ES2829415T3 - Algoritmo de perfil de expresión génica para calcular una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón - Google Patents

Abstract

Un método para clasificar a un paciente con cáncer de riñón que tiene un riesgo mayor de recurrencia o un riesgo menor de recurrencia que comprende: medir un nivel de transcritos de ARN a partir de cada uno de los genes de cada uno de los siguientes subconjuntos de genes en una muestra de tumor obtenida del paciente: un grupo de genes de normalización vascular, un grupo de genes de respuesta inmunitaria, un grupo de genes de crecimiento/división celular e IL-6; en donde los genes del grupo de genes de normalización vascular son: APOLD1, EDNRB, NOS3 y PPAP2B, y los genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria son: CCL5, CEACAM1 y CX3CL1, y los genes del grupo de genes de crecimiento/división celular son: EIF4EBP1, LMNB1 y TUBB2A; calcular una puntuación de recurrencia mediante el uso del siguiente algoritmo: RS =- -0,45 x puntuación del grupo de genes de normalización vascular -0,31 x puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria +0,27 x puntuación del grupo de genes de crecimiento/división celular +0,04 x IL6 donde: puntuación del grupo de genes de normalización vascular = (0,5APOLD1 + 0,5EDNRB + NOS3 + PPAP2B)/4 puntuación del grupo de genes de crecimiento/división celular = (EIF4EBP1 + 1,3LMNB1 + TUBB2A)/3; y puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria = (0,5CCL5 + CEACAM1 + CX3CL1)/3; y clasificar al paciente como de riesgo menor o riesgo mayor en base a la puntuación de recurrencia en comparación con el riesgo poblacional promedio de pacientes con cáncer de riñón.

Description

DESCRIPCIÓN

Algoritmo de perfil de expresión génica para calcular una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón

Campo técnico

La presente descripción se refiere a ensayos de diagnóstico molecular que proporcionan información relacionada con los perfiles de expresión génica para determinar información pronóstica para pacientes con cáncer. Específicamente, la presente descripción proporciona un algoritmo que comprende genes, o genes coexpresados, cuyos niveles de expresión pueden usarse para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer de riñón experimente un resultado clínico positivo o negativo. La presente descripción proporciona información de expresión génica útil para calcular una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón.

Introducción

La Sociedad estadounidense del cáncer estima que en 2013 habrá alrededor de 65 150 nuevos casos de cáncer de riñón y alrededor de 13680 muertes por cáncer de riñón en los Estados Unidos. (American Cancer Society, Kidney Cancer (Adult) Renal Cell Carcinoma Overview, disponible en línea en http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/003052-pdf.pdf). El carcinoma de células renales (RCC), además llamado adenocarcinoma renal o hipernefroma, es el tipo más común de cáncer de riñón, que representa más de 9 de cada 10 casos de cáncer de riñón, y representa aproximadamente del 2-3 % de todas las neoplasias malignas. (Id.; National Comprehensive Cancer Network Guidelines (NCCN) Clinical Practice Guidelines in Oncology, Kidney Cancer, versión I.2013). Por razones desconocidas, la tasa de RCC ha aumentado un 2 % por año durante los últimos 65 años. (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology, Kidney Cancer.)

Existen múltiples subtipos de RCC, que incluyen el carcinoma de células renales de células claras, el carcinoma de células renales papilares, el carcinoma de células renales cromófobas, el carcinoma de células renales de los conductos colectores, y el carcinoma de células renales no clasificadas. El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es el subtipo más común de carcinoma de células renales, y aproximadamente 7 de cada 10 pacientes con RCC tienen ccRCC. (American Cancer Society, Kidney Cancer (Adult) Renal Cell Carcinoma Overview) La evaluación y estadificación del RCC incluye la visualización a través de métodos de imágenes, como la exploración con tomografía computarizada (CT), el ultrasonido, o la resonancia magnética de imágenes (MRI), y las evaluaciones físicas y de laboratorio. Puede realizarse una biopsia por aspiración para diagnosticar el RCC y guiar la vigilancia de la enfermedad. Los médicos clasifican los tumores en base a las características clínicas y patológicas, como el estadio del tumor, el estado de los ganglios linfáticos regionales, el tamaño del tumor, el grado nuclear, y la necrosis histológica. Dichas designaciones pueden ser subjetivas, y existe una falta de concordancia entre los laboratorios de patología para hacer dicha determinación (Al-Ayanti M y otros (2003) Arch Pathol Lab Med 127, 593-596), lo que destaca la necesidad de designaciones más objetivas. Yao M. y otros, Int. J. Cancer, 123, págs. 1126-1132, 2008; Sanjmyatav J. y otros, J. Urology, 186, págs. 289-294 (2011); los documentos núms. WO2011085263 A2, WO2013028807 A2, WO02079411 A2, describen el uso de un marcador de expresión para evaluar el cáncer renal. El tratamiento del RCC varía en dependencia del estadio del cáncer, la salud general del paciente, los probables efectos secundarios del tratamiento, las posibilidades de curar la enfermedad, las posibilidades de mejorar la supervivencia, y/o aliviar los síntomas asociados con el cáncer. La cirugía es el tratamiento principal para el RCC que puede extirparse. (American Cancer Society Kidney Cancer (Adult) Renal Cell Carcinoma Overview.) Incluso después de la escisión quirúrgica, el 20-30 % de los pacientes con tumores localizados experimentan recaídas, la mayoría de las cuales ocurren dentro de los tres años. (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology, Kidney Cancer.) La metástasis pulmonar es el sitio más común de recaída a distancia, que ocurre en el 50-60 % de los pacientes. (Id.) Sin embargo, si un paciente tiene un tumor pequeño, por ejemplo, < 3 cm, es posible que el médico no realice la cirugía, optando en su lugar por controlar el crecimiento del tumor. Dicha vigilancia activa puede permitir que algunos pacientes eviten la cirugía y otros tratamientos. En los candidatos no quirúrgicos, particularmente los ancianos y aquellos con riesgos de salud competitivos pueden usarse técnicas ablativas, como criocirugía o ablación por radiofrecuencia, o vigilancia activa.

