CN113286895A - 用于诊断和治疗脑疾患，尤其是认知障碍的长的非编码RNA(lncRNA) - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种用于在具有患脑疾患例如认知障碍的风险或发展成脑疾患例如认知障碍的的受试者中，治疗处理和/或用于诊断脑疾患的方法，所述脑疾患包括但不限于认知障碍，例如轻度认知损害、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、具有路易体的痴呆。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月5日递交的美国临时申请62/727,210的权益和优先权。
技术领域
本发明涉及人类医学领域，尤其涉及脑疾患的诊断和治疗，尤其是认知障碍，包括具有轻度认知损害的那些疾患、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆和额颞痴呆。本发明涉及一种用于脑疾患(例如认知障碍)的生物标记物，其由外周循环体液(例如血浆或血液)中的和/或在脑组织和/或全血中表达的长的非编码RNA(lncRNA)组成，并代表用于脑疾患的治疗靶标，或者本发明涉及使用该生物标记物用于诊断脑疾患(例如认知障碍，尤其是阿尔茨海默病)或用于监测其发展或进程的非侵入性方法。本发明还涉及用于诊断目的和/或其他人类医学应用的相关试剂盒、方法、方案和信息的可传递形式，包括使用该生物标记物和来自患者的外周体液或全血在临床试验中对患者进行分层和/或监测治疗策略的效率。本发明进一步包括在患有脑疾患，特别是认知障碍的患者中改变的脑特异性lncRNA，其代表用于这些疾病治疗的诊断或治疗候选物。因此，本发明将对患者的生活质量产生重大影响，并将对医疗保健系统和经济产生重大影响。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种慢性神经退行性疾病，其特征在于认知功能的进行性丧失。轻度认知损害(MCI)是主要的首发症状，并逐渐演变成轻度、中度和重度AD阶段。早发性AD发生在30至60岁中期，占所有AD患者的不到10％，是由APP或PSEN1或PSEN2基因突变引起的。大多数患有AD的人具有迟发性形式，症状发生在60岁中、后期。迟发性AD的病因尚不完全清楚，但大多数文献记载的遗传风险因素是载脂蛋白E(APOE)基因等位基因ε4。所有AD形式，无论是早发性家族的还是散发形式，病理学上的特征都在于两个典型的标识：淀粉样斑块中β淀粉样肽(Aβ)(APP基因编码的APP蛋白的代谢产物)的细胞外沉积和高磷酸化的tau蛋白(由MAPT基因编码)在脑中神经原纤维缠结中的细胞内沉积，这与进行性神经元退行性变性相关(Marcus等人.J Neurogenet.2011；25(4):127-33；Gotz等人,Br JPharmacol.2012；165(5):1246-59)。
AD是痴呆的最常见形式。目前，全球约4680万人患有AD或其他类型的痴呆。随着人口的老龄化，估计这一数字到2050年将增加到1.315亿(世界阿尔茨海默病报告，2015年)。因此，在发达国家和新兴国家中，AD对患病者个体及其家庭以及医疗和保健资源的经济和社会成本造成的负担越来越重。
具有路易体的痴呆(DLB)和帕金森氏病性痴呆(PDD)，都被称为路易体痴呆，是65岁以上患者中第二大常见的变性性痴呆，其脑病理学标识是α-突触核蛋白神经元包涵体(路易体和路易神经突)，伴有神经元缺失(Lancet.2015Oct 24；386(10004):1683-97)。三种基因APOE、SNCA和GBA的变体与具有路易体的痴呆的风险增加相关，但是在多数情况下，原因尚不清楚。
额颞叶痴呆(FTD)是在所有年龄组中第三常见的痴呆，而在45-64岁年龄组中是第1或第2(在AD之后)普遍的痴呆。最常见的形式称为行为变异额颞叶痴呆(bvFTD)，其特征(在早期阶段)在于性格、行为和判断力改变。“额颞叶疾患”范畴内的其他疾患包括匹克氏病、原发性进行性失语症、原发性非流利性失语症、语义性痴呆、皮质基底节退行性变性(CBD)综合征、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)伴帕金森氏症和FTD伴肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
FTD系疾患的经典临床表型之间有重叠的临床特征，因此使临床诊断情况复杂化。FTD系疾患还具有共同的潜在分子病理学特征，其中发现具有额颞叶退行性变性，具有tau蛋白、TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)和罕见融合在肉瘤(FUS)中的RNA结合蛋白的神经元和星形细胞包涵体。bvFTD和PPA语言变异与tau、TDP-43或FUS蛋白病相关，而PSP综合征通常与tau蛋白病相关。虽然CBD综合征的病理包括CBD或PSP形式的tau蛋白病(tauopathy)，但也包括β-淀粉样蛋白病/tau蛋白病(典型的AD)，朊病毒蛋白病(prionopathy)、TDP-43蛋白病和α-突触核蛋白病。多达40％的FTD患者有家族病史。所有病例中的10％–20％归因于以下3个基因中或附近的突变：C9orf72(编码蛋白C9orf72)、GRN(编码颗粒蛋白前体)和MAPT(编码tau)。家族性FTD中还发现了更罕见的其他引起遗传突变的基因：由TDP蛋白病引起的FTD的情况：VCP、TARDBP、TIA1、TBK1和CCNF基因；由tau阴性、TDP阴性、泛素阳性病理引起的FTD的情况：CHMP2B和FUS(Lancet.2015Oct 24；386(10004):1672-82；Desmarais P,等人Neurosurg Psychiatry 2019；90:412–423)。
目前，AD或任何其他非AD痴呆类型无法治愈。针对这些疾病有对症治疗，均试图抵消神经递质的紊乱。尽管目前一些新的潜在改善疾病的治疗候选药物正在AD的临床试验中进行研究，但尚未批准。从2002年到2012年，99.6％的AD临床试验(289项2期和3期临床试验)都失败了，涉及针对症状的药物(36.6％)、改善疾病的小分子(35.1％)和改善疾病的免疫疗法(18％)(Cummings等人，Expert Rev Clin Pharmacol.2014；7(2):161-5)。在AD领域和制药行业的全球专家提出的提高AD药物开发成功率的策略中，包括：a)在神经退行性变开始之前早期干预疾病的进展，b)鉴定和开发用于早期诊断的准确生物标记物，其是非侵入性的、适合于对受试者群体分层以及在临床试验中纵向监测药物的疗效。
在死后组织病理学分析中限定了AD的病理特征。在脑中存在两种类型的病变(淀粉样斑块和缠结)，仍然是明确诊断AD所绝对需要的特征。
目前对该病的诊断仍不确定(Dubois等人Lancet Neurol.2014；13(6):614-29)，并且依赖于临床和神经心理学测试与神经影像学的一套组合，例如使用磁共振成像(MRI)和/或使用氟脱氧葡萄糖F18(18F-FDG)的正电子发射断层摄影(PET)的葡萄糖代谢的结构成像，根据方法和疾病的严重性阶段，其准确性低于70％-85％，(Frisoni等人,Nat RevNeurol.2010；6(2):67–77；Tahmasian等人,J Nucl Med.2016；57(3):410-5)。
有时，还要额外检测脑脊液(CSF)中与AD相关的生物标记物Aβ42和tau或磷酸化tau(Sunderland等人,JAMA.2003；289(16):2094-2103)，但CSF测试要求腰椎穿刺，这是一种侵入性程序，通常需要患者住院，因此仅在小部分患者中并且AD的晚期才使用。
纵向确认诊断测试对于AD临床前阶段的早期检测和轻度认知损害(MCI；定义为首次出现细微症状的早期阶段)的应用是重要的，从而早期检测并计算MCI转化为AD的风险。由于其局限性(侵入性)，CSF测试不是在症状出现之前在临床前AD阶段作为早期诊断的常规生物标记物，也不适合作为在纵向临床试验中招募的同一受试者在多个时间点重复操作的同伴生物标记物。
最近，正在开发与AD病理学相关的特定神经影像学方法，尤其是用于正电子发射断层摄影(PET)神经影像学的体内β淀粉样蛋白(Aβ)配体的放射性配体，包括F-18florbetapir和F-18flutemetamol，这些方法已获FDA和/或EMA的批准(Choi等人，2009和Wong等人re010)。然而，它们的实践成本高昂且非常受限(仅在大城市的某些医院中可用，仍主要用于临床研究目的，而健康保险并未对此提供补偿)，并且它们的诊断准确性仍在研究中，以进一步理解。因此，这些AβPET神经影像学方法的使用仍然非常受限，即使在富裕国家，绝大多数患者也无法从此类测试中受益。
有必要对包括在药物开发试验中的AD患者群体进行更好的定义：使用Aβ配体的PET成像显示，高达30％的被诊断为AD的受试者显示Aβ扫描阴性，并且高达35％的具有正常认知状态的受试者显示Aβ扫描阳性(
Chételat等人,NeuroImage Clinical 2013；2:356-65)。因此，PET Aβ扫描被用于指导在大型制药公司进行的一些临床试验中所需群体受试者的招募。在轻度至中度混合型AD患者中测试的抗Aβ抗体(例如Solanezumab)未能显示明确的疗效。在根据CSF生物标记物谱选择的轻度AD患者中，结果显示第一有希望的疗效(Carlson等人,Alzheimers Dement(Amst).2016；2:75-85；Siemers等人,AlzheimersDement.2016；12(2):110-20)。然而，CSF生物标记物的使用是侵入性的，极大地限制了其用作药物开发的生物标记物的用途。例如，它不适合重复使用以监测疾病的稳定性和/或进展，也不适合在临床纵向试验中监测在常规临床实践中使用的改善疾病的候选治疗药物或预防策略的功效。
总体而言，现有测试缺乏用于诊断大的AD群体用途的容易的可及性和简便性、和/或缺乏准确性(灵敏度和特异性)。这代表了开发用于AD的可靠且快速的诊断测试的主要障碍和瓶颈。另一个障碍是不需要侵入性样品收集(例如脊髓穿刺)的生物标记物的鉴定。缺乏可以通过细胞、动物模型、临床前模型和人测试验证的可及的、敏感的和特异的生物标记物，阻碍了AD疗法和药物的开发、或阻碍了触发AD的病理过程或参与AD进展的研究。
目前，很明显，对于有效预防或改善疾病的治疗处理、以及用于早期诊断AD(包括临床前和早期MCI)的准确且非侵入的外周生物标记物测试、以及对于在药物开发中的应用(患者分层和在临床试验中重复监测药物疗效)和监测将来批准后的新疗法的疗效和调整给药，存在迫切的医疗需求。
类似地，对于非AD痴呆(包括DLB)以及对于许多FTD相关的神经退行性疾患，存在迫切的医疗需求，需要有效预防或改善疾病的治疗处理、以及用于诊断(特别是疾病的早期形式)的准确且非侵入的外周生物标记物测试。
lncRNA通常定义为长于200个核苷酸的转录本，在RNA家族中，lncRNA似乎是组织特异性表达最高的。在脑中，lncRNA可以在具有多种功能(包括神经元传递和突触可塑性)的蛋白质的表观遗传、转录和转录后水平上调节基因的表达。最近的研究在AD死后脑组织中鉴定了一些候选lncRNA；在体外实验或动物模型中已经显示一些候选lncRNA直接或间接调节神经毒性Aβ的形成、突触活性或神经元DNA的修复(综述：Luo K and Chen Y,ClinInterv Aging 2016；11:867–872)。
我们在之前表明，在心脏组织或脑组织等组织中表达或高度富集的lncRNA可以释放到外周循环中，并且可以通过经典RT-PCR在不同的外周样品中轻松定量(PCT/EP2018/065492)。除RT-PCR之外，我们还对外周样品进行了总RNA测序，并在外周样品(如血清、血浆和Paxgene-RNA管收集的全血)中定量了显著比例的lncRNA(PCT/EP2018/065492)。
根据本发明，使用组合最新技术和以非侵入方式收集的样品(包括Paxgene管全血、血清和血浆)建立的方法，鉴定了新的脑疾患(特别是轻度认知损害(MCI)和阿尔茨海默病或其他认知障碍)特异的lncRNA标识。
发明内容
在本发明中，首次在人死后脑组织中，特别是在AD患者和认知完好的健康对照的中颞叶皮质中，测序和鉴定了1091个新的脑lncRNA。与健康对照的脑相比，已经鉴定出在AD患者的脑中具有差异表达的脑lncRNA(包括新的脑lncRNA)。此外，已经鉴定出与健康对照相比，在以非侵入方式收集的样品(包括在Paxgene RNA管中收集的全血以及来自患有MCI、AD、DLB或FTD的患者血液的血浆中)差异表达的新lncRNA标识(包含已测序和新测序的)，以及鉴定出与研究的其他痴呆类型相比，可特异性检测MCI和/或痴呆类型(AD、DLB或FTD)之一的组。此外，已经鉴定出脑富集的lncRNA，包括新的脑富集的lncRNA。这些脑富集的lncRNA包括在外周体液血浆和全血Paxgene RNA样品中可检测到的循环lncRNA。
在一方面，鉴定为在AD脑中表达不足的lncRNA(包括新的lncRNA)代表了用于开发lncRNA分子增强的治疗方法的新的候选治疗；鉴定为在AD脑中过度表达的新的脑lncRNA代表了用于开发lncRNA分子沉默的治疗方法的新的候选治疗，二者均可用于治疗脑疾患，尤其是阿尔茨海默病和其他认知障碍。
在另一方面，被鉴定为在患有认知障碍的患者中差异表达的血浆和全血lncRNAs组是潜在的治疗靶标和/或生物标记物，用于在有发展成AD、FTD、DLB和/或其他认知障碍或痴呆类型的风险的受试者中预测和/或诊断和/或鉴别诊断脑疾患，特别是认知障碍。
在另一方面，鉴定出的脑富集lncRNA组代表了脑疾患的治疗和诊断靶标，所述脑疾患包括但不限于认知障碍，例如MCI、AD、FTD、DLB。
可以使用创新的Celemics技术以显著更高的灵敏度、精确性和/或准确性在患者的外周样品中定量新的lncRNA，新鉴定的脑富集lncRNA组(我们称为BrainLinc)，新鉴定的在外周体液中差异表达的lncRNA组(包括脑和血浆(或脑和血液)共同的lncRNA)，这是使用其他当前现有技术无法实现的。通过Cemelics监测大量lncRNA靶标并通过qPCR和Quantamatrix定量少量lncRNA，是相对于其他现有方法(如NGS和HTG)的优选方法。
附图说明
