CN109897899B - 一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程及肿瘤标志物领域，尤指一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物及其应用，所述标志物为miR‑135b‑5p、miR‑139‑5p、miR‑29c‑5p和miR‑338‑3p中的一种或多种组成的组合标志物，通过检测肿瘤组织中上述4个miRNA表达水平，并按公式(0.4690×miR‑135b‑5p表达水平)+(0.3839×miR‑139‑5p表达水平)+(0.1733×miR‑29c‑5p表达水平)+(0.3368×miR‑338‑3p表达水平)计算预后风险分数以对局部晚期食管鳞癌预后进行预测；本发明组合标志物具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点，较传统临床病理因素如肿瘤TNM分期等更精确、更有价值的评估判断患者的预后；本发明一方面提供与食管鳞癌预后相关分子标志物，另一方面建立食管鳞癌预后预测模型，以实现食管鳞癌个体化治疗及提高食管鳞癌的综合治疗水平并改善食管鳞癌患者的生活质量和延长生存期。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程及肿瘤标志物领域，尤指一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物及其应用。
背景技术
食管癌是消化道肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一，食管癌可分为食管腺癌和食管鳞癌，在我国，95％的食管癌为食管鳞癌，恶性肿瘤发病率和死亡率分别排第三及第四位，占全球食管癌发病率及死亡率的一半以上，是一种严重危害我国人民健康的疾病。我国对于局部晚期的食管鳞癌治疗，手术仍然是一个重要的治疗手段，然而，由于肿瘤异质性的广泛存在，即使是同一临床分期的不同食管鳞癌患者，接受相同的手术治疗后，其预后也可能存在较大差异，而治疗前食管癌患者的临床因素如TNM分期、原发灶位置、患者性别和肿瘤病理类型等因素均不能准确预测食管癌患者的不同生物学反应及预后，治疗方案未能实现个体化，使得部分患者经历了“过度治疗”或得不到有效治疗的过程。因此，目前局部晚期食管鳞癌患者未寻找到合适预后判断标志物及检测方法，导致食管鳞癌患者的预后预测不准确，无法实现个体化治疗。
既往对我国食管鳞癌高发的华南和华北地区的食管鳞癌病例回顾性分析发现：在我国接受手术治疗的食管鳞癌患者中，局部晚期(具有局部淋巴结转移)患者占一半以上，这部分患者较早期患者预后显著降低，可见，占大部分手术病例的局部晚期患者的生存率很大程度上代表了食管癌治疗的效果，也就是说，要提高食管癌的疗效，除早诊、早治之外，关键是提高局部晚期食管癌的治愈率。
对于肿瘤患者的管理研究中，目前设有肿瘤分期系统。恶性肿瘤tumor-node-metastasis(TNM)分期系统是目前最为通用的肿瘤分期系统，沿用至今的TNM分期在预后的估计上已证明有巨大的价值，同时也深刻影响着癌症治疗决策；然而恶性肿瘤的治疗研究中，一个令人困惑的问题，就是同一分期、同一病理类型、采用同一治疗方案的患者，其生存期有明显不同。基于既往基础及转化研究的结果，认为有可能是恶性肿瘤患者的基因表达异质性，导致其对相同治疗的不同反应，进而导致其预后的不同。随着人类生物医学进入分子水平时代，迫切需要应用分子诊断技术，对肿瘤发生发展的病理学机制及生物学行为从分子水平上加以认识，并重新分期，其目的是在原来TNM分期的基础上，把分子生物学的最新研究成果结合到分期及预后预测中，为肿瘤的预后和判断决策提供更有利的依据。
MicroRNAs(miRNAs)是一种大约由21-25个核苷酸组成的内源性非编码RNA分子，迄今已有2500多个人类miRNA被发现，miRNA可通过与靶mRNA互补结合，从而抑制靶mRNA的翻译或直接降解，miRNA是动物基因表达调控分子中的一个重要类别，对基因表达有广泛的影响，miRNA在包括食管鳞癌在内的各种人类肿瘤中均存在异常表达。既往研究证实miRNA在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用，是肿瘤诊断、预后预测及指导个体化治疗的潜在重要分子标志物。绝大部分的人类蛋白编码基因都受miRNA调控，而一个miRNA通常靶向调控多个mRNA表达，因此，检测miRNA的表达变化可能较检测同样数目的mRNA/蛋白质表达变化更能有效反映肿瘤的生物学特性；并且，miRNA片段较短，在石蜡组织中可长久稳定存在，较mRNA不易降解，使得检测miRNA表达在回顾性分析中具有更重要的作用。