Los médicos necesitan información de pronóstico para ayudarlos a tomar decisiones de tratamiento informadas para los pacientes con RCC y reclutar pacientes de alto riesgo apropiados para los ensayos clínicos con el fin de aumentar el poder estadístico del ensayo. Los métodos existentes se basan en medidas subjetivas y, por lo tanto, pueden proporcionar información de pronóstico inexacta.

Resumen

Esta solicitud describe ensayos moleculares que involucran la medición del(de los) nivel(es) de expresión de uno o más genes o subconjuntos de genes a partir de una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de riñón.

Por ejemplo, la probabilidad de un resultado clínico puede describirse en términos de una puntuación cuantitativa basada en las características clínicas observadas de la enfermedad o el intervalo libre de recurrencia.

Además, esta solicitud describe métodos para obtener una puntuación de recurrencia (RS) para un paciente con cáncer de riñón en base a la medición del(los) nivel(es) de expresión de uno o más genes o subconjuntos de genes a partir de una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de riñón.

La presente descripción proporciona un método para obtener una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón que comprende medir un nivel de transcritos de ARN, o sus productos de expresión, en una muestra de tumor obtenida del paciente. Los transcritos de ARN, o sus productos de expresión, son APOLD1, EDNRB, NOS3, PPA2B, EIF4EBP1, LMNB1, TUBB2A, CCL5, CEACAM1, CX3CL1, e IL-6. El método comprende normalizar el nivel de expresión génica frente a un nivel de al menos un transcrito de ARN de referencia, o su producto de expresión, en la muestra de tumor. En algunas modalidades, la normalización puede incluir la compresión de mediciones de expresión génica para genes de baja expresión y/o genes con formas funcionales no lineales. El método comprende, además, asignar el nivel normalizado a un subconjunto de genes. El subconjunto de genes puede seleccionarse de un grupo de normalización vascular, un grupo de crecimiento/división celular, y un grupo de respuesta inmunitaria. En algunas modalidades, APOLD1, EDNRB, NOS3, y PPA2B se asignan al grupo de normalización vascular. En varias modalidades, EIF4EBP1, LMNB1, y TUBB2A se asignan al grupo de crecimiento/división celular. En otras modalidades, CCL5, CEACAM1, y CX3CL1 se asignan al grupo de respuesta inmunitaria. El método comprende además ponderar el subconjunto de genes de acuerdo con su contribución a la evaluación del riesgo de recurrencia del cáncer. El método comprende además calcular una puntuación de recurrencia para el paciente mediante el uso de los subconjuntos de genes ponderados y los niveles normalizados. El método puede comprender además la creación de un informe que comprende la puntuación de recurrencia.

La presente descripción proporciona además un método para predecir la probabilidad de un resultado clínico para un paciente con cáncer de riñón. El método comprende determinar un nivel de uno o más transcritos de ARN, o un producto de expresión de este, en una muestra de tumor obtenida del paciente. El o los transcritos de ARN se selecciona de APOLD1, EDNRB, NOS3, PPA2B, EIF4EBP1, LMNB1, TUBB2A, CCL5, CEACAM1, CX3CL1, e IL-6. El método comprende además asignar el o los transcritos de ARN, o un producto de expresión de este, a uno o más subconjuntos de genes. El método comprende además asignar el nivel normalizado a un subconjunto de genes. El subconjunto de genes puede seleccionarse de un grupo de normalización vascular, un grupo de crecimiento/división celular, y un grupo de respuesta inmunitaria. En algunas modalidades, APOLD1, EDNRB, NOS3, y PPA2B se asignan al grupo de normalización vascular. En varias modalidades, EIF4EBP1, LMNB1, y TUBB2A se asignan al grupo de crecimiento/división celular. En otras modalidades, CCL5, CEACAM1, y CX3CL1 se asignan al grupo de respuesta inmunitaria. El método comprende, además, calcular una puntuación cuantitativa para el paciente tras ponderar el nivel de uno o más transcritos de ARN, o un producto de expresión de estos, por su contribución a la evaluación de la probabilidad de un resultado clínico. El método comprende adicionalmente predecir la probabilidad de un resultado clínico para el paciente en base a la puntuación cuantitativa. En algunas modalidades, un aumento en la puntuación cuantitativa se correlaciona con una mayor probabilidad de un resultado clínico negativo. En algunas modalidades, el resultado clínico es la recurrencia del cáncer.