图1显示在早期到中度阿尔茨海默病(AD)的患者和年龄匹配的健康对照的人血清样品中，候选lncRNA lnc-TPPP-1:2、lnc-TMEM185B-12:7、lnc-NAXD-6:5和lnc-HECA-6:1的表达水平。Y轴：CPM中lncRNA浓度平均值的平均值+/-标准误差(每百万计数)。X轴：AD：阿尔茨海默病患者组，HV：健康对照组。
图2显示比较的火山图。火山图在线以上显示在AD组与HV(健康对照)组中差异表达的血清1008个lncRNA，具有统计学显著性(p<0.05)。33个lncRNA的p值小于0.05，而倍数变化≥2或≤0.5。在线以下显示了差异表达但未达到统计学显著性的lncRNA。
图3显示基于随机森林算法的预测建模，其能够鉴定从19867个lncRNA中选择的排名前13位的血清lncRNA候选标识。
图4显示基于随机森林算法的预测建模，其能够从90个lncRNA中鉴定排名前7位的血清lncRNA候选标识，p值<0.05，倍数变化≥2或≤0.5，或AUC≥0.85或≤0.15。
图5显示基于随机森林算法的预测建模，其能够鉴定从90个lncRNA中选择的排名前12位的血清lncRNA候选标识(p值<0.05，倍数变化≥1,6或≤0.6，AUC≥0.85或≤0.15。
图6显示基于随机森林算法的预测建模，其能够鉴定从lncRNA中选择的排名前3位的血清lncRNA候选标识，p值<0.05，并且与进行的神经认知测试(包括7种神经心理学测试中的MMSE和/或MoCA)评分具有良好的相关性(Pearson)。
图7显示基于随机森林算法的预测建模，其能够鉴定从血清lncRNA中选择的排名前7位的lncRNA候选标识，p值<0.05，并且与神经影像学评分具有良好的相关性(Pearson)(与认知和记忆相关的脑结构容积，例如测量的超过120个结构中的中颞叶区、左右海马、左右杏仁核、内嗅皮质)。
图8显示基于随机森林算法的预测建模，其能够鉴定从lncRNA中选择的前18位的血清lncRNA候选标识，其显示p值<0.05，并且与CSF生物标记物Aβ42和tau(总tau或磷酸化的tau)具有良好的相关性(Pearson)。
图9显示血清lncRNA水平与参与认知的脑结构(例如中颞叶区和海马区)的容积神经影像学评分之间的相关性的结果实例。
图10显示血清lncRNA与CSF生物标记物Aβ42或Tau之间的相关性的结果实例。
图11显示鉴定脑和血浆lncRNA的方案。
图12显示鉴定脑和血液(Paxgene RNA)lncRNA的方案。
图13显示当比较6名阿尔茨海默病患者(AD)和6名健康对照受试者(HC)时获得的血浆lncRNA的火山图，和血浆lncRNA LRRC10-1：1的箱线图，其ROC曲线显示其AUC＝1。火山图在线上方显示具有统计学显著性(p<0.05，Wilcoxon检验)的差异表达的lncRNA。在线下方显示差异表达但未达到统计学显著性的lncRNA。
图14显示与5名健康对照受试者的脑相比，在5名阿尔茨海默病患者的脑中差异表达的3个脑lncRNA的实例，其也被鉴定为与6名健康对照受试者相比在6名阿尔茨海默病患者血浆中的循环血浆lncRNA以及差异表达候选。
图15显示2个全血lncRNA的箱线图：与健康对照组相比，在MCI组和痴呆组(AD、DLB、FTD)中一个过度表达，另一个低表达。
图16显示与健康对照组相比，在至少一个患者组中差异表达的2个全血lncRNA的箱线图。与健康对照相比，在所有MCI患者中lncRNA TCONS_00035093表达降低。lncRNATTC21B-AS1：2在大多数MCI和AD患者中显示出增加的表达。
图17显示一组全血lncRNA的实例，可区分HC组与所有其他组，准确性为93.4％。
图18显示靶向测序方法，该方法显示了精确定量所选lncRNA的更高效率。例如，使用FIMICS显示富集了60X的目标序列，占全局测序(使分析结果更加困难)中总序列的1％以下。仅需要8M的读数即可达到100X的覆盖，从而比常规RNA-Seq实验具有更高的精确性。
图19显示热图，其显示许多鉴定出的脑富集lncRNA，这些lncRNA在AD和/或非AD受试者的脑中表达(第1、2列)，但在测试器官中没有表达或表达不佳(第2到13列)。有趣的是，在这些脑富集的lncRNA中，一些是在血浆中表达的循环的脑富集lncRNA。1：AD脑；2：非AD脑；3：肺；4：卵巢；5：结肠；6：前列腺；7：乳腺；8：肝脏；9：膀胱；10：肾；11：皮肤；12：心；13：肌肉；14：血浆。
发明描述
在本公开中公开的lncRNA，包括在本发明中首次鉴定的1091个新的lncRNA，可能参与原发性和继发性脑疾患的发病机理，所述脑疾患包括但不限于神经退行性疾病(特别是阿尔茨海默病和认知障碍)、神经精神疾患(例如抑郁症和焦虑症)、自闭症、神经系统疾患(例如多发性硬化症、运动神经元疾患、中风或全身性疾患相关的)、间接参与神经系统的心血管代谢疾患。因此，这些具有表达改变的lncRNA代表了用于治疗和诊断应用的新靶标。被鉴定为在AD脑中表达改变的新的脑lncRNA可代表新的候选治疗，用于开发治疗脑疾患特别是阿尔茨海默病和其他认知障碍的lncRNA分子沉默的治疗方法。
另外，候选药物或其他药品可能诱发脑毒性，例如自闭症或其他综合症。本发明中鉴定的lncRNA可以用于诊断、预测或监测其毒性或功效。
一方面，本发明涉及lncRNA，其用于在具有患轻度认知损害或认知障碍的风险或发展成轻度认知损害或认知障碍的受试者中治疗脑疾患，特别是轻度认知损害(MCI)和阿尔茨海默病或其他认知障碍，其中治疗包括向受试者施用有效量的药物，所述药物调节(诱导或抑制)lncRNA在脑和/或外周中的表达。药物可以是专门设计的分子，例如小化学实体或生物药用化合物，包括但不限于单克隆抗体、重组蛋白、重组载体驱动治疗剂(包括但不限于AV或AAV重组载体)，其他RNA相关的治疗剂工具。在一些实施方案中，将药物与至少一种药学上可接受的赋形剂一起施用于受试者。在一些实施方案中，所述药物作为口服、静脉内或皮下或脑内治疗被单次或重复地施用于受试者。
在一些实施方案中，用于治疗脑疾患的lncRNA是在本发明中首次鉴定的至少一个新的lncRNA(表7中列出的1091个新的lncRNA)。在一些实施方案中，lncRNA是选自922个lncRNA的至少一个新的lncRNA(表7中列出的倍数变化＜0.9的430个lncRNA，和倍数变化＞1.1的492个lncRNA)。在一个优选的实施方案中，lncRNA是选自以下在本公开中被称为“lncRNA标识12”的组中的至少一个lncRNA：
| 新的lncRNA | TCONS_00033653 | TCONS_00023309 | TCONS_00023401 |
| TCONS_00050539 | TCONS_00040878 | TCONS_00027765 | TCONS_00066358 |
| TCONS_00062555 | TCONS_00000634 | TCONS_00062602 | TCONS_00062306 |
| TCONS_00024916 | TCONS_00050178 | TCONS_00005325 | TCONS_00027438 |
| TCONS_00059198 | TCONS_00055496 | TCONS_00011974 | |
| TCONS_00066462 | TCONS_00033736 | TCONS_00023240 |
在一些实施方案中，用于治疗脑疾患的lncRNA是至少一个基于LINCipedia的lncRNA，其在脑中被测序并且通过本发明鉴定为与健康对照脑相比在阿尔茨海默病或痴呆脑中差异性缺失或过度表达。在一些实施方案中，lncRNA是选自表8中所列的在AD脑中表达水平降低的681个lncRNA和在AD脑中过度表达的521个lncRNA中的至少一个lncRNA。在一个优选的实施方案中，lncRNA是选自以下在本公开中被称为“lncRNA标识13”的组中的至少一个lncRNA：
| lncRNA | lnc-PMM2-6:2 | |
| LINC-PINT:16 | MALAT1:23 | lnc-LTBP3-2:3 |
| lnc-ATP6V1C1-12:1 | MALAT1:48 | MALAT1:11 |
| lnc-GABBR1-1:2 | lnc-LTBP3-2:6 | lnc-LTBP3-2:2 |
在另一个实施方案中，lncRNA是选自以下在本公开中被称为“lncRNA标识42”的组中的至少一个lncRNA：
| LncRNAs | lnc-FEM1B-4:1 |
| lnc-NEK6-2:1 | lnc-GNA14-3:1 |
| lnc-PMM2-6:4 | lnc-PINK1-2:1 |
| UGDH-AS1:10 | lnc-PRSS27-4:24 |
| lnc-RMDN2-3:24 | lnc-SLC25A3-7:1 |
| lnc-EIF1AD-1:1 | lnc-FEM1B-4:1 |
| lnc-FANCL-4:1 | NORAD:2 |
| lnc-FAAP100-2:1 | NORAD:8 |
| TCONS_00011974 | CACTIN-AS1:5 |
在一些实施方案中，用于治疗脑疾患的lncRNA是至少一个脑富集lncRNA，其被鉴定为在脑中可检测到，但在以下外周器官活检样品中未表达或表达减少至少2倍：肺、卵巢、结肠、前列腺、乳房、肝脏、膀胱、肾脏、皮肤、心脏、肌肉。在一些实施方案中，lncRNA是选自表12中列出的860个lncRNA的至少一个lncRNA。在一个优选的实施方案中，lncRNA是选自以下在本公开中被称为“lncRNA标识14”的组中的至少一个lncRNA：
| TCONS_00035022 | TCONS_00035024 | lnc-ENC1-5:1 |
| TCONS_00035023 | TCONS_00035091 | lnc-SNAP25-3:1 |
| TCONS_00035094 | TCONS_00012059 | lnc-HMGA1-2:4 |
| TCONS_00035093 | TCONS_00035092 | PEG3-AS1:1 |
| TCONS_00035021 | TCONS_00012060 | lnc-UNC80-1:1 |
| TCONS_00035090 | TCONS_00050014 |
在一些实施方案中，用于治疗脑疾患的lncRNA是选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识中的至少一个lncRNA。lncRNA标识1至42在本公开下文中定义。
一方面，本发明涉及lncRNA标识，其用于诊断脑疾患，特别是轻度认知损害(MCI)和阿尔茨海默病或其他认知障碍，或用于诊断和鉴别诊断脑疾患类型，尤其是痴呆类型，包括但不限于阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆和额颞叶痴呆。可以使用的lncRNA标识包括已测序的lncRNA和新测序的lncRNA，与健康对照相比，这些lncRNA标识在以非侵入方式收集的样品(包括Paxgene RNA管中收集的全血和患有MCI、AD、DLB和/或FTD的患者血液来源的血浆)中差异表达，以及包括与研究的其他痴呆类型相比，特异性检测MCI和/或痴呆类型(AD、DLB或FTD)之一的组。在一些实施方案中，lncRNA标识选自以下组：
以上42个lncRNA标识可以用于本公开中公开的所有方法或用途。
一方面，本发明涉及用于在具有患轻度认知损害或认知障碍的风险或发展成轻度认知损害或认知障碍的受试者中诊断脑疾患的方法，所述脑疾患包括但不限于认知障碍，例如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和/或具有路易体的痴呆，所述方法包括：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表7-12中列出的lncRNA中的至少一个lncRNA或由其组成；
(c)比较样品中的lncRNA表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(c)之后根据所述鉴定的脑疾患(例如认知障碍)设计治疗处理的步骤。在一些实施方案中，生物样品是全血、血清或血浆。
在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自表9和表12中都列出的lncRNA标识6加8个lncRNA、或在表10或11和表12中列出的55个lncRNA中的至少一个lncRNA，或由其组成(“lncRNA标识41”)。在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自在血浆样品中循环的脑富集lncRNA中的至少一个lncRNA，或由其组成，包括在血浆中循环的新的脑富集lncRNA。在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自6个lncRNA(TCONS_00045364,TCONS_00035023,TCONS_00035091,TCONS_00035022,TCONS_00035092,TCONS_00035093)(“lncRNA标识6”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识6或包含lncRNA标识6。
在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自表9中列出的410个lncRNA、表10中列出的2847个lncRNA和表11中列出的136个lncRNA(“lncRNA标识40”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识包含选自54个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识2或包含lncRNA标识2。
在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是或包含选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识。
