功能关联的潜在机制，我们研究了SOX9在TNBC细胞中的生物学功能。克隆形成实验显示，SOX9沉默明显抑制细胞增殖，而SOX9过表达促进细胞增殖(图2A)。我们还研究了SOX9对TNBC细胞迁移的影响，发现SOX9的抑制减弱了MDA-468和BT549的迁移能力。相反，过表达SOX9促进了MDA-157的细胞迁移(图2B和C)。由于数项研究已将SOX9鉴定为重要的干细胞标志物，因此我们测试了SOX9对肿瘤成球的影响。SOX9敲低抑制了肿瘤的起始能力，与对照组相比，敲低后的肿瘤成球更少。然而，在MDA-157和SOX-9过表达的MDA-157之间没有观察到统计学差异 (图2D)。先前的研究表明，上皮-间质转化(EMT)过程支持了癌细胞的干性并调节细胞迁移能力。如图2E所示，敲低SOX9可以显著提高上皮标记物E-cadherin的表达水平，但降低了间充质标记物N-cadherin，Vimentin和Snail的表达水平。此外，SOX9过表达可诱导N- cadherin、Vimentin和Snail的表达上调和E-cadherin丢失。这表明SOX9在引起EMT功能方面起关键作用。总之，这些实验表明，SOX9是促进TNBC细胞恶性特性的关键调节因子，靶向SOX9将是TNBC治疗的有效策略。

3.SOX9高表达的TNBC患者预后较差

先前的研究发现，相对于其他类型的肿瘤，乳腺癌的肿瘤组织中SOX9染色呈中度阳性，但SOX9与乳腺癌患者的临床特征之间的确切关系尚未发现。为了评估SOX9的临床作用，我们在两个组织微阵列中对来自278名乳腺癌患者的肿瘤组织中的SOX9进行了免疫组织化学(IHC)染色(图3A)。对于SOX9表达与乳腺癌患者不同临床病理因素的相关性，高SOX9表达水平似乎与晚期肿瘤分期有关(表2)。更重要的是，SOX9与雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)状态呈负相关，表明SOX9可能在激素受体阴性乳腺癌中高表达(表2)。我们还分析了在TNBC患者中SOX9表达与预后的关系。根据我们的组织芯片数据，SOX9表达低的TNBC患者的总体生存期(OS)更长(图3B)。

表2. SOX9表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系

为了扩大我们的观察范围，我们利用了从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中收集的乳腺癌患者中可用的mRNA表达和SOX9的表观遗传学数据。与正常组织相比，TNBC显示出SOX9 mRNA表达增加，SOX9位点DNA甲基化减少(图3C和D)。有趣的是，结果还显示，激素受体阳性乳腺癌相对于正常组织或TNBC亚型而言，SOX9表达降低而SOX9甲基化增加，表明在激素受体阳性乳腺癌中SOX9倾向于表观遗传和转录水平沉默，这与我们的IHC结果类似(图3C和D；表2)。这些结果表明SOX9是TNBC中的关键调节因子，其与生存期的关系与SOX9 在TNBC细胞中的致癌功能是一致的。然而，尚不清楚SOX9功能的基本机制。为了全面探究与SOX9相关的信号通路，我们从TCGA数据中对具有SOX9高表达和低表达的TNBC样本进行了基因集富集分析(GSEA)。值得注意的是，与转录调节、细胞周期和MYC激活相关的通路排名在前(图3E)。相比较于低表达SOX9(s-l)的TNBC，RNA pol-II转录前事件途径在高表达 SOX9(s-h)的TNBC中被富集。值得注意的是，CDK7被列为RNA pol-II转录前事件途径的第一位的＝基因，在临床上突出了SOX9和CDK7之间的显著关联(图3F和G)。这些结果表明 SOX9在TNBC中具有促进转录的强大能力。