En algunas modalidades de la presente descripción, el cáncer de riñón es un carcinoma de células renales. En otras modalidades, el cáncer de riñón es un carcinoma de células renales de células claras.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra curvas de predictibilidad e intervalos de confianza del 95 % para pacientes con ccRCC en estadio 1 (A) y pacientes con ccRCC en estadio 2 o estadio 3 (B) en base al algoritmo descrito en los Ejemplos. Descripción detallada

Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que se entiende habitualmente en la técnica a la que pertenece la invención. Singleton y otros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2da ed., J, Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ta ed., John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Los términos "tumor" y "lesión", como se usan en la presente descripción, se refieren a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer', "canceroso" y “carcinoma” se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer en la presente descripción incluyen cáncer de riñón, como carcinoma de células renales (RCC, cáncer de células renales, o adenocarcinoma de células renales), carcinoma de células renales de células claras, carcinoma de células renales papilares, carcinoma de células renales cromófobas, carcinoma de células renales del conducto colector, carcinoma de células renales no clasificadas, carcinoma de células de transición, tumor de Wilms, y sarcoma renal.

Como se usa en la presente descripción, los términos "cáncer de riñón", "cáncer renal", o "carcinoma de células renales" se refieren al cáncer que ha surgido del riñón.

Los términos "cáncer de células renales" o "carcinoma de células renales" (RCC), como se usan en la presente descripción, se refieren al cáncer que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal. Más específicamente, el RCC abarca varios subtipos histológicos relativamente comunes: carcinoma de células renales de células claras, carcinoma papilar (cromófilo), cromófobo, del conducto colector y carcinoma medular. El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es el subtipo más común de RCC. La incidencia de ccRCC está aumentando, y comprende el 80 % de la enfermedad localizada y más del 90 % de la enfermedad metastásica.

La “patología” incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, como ganglios linfáticos, etc.

El sistema de estadificación del Comité estadounidense conjunto sobre el cáncer (AJCC) (7‘ ed., 2010) (se refiere además como el sistema TNM (tumor, ganglio, metástasis) para el cáncer de riñón usa números romanos de I a IV (1­ 4) para describir la extensión de la enfermedad. (Edge, SB, y otros, AJCC Cancer Staging Manual, (7a ed. 2010.)) En general, cuanto menor es el número, menos se ha propagado el cáncer. Un número más alto, como el estadio IV, generalmente refleja un cáncer más grave. El sistema de estadificación TNM es el siguiente:

Tumor primario (T)

Tx No puede evaluarse el tumor primario

T0 Sin evidencia de tumor primario

T1 Tumor de 7 cm o menos en su dimensión mayor, limitado al riñón

T1a Tumor de 4 cm o menos en su dimensión mayor, limitado al riñón

T1b Tumor de más de 4 cm, pero no más de 7 cm en su dimensión mayor, limitado al riñón

T2 Tumor de más de 7 cm en su dimensión mayor, limitado al riñón

T2a Tumor de más de 7 cm, pero menor o igual a 10 cm en su dimensión mayor, limitado al riñón

T2b Tumor de más de 10 cm, limitado al riñón

T3 El tumor se extiende hacia las venas principales o los tejidos perinéfricos, pero no hacia la glándula suprarrenal ipsilateral y no más allá de la fascia de Gerota.

T3a El tumor se extiende extremadamente hacia la vena renal o sus ramas segmentarias (que contienen músculo), o el tumor invade la grasa del seno perirrenal y/o renal pero no más allá de la fascia de Gerota

T3b El tumor se extiende extremadamente hacia la vena cava debajo del diafragma

T3c El tumor se extiende extremadamente hacia la vena cava por encima del diafragma o invade la pared de la vena cava

T4 El tumor invade más allá de la fascia de Gerota'a (incluida la extensión contigua a la glándula suprarrenal ipsilateral)

Ganglios linfáticos regionales (N)

NX No pueden evaluarse los ganglios linfáticos regionales

N0 Sin metástasis en los ganglios linfáticos regionales

N1 Metástasis en ganglios linfáticos regionales

Metástasis distante (M)

M0 Sin metástasis distante

M1 Metástasis distante

Estadio anatómico/grupos pronósticos

Estadio 1 T1 N0 M0

Estadio II T2 N0 M0

Estadio III T2 N0 M0

Estadio IV T4 Cualquier N M0

Cualquier T Cualquier N M1

El término "cáncer renal en estadio temprano", como se usa en la presente descripción, se refiere a los Estadios 1-3. La referencia al "grado" del tumor para el carcinoma de células renales como se usa en la presente descripción se refiere a un sistema de clasificación basado en el aspecto microscópico de las células tumorales. De acuerdo con el sistema de estadificación TNM del AJCC, los diversos grados de carcinoma de células renales son:

GX (no puede evaluarse el grado de diferenciación);

G1 (bien diferenciado);

G2 (moderadamente diferenciado); y

G3-G4 (poco diferenciado/indiferenciado).

"Grado mayor", como se usa en la presente descripción, se refiere a la clasificación de un tumor en un grado que es más avanzado, por ejemplo, el grado 4 (G4) es un grado mayor en relación con los grados 1, 2, y 3. La clasificación del tumor es un factor pronóstico importante en el carcinoma de células renales. H. Rauschmeier y otros, World J Urol 2:103-108 (1984).