一方面，本发明涉及用于在具有患轻度认知损害或认知障碍的风险或发展成轻度认知损害或认知障碍的受试者中诊断脑疾患的方法，所述脑疾患包括但不限于认知障碍，例如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和/或具有路易体的痴呆，所述方法包括：
(a)从受试者中分离生物样品，其中所述生物样品是血浆；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表9中列出的410个血浆lncRNA(“lncRNA标识38”)中的至少一个lncRNA，或由其组成；
(c)比较样品中的lncRNA表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(c)之后根据所述鉴定的脑疾患(例如认知障碍)设计治疗处理的步骤。
在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自6个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-ZC3H12B-1:5)(“lncRNA标识3”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识3或包含lncRNA标识3。
在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自11个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39)(“lncRNA标识4”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在优选的实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识4或包含lncRNA标识4。
一方面，本发明涉及用于在具有患轻度认知损害或认知障碍的风险或发展成轻度认知损害或认知障碍的受试者中诊断脑疾患的方法，所述脑疾患包括但不限于认知障碍，例如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和/或具有路易体的痴呆，所述方法包括：
(a)从受试者中分离生物样品，其中所述生物样品是全血；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表10中列出的2847个lncRNA和表11中列出的个136个lncRNA(“lncRNA标识39”)中的至少一个lncRNA，或由其组成；
(c)比较样品中的lncRNA表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(c)之后根据所述鉴定的脑疾患(例如认知障碍)设计治疗处理的步骤。
在一些实施方案中，lncRNA标识包含选自43个lncRNA(TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识5”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一个优选的实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识5或包含lncRNA标识5。
一方面，本发明涉及用于在具有患轻度认知损害或认知障碍的风险或发展成轻度认知损害或认知障碍的受试者中诊断脑疾患的方法，所述脑疾患包括但不限于认知障碍，例如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和/或具有路易体的痴呆，所述方法包括：
(a)从受试者中分离两个或更多个生物样品(例如血浆和全血)；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表9中列出的410个lncRNA和表10中列出的个2847个lncRNA和表11中列出的个136个lncRNA(“lncRNA标识40”)中的至少一个lncRNA，或由其组成；
(c)比较样品中的lncRNA表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(c)之后根据所述鉴定的脑疾患(例如认知障碍)设计治疗处理的步骤。在一些实施方案中，两个或更多个生物样品是血浆和全血。
在一些实施方案中，lncRNA标识包含选自54个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识2或包含lncRNA标识2。
在一个方面，本发明还涉及一种在患有脑疾患(例如，认知功能丧失或损害、亚型待诊断的痴呆)的受试者中诊断和鉴别诊断脑疾患类型的方法，特别是痴呆类型，包括但不限于阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆和额颞叶痴呆，所述方法包括：
(a)从受试者中分离两个或更多个生物样品(例如血浆和全血)；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表9中列出的410个lncRNA和表10中列出的2847个lncRNA和表11中列出的136个lncRNA(“lncRNA标识40”)中的至少一个lncRNA，或由其组成；
(c)比较样品中的lncRNA表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(c)之后根据所述鉴定的脑疾患(例如认知障碍)设计治疗处理的步骤。在一些实施方案中，生物样品是血浆或全血。
在一些实施方案中，lncRNA标识包含选自54个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识2或包含lncRNA标识2。
在一个方面，本发明涉及一种在患有脑疾患(包括认知功能丧失或损害或痴呆)的受试者中监测脑疾患(包括但不限于认知障碍(例如轻度认知损害)、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆、额颞叶痴呆)进展的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表9中列出的410个lncRNA、表10中列出的2847个lncRNA和表11中列出的136个lncRNA(“lncRNA标识40”)中的至少一个lncRNA，或由其组成；
(c)比较样品中的lncRNA表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(c)之后根据所述鉴定的脑疾患(例如认知障碍)设计治疗处理的步骤。在一些实施方案中，生物样品是血浆或全血。
在一些实施方案中，lncRNA标识包含选自54个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识2或包含lncRNA标识2。
生物样品可以是从体液获得的受试者的一小部分，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、泪液或脑脊液或器官组织。适当地，生物样品是血浆或血清或全血(Paxgene-RNA-管)。
脑疾患是指，例如，认知障碍(例如痴呆类型)、神经退行性疾病、神经或神经精神疾患或系统性疾患，包括以下脑疾患列表中实例的脑疾患：
痴呆的类型和亚型很多，包括，例如
阿尔茨海默病(AD)和AD的MCI型
额颞叶痴呆(FTD)和FTD的MCI型
进行性核上性麻痹(PSP)
皮质基底节变性(CBD)
具有路易体的痴呆(DLB)和DLB的MCI型
帕金森氏病痴呆(PDD)和PDD的MCI型
血管性痴呆和相关的MCI
中风相关的MCI和痴呆
其他痴呆类型
具有认知损害的神经退行性、神经性和神经精神性疾患通常发生在疾病进展的早期或晚期：
帕金森氏病
亨廷顿病
自闭症
肌萎缩性侧索硬化
运动神经元疾病
多发性硬化症
神经病
重度抑郁症
焦虑
累及脑并对脑健康(例如脑认知损害)产生负面影响的全身疾患，包括代谢性疾患(例如糖尿病)、心血管疾病(例如中风)、自身免疫性和炎症性疾患。
脑疾患(包括认知损害或痴呆)的诊断：
“参考”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，该正常健康受试者没有脑疾患或认知损害的症状，也没有异常的神经影像学发现，并且年龄与将用本发明的方法诊断的患者相匹配。参考可以是来自在表现疾患或疾病症状之前、或在诊断出脑疾患或认知功能损害或丧失或痴呆之前，同一受试者的样品。参考可以是标准的样品，例如包含来自健康受试者的几种样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有脑或认知损害症状，也没有异常的神经影像学发现。
对特定痴呆类型或其轻度认知损害(MCI)与其他痴呆类型及其MCI的治疗、诊断或 鉴别诊断：
脑疾患和亚型很多，包括具有痴呆类型和亚型的认知障碍：
痴呆的类型和亚型很多，包括，例如
阿尔茨海默病(AD)和AD的MCI型
额颞叶痴呆(FTD)和FTD的MCI型
进行性核上性麻痹(PSP)
皮质基底节变性(CBD)
具有路易体的痴呆(DLB)和DLB的MCI型
帕金森氏病痴呆(PDD)和PDD的MCI型
血管性痴呆和相关的MCI
中风相关的MCI和痴呆
其他痴呆类型
具有认知损害的神经退行性、神经性和神经精神性疾患通常发生在疾病进展的早期或晚期：
帕金森氏病
亨廷顿病
肌萎缩性侧索硬化
自闭症多发性硬化症
运动神经元疾病
神经病
重度抑郁症
焦虑
累及脑并对脑健康(例如脑认知损害)产生负面影响的全身疾患，包括代谢性疾患(例如糖尿病)、心血管疾病(例如中风)、自身免疫性和炎症性疾患。
为了进行一种脑疾患的鉴别诊断，参考样品可以是来自患有相同类别疾患的另一种脑疾患的患者的样品(例如，对于痴呆亚型的鉴别诊断，参考样品可以是来自患有其他类型痴呆的患者的样品)、和/或从可能患有其他疾病但没有类似于目标脑疾患的症状的受试者样品中获得的参考值(例如，对于痴呆的鉴别诊断，参考样品可以来自不具有认知损害或痴呆的患者)。
本发明还涉及在患有进行性认知功能损害或丧失或痴呆的受试者中诊断脑疾患和监测其发展或进展的方法，所述脑疾患包括但不限于，认知障碍，例如阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、具有路易体的痴呆，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法、使用所述受试者的生物样品确定脑疾患(例如认知障碍)的存在，和
(b)针对步骤(a)的结果调整治疗处理。
本发明还涉及一种在受试者中诊断脑疾患(包括但不限于认知障碍，例如早期MCI和非常轻度的阿尔茨海默病)的方法，当使用可获得的方法检测临床症状时(例如MMSE、MoCA和其他针对认知障碍的神经认知测试)，所述受试者没有明显和/或没有可测量的症状，但在症状出现之前，本发明的生物标记物有异常变化，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法、使用所述受试者的生物样品确定发展成认知障碍的风险，和
(b)针对步骤(a)的结果调整治疗处理。
本发明还涉及一种通过测量本发明的生物标记物与风险因子的组合，将来改善受试者中脑疾患(包括但不限于认知障碍，例如早期MCI和非常轻度的阿尔茨海默病)的诊断的方法，所述风险因子例如，基因型(包括但不限于ApoE基因等位基因)、心血管、代谢、炎性生物标记物，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法、组合上述风险因子之一、使用所述受试者的生物样品确定发展成认知障碍的风险，和
(b)针对步骤(a)的结果调整治疗处理。
本发明还涉及一种在受试者中预测性诊断脑疾患(包括但不限于认知障碍，例如早期MCI和早期阿尔茨海默病、或额颞叶痴呆或具有路易体的痴呆)的方法，所述受试者通过神经影像学方法(如MRI和/或CT扫描)没有明显的和/或可测量的异常，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法、使用所述受试者的生物样品确定发展成认知障碍的风险，和
(b)针对步骤(a)的结果调整治疗处理。
本发明进一步涉及一种在受试者中预测性诊断认知障碍(包括但不限于早期MCI和早期阿尔茨海默病或额颞叶痴呆或具有路易体的痴呆)的方法，所述受试者通过分子神经影像学方法(例如但不限于淀粉样蛋白或tau或多巴胺能或突触核能PET扫描)没有明显的和/或可测量的异常，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法、使用所述受试者的生物样品确定发展成认知障碍的风险，和
(b)针对步骤(a)的结果调整治疗处理。
本发明还涉及一种使用本发明的生物标记物与神经影像学方法(包括分子神经影像学方法)的组合在受试者中诊断或鉴别诊断或监测认知障碍(包括但不限于早期MCI和早期阿尔茨海默病或额颞叶痴呆或具有路易体的痴呆)的方法，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法、使用所述受试者的生物样品确定发展成认知障碍的风险，和
(b)针对步骤(a)的结果调整治疗处理。
本发明还涉及治疗患有进行性认知功能损害或丧失或痴呆的患者的方法，所述方法包括：
(a)使用根据本发明的方法诊断与所述患者的进行性认知功能损害或丧失或痴呆相关的认知障碍，和
(b)针对步骤(a)中获得的结果调整治疗处理。
认知障碍的治疗处理的实例包括施用：
-已被批准用于治疗脑疾患的药物
ο例如，对于已被批准用于治疗阿尔茨海默病的药物，胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、卡巴拉汀或加兰他敏)，或NMDA受体拮抗剂(例如美金刚)，或，例如多奈哌齐和美金刚的组合，和/或
-临床开发中的治疗候选或组合
ο例如，目前在阿尔茨海默病患者的抗淀粉样蛋白领域中测试的，例如β-分泌酶抑制剂和抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体，以及抗tau方法，或者目前在抗tau领域中测试的，例如激酶调节剂或调节tau磷酸化状态的磷酸酶和抗tau抗体，调节神经变性、氧化应激、自噬、线粒体功能障碍和免疫炎症的分子通路的药物和候选药物，和/或
