CN117393044B - 一种用于轻度认知障碍症早期筛查的试剂盒及诊断系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于轻度认知障碍症早期筛查的试剂盒及诊断系统。本发明提供了可用于轻度认知障碍症体检的特征指标，分别为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A的表达量和年龄。同时，还提供了利用这些特征指标进行轻度认知障碍症早期筛查的诊断系统。利用这六种特征指标能够准确地对轻度认知障碍症进行诊断，在健康筛查和临床领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于轻度认知障碍症早期筛查的试剂盒及诊断系统
背景技术
轻度认知障碍(MCI)是指记忆力或其他认知功能进行性减退，但不影响日常生活能力，且未达到痴呆的诊断标准。根据中国全科医学杂志，我国老年人群轻度认知障碍(MCI)患病率逐年增加，而老年MCI会不同程度地进展为痴呆。目前针对中国老年人群轻度认知障碍方面的研究多是区域性研究，且患病率差异较大(0.8％～23.3％)。轻度认知障碍患者中有99.23％的人对自身疾病不熟悉，加之早期症状不明显，很有隐匿性，以及缺少早期筛查试剂盒和诊断系统，因此，如能开发更为精准的轻度认知障碍早期诊断系统，可以及时进行干预和治疗，从而延缓病情进展，提高生活质量。
轻度认知症在临床上使用的筛查工具主要有MMSE(蒙特利尔认知评估量表)和MoCA(蒙特利尔认知评估量表)。而目前缺乏能够用于诊断轻度认知障碍的血液标志物或基因检测靶点。为了更加全面准确地对轻度认知障碍进行早期筛查，本领域亟需开发用于轻度认知障碍诊断的生物标志物，并构建利用这些生物标志物进行轻度认知障碍早筛的试剂盒及诊断系统。
发明内容
针对现有技术的问题，本发发明提供一种用于轻度认知障碍症早期筛查的试剂盒及诊断系统，目的在于提供新的轻度认知障碍早筛生物标志物和模型，实现轻度认知障碍的早期筛查。
用于检测基因表达的试剂在制备轻度认知障碍症早期筛查试剂盒中的用途，所述基因选自RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A中的至少一种。
优选的，所述基因包括RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A。
优选的，所述试剂为用于荧光定量PCR检测的试剂；和/或，所述试剂用于检测血液样品。
本发明还提供一种用于轻度认知障碍症早期筛查的试剂盒，它包括用于检测基因表达的试剂，所述基因选自RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A中的至少一种。
优选的，所述基因包括RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A。
优选的，所述试剂为用于荧光定量PCR检测的试剂；和/或，所述试剂用于血液样品。
本发明还提供一种用于轻度认知障碍症早期筛查的诊断系统，包括：
输入模块，用于输入基因表达值和年龄，所述基因选自RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A中的至少一种；
评分模块，用于将所述基因表达值和年龄作为特征输入模型，得到轻度认知障碍得分；
结论模块，用于根据所述轻度认知障碍得分判断健康状况；
输出模块，用于输出所述轻度认知障碍得分以及健康状况。
优选的，所述基因包括RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A。
优选的，所述轻度认知障碍得分的计算公式为：
其中，X为X基因表达的等级得分，Y为年龄的等级得分；所述X基因为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A；
X基因表达的等级得分根据特征基因值分布区间确定，所述特征基因值的计算公式为：
其中，基因表达值为基因的荧光定量PCR的△△Ct值，内参基因表达值是对GAPDH基因的荧光定量PCR的△△Ct值；
根据分布区间确定X基因表达的等级得分的方式如下：
X基因为RPS23时，
[0，95)内等级得分为-15，
[95，103)内等级得分为7，
[103，106)内等级得分为23，
[106，200)内等级得分为44；
X基因为RPS24时，
[0，92)内等级得分为-49，
[92，99)内等级得分为-8，
[99，113)内等级得分为7，
[113，200)内等级得分为56；
X基因为EIF3E时，
[0，102)内等级得分为-107，
[102，103.5)内等级得分为-45，
[103.5，106)内等级得分为-18，
[106，113)内等级得分为4，
[113，200)内等级得分为38；
X基因为NDUFA1时，
[0，92.5)内等级得分为-88，
[92.5，96)内等级得分为-37，
[96，98.5)内等级得分为-6，
[98.5，108)内等级得分为10，