Los términos "necrosis" o "necrosis histológica" como se usan en la presente descripción se refieren a la muerte de células o tejidos vivos. La presencia de necrosis puede ser un factor pronóstico en el cáncer. Por ejemplo, la necrosis se observa comúnmente en el carcinoma de células renales (RCC) y se ha demostrado que es un factor pronóstico adverso en ciertos subtipos de RCC. V. Foria y otros, J Clin Pathol 58(1):39-43 (2005).

Los términos "invasión ganglionar" o "ganglios positivos (N+)" como se usan en la presente descripción se refieren a la presencia de células cancerosas en uno o más ganglios linfáticos asociados con el órgano (por ejemplo, drenar el órgano) que contiene un tumor primario. La evaluación de la invasión ganglionar es parte de la estadificación del tumor para la mayoría de los cánceres, que incluye el carcinoma de células renales.

El término "pronóstico" se usa en la presente descripción para referirse a la predicción de la probabilidad de que un paciente con cáncer tenga una muerte o progresión atribuible al cáncer, que incluye recurrencia, diseminación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, como el cáncer de riñón.

El término "gen pronóstico" se usa en la presente descripción para referirse a un gen, cuya expresión está correlacionada, positivamente o negativamente, con una probabilidad de recurrencia del cáncer en un paciente con cáncer tratado con la atención estándar. Un gen puede ser tanto un gen pronóstico como predictivo, en dependencia de la asociación del nivel de expresión génica con el criterio de valoración correspondiente. Por ejemplo, mediante el uso de un modelo de riesgos proporcionales de Cox, si un gen es solo pronóstico, su índice de riesgos (HR) no cambia cuando se mide en pacientes tratados con la atención estándar o en pacientes tratados con una nueva intervención. El término "predicción" se usa en la presente descripción para referirse a la probabilidad de que un paciente con cáncer tenga una respuesta particular al tratamiento, ya sea positiva ("respuesta beneficiosa") o negativa, después de la extirpación quirúrgica del tumor primario. Por ejemplo, el tratamiento podría incluir fármacos dirigidos, inmunoterapia, o quimioterapia.

Los términos "gen predictivo" y "gen indicador de respuesta" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un gen, cuyo nivel de expresión se asocia, positivamente o negativamente, con la probabilidad de una respuesta beneficiosa al tratamiento. Un gen puede ser tanto pronóstico como predictivo, y viceversa, en dependencia de la correlación del nivel de expresión génica con el criterio de valoración correspondiente (por ejemplo, la probabilidad de supervivencia sin recurrencia, la probabilidad de respuesta beneficiosa al tratamiento). Puede identificarse un gen predictivo mediante el uso de un modelo de riesgos proporcionales de Cox para estudiar la interacción entre los niveles de expresión génica y el efecto del tratamiento [mediante la comparación de pacientes tratados con el tratamiento A con pacientes que no recibieron el tratamiento A (pero que pueden haber recibido atención estándar, por ejemplo, el tratamiento B)]. El índice de riesgos (HR) de un gen predictivo cambiará cuando se mida en pacientes de atención estándar/no tratados frente a pacientes tratados con el tratamiento A.

Como se usa en la presente descripción, el término "nivel de expresión" como se aplica a un gen se refiere al nivel normalizado de un producto génico, por ejemplo, el valor normalizado determinado para el nivel de expresión de ARN de un gen o para el nivel de expresión del polipéptido de un gen.

El término "producto génico" o "producto de expresión" se usa en la presente descripción para referirse a los productos de transcripción de ARN (transcritos) del gen, que incluye ARNm, y los productos polipeptídicos de dichos transcritos de ARN. Un producto génico puede ser, por ejemplo, un ARN no empalmado, un ARNm, una variante de empalme de ARNm, un microARN, un a Rn fragmentado, un polipéptido, un polipéptido modificado postraduccionalmente, un polipéptido variante de empalme, etcétera.

El término "transcrito de ARN", como se usa en la presente descripción, se refiere a los productos de la transcripción de un gen, por ejemplo, ARNm, un ARN no empalmado, una variante de empalme de ARNm, un micro ARN y un ARN fragmentado.

A menos que se indique de cualquier otra manera, cada nombre de gen usado en la presente descripción corresponde al Símbolo Oficial asignado al gen y proporcionado por Entrez Gene (URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) a partir de la fecha de presentación de esta solicitud.