-由本发明衍生的新的治疗方法。
一方面，本发明还提供了用于诊断和/或监测脑疾患(包括但不限于例如MCI、AD、FTD、DLB的认知障碍)的试剂盒，其包含至少一种用于测定lncRNA表达谱的试剂，所述lncRNA表达谱包括：选自表9中列出的410个lncRNA、表10中列出的2847个lncRNA和表11中列出的136个lncRNA(“lncRNA标识40”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA表达谱包含选自54个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA表达谱包括选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA表达谱包括选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA表达谱是lncRNA标识2或包含lncRNA标识2。
本发明的试剂盒允许进行本发明的lncRNA标识的测量，其中所述试剂盒包含至少一种试剂，该试剂用于测量选自如上所述的lncRNA中的至少一个lncRNA。
“试剂”也意指特定允许测定lncRNA表达谱的试剂，即特定用于特异地测定lncRNA表达谱中存在的lncRNA表达水平的试剂。实例包括，例如对lncRNA表达谱中存在的lncRNA具有特异性的扩增引物对(正向和反向)和/或探针。该定义不包括可用于测定任何其他lncRNA表达水平的通用试剂。
在一些实施方案中，用于诊断和/或监测脑疾患(包括但不限于认知障碍，例如MCI、AD、FTD、DLB)的试剂盒包含对目的lncRNA具有特异性的一个或多个寡核苷酸探针，和用于纯化探针-靶核酸复合物的试剂。寡核苷酸探针包含与目的lncRNA的区域互补的序列。寡核苷酸探针可以是DNA或RNA。寡核苷酸探针优选是DNA。对lncRNA具有特异性的寡核苷酸探针的长度可以是30至80个核苷酸，例如40至70个核苷酸，40至60个核苷酸或大约50个核苷酸。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸探针被生物素化，并且用于纯化探针-靶复合物的试剂是链霉亲和素包被的底物，例如链霉亲和素包被的磁性颗粒，例如T1链霉亲和素包被的磁珠。
本发明的另一个实施方案涉及用于下一代测序的靶向测序组，其包含对选自68个lncRNA(TCONS_00050539,TCONS_00062555,TCONS_00024916,TCONS_00059198,TCONS_00066462,TCONS_00033653,LINC-PINT:16,lnc-ATP6V1C1-12:1,lnc-GABBR1-1:2,lnc-PMM2-6:2,MALAT1:23,MALAT1:48,lnc-LTBP3-2:6,lnc-LTBP3-2:3,lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识1”)中的至少一个lncRNA具有特异性的核酸。在一些实施方案中，至少一个lncRNA选自lncRNA标识，所述lncRNA标识选自lncRNA标识1至42。在一些实施方案中，至少一个lncRNA包括选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识，或由其组成。在一个优选的实施方案中，至少一个lncRNA是lncRNA标识1或包含lncRNA标识1。
本发明还涉及开发新的治疗策略(候选药物)的方法，其在临床试验中测试用于治疗脑疾患(包括但不限于认知障碍，例如阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆、额颞叶痴呆)，其中所述方法可用于(a)在开始治疗之前选择将在临床试验中招募的患者；因此，测试将增加治疗的患者群体从测试的治疗策略中受益的可能性，同时避免招募不能从该测试的新候选药物受益的患者亚群和/或(b)用于监测一旦用新的测试候选药物开始治疗后，测试治疗策略的反应，包括疗效。
在另一方面，本发明还涉及检测方法。例如，本发明考虑一种用于检测一个或多个lncRNA的方法。一方面，该方法包括：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包含选自68个lncRNA(TCONS_00050539,TCONS_00062555,TCONS_00024916,TCONS_00059198,TCONS_00066462,TCONS_00033653,LINC-PINT:16,lnc-ATP6V1C1-12:1,lnc-GABBR1-1:2,lnc-PMM2-6:2,MALAT1:23,MALAT1:48,lnc-LTBP3-2:6,lnc-LTBP3-2:3,lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)的至少一个lncRNA，或由其组成。
在一些实施方案中，lncRNA标识包括选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识中的至少一个lncRNA，或由其组成。在一些实施方案中，lncRNA标识是或包含选自lncRNA标识1至42中的lncRNA标识。在一个优选的实施方案中，lncRNA标识是lncRNA标识1或包含lncRNA标识1。
lncRNA的表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何技术来确定。特别地，通过测量每个lncRNA的核酸转录本的量来确定lncRNA的表达水平。核酸转录本的量可以通过本领域技术人员已知的任何技术来测量。可以通过本领域公知的技术直接在提取的RNA样品上进行测量、或从提取的RNA制备的逆转录互补DNA(cDNA)上进行测量。可以使用本领域技术人员已知的任何技术从RNA或cDNA样品中测量核酸转录本的量，所述技术包括核酸微阵列、定量PCR、测序(例如，下一代测序)、FIMAP定量和用标记的探针杂交。
在一些实施方案中，使用测序(例如下一代测序)确定lncRNA的表达水平。可以在使用逆转录酶将提取的RNA转换为cDNA后进行测序，也可以直接对RNA分子进行测序。在不应被认为限制本发明范围的特定实施方案中，可以如下进行使用下一代测序对表达水平的测量。简而言之，从样品(例如血液样品)中提取RNA。除去rRNA后，然后将RNA样品逆转录为cDNA。为确保链特异性，首先在放线菌素D存在的情况下，使用Super-Script II逆转录酶和随机引物合成单链cDNA，然后将其转化为具有第二链标记混合物的双链cDNA，该标记混合物掺入dUTP代替dTTP。使用AMPure XP磁珠纯化所得的平末端cDNA。在3'末端腺苷酸化步骤后，将适体连接至cDNA。这样可以通过PCR扩增获得的cDNA(测序文库)。可以通过本领域技术人员已知的任何下一代测序技术来测序测序文库。
在一些实施方案中，通过在测量之前捕获和富集目的ncRNA对应的核酸(RNA或cDNA)来促进lncRNA的表达水平的测量，例如通过测序(例如，下一代测序)。如本文所用，富集是指通过选择性地纯化目的核酸来增加样品中目的核酸相对于初始样品的百分比。可以在提取的RNA样品或从提取的RNA制备的cDNA样品上进行对应于目的lncRNA的核酸的富集。在一些实施方案中，在允许探针与靶核酸杂交以形成探针-靶核酸复合物的条件下，通过使RNA或cDNA样品与对目的lncRNA特异的寡核苷酸探针(例如，包含与目的lncRNA的区域互补的序列的寡核苷酸探针)杂交，捕获和富集对应于目的lncRNA的核酸。探针可以是DNA或RNA，优选DNA。对lncRNAs特异的探针的长度可以是30至80个核苷酸，例如40至70个核苷酸、40至60个核苷酸或大约50个核苷酸。探针-靶核酸复合物可以通过本领域技术人员已知的任何技术来纯化。在一个优选的实施方案中，探针被生物素化。可以通过使用链霉亲和素包被的底物，例如链霉亲和素包被的磁性颗粒，例如T1链霉亲和素包被的磁珠，来纯化生物素化的探针-靶核酸复合物。
在一些实施方案中，可以使用定量PCR测定lncRNA的表达水平。定量或实时PCR是本领域技术人员众所周知的且容易获得的技术，不需要精确的描述。在不应被认为限制本发明范围的特定实施方案中，使用定量PCR测定表达谱可以如下进行。简而言之，使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行实时PCR反应。将6μl cDNA添加到9μl PCR混合物中，所述PCR混合物包含7.5μl TaqMan Universal PCR Master Mix，0.75μl 20X探针和引物的混合物以及0.75μl水。该反应由以下步骤组成：在50℃下2分钟的一个引发步骤，然后在95℃下10分钟，40个循环的扩增(包括95℃、15秒；60℃、1分钟)。反应和数据采集可使用ABI 7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行。通过记录指数期的扩增循环(循环阈值或CQ或CT)来确定样品中模板转录本分子的数量，在该指数期可以检测到高于背景荧光的荧光信号。因此，模板转录本分子的起始数量与CT成反比。
在一些实施方案中，lncRNA的表达水平可以通过使用核酸微阵列来测定。核酸微阵列由附着至基质的不同核酸探针组成，基质可以是微芯片、载玻片或微球大小的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素组成。探针可以是核酸，例如cDNA(“cDNA微阵列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微阵列”)。为了测定靶核酸样品的表达谱，标记所述样品，使其在杂交条件下与微阵列接触，导致在与附着至微阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物的存在。微阵列杂交技术的许多变形对本领域技术人员而言是可用的。
在一些实施方案中，可以通过FIMAP定量测定lncRNA的表达水平。简而言之，使用与经化学修饰的qPCR相同序列的引物，通过PCR扩增lncRNA。正向引物在5'被磷酸化，反向引物在5'被生物素化。使用核酸外切酶消化PCR产物，以消除磷酸化链，仅保留生物素化链。将生物素化的PCR产物与包被与目的RNA互补的寡核苷酸的编码的二氧化硅微盘(每个靶寡核苷酸一个代码)孵育，并通过添加荧光链霉亲和素缀合物显示杂交产物。通过测量荧光信号来测定lncRNA的表达水平。
在另一方面，检测方法考虑使用试剂来测量或检测一个或多个lncRNA。“试剂”意指专门特定测定lncRNA表达谱的试剂，即专门用于特异地测定lncRNA表达谱中存在的lncRNA表达水平的试剂。实例包括，例如扩增引物对(正向和反向)和/或lncRNA表达谱中存在的lncRNA。该定义不包括可用于测定任何其他lncRNA表达水平的通用试剂。
在另一方面，检测方法包括从生物样品中检测一个或多个lncRNA，其中所述生物样品选自血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓液、泪液、唾液。在一些实施方案中，生物样品是血液。
通过“治疗”或“治疗”处于发展成认知障碍的风险的受试者或患有认知障碍的受试者，特别是进行性损害或认知功能丧失或痴呆的受试者，例如AD、FTD、DLB，是指向有此需要的受试者施用或施用方案，以使该疾患或疾病的至少一个症状被治愈、减轻、挽救或改善。根据本发明，根据诊断结果，对受试者进行调整的治疗处理，并进一步监测。基于本发明的lncRNA标识的受试者监测允许进一步调整或改变治疗处理，例如增加药物量、施用药物组合以获得协同作用、或用有效量的另一种药物替代该药物。
本发明还涉及改变患有脑疾患(例如认知障碍)的受试者的治疗策略，所述受试者已经使用根据本发明的(体外)诊断或监测进行性脑功能(例如认知功能的损害或丧失或痴呆)的方法进行诊断和/或监测。
根据本发明，本发明的lncRNA可以与一种或多种目前用于诊断认知障碍(包括但不限于MCI、AD、FTD、DLB)的生物标记物组合使用。此类生物标记物的实例包括但不限于USP9,377,472,USP 7,897,786和USP 6,703,212,PCT/EP2018/073905/PCT/EP2018/073905中公开的生物标记物，其内容通过引用并入本文。将本发明的lncRNA与一种或多种已知的生物标记物组合的本发明的方法，可允许提高诊断或鉴别诊断的准确性；允许更有效、更成功的药物开发，例如，提高招募临床试验的患者之前患者分层的准确性，以及监测批准的疗法或开发中的新药的疗效。
根据本发明，本发明的lncRNA可以与一种或多种目前用于诊断认知障碍(包括但不限于AD、FTD、DLB)和/或用于鉴别诊断目的的测试组合使用。这样的测试的实例包括但不限于神经心理学测试，例如MMSE、MoCA、FCSRT测试和神经影像学方法，特别是使用对淀粉样蛋白、Tau、α-突触核蛋白或其他分子具有特异性的配体的体积MRI和分子神经影像学PET方法，以使脑中的蛋白质病形可视化。将本发明的lncRNA与一种或多种已知的生物标记物组合的本发明的方法，可以允许提高诊断或鉴别诊断的准确性；允许更有效、更成功的药物开发，例如，提高招募临床试验的患者之前患者分层的准确性，以及监测批准的疗法或开发中的新药的疗效。
根据本发明，新的治疗方法包括将本发明首次在脑中鉴定的lncRNA的表达和/或量标准化，这些方法可以用作脑疾患的治疗(单独或与现有的和新的其他疗法组合)，所述脑疾患的特征在于本发明鉴定的此类新lncRNA的表达或量的改变。
根据本发明，鉴定的脑富集lncRNA、在血浆、血清、血液或其他体液中鉴定的循环lncRNA可以用于设计和开发新的治疗处理以及用于脑疾患的诊断应用，所述脑疾患的特征在于本发明鉴定的此类循环lncRNA的表达或量的改变。
根据本发明，通过本发明在脑或外周体液中鉴定为在脑疾患(例如认知障碍(MCI、AD、DLB和/或FTD))中差异表达的改变的lncRNA，可以用于设计和开发新的治疗处理以及用于脑疾患的诊断应用，所述脑疾患的特征在于本发明鉴定的此类lncRNA的表达或量的改变，在脑或外周体液中差异表达。
