CN116083584A - 一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物及其筛选方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物及其筛选方法和应用，所述血浆miRNA标志物包括miR‑205‑5p、miR‑206、miR‑4732‑3p、miR‑4732‑5p和miR‑12136中的任意一种或者五种组合，通过检测该miRNA组合中各miRNAs的血浆表达水平来评估非小细胞肺癌风险。本发明基于血浆miRNAs的无创的评估非小细胞肺癌风险的方法，在肺腺癌和肺鳞癌、早期和晚期非小细胞肺癌中均具有良好的预测价值，为非小细胞肺癌的风险评估提供了重要价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体是一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物及其筛选方法和应用。
背景技术
肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌早期病情隐匿，通常无任何症状，但大部分患者在初诊时已处于中晚期，失去了手术切除的机会。晚期肺癌患者的五年生存率不足5％，而早期肺癌患者的五年生存率可达90％以上。因此，早期诊断是肺癌患者获得良好预后的一个重要机会。
目前，肺癌的早期诊断方法有胸部影像学、支气管镜检技术以及痰脱落细胞学检测等，但这些方法的检测效果均不理想。据报道，在肺癌早期筛查和诊断中广泛应用的LDCT技术，其检测产生的假阳性可高达21％以上。因此，单独利用影像学方法很难准确诊断早期肺癌，尚缺乏有效的生物标志物结合影像学技术(LDCT)来提高早期肺癌诊断的特异性。
非小细胞肺癌占肺癌全部肺癌的80％，其主要病理分型包括肺腺癌(60％)和肺鳞癌(30-35％)。非小细胞肺癌的生存率与肿瘤分期关系密切，在非小细胞肺癌发生早期阶段发现能显著提高其生存率。然而目前用来预测并发现肺癌的方法大部分存在侵入性、低灵敏度、有辐射等局限性，且识别早期肺癌的能力有限。近年来对于分子生物标志物的相关研究为肺癌的识别和风险预测提供了新的方向。
miRNA是长度～22个核苷酸的非编码小RNA，通过种子序列(5’端第2-8位核苷酸)识别靶基因(特别是mRNA)的3’非翻译区域的互补结合位点发挥作用。miRNA作用方式主要包括三种：转录、抑制与mRNA的切割或降解。miRNA可以在不改变DNA序列的情况下，调控转录后mRNA水平及蛋白质稳定性，改变肿瘤表观遗传学特征，参与恶性肿瘤的发生发展，有望成为恶性肿瘤早期诊断的生物标志物。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明公开一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物及其筛选方法和应用，基于对5种miRNA的血浆表达水平的检测，miRNA标志物组合对肺癌发生具有良好的预测价值，可以作为肺癌风险评估的生物标志物。
本发明提供的技术方案：一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物，包括miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136中的任意一种或者五种组合。
进一步的，所述的血浆miRNA标志物在制备用于非小细胞肺癌患病评估的miRNA标志物检测试剂中的应用。
进一步的，所述的血浆miRNA标志物在制备用于非小细胞肺癌患病评估的试剂盒中的应用。
一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物组合的筛选方法，包括以下步骤：
(1)设计一个1:1匹配的非小细胞肺癌病例对照人群，收集医院就诊的非小细胞肺癌病例，以年龄±2岁、性别匹配在同一医院体检科室收集对照。在非小细胞肺癌(包括肺腺癌和肺鳞癌)患者和健康对照中，用EDTA抗凝采血管收集外周血；在做了肺癌切除手术的非小细胞肺癌(包括肺腺癌和肺鳞癌)患者中，用EDTA抗凝采血管收集术前和术后经过一周的外周血。从收集的外周血中分离出血浆和血细胞，采用Qiagen小RNA建库试剂盒的流程对血浆样本进行小RNA建库；采用Illumina NextSeq500测序平台进行小RNA文库的测序；借助CLC平台(Qiagen)商业化小RNA定量比对流程将海量测序数据比对至miRbase v22得到miRNAs的count数据。得到肺癌患者和正常对照及肺癌患者术前术后的血浆miRNAs count数据。