既往已有研究分析了食管鳞癌中的miRNA表达水平，并分析了其与临床预后的潜在相关性，第一个研究中研究人员运用可检测509个成熟miRNA的表达谱芯片检测并发现了在食管鳞癌及正常食管粘膜间差异表达的7个miRNA，其中生存分析显示miR-103/107的高表达在由31例食管鳞癌构成的训练集及22例食管鳞癌构成的验证集中均是预后不良因素。第二个研究中研究人员运用TaqMan qPCR检测石蜡包埋的21例局部进展期的食管鳞癌组织中miR-21,miR-106a,miR-148a的miR-205表达，结果发现，miR-106a和miR-148a的表达水平在复发或死亡食管鳞癌病例肿瘤组织中表达水平较无复发或无死亡者显著降低。第三个研究中研究人员运用可检测291个miRNA表达的表达谱芯片检测了食管鳞癌组织中miRNA的表达，结果发现由miR-218-5p,miR-142-3p,miR-150-5p和miR-205-5p构成的预后特征可将训练集(60例)、检测集(59例)及独立验证集(58例)中接受手术治疗的食管鳞癌患者分为预后良好及预后不良组。但是，综合既往食管鳞癌预后相关miRNA分子标志物的研究，存在筛选miRNA数较少、病例数较少以及部分研究缺乏独立验证队列等问题。一些研究仅通过检测单个miRNA分子作为预后判断指标，其效果不如联合多个miRNA分子，另外，对miRNA标志物预后预测价值缺乏客观评价。
【参考文献】
1.Xu XL,Jiang YH,Feng JG,et al.MicroRNA-17,microRNA-18a,and microRNA-19a are prognostic indicators in esophageal squamous cell carcinoma.AnnThorac Surg.2014；97:1037-1045.
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发明内容
为解决上述问题，本发明旨在公开一种生物工程及肿瘤标志物领域，尤指一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物，其特征在于，所述的标志物为miRNA组合标志物，为miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和miR-338-3p中的一种或多种。
如一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物在局部晚期食管鳞癌预后判断的应用。
基于一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物建立分析系统，其特征在于，所述分析系统的建立包括步骤：
1)收集145例局部晚期食管鳞癌患者的肿瘤组织作为训练集；
2)采用R语言软件包“glmnet”，运用最小绝对收缩与选择运算Cox回归分析的方法，在训练集145例样本中筛选局部晚期食管鳞癌预后最为相关的miRNA标志物；
3)从结果显示中记录局部晚期食管鳞癌预后最相关的X个miRNA；
4)联合X个miRNA，利用R语言软件包“survival”中的Cox回归模型纳入步骤3)的X个miRNA，并建立局部晚期食管鳞癌预后风险预测模型，计算预后风险分数；
5)对于训练集145例中的每一例，计算出预后风险分数后，运用Cutoff Finder寻找该预后风险分数与145例病例总生存相关性的最优界值，设最优界值结果为Y，当预后风险分数>Y记为预后高风险，当预后风险分数<Y为预后低风险；
6)比较训练集145例样本中低风险组和高风险组的生存差异；
7)收集除训练集外的145例单纯手术治疗局部晚期食管鳞癌患者标本作为内部测试集以验证上述预后风险模型的价值；
8)再收集243例局部晚期食管鳞癌患者组织标本构成的独立验证集以验证上述预后风险模型的价值；
9)将训练集、内部测试集及独立验证集共533例样本，合并为一个队列；
10)在整体队列中，为比较由X个miRNA组成的预后风险模型与单个miRNA的预后预测价值，利用R语言软件包“risksetROC”进行了时间依赖的接收者工作特征曲线分析，并利用R语言软件包“CsChange”对一致性指数进行比较；