为了鉴定特异地参与AD发病机制和AD类型中的轻度认知损害(MCI)的lncRNA标识，筛选了来自不同组(包括AD或AD型MCI的患者和无脑影像学异常的认知完好的健康对照组)的样品中共127802个lncRNA。随后在所有样品的lncRNA分析中，检测出19867个lncRNA超过阈值。通过比较不同组样品中测量的lncRNA表达水平，与被诊断患有AD或AD型认知损害的患者组(在神经科临床站点，基于神经认知和神经心理学测试以及神经影像学测试以及脑脊髓液生物标记物：β-淀粉样肽1-42(Aβ42)和tau(全部和/或磷酸化))样品中的表达水平相比，对照组样品中差异表达的lncRNA被鉴定为候选lncRNA生物标记物。
使用双尾Welch t检验和/或Wilcoxon Mann-Whitney检验，对两组之间的表达水平进行了分析。显著的差异表达被鉴定为p<0.05。对每个lncRNA和每种测试条件，计算倍数变化和AUC(曲线下面积)。
当基于倍数变化≥1.6(或≤0.6)和/或AUC≥0.80(或<0.20)确定差异表达时，还选择了候选血清lncRNA，示于表2和表3。
随机森林算法(Breimann 2001，Breiman和Cutler 2001)用于构建模型，还用于选择前面的lncRNA。基于前2-20个lncRNA的组合的预测建模能够以≥80％的准确性预测疾病。
在测序的127802个血清lncRNA中，基于其阈值表达水平选择了19867个lncRNA进行统计分析。AD患者与健康对照群体的比较显示1008个lncRNA差异表达，具有统计学显著性(p值<0.05，Wilcoxon检验)(表1)。这些1008个lncRNA的序列显示在本申请中包含的序列表中。
表1：与健康对照组相比，AD组中差异表达的1008个血清lncRNA的序列号、p值、平均值+/-SD、倍数变化和AUC(p值<0.05，Wilcoxon检验)
在1008个具有统计学显著性(p值<0.05)的差异表达的血清lncRNA中，33个lncRNA显示倍数变化>2或<0.5，如表2所示。
表2：具有统计学显著性(p<0.05，Wilcoxon检验)且倍数变化>2或<0.5的显示差异表达的33个血清lncRNA的平均值+/-SD
在1008个具有统计学显著性(p值<0.05)的差异表达的血清lncRNA中，60个lncRNA显示AUC≥0.85，如表3所示。
表3：P值<0.05且个体AUC值AUC≥0.85的60个血清lncRNA
使用所分析的共19867个血清lncRNA时，基于随机森林算法的区分AD患者和健康对照群体的预测建模，能够显示使用以下13个lncRNA，作为lncRNA数量的函数AUC达到了平台。这13个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(轻度AD患者和健康对照群体)，AUC值＝0.993，准确性＝95.8％，灵敏度＝100％，特异性＝91.7％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-DLG5-1:1 | 1 |
| lnc-EBLN1-1:4 | 2 |
| lnc-FAT1-7:2 | 3 |
| lnc-PRR5-5:1 | 4 |
| lnc-RBKS-6:1 | 5 |
| lnc-FOXD4L5-35:1 | 6 |
| lnc-TENM3-3:3 | 7 |
| lnc-FAM133B-2:1 | 8 |
| lnc-ZNF726-1:3 | 9 |
| lnc-AP3M1-1:1 | 10 |
| lnc-DUSP10-6:1 | 11 |
| lnc-TPPP-1:2 | 12 |
| LINC01206:20 | 13 |
在具有统计学显著性的差异表达的1008个血清lncRNA中(p值<0.05)，将倍数变化>2(或<0.5)或AUC≥0.85(或≤0.15)的90个lncRNA用于基于随机森林算法的建模。结果显示，通过以下排名前7的候选物，能够完全区分AD和HV组，其中AUC值为100％，准确性为100％，灵敏度为100％，特异性为100％。
| lncRNA | 排名 |
| LINC02345:11 | 1 |
| lnc-EBLN1-1:4 | 2 |
| lnc-TPPP-1:2 | 3 |
| lnc-TENM3-3:3 | 4 |
| lnc-FAT1-7:2 | 5 |
| lnc-DKK1-5:3 | 6 |
| lnc-TACSTD2-2:4 | 7 |
当应用另一过滤，考虑倍数变化≥1.6且AUC≥0.85的lncRNA列表，使用随机森林算法使得能够选择以下排名前12的血清lncRNA来构建模型，从而使得能够区分AD和HV群体，其仍然具有出色的AUC＝0.979，出色的准确性95.8％，灵敏度为91.7％，特异性为100％。
进一步为了选择最佳的候选血清lncRNA，使用随机森林算法对一组特定的候选lncRNA进行建模，该组候选lncRNA在AD患者与健康对照群体中具有统计学上显著的差异表达，并且与进行的神经认知测试(包括7种神经心理学测试中的MMSE和/或MOCA)的评分具有良好的相关性(Pearson R系数)(表4)：结果表明，以下排名前3的lncRNA标识使得能够出色地区分AD患者与健康对照群体，AUC＝0.953，准确性、灵敏度和特异性分别为91.7％、91.7％和91.7％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-TENM3-3:3 | 1 |
| lnc-MARCH4-2:7 | 2 |
| lnc-LRRC1-5:2 | 3 |
表4：与神经认知测试MoCA、MMSE相关的本发明的血清lncRNA。R：相关系数(Pearson)。HV：健康对照组，AD：轻度至中度AD组
使用随机森林算法的建模还应用于表5中一组特定的候选血清lncRNA，这些候选血清lncRNA在AD患者与健康对照群体中具有统计学上显著的差异表达，并且与神经影像学评分(与认知和记忆相关的脑结构容积，例如测量的超过120个结构中的中颞叶区、左右海马、左右杏仁核、内嗅皮质)具有良好的相关性(Pearson)：结果表明，以下排名前7的lncRNA标识使得能够出色地区分AD患者与健康对照群体，AUC＝0.993，准确性＝95.8％，灵敏度＝91.7％，特异性＝100％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-TPPP-1:2 | 1 |
| lnc-TENM3-3:3 | 2 |
| lnc-TMEM185B-12:7 | 3 |
| lnc-NAXD-6:5 | 4 |
| lnc-HECA-6:1 | 5 |
| lnc-COMMD6-10:1 | 6 |
| MIR29B2CHG:46 | 7 |
表5：与MRI(脑结构的容积)相关的本发明的血清lncRNA。R：相关系数(Pearson)。HV：健康对照组，AD：轻度至中度AD组。
还使用随机森林算法对表6中的一组特定的候选血清IncRNA进行了建模，这些候选血清IncRNA在AD患者与健康对照群体中具有统计学上显著的差异表达，并且与AD病理学高度相关的CSF生物标记物水平具有良好的相关性(Pearson)：Aβ42、tau或磷酸化tau：结果表明，以下排名前18的lncRNA标识使得能够出色地区分AD患者与健康对照群体，AUC＝0.972，准确性＝0,917，灵敏度＝0.83，特异性＝1。
| lncRNA | 排名 | lncRNA | 排名 |
| lnc-TPPP-1:2 | 1 | lnc-DNALI1-5:4 | 10 |
| LINC02345:11 | 2 | RORB-AS1:6 | 11 |
| lnc-ZNF273-4:4 | 3 | lnc-TPPP-1:3 | 12 |
| lnc-TACC2-8:6 | 4 | lnc-BMS1-2:1 | 13 |
| LINC01206:20 | 5 | lnc-ADRB1-4:1 | 14 |
| lnc-C5orf67-3:1 | 6 | lnc-XXYLT1-5:1 | 15 |
| HAND2-AS1:58 | 7 | MIR99AHG:104 | 16 |
| lnc-PRDM9-20:1 | 8 | LINC01748:17 | 17 |
| lnc-CLK1-1:7 | 9 | lnc-AKR1E2-15:1 | 18 |
表6：与CSF生物标记物相关的本发明的血清lncRNA
为了鉴定用于治疗应用的特异地参与脑疾患(特别是MCI、AD)的其他脑lncRNA，使用冷冻组织样品(由来自AD患者(组织病理学上显示典型的AD病变的组织：淀粉样斑块和缠结)和来自非痴呆的健康对照组(HC)受试者(无AD和其他病变的组织)的死后脑中颞叶皮质组成)进行基于LNCipedia(一种用于注释人lncRNA转录本序列和结构的数据库)的新lncRNA和127802个lncRNA的深度测序和定量实验。
在AD和/或HC脑中总共鉴定出1091个新的lncRNA。随后将这些新的1091个lncRNA添加到已测序的127802个lncRNA的列表中，在脑的所有实验中分析总计128,894个lncRNA。表7中显示了1091个新的lncRNA。
表7：通过本发明鉴定的1091个新的lncRNA以及倍数变化和p值(AD组与健康对照组的差异表达)。
在1091个新的脑lncRNA中(表7)，492个lncRNA显示倍数变化>1.1，431个lncRNA显示倍数变化<0.9，分别代表用于沉默或增强脑中此类lncRNA的潜在新的治疗候选物，用于治疗脑疾患，特别是认知障碍，例如MCI和阿尔茨海默病。
在1091个新的脑lncRNA中，一些优选的新的候选lncRNA用于治疗应用，而没有或具有有限的外周副作用，例如，那些新的脑lncRNA在脑中的倍数变化≤0.5或≥2，且p值<0.05，而在外周组织和外周体液(如血液)中表达低或无表达。
通过本发明在AD和对照脑中测序的、并且表达>5CPM(中值)的总数为10122个新的和来自LINCipedia的lncRNA中，鉴定出1202个lncRNA，包括42个新的lncRNA，这些lncRNA在比较AD脑和HC脑时，显示出在统计学上显著的差异表达。该1202个lncRNA在表8中列出，并且代表用于治疗认知障碍，特别是MCI和阿尔茨海默病的治疗候选物。
表8：相对于人健康对照脑颞叶皮质，通过本发明鉴定的具有已知序列的1202个lncRNA在人AD脑颞叶皮质中表达不足(FC≤0.84)或过度表达(FC≥1.22)。
包含28个新lncRNA的386个lncRNA表现出(i)在死后脑中高表达(CPM>25)，(ii)在AD脑与HC脑中显著的差异表达，以及(iii)在活着的AD患者或健康对照者的血浆和血液(Paxgene)中无表达或低表达(<5CPM)。表7和表8列出了这386个lncRNA，其谱也包括在表7和表8中。
为了鉴定特异性参与脑疾患病发病机制(包括但不限于认知障碍，例如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)、额颞叶(FTD)痴呆和/或具有路易体的痴呆(DLB))的外周体液、血液和血浆lncRNA标识中的循环lncRNA的诊断和治疗应用，筛选了总共128,893个lncRNA，包括1091个新的lncRNA和127802个基于LNCipedia的lncRNA，并分析了AD病例和非痴呆病例脑中、以及不同受试者组的血浆和/或全血样品，所述受试者组包括一组MCI患者、一组轻度AD患者、一组中度至重度AD患者、一组DLB患者和一组FTD患者、以及参考对照组，该参考对照组为具有正常的神经认知评分且没有脑影像学异常的认知完好的健康对照组。
随后，在所有样品中的128894个lncRNA中，脑样品中53747个lncRNA、血浆样品中35618个lncRNA、全血(Paxgene RNA管)样品中71132个lncRNA被检测到在实验包括的样品的样品中具有至少一个计数水平。在至少一个研究受试者组的50％样品中进一步应用表达水平>5CPM的其他阈值，保留了以下数量的lncRNA用于统计分析：10122个脑lncRNA、3774个血浆lncRNA和9367个全血lncRNA。
对于每个lncRNA，使用双尾Welch t检验和/或Wilcoxon Mann-Whitney检验通过比较两组(例如AD组和健康对照组)之间的表达水平来确定差异表达水平。显著的差异表达被鉴定为p<0.05。410个lncRNA在AD血浆和HC血浆中差异表达，具有统计学上的显著性(p<0.05，Wilcoxon检验)，倍数变化FC<0.80或>1.20。表9显示了410个血浆lncRNA。
表9：在AD血浆与HC血浆中差异表达的410个血浆lncRNA。
与健康对照组相比，2847个lncRNA在MCI组或轻度AD组或中度至重度或这两个AD组或FTD组或DLB组全血(Paxgene RNA管)中差异表达，具有统计学上的显著性(p值<0.05，Wilcoxon检验)和倍数变化FC≤0.80或≥1.20。与健康对照组相比时，这些lncRNA在至少一个疾病组中显示差异表达，具有统计学上的显著性(p值<0.05，Wilcoxon)。表10显示了2847个lncRNA。
表10：与健康对照组相比，2847个全血(Paxgene RNA管)lncRNA在MCI组或轻度AD组或中度至重度AD组或这两个AD组或FTD组或DLB组中差异表达。
为了进一步鉴定在AD患者中差异表达的lncRNA，将AD患者中的全血(Paxgene RNA管)表达与非AD受试者组进行了比较。与非AD受试者组(DLB+FTD组或DLB+FTD+HC组)相比时，AD患者组(轻度AD+中度至重度AD组)的全血(Paxgene RNA管)中136个lncRNA差异表达，具有统计学上的显著性(p值<0.05，Wilcoxon检验)，倍数变化FC≤0.80或≥1.20。表11显示了136个lncRNA。
表11：与非AD受试者组(DLB+FTD组或DLB+FTD+Hc组)相比时，136个全血(PaxgeneRNA管)lncRNA在AD患者组(轻度AD+中度至重度AD组)中差异表达。
脑富集的lncRNA：在本发明在AD和对照脑中测序的表达水平>5CPM(中值)的10122个lncRNA中，860个lncRNA表现出在脑中的表达水平是外周器官肺、卵巢、结肠、前列腺、乳腺、肝脏、膀胱、肾脏、皮肤、心脏、肌肉中的2倍。表12显示了860个lncRNA。
表12：860个脑富集的lncRNA在脑中的表达水平是12个外周器官中的表达水平的至少2倍。