(2)采用DESeq2软件包中的variance stabilizing transformation方法对非小细胞肺癌患者和健康对照的血浆miRNAs的count数据进行标准化，用多元线性模型在全基因组范围筛选与非小细胞肺癌有关联的miRNAs；
(3)采用DESeq2软件包进行匹配的差异分析，依据差异倍数>2或<0.5、Bonferroni方法多重校正的P值小于0.05的标准，筛选出术前相对于术后显著性差异表达的血浆miRNAs，从而验证出与非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs；
(4)在不同病理分型的亚组分析中，依次按照与步骤(2)和步骤(3)相同的方法和标准，分别筛选出肺腺癌和肺鳞癌相关的血浆miRNAs，并进一步筛选出同时与肺腺癌和肺鳞癌相关的血浆miRNAs的组合。
进一步；所述步骤(2)中以标准化后的miRNA数据为因变量，肺癌状态为自变量，校正年龄、性别、体质指数、吸烟状态、饮酒状态；依据Bonferroni方法多重校正的P值小于0.05的检验标准，筛选出具有显著性的非小细胞肺癌相关血浆miRNAs。
非诊断目的的血浆miRNA标志物评估非小细胞肺癌患病风险的方法，将检测上述血浆miRNA标志物的表达量与传统预测因素相结合。
进一步的，所述传统预测因素包括年龄，性别和吸烟状态。
本发明的miRNA标志物组合包括5种miRNAs，分别是miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136。这5个miRNAs组成的标志物组合对非小细胞肺癌的风险具有较高的预测价值。本发明筛选的miRNA组合从全基因组层面出发，经过发现和验证阶段，在非小细胞肺癌风险评估中具有高灵敏度和高特异性，且在肺腺癌和肺鳞癌中同时具有良好的预测能力，是十分有前景的血浆生物标志物。
附图说明
图1是非小细胞肺癌全基因组关联分析(A)和术前血浆vs.术后血浆(B)的miRNAs筛选的火山图及对应的筛选过程(C)；
图2是肺腺癌全基因组关联分析(A)和术前血浆vs.术后血浆(B)的miRNAs筛选的火山图及对应的筛选过程(C)；
图3是肺鳞癌全基因组关联分析(A)和术前血浆vs.术后血浆(B)的miRNAs筛选的火山图及对应的筛选过程(C)；
图4是本发明筛选的hsa-miR-205-5p(A)、hsa-miR-206(B)、hsa-miR-4732-3p(C)、hsa-miR-4732-5p(D)和hsa-miR-12136(E)在病例vs对照及术前vs术后的表达量水平；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.研究对象的收集及数据产生
以年龄±2岁、性别一致匹配对照，设计并建立136对非小细胞肺癌病例对照人群。通过标准化设计的问卷收集肺癌病例和健康对照的基本特征、生活方式和病史，包括年龄(岁)、性别(男/女)、吸烟包年(年)、吸烟状态、饮酒状态、体质指数(BMI)。通过病理检测确诊为非小细胞肺癌并确定病理分型和肿瘤分期，具体结果如表1所示。
在肺癌患者(包括肺腺癌和肺鳞癌)和对照中，用EDTA抗凝采血管收集外周血；在21个已做肺癌切除手术的非小细胞肺癌(包括肺腺癌和肺鳞癌)患者中，用EDTA抗凝采血管收集术前和术后经过一周的外周血。从收集的外周血中分离出血浆和血细胞，取不少于300ul血浆(136例对照中，7例对照血浆不足)并采用
LS裂解液前处理联合miRNeasy Serum/Plasma Kit(catalog no.217184)的方法提取血浆中总RNA，以5ul血浆总RNA为起始RNA模板，用
miRNA Library Kit(德国QIAGEN公司)说明书上的方法步骤进行血浆小RNA建库；在illumina二代测序仪器上完成小RNA文库的测序，进一步通过CLCGenomics Workbench分析二代测序仪生成的海量数据，定量比对miRNAs表达counts(miRbase v22库)。