11)在整体队列中，判断由4个miRNA构成的预后风险模型与单个miRNA显示的曲线下面积和一致性指数，曲线下面积更大和一致性指数更高的一方，具有更高的预后预测价值。
优选地，所述步骤3)的X个miRNA，为4个miRNA，分别为miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和miR-338-3p。
优选地，所述步骤4)的预后风险分数的计算公式为：预后风险分数＝(0.4690×miR-135b-5p表达水平)+(0.3839×miR-139-5p表达水平)+(0.1733×miR-29c-5p表达水平)+(0.3368×miR-338-3p表达水平)；其中高表达水平记为1，低表达水平记为0。
优选地，其特征在于，所述步骤5)的最优界值结果Y为0.9366。
本发明的有益效果体现在：本发明的目的在于提供一种用于判断局部晚期的食管鳞癌的预后的miRNA组合标志物，即主要通过检测肿瘤组织中4个miRNA表达水平，并组合4个miRNA计算局部晚期食管鳞癌预后风险分数以对局部晚期食管鳞癌预后进行预测。组合标志物具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点，较传统临床病理因素及肿瘤TNM分期更精确、更有价值的评估判断患者的预后；本发明一方面提供与食管鳞癌预后相关分子标志物，另一方面建立食管鳞癌预后预测模型，共同实现食管鳞癌个体化治疗及提高食管鳞癌的综合治疗水平并改善食管鳞癌患者的生活质量和延长生存期。
本发明所建立的分析系统及其预测模型，通过回顾性收集多中心局部晚期食管鳞癌肿瘤组织标本，运用miRNA表达谱芯片筛选食管鳞癌特征性miRNA，并分析肿瘤组织中miRNA表达情况及其与临床病理因素和患者预后的关系，运用紧密严谨的数学模型及统计学分析，建立并验证局部晚期单纯手术食管鳞癌患者的miRNA预后风险模型，并进行各阶段的对比验证，客观评价其与TNM分期等临床病理因素等的预后判断价值，获得可靠性的价值意义，为局部晚期食管鳞癌的个体化治疗的实现奠定基础。
附图说明
图1为本发明聚类分析显示31例局部晚期食管鳞癌与正常食管上皮间的差异表达miRNA。
图2为本发明的局部晚期食管鳞癌miRNA预后标志物的筛选示图。
图3为本发明基于4个miRNA的预后风险模型对局部晚期食管鳞癌的预后预测价值图。
图4为本发明中时间依赖的受试者工作特征曲线比较由4个miRNA构成的预后风险模型与临床病理预后因素对局部晚期食管鳞癌患者预后的预测价值图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：
一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物，其特征在于，所述的标志物为miRNA组合标志物，为miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和miR-338-3p中的一种或多种；本实施例为由miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和miR-338-3p组成的miRNA组合标志物；
如一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物在局部晚期食管鳞癌预后判断的应用；
基于一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物建立分析系统，其特征在于，所述分析系统的建立包括步骤：
1)收集145例局部晚期食管鳞癌患者的肿瘤组织作为训练集；
2)采用R语言软件包“glmnet”，运用最小绝对收缩与选择运算Cox回归分析的方法，在训练集145例样本中筛选局部晚期食管鳞癌预后最为相关的miRNA标志物；
3)从结果显示中记录局部晚期食管鳞癌预后最相关的X个miRNA；进一步地，X个miRNA为4个miRNA，分别为miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和miR-338-3p；
4)联合X个miRNA，利用R语言软件包“survival”中的Cox回归模型纳入步骤3)的X个miRNA，并建立局部晚期食管鳞癌预后风险预测模型，计算预后风险分数；进一步地，预后风险分数的计算公式为：预后风险分数＝(0.4690×miR-135b-5p表达水平)+(0.3839×miR-139-5p表达水平)+(0.1733×miR-29c-5p表达水平)+(0.3368×miR-338-3p表达水平)；其中高表达水平记为1，低表达水平记为0；