检查了本发明中鉴定的31个lncRNA与神经认知MMSE(小精神状态检查)测试或脑脊液CSF生物标记物Aβ和Tau或磷酸化的tau或年龄之间的相关性。结果示于表13。
表13.血液lncRNA与神经认知MMSE测试或脑脊液CSF生物标记物Aβ和Tau或磷酸化的tau或年龄之间的相关性。
在所有检查的lncRNA中，除ANKRD36-1-4以外，在通过广义线性模型进行年龄调整后，针对受试者组与年龄的相关性仍然保持显著性，表明所选择的lncRNA与受试者组相比的差异表达并非仅由于年龄的影响，而是疾病影响，突出了它们与相应痴呆类型的诊断和/或治疗应用的相关性。
为了进一步选择最佳的候选lncRNA，针对每个lncRNA和每种测试条件计算了倍数变化(FC)和AUC。基于比较两组时的合适的倍数变化(FC)(例如FC>1.2(或<0.8))和/或合适的AUC(例如AUC>0.65(或<0.35))确定差异表达，选择候选lncRNA。随机森林算法(Breimann2001，Breiman和Cutler 2001)用于构建模型，还用于选择排名前面的lncRNA。基于包含至少2个lncRNA的排名前面的候选者列表的组合的预测建模，使得能够预测疾病，准确性≥65％，高达100％。
当使用表11中所示的在全血样品中可测量的、且AUC≥0.8(或≤0.2)的总共844个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分轻度认知损害(MCI)患者和健康对照群体，能够显示使用以下2个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这2个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识能够区分两个群体(轻度认知损害患者和健康对照群体)，AUC值＝1，准确性＝100％，灵敏度＝100％，特异性＝100％。
| lncRNA | 排名 |
| TCONS_00035093 | 1 |
| lnc-OCM-3:4 | 2 |
当使用表11中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.7(或≤0.3)的总共500个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分轻度AD患者和健康对照群体，能够显示使用以下7个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这7个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(轻度AD患者和健康对照群体)，AUC值＝0.954，准确性＝91％，灵敏度＝90％，特异性＝91％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-KIF14-1:2 | 1 |
| PCBP1-AS1:302 | 2 |
| lnc-CA6-8:1 | 3 |
| NEAT1:22 | 4 |
| lnc-CA6-8:2 | 5 |
| STARD7-AS1:5 | 6 |
| lnc-IL31RA-1:1 | 7 |
当使用表11中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.65(或≤0.35)的总共605个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分中度至重度AD患者和健康对照群体，能够显示使用以下6个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这6个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(中度至重度AD患者和健康对照群体)，AUC值＝0.922，准确性＝83％，灵敏度＝70％，特异性＝91％。
当使用表11中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.65(或≤0.35)的总共1124个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分所有AD患者(轻度+中度至重度)和健康对照群体，能够显示使用以下7个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这7个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(AD患者和健康对照群体)，AUC值＝0.954，准确性＝91％，灵敏度＝88％，特异性＝92％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-CA6-8:2 | 1 |
| lnc-CA6-8:1 | 2 |
| RBM26-AS1:1 | 3 |
| PCBP1-AS1:302 | 4 |
| MIR181A2HG:1 | 5 |
| TTC21B-AS1:2 | 6 |
| lnc-SOCS6-10:1 | 7 |
当使用表11中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.8(或≤0.2)的总共1352个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分具有路易体的痴呆患者和健康对照群体，能够显示使用以下2个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这2个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(具有路易体的痴呆患者和健康对照群体)，AUC值＝1，准确性＝100％，灵敏度＝100％，特异性＝100％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-OCM-3:4 | 1 |
| lnc-SLC35E3-8:1 | 2 |
当使用表4中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.8(或≤0.2)的总共1041个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分额颞叶痴呆患者和健康对照群体，能够显示使用以下3个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这3个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(额颞叶痴呆患者和健康对照群体)，AUC值＝1，准确性＝100％，灵敏度＝100％，特异性＝100％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-ZCCHC13-4:1 | 1 |
| PCBP1-AS1:302 | 2 |
| lnc-NEMF-1:4 | 3 |
当使用表11、12中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.65(或≤0.35)的总共6个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分所有AD患者的群体和NAD(FTD+DLB)患者群体，能够显示使用以下6个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这X6个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(AD患者和患有其他类型痴呆的群体)，AUC值＝0,804，准确性＝79％，灵敏度＝56％，特异性＝91％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-STAT3-1:2 | 1 |
| lnc-NEMF-1:4 | 2 |
| lnc-EPN2-3:2 | 3 |
| lnc-SLC25A39-2:1 | 4 |
| lnc-ARF6-1:1 | 5 |
| lnc-CCNYL1-2:1 | 6 |
当使用表4中所示的在全血中可测量的、且AUC≥0.65(或≤0.35)的总共5个lncRNA时，基于随机森林算法的预测建模用于区分所有AD患者的群体和DLB、FTD患者+健康对照群体，能够显示使用以下5个lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这5个lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标识可以区分两个群体(AD群体和患有其他类型痴呆的群体、或具有正常认知状态的群体)，AUC值＝0,811，准确性＝72％，灵敏度＝61％，特异性＝81％。
| lncRNA | 排名 |
| ANKRD44-IT1:1 | 1 |
| APOBEC3B-AS1:2 | 2 |
| ADAMTSL4-AS1:2 | 3 |
| AGAP2-AS1:2 | 4 |
| A1BG-AS1:14 | 5 |
在诊断方面，为了进行鉴别诊断，还鉴定了其他几个lncRNA组，例如下面列出的那些，其至少包含来自表11、12的3个lncRNA，并且能够特异性地检测每种痴呆类型：
| 组实例1 | 组实例2 | 组实例3 | 组实例4 |
| LEF1-AS1:1 | lnc-CGREF1-2:1 | TCONS_00011994 | OIP5-AS1:36 |
| PCBP1-AS1:302 | PSMB8-AS1:14 | lnc-EVX1-15:1 | MYLK-AS1:13 |
| lnc-CA6-8:2 | lnc-STX10-2:1 | lnc-REC8-2:1 | lnc-PCP4L1-3:2 |
| lnc-TCFL5-6:1 | |||
| ZC3H12B-11:1 |
在全血中表达的以下排名前11的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分HC组与所有其他组(MCI、所有AD、DLB、FTD)，AUC＝0.963，准确性＝93.4％，灵敏度＝65％，特异性＝98.3％。
| lncRNA | 排名 |
| PCBP1-AS1:302 | 1 |
| STARD7-AS1:5 | 2 |
| lnc-NID1-4:4 | 3 |
| RBM26-AS1:1 | 4 |
| LEF1-AS1:1 | 5 |
| lnc-CA6-8:1 | 6 |
| lnc-CA6-8:2 | 7 |
| lnc-OCM-3:4 | 8 |
| lnc-AFG1L-7:1 | 9 |
| lnc-LASP1-5:1 | 10 |
| lnc-GCGR-1:2 | 11 |
在全血中表达的以下排名前7的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分HC组与患有轻度AD的患者，准确性＝90,7％，灵敏度＝90％，特异性＝91.2％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-KIF14-1:2 | 1 |
| PCBP1-AS1:302 | 2 |
| lnc-CA6-8:1 | 3 |
| NEAT1:22 | 4 |
| lnc-CA6-8:2 | 5 |
| STARD7-AS1:5 | 6 |
| lnc-IL31RA-1:1 | 7 |
在全血中表达的以下排名前7的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分HC组与患有中度至重度AD的患者，准确性＝83,3％，灵敏度＝70％，特异性＝91.2％。
在全血中表达的以下排名前3的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分HC组与具有路易体痴呆的患者，准确性＝100％，灵敏度＝100％，特异性＝100％。
| lnc-OCM-3:4 | 1 |
| lnc-SLC35E3-8:1 | 2 |
| LINC-PINT:11 | 3 |
在全血中表达的以下排名前2的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分HC组与患有额颞叶痴呆的患者，准确性＝100％，灵敏度＝100％，特异性＝100％。
| lnc-ZCCHC13-4:1 | 1 |
| PCBP1-AS1:302 | 2 |
在全血中表达的以下排名前5的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分AD患者(轻度AD患者和中度至重度AD)和非AD痴呆组(FTD+DLB)，准确性＝76,5％，灵敏度＝55.9％，特异性＝86.8％。
| lncRNA | 排名 |
| lnc-JUNB-1:1 | 1 |
| lnc-RARB-4:1 | 2 |
| lnc-ZNF284-1:1 | 3 |
| TCONS_00035093 | 4 |
| lnc-TELO2-3:3 | 5 |
在全血中表达的以下排名前5的lncRNA的标识(Paxgene RNA样品)能够出色地区分AD患者(轻度AD患者和中度至重度AD)和非AD痴呆组(FTD+DLB)，准确性＝82,4％，敏感性＝61.8％，特异性＝92.6％。
材料与方法
为了鉴定脑、血清、血浆、全血或人受试者的其他样品中的lncRNA，首先提取总RNA并通过去除核糖体RNA制备测序文库(RiboZero TruSeq文库制备试剂盒，Illumina Inc.，圣地亚哥，美国)，并在Illumina NextSeq500上测序，读取长度为2x75 bp。
还使用特异性引物通过qPCR测量了lncRNA。为此，首先提取总RNA，使用特异性引物进行逆转录和实时PCR。使用FiMAP(也称为Quantamatrix QMAP平台，也是新的完全自动化的版本QMX)，这是一个专有平台，基于将PCR产物与包被有检测探针偶联的互补寡核苷酸的微盘杂交。提取总RNA，然后进行逆转录和PCR步骤，使用与lncRNA特异的引物对多个靶标进行多路扩增。