表1.肺癌病例对照研究中的基本信息
注：连续型变量以均数±标准差表示，分类变量以人数(百分比)表示。P代表变量在病例组和对照组之间的差异。
2.筛选非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs
(1)非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs筛选的发现环节
采用DESeq2软件包中的variance stabilizing transformation方法对非小细胞肺癌患者和健康对照的血浆miRNAs的count数据进行标准化，在病例对照人群中用广义线性模型在全基因组范围筛选与非小细胞肺癌有关联的miRNAs。将136例肺癌血浆和129例健康对照血浆中均有20％的样本达到Count per million(CPM)≥1的miRNAs纳入分析(共817个血浆miRNAs纳入)，以标准化后的miRNA数据为因变量，肺癌状态为自变量，校正年龄、性别、体质指数(BMI)、吸烟状态、饮酒状态。依据Bonferroni方法多重校正的P值小于0.05的检验标准，筛选出具有显著性的非小细胞肺癌相关血浆miRNAs；miRNAs筛选发现阶段的火山图如图1(A)所示。在纳入的817个miRNAs中，共190个miRNAs与非小细胞肺癌显著相关。在190个miRNAs中，66个miRNAs在非小细胞肺癌中相对于健康对照表达水平增加，其他124个miRNAs则降低。
(2)非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs筛选的验证环节
基于(2)中筛选的190个非小细胞肺癌相关血浆miRNAs的count数据，采用DESeq2软件包进行匹配的差异分析(术前vs.术后)，依据差异倍数>2或<0.5、Bonferroni方法多重校正的P值小于0.05的标准，筛选出术前相对于术后显著性差异表达的血浆miRNAs，从而验证出与非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs；miRNAs筛选验证阶段的火山图如图1(B)所示。在发现阶段筛选的190个miRNAs中，57个miRNAs在经过肺癌切除手术后表达水平在术前术后显著性改变。在57个miRNAs中，24个miRNAs在术前状态下相对于术后表达水平更高，其他33个miRNAs则更低。
依次按照2-(1)发现环节、2-(2)验证环节，发现并验证出57个与非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs，如图1(C)所示。
3.非小细胞肺癌的不同病理分型的亚组分析
在不同病理分型的亚组分析中，依次按照与2-(1)发现环节、2-(2)验证环节相同的步骤和标准，分别筛选出肺腺癌和肺鳞癌相关的血浆miRNAs，并进一步筛选出5个同时与肺腺癌和肺鳞癌相关的血浆miRNAs(miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136)，图2和图3显示其具体筛选过程，具体筛选结果如表2所示。
表2.miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136的关联性及差异性分析结果
注：拟合广义线性模型进行关联性分析，以标准化的miRNA值为因变量、肺癌状态(是/否)为自变量，校正年龄、性别、吸烟、饮酒和BMI；术前vs.术后的差异分析通过R包DESeq2完成。
如图4所示，在筛选选出的5个miRNAs中，4个miRNAs(miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p和miR-4732-5p)的血浆表达水平在肺癌患者中高于对照，且其血浆表达水平在肺癌切除手术后显著降低；相反，与对照相比，肺癌患者血浆中的miR-12136表达水平更低，且在术后升高。以上结果说明筛选得到的5个miRNAs在非小细胞肺癌中的表达水平相对于对照均存在显著差异，有预测非小细胞肺癌风险的潜在能力。
4.单个血浆miRNA标志物或miRNA组合与传统预测因素联合对非小细胞肺癌的预测能力评估