5)对于训练集145例中的每一例，计算出预后风险分数后，运用Cutoff Finder寻找该预后风险分数与145例病例总生存相关性的最优界值，设最优界值结果为Y，当预后风险分数>Y记为预后高风险，当预后风险分数<Y为预后低风险；进一步地，最优界值结果Y为0.9366；
6)比较训练集145例样本中低风险组和高风险组的生存差异；
7)收集除训练集外的145例单纯手术治疗局部晚期食管鳞癌患者标本作为内部测试集以验证上述预后风险模型的价值；
8)再收集243例局部晚期食管鳞癌患者组织标本构成的独立验证集以验证上述预后风险模型的价值；
9)将训练集、内部测试集及独立验证集共533例样本，合并为一个队列；
10)在整体队列中，为比较由X个miRNA组成的预后风险模型与单个miRNA的预后预测价值，利用R语言软件包“risksetROC”进行了时间依赖的接收者工作特征曲线分析，并利用R语言软件包“CsChange”对一致性指数进行比较；
11)在整体队列中，判断由4个miRNA构成的预后风险模型与单个miRNA显示的曲线下面积和一致性指数，曲线下面积更大和一致性指数更高的一方，具有更高的预后预测价值。
具体实施过程为：
一、对食管鳞癌肿瘤组织与正常食管粘膜上皮差异表达基因的筛选：
提取30例局部晚期食管鳞癌患者的肿瘤组织及10例正常食管粘膜上皮，运用可检测1887个miRNA的表达谱芯片检测组织中miRNA表达情况，原始数据导入Genespring 12.0软件，经log2转化及正态化处理后，过滤掉极低表达量基因，运用非配对样本t检验及Benjamin-hocheberg多重检验校正方法，筛选肿瘤组织及正常上皮间的差异表达miRNA；为寻找差异表达最为显著的miRNA，规定仅差异表达倍数≥4，且p<0.001的为显著差异表达miRNA；据此，发现26个在食管鳞癌与正常食管粘膜上皮间差异表达的miRNA；其中，5个在食管鳞癌组织表达较正常食管粘膜上皮升高，20个降低。如图1，为聚类分析显示30例局部晚期食管粘膜与正常食管上皮间的差异表达miRNA，每一行代表一个miRNA，每一列代表一个样本，NE：正常食管粘膜上皮，ESCC：食管鳞癌。
二、通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerasechain reaction,qRT-PCR)验证上述芯片发现的差异表达miRNA：
提取41对局部晚期食管鳞癌肿瘤组织及配对正常食管粘膜上皮，提取RNA后，利用miRNA qRT-PCR定量检测探针，检测上述26个差异miRNA表达情况，结果发现，20个miRNA在局部晚期食管鳞癌及配对正常食管粘膜间具有显著差异表达(改变倍数>2,配对样本t检验p<0.05)，如表1，为局部晚期食管鳞癌组织与配对食管粘膜上皮间的差异表达miRNA，“↓”代表miRNA在食管鳞癌肿瘤组织中的表达较配对正常食管粘膜上皮降低；“↑”代表miRNA在食管鳞癌肿瘤组织中的表达较配对正常食管粘膜上皮升高。
表1：
三、差异表达miRNA与局部晚期食管鳞癌预后的关系：
收集145例来自中山大学肿瘤防治中心的单纯手术根治性切除的局部晚期食管鳞癌患者肿瘤组织作为训练集，提取RNA，qRT-PCR检测上述20个差异表达miRNA在其中的表达，运用Cutoff Finder寻找每一miRNA与145例病例总生存相关性的最优界值，据此将病例分为某一miRNA的高表达组和低表达组；单因素Cox生存分析结果显示19个miRNA的高、低表达组在训练集145例病例的总生存存在显著差异，如表2，为单因素Cox生存分析训练集145例单纯手术治疗局部晚期食管鳞癌组织中miRNA表达与患者总生存的相关性。
表2：
四、局部晚期食管鳞癌预后判断的数学模型的建立：
利用R软件包“glmnet”，运用最小绝对收缩与选择运算(least absoluteshrinkage and selection operator,LASSO)Cox回归分析的方法，在训练集145例样本中筛选局部晚期食管鳞癌预后最为相关的miRNA标志物，结果显示，miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和miR-338-3p局部晚期食管鳞癌预后最相关miRNA；如图2，为局部晚期食管鳞癌miRNA预后标志物的筛选示图，图中A线图表示利用最小绝对收缩与选择运算对训练集的145例病例中19个预后相关miRNA基于缺一交叉验证法计算调谐参数(λ)，以部分似然偏差(partially likelihood deviance)作为纵坐标，ln(λ)作为横坐标绘制图A，以部分似然偏差最小值对应的λ为最优λ，图中纵线对应的为最优λ，即λ＝0.111时，ln(λ)＝-2.20；图中B线图表示：LASSO图展示训练集中19个预后相关的miRNA，纵线所对应的L1norm值由上述最优λ值决定。