4.THZ1抑制了SOX9与超级增强子相关转录因子的增强子的结合

为了深入了解SOX9特异性转录的调控以及THZ1对SOX9调控转录的影响，我们在用THZ1处理MDA-468后，用高通量测序(Chip-seq)进行染色质免疫沉淀。CHIP-seq实验在MDA-468细胞中检测到3906个峰。大多数SOX9结合位点富集在远端基因间隔区和内含子区域(图4A)。值得注意的是，在用THZ1处理24小时后，通过将SOX9结合峰的序列与MDA- 468中的所有超级增强子序列进行比较，我们发现THZ1在总峰数不减少的条件下抑制SOX9 与超级增强子的结合(图4B)。正如SOX9结合区的顶部序列基序(TCTCCAGGCCCA)所示，这些基序与典型的SOX9基序(AGAACAATGG)不相似，但THZ1没有太大改变MDA-468中SOX9的结合基序(图4C)。此外，基因本体(GO)分析表明，与SOX9结合位点相关的基因(每个基因的上下游均在100kb内)与多种致癌途径相关，表明SOX9作为转录因子具有潜在重要的致癌功能。值得注意的是，在THZ1治疗后，与肿瘤表型相关的途径减少，表明THZ1的抗肿瘤作用 (图4D)。我们的进一步分析集中在SE相关转录因子的基因上，结果表明，THZ1减弱了 SOX9与这些转录因子基因的增强子的结合(图4E)。接下来，我们使用针对SOX9的抗体对五个基因进行CHIP-qPCR，如图4F所示。结果表明，THZ1抑制了SOX9与FOXC1，E2F3和 FOXQ1附近增强子的结合，表明THZ1抑制了SOX9调节的转录网络。接下来，我们选择 FOXC1进行进一步研究是因为：(1)THZ1抑制SOX9与FOXC1附近两个增强子的结合，这反映了它对FOXC1转录和表达有相对较大影响，而进一步的ChIP-seq分析表明SOX9结合位点含有FOXC1基序(图4G)；(2)大量的文献表明，转录因子FOXC1的过表达是TNBC的一个重要的生物标志物。

5.SOX9和FOXC1相互作用并且促进TNBC

最后，我们利用mRNA表达芯片数据检验了TCGA数据库中TNBC样本中SOX9和FOXC1表达之间的相关性。令人惊讶的是，在所有基因中，FOXC1的表达与SOX9的表达相关性最高(r值＝0.53，p值＝2.94e-12，Matlab相关函数；图5A)。用芯片检测TNBC细胞中FOXC1对SOX9的影响。ChIP-qPCR结果表明FOXC1直接与SOX9启动子结合，此外，THZ1处理使结合减少(图5B)。此外，SOX9敲低显著降低TNBC细胞中FOXC1蛋白水平，而SOX9过表达增加 FOXC1表达(图5C)。有趣的是，FOXC1敲除也显着降低了TNBC细胞中SOX9蛋白的水平。 SOX9和FOXC1敲低都降低了TNBC细胞中MYC的蛋白表达，这表明SOX9和FOXC1对重要癌基因的调节作用(图5D)。在TNBC细胞中观察到SOX9和FOXC1之间的正关联后，首先我们用SWISS模型预测SOX9和FOXC1的3D结构，并用Phyre2工具解释模型。我们通过进行蛋白质-蛋白质对接分析来测试预测的SOX9和FOXC1的相互作用。如图5E所示，SOX9可以与 FOXC1相互作用。我们采用免疫共沉淀试验研究SOX9和FOXC1是否可以在体内相互作用。将FLAG标记的SOX9(SOX9-FLAG)和/或HA标记的FOXC1(FOXC1-HA)质粒转染MDA-468和BT- 549细胞24h。随后，抗HA抗体免疫沉淀蛋白复合物被抗Flag抗体识别。在反向实验中，抗Flag抗体免疫沉淀蛋白复合物也被抗HA抗体检测到。结果表明，当SOX9和FOXC1在 TNBC细胞中都过度表达时，SOX9可与FOXC1发生物理相互作用(图5F)。这些结果表明， SOX9和FOXC1可能在某些条件下协同调控相同的基因。为了确定SOX9/FOXC1复合物介导的基因在临床中的作用，我们对SOX9和FOXC1反应基因进行了GSEA，它们分别被鉴定为与高 SOX9和FOXC1表达正相关的基因。结果表明先前确定的MYC信号通路和与乳腺癌发展相关的通路都有着显着富集(图5G)。

总之，我们发现CDK7抑制剂THZ1抑制超级增强子相关致癌因子SOX9的表达，以及SOX9对TNBC重要的特异性基因FOXC1存在转录激活。我们还发现SOX9和FOXC1相互作用，调控重要的癌基因MYC，但正向环可被THZ1阻断(如图6所示)。