在136例肺癌病人和129例健康对照样本中，用上述2-(1)提取的variancestabilizing transformation转换后的血浆miRNAs数据构建logistics预测模型。用GraphPad Prism(版本8.2.1)绘制ROC曲线。分析了传统预测因素(年龄，性别，吸烟包年)，miRNA组合(在模型中同时纳入5个miRNAs：miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136)的肺癌预测效能，以及单个miRNA或miRNA组合联合传统预测因素的肺癌预测效能(在模型中额外加入上述单个或全部5个miRNAs)，具体结果如表3所示。
表3单个miRNA或miRNA组合联合传统预测因素的肺癌预测效能
相对于传统预测因素，额外联合miRNA生物标志物可显著增加预测非小细胞肺癌风险的能力，且传统因素联合miRNA组合的预测能力最佳。对于非小细胞肺癌，相对于传统预测因素，联合miRNA生物标志物组合使AUC从0.620增加到0.913；对于肺腺癌，传统预测因素的AUC＝0.607，联合miRNA组合使AUC增加到0.914；对于肺鳞癌，传统预测因素的AUC＝0.654，联合miRNA组合使AUC增加到0.972。对于I期非小细胞肺癌，相对于传统预测因素，联合miRNA生物标志物组合使AUC从0.622增加到0.897；对于II期非小细胞肺癌，传统预测因素的AUC＝0.587，联合miRNA组合使AUC增加到0.917；对于III+IV期非小细胞肺癌，传统预测因素的AUC＝0.675，联合miRNA组合使AUC增加到0.920。由此可见，血浆miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136的表达水平将是十分有潜力有前景的非小细胞肺癌相关生物标志物。
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物，其特征在于：包括miR-205-5p、miR-206、miR-4732-3p、miR-4732-5p和miR-12136中的任意一种或者五种组合。
2.如权利要求1所述的血浆miRNA标志物在制备用于非小细胞肺癌患病评估的miRNA标志物检测试剂中的应用。
3.如权利要求1所述的血浆miRNA标志物在制备用于非小细胞肺癌患病评估的试剂盒中的应用。
4.一组用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物组合的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)检测非小细胞肺癌患者和与患者年龄和性别相匹配的健康对照者的外周血样品中miRNAs，以及检测非小细胞肺癌患者术前、术后的血浆miRNAs count数据；
(2)对非小细胞肺癌患者和健康对照者的血浆miRNAs的count数据进行标准化，用多元线性模型在全基因组范围筛选与非小细胞肺癌有关联的miRNAs；
(3)采用DESeq2软件包进行匹配的差异分析，依据差异倍数>2或<0.5、Bonferroni方法多重校正的P值小于0.05的标准，筛选出术前相对于术后显著性差异表达的血浆miRNAs，从而验证出与非小细胞肺癌相关的血浆miRNAs；
(4)在不同病理分型的亚组分析中，依次按照与步骤(2)和步骤(3)相同的方法和标准，分别筛选出肺腺癌和肺鳞癌相关的血浆miRNAs，并进一步筛选出同时与肺腺癌和肺鳞癌相关的血浆miRNAs的组合。
5.根据权利要求4所示的用于评估非小细胞肺癌风险的血浆miRNA标志物组合的筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中以标准化后的miRNA数据为因变量，肺癌状态为自变量，校正年龄、性别、体质指数、吸烟状态、饮酒状态；依据Bonferroni方法多重校正的P值小于0.05的检验标准，筛选出具有显著性的非小细胞肺癌相关血浆miRNAs。
6.非诊断目的的血浆miRNA标志物评估非小细胞肺癌患病风险的方法，其特征在于：将检测如权利要求1所述的血浆miRNA标志物的表达水平与传统预测因素相结合。
7.如权利要求6所述的非诊断目的的血浆miRNA标志物评估非小细胞肺癌患病风险的方法，其特征在于：所述传统预测因素包括年龄，性别和吸烟状态。
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