联合上述4个miRNA，利用R软件包“survival”中的Cox回归模型纳入上述4个miRNA,建立局部晚期食管鳞癌预后风险预测模型：预后风险分数＝(0.4690×miR-135b-5p表达水平)+(0.3839×miR-139-5p表达水平)+(0.1733×miR-29c-5p表达水平)+(0.3368×miR-338-3p表达水平)，其中各miRNA表达水平据表2中的对应miRNA界值判断为高表达或低表达，高表达在上述预后风险分数公式中记为1，低表达记为0；对于训练集145例病例中的每一例，计算出预后风险分数，运用Cutoff Finder寻找该预后风险分数与145例病例总生存相关性的最优界值，其结果为0.9366，即>0.9366记为预后高风险，<0.9366为预后低风险。
五、预后风险模型的预后预测价值评价：
在训练集145例样本中，低风险组的5年总生存率为50.3％(95％置信区间：40.0％-60.7％)，高风险组的5年生存率为8.7％(95％置信区间：0-20.3％)，两组具有显著差异(P<0.0001；如图3中A部分)，此外，收集了来自中山大学肿瘤防治中心的除训练集外的145例单纯手术治疗局部晚期食管鳞癌患者标本，作为内部测试集，验证上述预后风险模型的价值，结果显示，内部测试集低风险组5年生存率为49.3(95％置信区间：38.9％-59.7％)，而高风险组5年生存率为4.7％(95％置信区间：0-13.5％)，两组具有显著差异(P<0.0001；如图3中B部分)；进一步地，在由来自汕头大学附属肿瘤医院和中山大学孙逸仙纪念医院的243例单纯手术治疗局部晚期食管鳞癌患者构成的独立验证集中，该预后风险模型将其中42例患者判断为高风险，其5年生存率为12.5％(95％置信区间：0-26.6％)，201例为低风险，其5年生存率为42.5％(95％置信区间：34.9％-50.1％)，两组具有显著差异(P＝0.00073；如图3中C部分)；若将训练集、内部测试集及独立验证集合并为一个队列(533例病例)，则436(81.8％)病例被判为低风险，而97例为高风险，其5年生存率分别为46.4％(95％置信区间：41.1％-51.7％)和10.7％(95％置信区间：3.3％-18.1％)，两组具有显著差异(P<0.0001；Fig.如图3中D部分)；为比较上述由4个miRNA组成的预后风险模型与单个miRNA的预后预测价值，利用R软件包“risksetROC”进行了时间依赖的接收者工作特征曲线(receiver operating characteristics,ROC)分析，并利用R软件包“CsChange”比较了一致性指数(C-index)；结果显示，对于全部的533例病例来说，由4个miRNA构成的预后风险模型较单个miRNA显示出更大的曲线下面积(area under curve,AUC)和显著增高的一致性指数(图3E)，证实联合4个miRNA较单个miRNA具有更高的预后预测价值；为进一步判断这一4个miRNA组成的预后风险模型在不同队列中是否为独立预后因素，进行了多因素Cox回归分析，如表3显示，在训练集、内部测试集、独立验证集及整体队列中，该预后风险模型均为独立的预后因素；此外，病理T-分期，N-分期及切除的淋巴结数目也是独立的预后因素。图3为基于4个miRNA的预后风险模型对局部晚期食管鳞癌的预后预测价值，根据该预后风险模型，将训练集(A)、内部测试集(B)、独立验证集(C)及整个对立列(D)的病例分为高风险和低风险，并依据患者总生存运用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，P值由log-rank检验得出；(E)图显示由4个miRNA构成的预后风险模型与单个miRNA进行比较的时间依赖ROC曲线及Harrel一致性指数(C-index)；P值通过Z-检验得出；表3为由4个miRNA组成的预后风险模型及临床病理因素的多因素生存对照表。
表3：