[108，200)内等级得分为75；
X基因为RPS15A时，
[0，104)内等级得分为50，
[104，111)内等级得分为17，
[111，115)内等级得分为-10，
[115，120)内等级得分为-24，
[120，200)内等级得分为-49；
所述年龄的等级得分根据年龄分布区间确定，根据分布区间确定年龄的等级得分的方式如下：
[45，66)内等级得分为-14，
[66，79)内等级得分为17，
[79，81)内等级得分为-43，
[81，84)内等级得分为-2，
[84，100)内等级得分为-62；
和/或，所述健康状况按照如下方式进行判断：
当轻度认知障碍得分小于337，健康状况为健康，
当轻度认知障碍得分大于等于337且小于528，健康状况为复查；
当轻度认知障碍得分大于528，健康状况为患病。
本发明还提供一种计算机可读存储介质，其上存储有：用于实现上述用于轻度认知障碍症早期筛查的诊断系统的计算机程序。
本发明中，所涉及的基因包括：
RPS23(ENSG00000186468)，现有技术已知其能够提高蛋白质合成的保真度可以延长寿命。
RPS24(ENSG00000138326)，它位于细胞质中。已经发现该基因编码不同同种型的多种转录变体。如编码核糖体蛋白的基因的典型情况，存在该基因的多个加工假基因分散在基因组中。它通过抑制基因的表达来促进颈动脉斑块的新血管生成。
EIF3E(ENSG00000104408)，进翻译起始因子活性，参与mRNA结合活性的正向调节，基因表达的调节和翻译起始。
NDUFA1(ENSG00000125356)，它是高度保守的双结构域结构，这一特征对蛋白质功能至关重要，可能作为NADH的锚点：线粒体内膜上的泛醌氧化还原酶复合物。
RPS15A(ENSG00000134419)，在翻译早期的mRNA和核糖体相互作用中起促进作用。
本发明提供了六种可用于轻度认知障碍早期筛查的特征指标，分别为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A的表达值和年龄。进一步，本发明提供了利用这些特征指标开发的试剂盒和诊断系统。本发明的技术方案简易可行，灵敏度高，能够作为轻度认知障碍的早期筛查。有助于尽早发现轻度认知障碍，并为其临床治疗方案的决策提供辅助，实现精准治疗，具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为LASSO和SVM-RFE机器学习的ROC曲线图。
图2对打分卡进行评估和矫正图，A为K-S检验图，B为ROC曲线图，C为密度面积图，D为阴阳性矫正图。
图3为基于荧光定量PCR对健康状况评估图。
具体实施方式
需要特别说明的是，实施例中未具体说明的数据采集、传输、储存和处理等步骤的算法，以及未具体说明的硬件结构、电路连接等均可通过现有技术已公开的内容实现。
实施例1轻度认知障碍早期筛查的体检试剂盒
一、试剂盒组成(5人份)
表1试剂盒组成
上述表格中的试剂中，引物、探针序列均可基于现有技术得到，各种溶液也可基于现有技术中的配方配置。
二、样本处理
采1ml血液样本加入样本裂解液中，处理样本。
三、试剂准备
取出盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀后备用。
将准备好的样本加入PCR-反应液混匀后，加入PCR-酶混合液中反应，最后转移到PCR-酶标板中。
四、PCR扩增
将PCR-酶标板放入扩增仪样品槽，按对应顺序并设置样本名称。
推荐的循环参数设定：
表2循环参数设定
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
五、结果分析
对实验所得数据用转化函数转换为基因表达值计算特征值。
计算公式为：
其中，基因表达值为基因的荧光定量PCR的△△Ct值，内参基因表达值是对GAPDH基因的荧光定量PCR的△△Ct值。
实施例2轻度认知障碍症早期筛查的诊断系统
本实施例的系统包括：
输入模块，用于输入基因表达值和年龄，所述基因选自RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A；
评分模块，用于将所述基因表达值和年龄作为特征输入模型，得到轻度认知障碍得分；
结论模块，用于根据所述轻度认知障碍得分判断健康状况；
输出模块，用于输出所述轻度认知障碍得分以及健康状况。
所述认知障碍得分的计算公式为：
其中，X为X基因表达的等级得分，Y为年龄的等级得分；所述X基因为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A；
所述X基因表达的等级得分和年龄的等级得分按照如下方式得到：
表3打分卡
打分卡包含基点分，其中每个因子被划分成不同的等级。通过根据特征基因值和年龄所对应的等级区间，可以获得相应的得分，即等级得分。X基因的等级根据特征基因值分布区间确定，所述特征基因值的计算公式为：
其中，基因表达值为基因的荧光定量PCR的△△Ct值，内参基因表达值是对GAPDH基因的荧光定量PCR的△△Ct值。
所述健康状况按照如下方式进行判断：