为了显示作为能够定量lncRNA的多路平台的FiMAP的功效，使用NGS、qPCR、Celemics和FiMAP对血浆样品进行测试。大多数lncRNA显示其被良好地定量，因为在QMAP上测量的输入RNA的稀释度是浓度依赖性方式，对于lncRNA 20321，使用参考qPCR方法可获得非常等同的结果。因此，使用对每个lncRNA特异的编码微盘在FiMAP平台上进行定量。
患者人群和样品
脑组织活检：死后脑中颞叶皮质组织样品和血液样品(不是以下提及的前瞻性研究)，以及外周器官活检样品：肺、卵巢、结肠、前列腺、乳腺、肝脏、膀胱、肾脏、皮肤、心脏、肌肉)来自欧洲多家医院和Firalis生物库。
体液样品：体液样品来自健康志愿者(HV)，法国牟罗兹的“Etablissement
du Sang”(EFS)捐献者，来自认知完好的健康对照受试者以及来自患有轻度认知损害或患有阿尔茨海默病不同阶段(AD)或其他类型痴呆的患者，根据国家伦理委员会接受的欧洲医院的协议招募这些患者，在Amoneta Diagnostics赞助的前瞻性研究中，向SAgenceNationale de Sécuritédu Médicament et des Produits de Santé(ANSM)注册，例如IDRCB:2015-A00118-41，于2015年1月22日；ID RCB:2016-A200227-44，于2016年2月4日。全血样品收集在Paxgene RNA管中。从收集在锂肝素管或EDTA管中的血液样品中制备血清或血浆样品，并使用聚丙烯管收集CSF、尿液、唾液和泪液。
在本发明的表和图中显示的结果是从10个死后脑样品(5AD，5HC)、24个血清样品(12AD和12HC)、12个血浆样品(6AD和6Hc)和139个来自以下受试者组的样品中获得：
lncRNA的方法
样品测序
根据制造商的说明，使用Norgen血清/血浆提取液和RNA纯化和浓缩微洗脱试剂盒，从1.5ml血清开始进行核糖核酸(RNA)提取。使用Illumina TruSeq链式总RNA文库制备试剂盒，与人/小鼠/大鼠RiboZero rRNA去除试剂盒(Illumina Inc.San Diego,USA,C)组合，从提取的RNA总量中制备测序文库。所有步骤均按照低通量方案、根据制造商的说明进行，没有片段化的步骤。简而言之，将细胞质核糖体RNA(rRNA)与生物素化的靶特异性寡核苷酸杂交，并使用链霉亲和素包被的磁珠去除。然后将去除rRNA的RNA样品逆转录为互补的脱氧核糖核酸(cDNA)。为确保链特异性，首先在放线菌素D存在的情况下，使用Super-Script II逆转录酶(Invitrogen)和随机引物合成单链cDNA，然后将其转化为具有第二链标记混合物的双链cDNA，该标记混合物掺入dUTP代替dTTP。使用AMPure XP磁珠纯化所得的平末端cDNA。在3'末端腺苷酸化步骤之后，进行Illumina适体连接。因此，使用AMPure XP珠将获得的单索引文库洗涤两次，以去除过量的适体，并通过PCR富集(15个循环)。用最后的AMPure XP珠洗涤液纯化PCR产物，并在30μl的重悬缓冲液中洗脱准备测序的文库。
为了进行质量控制，根据制造商的建议，使用DNA 1000芯片在AgilentTechnologies 2100生物分析仪上运行1μl每个文库。检查适体二聚体的缺失，平均文库大小由区域表确定。使用Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒(Invitrogen)在Qubit 2.0上对文库进行定量。之前在生物分析仪上确定的文库大小用于从质量浓度计算摩尔浓度。所有文库均使用Illumina NextSeq500(2x75bp)进行测序。
生物信息学分析
基于智人hg38基因组的lncRNA
使用Partek Flow(Partek Inc.,St Louis,MO,USA build 6)进行RNA-seq数据分析。Partek Flow的预比对QA/QC模块用于可视化FASTQ文件的读取质量。检查所有读取。原始FASTQ文件作为其质量评分(Phred评分)的函数在3'端进行修剪。使用的参数是末端最低质量级别30和最小修剪读取长度50。使用智人hg38基因组对未比对的读取进行定位。使用软件STAR版本2.5.3(Dobin A.等人，2013)STAR:ultrafast universal RNA-seqaligner.Bioinforma.Oxf.Engl.29,15–21)完成定位。使用默认参数。使用比对后PartekFlow的QC模块可视化每个位置的平均碱基质量评分以及每个比对的定位质量。使用GTF文件定量定位的读取，具有专利的lncRNA注释用于使用Partek期望/最大化(E/M)算法(XingY.等人,2006)An expectation-maximization algorithm for probabilisticreconstructions of full-length isoforms from splice graphs.Nucleic AcidsRes.34,3150–3160)的定量。使用默认参数。放弃其中值在基因间区域中的中值读取密度以下的转录本，以进行下一步分析。通过CPM(每百万计数)标准化转录本计数。仅考虑在一组的至少一半样品中显示高表达(CPM≥5)的转录本。
新lncRNA的发现
通过使用UClncR管线版本1.1.1(Sun Z.等人,Scientific Reports,7(1):14196,2017)进行新的发现。在该管线中，使用StringTie版本1.3.4d(Pertea M.等人,NatBiotechnol,33(3):290–295,2015)用于重建。
“cuffcompare”程序版本2.2.1(C.Trapnell et al.,‘Nat Protoc,7(3):562–578,2012)用于比较组装的转录本与参考注释GTF文件(Gencode 27和LNCipedia 5)，并使用来自9个样品的所有转录本生成新的GTF文件，以进行进一步分析。
对由cuffcompare、转录本长度、外显子数量和蛋白质编码潜力产生的Transfrag类代码进行过滤。首先，提取代码为“i”、“j”、“o”、“u”、“x”和“.”的转录本，所有这些可能包括新的lncRNAs。例如，“i”类别可能包含完全在已知基因内含子中的lncRNA。同样，“j”类别可能是已知基因的长的非编码亚型。“o”类别可能包含新的lncRNA，其与已知转录本具有通用的外显子重叠。“u”类别可能是长的基因间非编码RNA(lincRNA)。“X”类别可能包含参考基因相反链上的新的lncRNA。'.'类别可以是具有多个分类的序列。此后，仅保留长度≥200nt且具有至少2个外显子的转录本用于下一步。CPAT(编码潜力评估工具，L.Wang L.,等人,Nucleic Acids Res,41(6):e74,2013.)用于评估非编码潜力。CPAT评分<0.3的转录本被视为非编码的。生成了新的GTF文件，其具有所选的新lncRNA的最终列表。
从ArrayExpress下载GSE45326的Fastq文件[9]。该数据集包括12个正常人组织的RNA-seq数据。在ribominus总RNA文库上进行配对末端测序。如前所述进行读取比对。使用Partek E/M算法使用新的lncRNA注释进行定量。
统计分析和预测建模
为了确定差异表达的lncRNA，使用Wilcoxon Mann-Whitney参数检验进行统计学分析，以比较两组受试者。p值≤0.05的lncRNA被认为是差异表达的。Anova检验用于比较多于两个的受试者组。
为了建立2个分类的分类模型，使用微阵列分类(CMA)包R(Slawski M,Daumer M,Boulesteix AL.CMA:a comprehensive Bioconductor package for supervisedclassification with high dimensional data.BMC Bioinformatics 2008,9:439)，使用留一法交叉验证。
用于此预测建模的算法是(a)随机森林、(b)线性判别分析和(c)朴素贝叶斯(Breiman L.Random forests.Machine Learning,45(1):5–32,2001)。
通过10个候选选项的平均排名(每CV倍)计算模型中候选RNA的排名。根据模型(和RNA选择方法)，绘制AUC作为模型中RNA数量的函数图形。通过图形确定每个模型的最佳RNA数量。生成了ROC曲线和混淆矩阵，以评估我们模型的预测性能。报告了AUC的值、准确性、灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。
定量lncRNA的其他方法
总RNA提取
根据制造商的说明，分别使用Paxgene Blood RNA试剂盒(Qiagen,法国)和Serum/Plasma mini试剂盒(Norgen Biotek,加拿大)提取总RNA。使用RNA 6000Nano试剂盒(Agilent,法国)在Agilent 2100生物分析仪上检查RNA的质量。使用RNA高灵敏度试剂盒(Fisher Scientific，法国)在Qubit 3.0荧光计上测量RNA的量。
cDNA合成
根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Fisher science，法国)进行逆转录。
qPCR定量
在qPCR之前对lncRNA进行预扩增。使用Applied Biosystems的预扩增master mix进行预扩增反应，其中lncRNA相应的各引物对为0.1X(100nM)。如供应商所指出的，进行16个预扩增循环(50℃，2分钟；96℃，10分钟，40个循环的95℃，15秒和60℃，1分钟)。在10μl的总体积中进行生物样品的定量PCR，其中1μl的以1/20稀释在TE缓冲液中的预扩增产物，5μl的2x Soadvanced SYBR green PCR master mix(Biorad，美国)和250nM的各引物。循环条件为95℃，5-10分钟；然后40个循环的95℃，10-30秒和60℃，30-60秒。热谱后进行熔解曲线分析(60℃至99℃)，以确保扩增的特异性。使用CFX maestro软件(Biorad，美国)，相对于5对数刻度制备的标准曲线确定相对表达水平。
QUANTAMATRIX FIMAP定量
还使用Quantamatrix(韩国)开发的FIMAP/QMAP平台对目的lncRNA进行定量。简而言之，使用与经化学修饰的qPCR相同序列的引物，通过PCR扩增lncRNA。正向引物在5'被磷酸化，反向引物在5'被生物素化。在Biorad T100热循环仪上、在20μl反应液中进行多路PCR反应，所述反应液包含2μl lncRNA cDNA，250nM各引物和10μl 2X One Taq Hot Start 2Xmaster Mix(New England Biolabs,USA)，条件如下：在94℃下30秒；25个循环的94℃下30秒，60℃下1分钟，和68℃下1分钟；然后在68℃下最后延长5分钟。然后将PCR产物用25Uλ核酸外切酶在37℃下消化30分钟，以消除磷酸化链，仅保留生物素化链。因此，使用编码二氧化硅微盘在QMAP上定量消化的产物，该微盘上包被与目的RNA互补的寡核苷酸(每个靶寡核苷酸一个代码)。简而言之，将生物素化的PCR产物与包被的微盘在96孔板中孵育，并在洗涤步骤之后通过添加荧光链霉亲和素缀合物SAPE(Prozyme，丹麦)使杂交产物显色。将板在QMAP上成像，每个点拍摄2张图像：一张暗图像以定量荧光，一张光图像以读取微盘代码。然后，根据相关的微盘代码将荧光信号分配给每个靶标，通过QMAP软件来计算每个靶标的相对表达。
还使用特异性引物通过qPCR测量了lncRNA。为此，首先提取总RNA，使用特异性引物进行逆转录和实时PCR。使用FiMAP(也称为Quantamatrix QMAP平台，也是新的完全自动化的版本QMX)，这是一个专有平台，基于将PCR产物与包被有检测探针偶联的互补寡核苷酸的微盘杂交。提取总RNA，然后进行逆转录和PCR步骤，使用与lncRNA特异的引物对多个靶标进行多路扩增。
为了显示作为能够定量lncRNA的多路平台的FiMAP的功效，使用NGS、qPCR、Celemics和FiMAP对血浆样品进行测试。大多数lncRNA显示它们在QMAP上被良好地定量，并且定量的稀释度是在QMAP上以剂量依赖性方式测量的输入RNA浓度的线性函数，当使用参考qPCR方法用于已知的参考lncRNA20321时，获得非常相同的结果。
使用各lncRNA特异的编码微盘在FiMAP平台上进行的定量适用于多路测试平台。
Celemics描述
Celemics是基于靶向测序的方法，其使用120个核苷酸的捕获探针，这些核苷酸与所选的lncRNA和磁珠杂交。捕获步骤是在上述文库制备之后进行的。简而言之，将100ng的文库DNA以3.4μl的体积与5.6μl的Block Mix混合使用。然后，将7μL的捕获文库和13μL的杂交缓冲液与9μl的DNA文库制剂混合，并在65℃下孵育24小时。孵育后，将50μl的DynabeadsMyone链霉亲和素T1与200μl的洗涤缓冲液#1混合，添加到杂交混合物中。在磁性条件下去除上清液后，添加500μl洗涤缓冲液#2，并使用分离器去除，并用洗涤缓冲液#3洗涤3至6次，然后添加30μl无核酸酶的水进行洗脱。然后使用PCR混合物在珠上扩增文库，捕获DNA(15μl)、PCR捕获后引物(5μl)、KAPA库扩增混合物(25μl)和无核酸酶的水(5μl)进行16个循环，并使用AMPure XP珠纯化样品，然后测序。所有文库均使用Illumina NextSeq500(2x75bp)进行测序。
结果
使用总RNA序列技术对来自阿尔茨海默病患者和认知完好的健康受试者的血清样品进行基于LNCipedia v5.2的127,802个转录本分析。在127,802个转录本中，在一组的至少一半样品中鉴定出19867个lncRNA的表达水平超过10CPM。
在19867个血清lncRNA中，基于统计学显著性(p值<0.05，Wilcoxon检验)选择了1008个lncRNA可用于诊断阿尔茨海默病。分类模型使用随机森林算法。据此，鉴定出具有高预测值的几组2-20个lncRNA。所选的2-20个lncRNA的组提供了从0.7至高达1的AUC范围，准确性、灵敏度和特异性的范围为0.7到1。