本发明技术中，结合了稳定性、灵敏性和特异性高的标志物作为预后判断的试剂，也建立并验证局部晚期单纯手术食管鳞癌患者的miRNA预后风险模型，实现食管鳞癌个体化治疗及提高食管鳞癌的综合治疗水平并改善食管鳞癌患者的生活质量和延长生存期的重要环节。恶性肿瘤tumor-node-metastasis(TNM)分期系统是目前最为通用的肿瘤分期系统，沿用至今的TNM分期在预后的估计上已证明有巨大的价值，同时也深刻影响着癌症治疗决策，然而恶性肿瘤的治疗研究中，同一分期、同一病理类型、采用同一治疗方案的患者，其生存期有明显不同；单纯依靠TNM分期不能难以准确判断肿瘤患者预后；在本发明中，证实基于四个miRNA的预后风险模型可显著提高临床病理因素的预后预测准确性，进行了时间依赖的ROC曲线分析和C指数分析以比较基于4个miRNA的预后预测风险模型和其他临床病理因素的预后预测准确性；如图4显示，基于4个miRNA的预后预测风险模型较单个临床病理预后因素(包括病理T分期、病理N分期或切除淋巴结数)，具有更好的预后预测能力。进一步地，当基于4个miRNA的预后预测风险模型与临床病理预后因素病理T分期、病理N分期和切除淋巴结数联合时，可获得更好的临床预后预测价值，从而为实现食管鳞癌个体化治疗奠定基础；如图4，时间依赖的ROC曲线比较由4个miRNA构成的预后风险模型与临床病理预后因素对局部晚期食管鳞癌患者预后的预测价值。(A)整个队列；(B)训练集和内部测试集合并；(C)独立验证集。Z-检验比较单一预后因素的一致性指数(C-index)与联合miRNA预后风险模型和临床病例因素时的一致性指数(C-index)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物，其特征在于，所述的标志物为miRNA组合标志物，由miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和 miR-338-3p四种组成；
将所述标志物用于分析系统的建立中，建立步骤包括如下：
1）收集145例局部晚期食管鳞癌患者的肿瘤组织作为训练集；
2）采用R语言软件包“glmnet”，运用最小绝对收缩与选择运算Cox回归分析的方法，在训练集145例样本中筛选局部晚期食管鳞癌预后最为相关的miRNA标志物；
3）从结果显示中记录局部晚期食管鳞癌预后最相关的4个miRNA，分别为miR-135b-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p和 miR-338-3p；
4）联合X个miRNA，利用R语言软件包“survival”中的Cox回归模型纳入步骤3）的X个miRNA，并建立局部晚期食管鳞癌预后风险预测模型，计算预后风险分数；
5）对于训练集145例中的每一例，计算出预后风险分数后，运用Cutoff Finder寻找该预后风险分数与145例病例总生存相关性的最优界值，设最优界值结果为Y，当预后风险分数>Y记为预后高风险，当预后风险分数<Y为预后低风险；
6）比较训练集145例样本中低风险组和高风险组的生存差异；
7）收集除训练集外的145例单纯手术治疗局部晚期食管鳞癌患者标本作为内部测试集以验证上述预后风险预测模型的价值；
8）再收集243例局部晚期食管鳞癌患者组织标本构成的独立验证集以验证上述预后风险预测模型的价值；
9）将训练集、内部测试集及独立验证集共533例样本，合并为一个队列；
10）在整体队列中，为比较由X个miRNA组成的预后风险模型与单个miRNA的预后预测价值，利用R语言软件包“risksetROC”进行了时间依赖的接收者工作特征曲线分析，并利用R语言软件包“CsChange”对一致性指数进行比较；
11）在整体队列中，判断由4个miRNA构成的预后风险模型与单个miRNA显示的曲线下面积和一致性指数，曲线下面积更大和一致性指数更高的一方，具有更高的预后预测价值。
2.如权利要求1所述的一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物，其特征在于，所述步骤4）的预后风险分数的计算公式为：预后风险分数=(0.4690 × miR-135b-5p表达水平)+(0.3839 × miR-139-5p表达水平)+(0.1733 × miR-29c-5p表达水平)+(0.3368 ×miR-338-3p表达水平)；其中高表达水平记为1，低表达水平记为0。
3.如权利要求2所述的一种用于局部晚期食管鳞癌预后判断的标志物，其特征在于，所述步骤5）的最优界值结果Y为0.9366。
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