当轻度认知障碍得分小于337，健康状况为健康，
当轻度认知障碍得分大于等于337且小于528，健康状况为复查；
当轻度认知障碍得分大于528，健康状况为患病。
下面通过实验对本发明的技术方案做进一步说明。
实验例1特征指标的筛选和验证
一、实验方法
1、数据收集和预处理
健康和轻度认知障碍的血液样本转录本数据(GSE63063和GSE140829)从GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)数据库中获得，对其数据去除批次效应和归一化，进一步进行每百万转录本(TPM)转化和数据归一化以便后续分析。数据总样本数为781个，轻度认知障碍样本为313，正常样本为467个。年龄从52到100岁，男性348人，女性432人。
2、差异基因计算
对其数据进行差异分析，选择|log(FC|)|>3，p值<0.01的基因为差异基因，最终获得67个差异基因
3、基于LASSO和SVM-RFE算法筛选特征基因
采用LASSO和SVM-RFE方法对特征基因进行分析筛选。首先，通过LASSO算法结合glmnet包来获得LASSO特征基因。另外，SVM-RFE是一种基于支持向量机的机器学习技术，通过删除SVM生成的特征向量来寻找最佳变量。我们建立了一个SVM模块，利用e1071包进一步验证这些分子标志物在轻度认知障碍诊断中的价值。最后，我们将来自LASSO和SVM-RFE算法的特征基因取交集，作为核心特征基因集，以便进行更深入的分析。
4、构建轻度认知障碍打分卡
为了便于临床应用，我们进一步设计了一个打分卡，通过logistic回归评估轻度认知障碍风险。打分卡可以以相同的频率将连续变量转移到箱子中。轻度认知障碍风险打分卡中使用的特征基因是3节获得核心特征基因集，加年龄和性别。每个轻度认知障碍风险水平不同的人在打分卡上有不同的分数；因此，每个特征都应该被划分成框。我们使用证据权重(WoE)来衡量每个盒子的疾病概率，并使用分箱法对连续变量进行离散化。最后，对打分卡进行校准，以确定总分在0到600分之间。最终的打分卡由基点分数和每个特征中每个分组区间的分数组成。
5、开发轻度认知障碍症早期筛查的体检试剂盒和系统
采用实施例1的方法检测统计数据集中内参基因表达水平，选择没有差异的内参基因(GAPDH)，计算内参转化系数，试剂盒包含特征基因和内参基因，基于荧光定量PCR获得△△Ct值，使用函数将该△△Ct值转化为特征值。根据实施例2的系统判断健康状况。
二、实验结果
对大量健康和轻度认知障碍样本进行差异分析，我们获得了67个差异表达基因(如下表所示)。
表4差异基因表
通过LASSO回归分析，我们确定了18个特征因子。另外，使用SVM-RFE机器学习分析得到10个特征基因，并将它们取交集，最终确定8个核心特征因子(EIF3E，RPS24，ENY2，RPS15A，NDUFB2，RPS23，NDUFA1和SLIRP)加上年龄和性别作为轻度认知障碍的核心特征。为了验证这些特征基因集的准确性，我们进行了AUC分析并绘制了轻度认知障碍预测模型的ROC曲线。结果显示，LASSO算法的AUC为0.8246，而SVM-RFE机器学习的AUC为0.82(图1)。
在保证预测性能的准确性的基础上，为了方便临床应用，我们进一步简化了特征因子的数量设计了一个打分卡，通过logistic回归评估轻度认知障碍风险，并最终获得了六个核心特征的打分卡(如表3所示)。然后，我们对打分卡进行了校准，以确保总分在0到100分之间。最终的打分卡由基础分数和每个特征中每个分组区间的分数组成，将打分卡用于实施例2的系统，KS为0.528(A)，AUC为0.8223(B)，训练组和测试组得分分布相似(C)和PSI为0.0686(D)。结果表明，该打分卡可以用于准确识别轻度认知障碍(图2)。
针对核心特征中的基因，采用实施例1提供的试剂盒进行检测。通过表达数据分析发现GAPDH基因表达没有差异可以作为内参基因，因此可以利用荧光定量PCR来对轻度认知障碍症进行早期筛查(图3)。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了六种特征指标(年龄和五种基因的表达)，利用这六种特征指标可以准确地对轻度认知障碍进行早期筛查。在健康筛查和临床实践中具有广阔的应用前景。
Claims (7)
1.用于检测基因表达的试剂在制备轻度认知障碍症早期筛查试剂盒中的用途，其特征在于，所述基因包括RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A；
所述轻度认知障碍症早期筛查的过程包括：
将基因表达值和年龄作为特征输入模型，得到轻度认知障碍得分；
根据所述轻度认知障碍得分判断健康状况；
所述轻度认知障碍得分的计算公式为：
其中，X为X基因表达的等级得分，Y为年龄的等级得分；所述X基因为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A；
X基因表达的等级得分根据特征基因值分布区间确定，所述特征基因值的计算公式为：