在来自深度测序实验的人死后中颞叶脑组织中(5个AD病例和10个HC病例)，使用转录本重建，进一步鉴定了总共1091个新的lncRNA。使用总RNAseq技术，在来自人AD脑组和健康对照脑组的相同脑区域，中颞叶皮质上对这些新的1091个lncRNA进行了分析。在这1091个新的脑转录本中，与HC脑相比，在AD脑中有26个显示表达不足，有16个显示过度表达水平(P<0.05)。
使用总RNAseq技术对来自5个AD病例和5个健康对照的脑皮质(中颞叶)、来自12名受试者(6名阿尔茨海默病患者和6名健康对照)的血浆样品、以及来自5组中包括的137名受试者(MCI、轻度AD、中度至重度AD、DLB或FTD患者、以及认知完好的健康对照受试者)的全血(Paxgene RNA管)样品进行基于LNCipedia v5.2的总共128 893个lncRNA的分析，包括1091个新的lncRNA和127,802个转录本。
在来自所有患者和HC组的每种生物样品类型中测序的128 893个转录本中，基于其阈值表达水平(在研究的至少一个受试者组的至少一半样品中中值超过每百万5个计数(CPM))鉴定lncRNA。保留了10122个脑lncRNA、3774个血浆lncRNA和9367个全血lncRNA进行统计学分析。结果显示：
1-脑lncRNA组：在脑中测序的10122个脑lncRNA中，表达水平>5CPM：
-我们在测试的所有脑中证实了以前没有描述过的1091个新的lncRNA(表7)在脑中的表达，它们代表了用于脑疾患(包括认知障碍)的新的治疗和诊断靶标。
-我们鉴定了860个脑富集lncRNA(表12)，其在脑中的表达水平是研究的所有其他外周器官(肺、卵巢、结肠、前列腺、乳房、肝脏、膀胱、肾脏、皮肤、心脏、肌肉)的2倍。这860个lncRNA代表了用于脑疾患(包括认知障碍)的新的治疗和/或诊断靶标。
-我们鉴定了1202个lncRNA，包括42个新的lncRNA(表8)，在比较AD脑和HC脑时，这些lncRNA显示统计学上显著的差异表达：这1202个lncRNA代表特异性地用于认知障碍，尤其是阿尔茨海默病的治疗和/或诊断的候选物，
2-血浆lncRNA组：在保留的3714个血浆lncRNA中，我们鉴定了410个血浆lncRNA(表9)，在比较AD血浆样品和HC血浆样品时，这些lncRNA显示统计学上显著的差异表达(p<0.05，Wilcoxon检验)：这410个lncRNA代表新的生物标记物组，可用于认知障碍(尤其是MCI和阿尔茨海默病)的诊断和治疗反应的监测应用。
3-血液lncRNA组：在保留的血液9367个lncRNA中，我们鉴定了2982个血液lncRNA(表10、11)，其在研究的至少一个受试者组(HC、MCI、轻度AD、中度至重度AD、所有AD、DLB、FTD)中显示统计学上显著的差异表达(使用Anova检验比较所有组，p值<0.05；当使用Wilcoxon检验比较HC组和所研究的患者群体组之一时，p值<0.05)。此外，我们应用了其他标准(例如倍数变化<0.8或>1.2和AUC>0.65或<0.35)选择表10和表11中列出的2847个lncRNA和136个lncRNA。
这2982个血液lncRNA代表新的生物标记物和生物标记物标识，可用于认知障碍(尤其是MCI和阿尔茨海默病，如MCI、轻度AD、中度至重度AD、DLB和FTD，以及其他认知障碍)的诊断、鉴别诊断以及治疗反应的监测应用。
-循环lncRNA组(常见于脑并存在于外周体液中)：在脑中测序的10122个lncRNA中，以下数量被鉴定为体液中循环的lncRNA：
–2096个血浆中的循环lncRNA：在这2096个lncRNA中，一组46个lncRNA显示与HC受试者组相比，在AD患者组的血浆样品中差异表达，具有统计学上的显著性(p<0.05，Wilcoxon检验)，且所有AUC值均>0.8或<0.2。在这46个差异表达的循环lncRNA中，17个的AUC值>0.9，4个候选物的AUC值＝1，从而将AD患者与健康对照受试者完全区分开。
-4902个在血液样品(Pax RNA管)中检测到的lncRNA，因此被鉴定为可在外周体液中测量的新的lncRNA组。在这4902个lncRNA中，与HC受试者组相比，一组310个lncRNA在五个患者组研究(MCI、轻度AD、中度至重度AD、DLB或FTD患者)中至少一个的血液样品中显示差异表达，具有统计学上的显著性(p<0.05，Wilcoxon检验)，并且代表用于认知障碍的诊断和治疗应用的良好候选者。-5054个在血清中的循环lncRNA。在这5054个lncRNA中，与健康组相比，43个lncRNA在AD组的血清中差异表达，具有统计学上的显著性(p<0.05，Wilcoxon检验)。因此，本发明还涉及任何脑/血浆共同和/或脑/血液共同和/或脑/血清lncRNA和/或血浆、血液、血清或使用本发明的方法检测的任何其他非侵入性外周体液中循环的脑富集lncRNA，用于任何脑疾患的治疗和诊断应用，在所述脑疾患中循环的lncRNA发生改变。
特别地，本发明涉及表1-12中列出的lncRNA的组，其用于脑疾患特别是认知障碍的治疗和诊断应用。
在本公开包括的序列表中显示了本公开中公开的lncRNA的序列。
Claims (13)
1.一种在具有患认知障碍风险或发展成认知障碍的受试者中诊断认知障碍的方法，所述认知障碍包括但不限于阿尔茨海默病，所述方法包括：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在来自所述受试者的生物样品中，检测lncRNA标识的表达水平，所述lncRNA标识包括选自表7-12中列出的lncRNA中的至少一个lncRNA或由其组成；
(c)比较样品中的表达水平与参考中的表达水平，
其中，与参考中的水平相比，样品中表达水平的升高或降低鉴定了患有认知障碍或具有发展成认知障碍的风险的受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述lncRNA标识包含选自54个lncRNA(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述lncRNA标识包括选自6个lncRNA(TCONS_00045364,TCONS_00035023,TCONS_00035091,TCONS_00035022,TCONS_00035092,TCONS_00035093)(“lncRNA标识6”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，检测lncRNA的表达水平与其他适用于检测认知障碍的生物标记物组合，例如神经认知测试、神经影像学方法和/或CSF生物标记物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于监测患有认知功能丧失或损害的受试者的认知障碍的发展或进展，所述方法包括步骤(a)、(b)和(c)，和
(d)针对所述鉴定的认知障碍设计治疗处理。
6.一种治疗患有进行性认知功能损害或丧失或痴呆的受试者的方法，所述方法包括：
(a)使用根据权利要求1至3中任一项所述的方法诊断与所述患者中的进行性认知功能损害或丧失或痴呆的认知障碍，和
(b)针对步骤(a)中获得的结果调整治疗处理。
7.一种调整患有进行性认知功能损害或丧失或痴呆的受试者的治疗策略的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用根据权利要求1-4中任一项所述的方法诊断或监测所述患者中的进行性认知功能损害或丧失或痴呆，和
(b)因此改变患者的治疗策略。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自血液、血浆、血清、唾液、泪液、尿液或脑脊液。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中诊断认知障碍或任何痴呆类型(相对于健康对照的差异)，或者其中相对于其他类型的痴呆，诊断具体的痴呆类型，包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、AD的轻度认知损害型(MCI)、额颞叶痴呆(FTD)和FTD的MCI型、具有路易体的痴呆(DLB)和DLB的MCI型、帕金森氏病痴呆(PDD)和PDD的MCI型、血管性痴呆、进行性核上性麻痹(PSP)和皮质基底节变性(CBD)。
10.一种用于诊断和/或监测认知障碍的试剂盒，所述认知障碍包括但不限于AD，所述试剂盒包含至少一种用于测定lncRNA表达谱的试剂，所述lncRNA表达谱包含选自54个(lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识2”)中的至少一个lncRNA，或由其组成。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述至少一种试剂包含与目的lncRNA互补的特异性寡核苷酸。
12.一种用于下一代测序的靶向测序组，其包含对选自68个lncRNA(TCONS_00050539,TCONS_00062555,TCONS_00024916,TCONS_00059198,TCONS_00066462,TCONS_00033653,LINC-PINT:16,lnc-ATP6V1C1-12:1,lnc-GABBR1-1:2,lnc-PMM2-6:2,MALAT1:23,MALAT1:48,lnc-LTBP3-2:6,lnc-LTBP3-2:3,lnc-ANAPC11-2:8,lnc-CLLU1-2:6,lnc-KLHL36-2:2,lnc-LRRC10-1:1,lnc-RMDN2-3:24,lnc-SMN2-4:2,lnc-SPRYD3-1:17,lnc-USP47-2:1,lnc-ZC3H12B-1:5,TCONS_00019798,TSPOAP1-AS1:39,TCONS_00035093,lnc-OCM-3:4,lnc-KIF14-1:2,PCBP1-AS1:302,lnc-CA6-8:1,NEAT1:22,lnc-CA6-8:2,STARD7-AS1:5,lnc-IL31RA-1:1,lnc-ANKRD36-1:4,lnc-ATP6AP2-13:1,lnc-SOCS6-10:1,lnc-CDIPT-2:1,lnc-USP47-2:1,RBM26-AS1:1,MIR181A2HG:1,TTC21B-AS1:2,LEF1-AS1:1,lnc-SLC35E3-8:1,lnc-ZCCHC13-4:1,lnc-NEMF-1:4,TCONS_00011994,lnc-EVX1-15:1,lnc-REC8-2:1,OIP5-AS1:36,MYLK-AS1:13,lnc-PCP4L1-3:2,lnc-CGREF1-2:1,ZC3H12B-11:1,PSMB8-AS1:14,lnc-STX10-2:1,lnc-TCFL5-6:1,lnc-UQCC3-2:1,lnc-ZNF516-14:1,lnc-PDGFA-6:2,lnc-FOXD4L5-16:1,lnc-SAMD11-12:4,lnc-ADAD1-3:1,lnc-SLC35E3-8:2,lnc-NID1-4:4,FTX:19,TCONS_00017372,lnc-GRAP-1:2)(“lncRNA标识1”)中的至少一个lncRNA具有特异性的核酸。
13.一种lncRNA，其用于在具有患轻度认知损害或认知障碍的风险或发展成轻度认知损害或认知障碍的受试者中治疗脑疾患，特别是轻度认知损害(MCI)和阿尔茨海默病或其他认知障碍，其中治疗包括向受试者施用有效量的药物，所述药物调节(诱导或抑制)lncRNA在脑和/或外周中的表达，其中所述lncRNA是选自以下lncRNA标识之一的至少一个lncRNA：
(i)21个lncRNA(TCONS_00050539,TCONS_00062555,TCONS_00024916,TCONS_00059198,TCONS_00066462,TCONS_00033653,TCONS_00040878,TCONS_00000634,TCONS_00050178,TCONS_00055496,TCONS_00033736,TCONS_00023309,TCONS_00027765,TCONS_00062602,TCONS_00005325,TCONS_00011974,TCONS_00023240,TCONS_00023401,TCONS_00066358,TCONS_00062306,TCONS_00027438)(“lncRNA标识12”)；
(ii)10个lncRNA(LINC-PINT:16,lnc-ATP6V1C1-12:1,lnc-GABBR1-1:2,lnc-PMM2-6:2,MALAT1:23,MALAT1:48,lnc-LTBP3-2:6,lnc-LTBP3-2:3,MALAT1:11,lnc-LTBP3-2:2)(“lncRNA标识13”)；
(iii)17个lncRNA(TCONS_00035022,TCONS_00035023,TCONS_00035094,TCONS_00035093,TCONS_00035021,TCONS_00035090,TCONS_00035024,TCONS_00035091,TCONS_00012059,TCONS_00035092,TCONS_00012060,TCONS_00050014,lnc-ENC1-5:1,lnc-SNAP25-3:1,lnc-HMGA1-2:4,PEG3-AS1:1,lnc-UNC80-1:1)(“lncRNA标识14”)；
(iv)17个lncRNA(lnc-NEK6-2:1,lnc-PMM2-6:4,UGDH-AS1:10,lnc-RMDN2-3:24,lnc-EIF1AD-1:1,lnc-FANCL-4:1,lnc-FAAP100-2:1,TCONS_00011974,lnc-FEM1B-4:1,lnc-GNA14-3:1,lnc-PINK1-2:1,lnc-PRSS27-4:24,lnc-SLC25A3-7:1,lnc-FEM1B-4:1,NORAD:2,NORAD:8,CACTIN-AS1:5)(“lncRNA标识42”)。
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