Los términos "correlacionado" y "asociado" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a la asociación entre dos mediciones (o entidades medidas). La descripción proporciona genes y subconjuntos de genes, cuyos niveles de expresión están asociados con una medida de resultado particular, como por ejemplo la asociación entre el nivel de expresión de un gen y la probabilidad de resultado clínico. Por ejemplo, el mayor nivel de expresión de un gen puede estar correlacionado positivamente (asociado positivamente) con una probabilidad mayor de un buen resultado clínico para el paciente, como una mayor probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer, y similares. Dicha correlación positiva puede demostrarse estadísticamente de diversas formas, por ejemplo, mediante un índice de riesgos bajo para la recurrencia del cáncer o la muerte. En otro ejemplo, el mayor nivel de expresión de un gen puede estar correlacionado negativamente (asociado negativamente) con una mayor probabilidad de un resultado clínico bueno para el paciente. En ese caso, por ejemplo, el paciente puede tener una probabilidad reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer, y similares. Dicha correlación negativa indica que es probable que el paciente tenga un pronóstico desfavorable, y esto puede demostrarse estadísticamente de diversas formas, por ejemplo, un índice de riesgos alto para la recurrencia del cáncer o la muerte. "Correlacionado" se usa además en la presente descripción para referirse a la asociación entre los niveles de expresión de dos genes diferentes, de manera que el nivel de expresión de un primer gen puede sustituirse con un nivel de expresión de un segundo gen en un algoritmo dado en vista de su correlación de expresión. Dicha "expresión correlacionada" de dos genes que son sustituibles en un algoritmo usualmente involucra niveles de expresión génica que se correlacionan positivamente entre sí, por ejemplo, si una expresión mayor de un primer gen se correlaciona positivamente con un resultado (por ejemplo, una probabilidad mayor de un buen resultado clínico), entonces el segundo gen que se coexpresa y muestra una expresión correlacionada con el primer gen además se correlaciona positivamente con el mismo resultado.

Un "resultado clínico positivo" puede evaluarse mediante el uso de cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para el paciente, que incluye, sin limitación, (1) inhibición, en cierta medida, del crecimiento tumoral, que incluye la desaceleración y la detención completa del crecimiento; (2) reducción en el número de células tumorales; (3) reducción en el tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, desaceleración o detención completa) de la infiltración de células tumorales en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) inhibición de la metástasis; (6) mejora de la respuesta inmunitaria antitumoral, que posiblemente dé como resultado la regresión o el rechazo del tumor; (7) alivio, en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el tumor; (8) aumento en la duración de la supervivencia después del tratamiento; y/o (9) disminución de la mortalidad en un momento dado después del tratamiento. La respuesta clínica positiva puede expresarse además en términos de diversas medidas de resultado clínico. El resultado clínico positivo puede considerarse además en el contexto del resultado de un individuo en relación con un resultado de una población de pacientes que tienen un diagnóstico clínico comparable, y puede evaluarse mediante el uso de varios criterios de valoración, como un aumento en la duración del intervalo libre de recurrencia (RFI), un aumento en el tiempo de supervivencia en comparación con la supervivencia general (OS) en una población, un aumento en el tiempo de supervivencia libre de enfermedad (DFS), un aumento en la duración del intervalo libre de recurrencia distante (DRFI), y similares. Un aumento en la probabilidad de respuesta clínica positiva corresponde a una disminución en la probabilidad de recurrencia del cáncer.

El término "clasificación de riesgo" significa un nivel de riesgo (o probabilidad) de que un sujeto experimente un resultado clínico particular. Un sujeto puede clasificarse en un grupo de riesgo o clasificarse a un nivel de riesgo en base a los métodos de la presente descripción, por ejemplo, riesgo alto, medio o bajo. Un "grupo de riesgo" es un grupo de sujetos o individuos con un nivel de riesgo similar para un resultado clínico particular.

El término supervivencia a "largo plazo" se usa en la presente descripción para referirse a la supervivencia durante un período de tiempo particular, por ejemplo, durante al menos 3 años, o durante al menos 5 años.

Los términos "recurrencia" y "recaída" se usan en la presente descripción, en el contexto de posibles resultados clínicos del cáncer, para referirse a metástasis locales o distantes. La identificación de una recurrencia podría realizarse, por ejemplo, mediante imágenes de CT, ultrasonido, arteriograma, o rayos X, biopsia, análisis de orina o sangre, examen físico o registro de tumores en un centro de investigación.

El término "intervalo libre de recurrencia (RFI)" se usa en la presente descripción para referirse al tiempo (en años) desde la aleatorización hasta la primera recurrencia del cáncer de riñón o la muerte debido a la recurrencia del cáncer de riñón.

El término "Supervivencia General (OS)" se usa en la presente descripción para referirse al tiempo (en años) desde la aleatorización hasta la muerte por cualquier causa.

El término "supervivencia libre de enfermedad (DFS)" se usa en la presente descripción para referirse al tiempo (en años) desde la aleatorización hasta la primera recurrencia del cáncer de riñón o la muerte por cualquier causa.

En la práctica, el cálculo de las medidas enumeradas anteriormente puede variar de un estudio a otro en dependencia de la definición de eventos ya sean censurados o no censurados.

El término "índice de riesgos (HR)", como se usa en la presente descripción, se refiere al efecto de una variable explicativa sobre el riesgo de un evento (es decir, recurrencia o muerte). En los modelos de regresión de riesgos proporcionales, HR es el índice del riesgo previsto para dos grupos (por ejemplo, pacientes con dos estadios diferentes de cáncer) o para un cambio de unidad en una variable continua (por ejemplo, un cambio de desviación estándar en la expresión génica).

El término "micromatriz" se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridables, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos o polinucleótidos, sobre un sustrato.

El término "polinucleótido", cuando se usa en singular o plural generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por lo tanto, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen en la presente descripción incluyen, sin limitación, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido", como se usa en la presente descripción, se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente involucran solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente los ADNc. El término incluye ADN (incluidos ADNc) y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones, son "polinucleótidos" como el término se entiende en la presente descripción. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiadas, se incluyen dentro del término "polinucleótidos" como se define en la presente descripción. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas modificadas químicamente, enzimáticamente y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen las células simples y complejas.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, híbridos de ARNrADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos de sonda de ADN monocatenario, a menudo se sintetizan mediante métodos químicos, por ejemplo, mediante el uso de sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están disponibles comercialmente. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden prepararse mediante una variedad de otros métodos, que incluyen técnicas in vitro mediadas por ADN recombinante y mediante la expresión de los ADN en células y organismos.