其中，基因表达值为基因的荧光定量PCR的△△Ct值，内参基因表达值是对GAPDH基因的荧光定量PCR的△△Ct值；
所述年龄的等级得分根据年龄分布区间确定，根据分布区间确定年龄的等级得分的方式如下：
[45，66)内等级得分为-14，
[66，79)内等级得分为17，
[79，81)内等级得分为-43，
[81，84)内等级得分为-2，
[84，100)内等级得分为-62。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂为用于荧光定量PCR检测的试剂；和/或，所述试剂用于检测血液样品。
3.一种用于轻度认知障碍症早期筛查的试剂盒，其特征在于：它包括用于检测基因表达的试剂，所述基因选自RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A；
所述轻度认知障碍症早期筛查的过程包括：
将基因表达值和年龄作为特征输入模型，得到轻度认知障碍得分；
根据所述轻度认知障碍得分判断健康状况；
所述轻度认知障碍得分的计算公式为：
其中，X为X基因表达的等级得分，Y为年龄的等级得分；所述X基因为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A；
X基因表达的等级得分根据特征基因值分布区间确定，所述特征基因值的计算公式为：
其中，基因表达值为基因的荧光定量PCR的△△Ct值，内参基因表达值是对GAPDH基因的荧光定量PCR的△△Ct值；
所述年龄的等级得分根据年龄分布区间确定，根据分布区间确定年龄的等级得分的方式如下：
[45，66)内等级得分为-14，
[66，79)内等级得分为17，
[79，81)内等级得分为-43，
[81，84)内等级得分为-2，
[84，100)内等级得分为-62。
4.按照权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂为用于荧光定量PCR检测的试剂；和/或，所述试剂用于血液样品。
5.一种用于轻度认知障碍症早期筛查的诊断系统，其特征在于，包括：
输入模块，用于输入基因表达值和年龄，所述基因选自RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1和RPS15A；
评分模块，用于将所述基因表达值和年龄作为特征输入模型，得到轻度认知障碍得分；
结论模块，用于根据所述轻度认知障碍得分判断健康状况；
输出模块，用于输出所述轻度认知障碍得分以及健康状况；
所述轻度认知障碍得分的计算公式为：
其中，X为X基因表达的等级得分，Y为年龄的等级得分；所述X基因为RPS23、RPS24、EIF3E、NDUFA1或RPS15A；
X基因表达的等级得分根据特征基因值分布区间确定，所述特征基因值的计算公式为：
其中，基因表达值为基因的荧光定量PCR的△△Ct值，内参基因表达值是对GAPDH基因的荧光定量PCR的△△Ct值；
所述年龄的等级得分根据年龄分布区间确定，根据分布区间确定年龄的等级得分的方式如下：
[45，66)内等级得分为-14，
[66，79)内等级得分为17，
[79，81)内等级得分为-43，
[81，84)内等级得分为-2，
[84，100)内等级得分为-62。
6.按照权利要求5所述的诊断系统，其特征在于：
根据分布区间确定X基因表达的等级得分的方式如下：
X基因为RPS23时，
[0，95)内等级得分为-15，
[95，103)内等级得分为7，
[103，106)内等级得分为23，
[106，200)内等级得分为44；
X基因为RPS24时，
[0，92)内等级得分为-49，
[92，99)内等级得分为-8，
[99，113)内等级得分为7，
[113，200)内等级得分为56；
X基因为EIF3E时，
[0，102)内等级得分为-107，
[102，103.5)内等级得分为-45，
[103.5，106)内等级得分为-18，
[106，113)内等级得分为4，
[113，200)内等级得分为38；
X基因为NDUFA1时，
[0，92.5)内等级得分为-88，
[92.5，96)内等级得分为-37，
[96，98.5)内等级得分为-6，
[98.5，108)内等级得分为10，
[108，200)内等级得分为75；
X基因为RPS15A时，
[0，104)内等级得分为50，
[104，111)内等级得分为17，
[111，115)内等级得分为-10，
[115，120)内等级得分为-24，
[120，200)内等级得分为-49；
和/或，所述健康状况按照如下方式进行判断：
当轻度认知障碍得分小于337，健康状况为健康，
当轻度认知障碍得分大于等于337且小于528，健康状况为复查；
当轻度认知障碍得分大于528，健康状况为患病。
7.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其上存储有：用于实现权利要求5或6所述用于轻度认知障碍症早期筛查的诊断系统的计算机程序。
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