三、讨论

自从CDK7抑制剂THZ1被开发以来，它引起了相当大的关注，它显示出对各种肿瘤的有效细胞毒性，特别是对一些缺乏有效治疗方法的恶性肿瘤，如TNBC和小细胞肺癌。然而， THZ1仍然在不同的TNBC细胞系之间存在不同的效应(图1A)。通常认为THZ1可以显著干扰由超级增强子调节的一组癌基因的转录。最近的一项研究发现，扩增的超级增强子相关的 MYCN癌基因，上调激活的转录程序，使癌细胞对神经母细胞瘤中CDK7的抑制变得敏感。在这项研究中，我们证明了超级增强子相关的转录因子SOX9有助于TNBC细胞对THZ1的敏感性。先前的研究已经报道了SOX9在前列腺癌和结直肠癌中的高表达，并且SOX9的过表达促进肿瘤的形成和发展。在这里，我们发现了SOX9作为TNBC中致癌因子的关键作用和临床数据。我们相信SOX9抑制剂将是控制TNBC的有效措施。有趣的是，尽管与激素受体阳性乳腺癌相比，TNBC细胞对THZ1更敏感，但我们发现TNBC中SOX9 mRNA和甲基化水平分别显著高于和低于激素受体阳性乳腺癌，这可能可以解释TNBC和激素受体阳性乳腺癌之间的敏感性的差异。

作为一种转录因子，SOX9可能通过调节一系列转录因子来激活转录网络，GSEA结果反映了这一点。我们的ChIP-seq数据表明，THZ1确实阻断了SOX9与超级增强子的结合，因此为THZ1处理后转录受损提供了令人信服的证据。进一步的ChIP-qPCR证实了THZ1减少SOX9与几个超级增强子相关转录因子附近的增强子的结合，特别是包括FOXC1。FOXC1也是一个重要的转录因子，被认为TNBC中的关键分子标志物，它促进TNBC的恶性表型特征。我们已经通过ChIP-qPCR证明SOX9通过激活其增强子来促进FOXC1的表达。THZ1对结合的干扰可能是THZ1在TNBC细胞中作用的机制。SOX9和FOXC1敲降均可降低MYC蛋白水平，这与我们的推测一致，即SOX9和FOXC1可能介导MYC蛋白翻译和/或稳定性。需要进一步的研究来检测这种可能性，并阐明其潜在的机制。因此，用THZ1抑制SOX9和FOXC1显着降低了 TNBC细胞的致瘤性。

总之，研究表明SOX9高表达的TNBC患者THZ1治疗效果更好。我们通过对SOX9在TNBC中的功能及其与FOXC1关系的综合分析表明，SOX9是一个新的TNBC癌基因。更重要的是，SOX9-FOXC1通路基因的干预可能为TNBC治疗提供潜在的策略。

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2Zhang W,Luo J,Yang F,Wang Y,Yin Y,Strom A et al.BRCA1 inhibits AR–mediated proliferation of breast cancer cells through the activation ofSIRT1.Scientific reports 2016；6.

3Heintzman ND,Stuart RK,Hon G,Fu Y,Ching CW,Hawkins RD et al.Distinctand predictive chromatin signatures of transcriptional promoters andenhancers in the human genome.Nature genetics 2007；39:311-318。

Claims (6)

1.Sox9在预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9的表达水平，Sox9高表达的三阴性乳腺癌患者对THZ1敏感，易受THZ1治疗的影响。

3.Sox9在制备用于预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性试剂盒中的应用。

4.定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9表达水平的试剂在制备用于预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9表达水平的试剂包括引物SOX9-FORWARD和SOX9-REVERSE，

SOX9-FORWARD：AGCGAACGCACATCAAGAC；

SOX9-REVERSE：CTGTAGGCGATCTCTGTGGGG。

6.一种预测三阴性乳腺癌对CDK7抑制剂THZ1敏感性的方法，其特征在于，定量检测三阴性乳腺癌患者癌细胞中Sox9的表达水平，Sox9高表达的三阴性乳腺癌患者对THZ1敏感，易受THZ1治疗的影响。

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