Como se usa en la presente descripción, el término "nivel de expresión" como se aplica a un gen se refiere al nivel del producto de expresión de un gen, por ejemplo, el valor normalizado determinado para el producto de expresión de ARN de un gen o para el nivel de expresión del polipéptido de un gen.

El término "Ct", como se usa en la presente descripción, se refiere al ciclo umbral, el número de ciclo en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en el que la fluorescencia generada dentro de una reacción supera con creces el umbral definido, es decir, el punto durante la reacción en el que un número suficiente de amplicones se han acumulado para alcanzar el umbral definido.

El término "Cp", como se usa en la presente descripción, se refiere a "punto de cruce". El valor de Cp se calcula mediante la determinación de las segundas derivadas de las curvas de amplificación qPCR completas y su valor máximo. El valor de Cp representa el ciclo en el que el aumento de fluorescencia es más alto y donde comienza la fase logarítmica de una PCR.

Los términos "umbral" o "umbralización" se refieren a un procedimiento usado para explicar las relaciones no lineales entre las mediciones de expresión génica y la respuesta clínica, así como también para reducir aún más la variación en las mediciones de la expresión génica informadas y las puntuaciones de los pacientes inducidas por los genes de expresión baja. Cuando se aplica la umbralización, todas las mediciones por debajo o por encima de un umbral se establecen en ese valor umbral. Podría examinarse la relación no lineal entre la expresión génica y el resultado mediante el uso de suavizadores o splines cúbicos para modelar la expresión génica en la regresión de Cox PH en el intervalo libre de recurrencia o en la regresión logística en el estado de recurrencia. La variación en las puntuaciones de pacientes informadas podría examinarse en función de la variabilidad en la expresión génica en el límite de cuantificación y/o detección de un gen en particular.

Como se usa en la presente descripción, el término "amplicón" se refiere a fragmentos de ADN que se han sintetizado mediante el uso de las técnicas de amplificación, tales como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y las reacciones en cadena de la ligasa.

El "rigor" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por un experto en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridar nuevamente cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas lo harán menos. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en la presente descripción, típicamente: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para los lavados, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio 0,1 % a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino 0,1 %/Ficoll 0,1 %/polivinilpirrolidona 0,1 %/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1 %, Solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 _g/ml), SDS 0,1 %, y sulfato de dextrano 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0,2 x (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida 50 %, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 °C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos riguroso que los descritos anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida 20 %, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano 10 % y ADN desnudo desnaturalizado de esperma de salmón 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-500 °C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etcétera, como sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

Los términos "empalme" y "empalme de ARN" se usan indistintamente y se refieren al procesamiento del ARN que elimina intrones y une exones para producir el ARNm maduro con secuencia codificante continua que se mueve hacia el citoplasma de una célula eucariota.

Como se usa en la presente descripción, el término "exón" se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que está representado en el producto de ARN maduro. Como se usa en la presente descripción, el término "intrón" se refiere a cualquier segmento de ADN que se transcribe, pero se elimina del interior del transcrito mediante el empalme de los exones a cada lado del mismo. "ARN intrónico" se refiere a ARNm derivado de una región intrónica de ADN. Operacionalmente, las secuencias exónicas aparecen en la secuencia de ARNm de un gen como se define mediante los números de SEQ ID de referencia. Operacionalmente, las secuencias de intrones son las secuencias intermedias dentro del ADN genómico de un gen.

El término "coexpresado", como se usa en la presente descripción, se refiere a una correlación estadística entre el nivel de expresión de un gen y el nivel de expresión de otro gen. La coexpresión por pares puede calcularse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el cálculo de los coeficientes de correlación de Pearson o los coeficientes de correlación de Spearman. Las camarillas de genes coexpresados pueden identificarse además mediante el uso de una teoría de grafos. Puede calcularse un análisis de la coexpresión mediante el uso de los datos de expresión normalizados.

Un "sistema basado en ordenador" se refiere a un sistema de los componentes físicos de un ordenador, el programa informático y los medios de almacenamiento de datos usados para analizar información. Los mínimos componentes físicos de un ordenador de un sistema basado en ordenador del paciente comprende una unidad central de procesamiento (CPU) y los componentes físicos de un ordenador para la entrada de datos, salida de datos (por ejemplo, pantalla) y almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que cualquier sistema basado en ordenador y/o sus componentes actualmente disponibles son adecuados para usar en relación con los métodos de la presente descripción. El medio de almacenamiento de datos puede comprender cualquier fabricación que comprenda un registro de la presente información como se describió anteriormente, o un dispositivo de acceso a memoria que puede acceder a dicha fabricación.

Para "registro" de datos, programación u otra información en un medio legible por ordenador se refiere a un proceso para almacenar información, mediante el uso de cualquiera de dichos métodos conocidos en la técnica. Puede elegirse cualquier estructura conveniente de almacenamiento de datos, en base a los medios usados para acceder a la información almacenada. Puede usarse una diversidad de programas y formatos de procesador de datos para el almacenamiento, por ejemplo, archivos de texto de procesamiento de texto, formatos de bases de datos, etcétera.

Un "procesador" o "medio informático" se refiere a cualquier combinación de componentes físicos de un ordenador y/o el programa informático que realizará las funciones requeridas. Por ejemplo, un procesador adecuado puede ser un microprocesador digital programable tal como el disponible en forma de controlador electrónico, ordenador central, servidor u ordenador personal (de escritorio o portátil). Cuando el procesador es programable, la programación adecuada puede comunicarse desde una ubicación remota al procesador, o guardarse previamente en un producto de programa informático (tal como un medio de almacenamiento legible por ordenador portátil o fijo, ya sea basado en un dispositivo de estado sólido, óptico o magnético). Por ejemplo, un medio magnético o un disco óptico pueden portar la programación, y pueden leerse mediante un lector adecuado que se comunique con cada procesador en su estación correspondiente.

Los términos "cirugía" o "resección quirúrgica" se usan en la presente descripción para referirse a la extirpación quirúrgica de parte o de la totalidad de un tumor, y usualmente parte del tejido circundante. Los ejemplos de técnicas quirúrgicas incluyen procedimientos laparoscópicos, biopsia, o ablación de tumores, como crioterapia, ablación por radiofrecuencia, y ultrasonido de alta intensidad. En pacientes con cáncer, la extensión del tejido extirpado durante la cirugía depende del estado del tumor observado por un cirujano. Por ejemplo, una nefrectomía parcial indica que se extrae parte de un riñón; una nefrectomía simple implica la extirpación de todo un riñón; una nefrectomía radical, la extirpación de todo un riñón y tejido vecino (por ejemplo, glándula suprarrenal, ganglios linfáticos); y nefrectomía bilateral, extirpación de ambos riñones.

Métodos basados en algoritmos y subconjuntos de genes

La presente descripción proporciona un ensayo de diagnóstico molecular basado en algoritmos para determinar un resultado clínico esperado, por ejemplo, pronóstico. El cáncer puede ser, por ejemplo, carcinoma de células renales o carcinoma de células renales de células claras. La presente descripción proporciona además un método para obtener una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón. Por ejemplo, los niveles de expresión de los genes de pronóstico pueden usarse para obtener una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón. El ensayo basado en algoritmos y la información asociada proporcionada por la práctica de los métodos de la presente invención facilitan la toma de decisiones de tratamiento óptimo en el cáncer de riñón. Por ejemplo, dicha herramienta clínica permitiría a los médicos identificar a los pacientes que tienen una probabilidad baja de recurrencia y, por lo tanto, podrían renunciar al tratamiento adyuvante. De manera similar, dicha herramienta además puede permitir a los médicos identificar a los pacientes que tienen una alta probabilidad de recurrencia y que pueden ser buenos candidatos para el tratamiento adyuvante.

Como se usa en la presente descripción, una "puntuación cuantitativa" es un valor numérico calculado aritméticamente o matemáticamente para ayudar a simplificar o describir o informar el análisis de información cuantitativa más compleja, tal como la correlación de determinados niveles de expresión de los genes o subconjuntos de genes descritos a una probabilidad de un resultado clínico de un paciente con cáncer de riñón. Una puntuación cuantitativa puede determinarse mediante la aplicación de un algoritmo específico. El algoritmo usado para calcular la puntuación cuantitativa en los métodos descritos en la presente descripción puede agrupar los valores del nivel de expresión de los genes. La agrupación de genes puede realizarse, al menos en parte, en base al conocimiento de la contribución relativa de los genes de acuerdo con las funciones fisiológicas o características de los componentes celulares, tales como en los grupos discutidos en la presente descripción. Puede determinarse una puntuación cuantitativa para un grupo de genes ("puntuación de grupo de genes"). La formación de grupos, además, puede facilitar la ponderación matemática de la contribución de varios niveles de expresión de genes o subconjuntos de genes a la puntuación cuantitativa. La ponderación de un gen o grupo de genes que representa un proceso fisiológico o características de los componentes celulares puede reflejar la contribución de ese proceso o característica a la patología del cáncer y el resultado clínico, tal como la recurrencia o aumento del grado/estadificación del cáncer. La presente invención proporciona un algoritmo para calcular las puntuaciones cuantitativas, por ejemplo, como se establece en los Ejemplos. En una modalidad de la invención, un aumento en la puntuación cuantitativa indica una probabilidad mayor de un resultado clínico negativo.

En una modalidad, una puntuación cuantitativa es una "puntuación de recurrencia", que indica la probabilidad de recurrencia de un cáncer, aumento de grado o estadificación de un cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado, y/o enfermedad de alto grado o no confinada a órganos. Un aumento en la puntuación de recurrencia puede correlacionarse con un aumento en la probabilidad de recurrencia del cáncer, aumento de grado o estadificación de un cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado, y/o enfermedad de alto grado o no confinada a órganos.

Los subconjuntos de genes de la presente invención incluyen un grupo de genes de normalización vascular, un grupo de genes de respuesta inmunitaria, un grupo de genes de crecimiento/división celular, e IL-6.

El subconjunto de genes identificado en la presente descripción como el "grupo de normalización vascular" incluye genes que están involucrados con funciones vasculares y/o angiogénesis. El grupo de normalización vascular incluye, por ejemplo, APOLD1, EDNRB, NOS3, y PPA2B.

El subconjunto de genes identificado en la presente descripción como el "grupo de división/crecimiento celular" incluye genes que están involucrados en la(s) vía(s) clave de crecimiento celular y división celular. El grupo de crecimiento/división celular incluye, por ejemplo, EIF4EBP1, LMNB1, y TUBB2A.

El subconjunto de genes identificado en la presente descripción como el "grupo de respuesta inmunitaria" incluye genes que están involucrados en funciones del sistema inmunitario. El grupo de respuesta inmunitaria incluye, por ejemplo, CCL5, CEACAM1 y CX3CL1.

Además, los niveles de expresión de ciertos genes individuales pueden usarse para calcular la puntuación de recurrencia. Por ejemplo, el nivel de expresión de IL-6 puede usarse para calcular la puntuación de recurrencia. Aunque la IL-6 puede estar involucrada en respuestas inmunitarias, puede además estar involucrada en otros procesos biológicos, que la hacen menos adecuada para agruparse con otros genes relacionados con la inmunidad.

La presente descripción proporciona, además, métodos para determinar un nivel de expresión umbral para un gen particular. Puede calcularse un nivel de expresión umbral para un gen específico. Un nivel de expresión umbral para un gen puede basarse en un nivel de expresión normalizado. En un ejemplo, puede calcularse un nivel de expresión umbral de Ct por la evaluación de formas funcionales mediante el uso de la regresión logística o regresión de riesgos proporcionales de Cox.

La presente invención proporciona, además, métodos para determinar genes que se coexpresan con genes particulares identificados mediante, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR), como biomarcadores validados relevantes para un tipo particular de cáncer. Los propios genes coexpresados son biomarcadores útiles. Los genes coexpresados pueden sustituirse por los genes con los que se coexpresan. Los métodos pueden incluir la identificación de camarillas de genes a partir de datos de micromatrices, normalizar los datos de micromatrices, calcular una matriz de correlación de Spearman por pares para las sondas de las matrices, filtrar sondas coexpresadas significativas en diferentes estudios, construir un gráfico, mapear la sonda con respecto a los genes, y generar un informe de camarillas de genes. Los niveles de expresión de uno o más genes de una camarilla de genes pueden usarse para calcular la probabilidad de que un paciente con cáncer de riñón experimente un resultado clínico positivo, tal como una probabilidad reducida de recurrencia del cáncer.

De acuerdo con la presente descripción, pueden analizarse una o más combinaciones de grupos de genes. Por ejemplo, puede analizarse un grupo de genes de normalización vascular, solo o en combinación, con un grupo de genes de crecimiento/división celular, un grupo de genes de respuesta inmunitaria, y/o IL-6. Además, puede analizarse cualquier número de genes dentro de cada grupo de genes.

En una modalidad específica de la invención, un método para predecir un resultado clínico para un paciente con cáncer de riñón comprende medir un nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de este, y al menos un gen de un grupo de genes de división/crecimiento celular, o un gen coexpresado de este. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de estos, y al menos dos genes de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de estos. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes a partir de cada uno del grupo de genes de normalización vascular y del grupo de genes de crecimiento/división celular. En una modalidad adicional, se miden los niveles de expresión de al menos cuatro genes del grupo de genes de normalización vascular y al menos tres genes del grupo de genes de crecimiento/diferenciación celular.

En otra modalidad de la descripción, se miden al menos un gen de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de este, y al menos un gen de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de este. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de estos, y al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de estos. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes a partir de cada uno del grupo de genes de normalización vascular y del grupo de genes de respuesta inmunitaria. En una modalidad adicional, se miden los niveles de expresión de al menos cuatro genes del grupo de genes de normalización vascular y al menos tres genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria.

En una modalidad adicional de la descripción, se mide el nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de este, e IL-6. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de estos, e IL-6. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes del grupo de genes de normalización vascular e IL-6. En una modalidad adicional, se miden los niveles de expresión de al menos cuatro genes del grupo de genes de normalización vascular e IL-6.

Además, se mide un nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de este, y al menos un gen de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de este. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de estos, y al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de estos. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes a partir de cada uno del grupo de genes de normalización vascular y del grupo de genes de respuesta inmunitaria. En una modalidad adicional, se miden los niveles de expresión de al menos cuatro genes del grupo de genes de normalización vascular y al menos tres genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria.

En una modalidad específica de la descripción, un método para predecir un resultado clínico para un paciente con cáncer de riñón comprende medir un nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de este, y al menos un gen de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de este. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de estos, y al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de estos. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes a partir de cada uno de los grupos de genes de crecimiento/división celular y del grupo de genes de respuesta inmunitaria.

En una modalidad adicional de la invención, se mide el nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de este, e IL-6. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de estos, e IL-6. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes del grupo de genes de crecimiento/división celular e IL-6.

En una modalidad adicional de la descripción, se mide el nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de este, e IL-6. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta inmunitaria, o un gen coexpresado de este, e IL-6. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria e IL-6.

En una modalidad adicional de la invención, se mide un nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de este, al menos un gen de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de este, y al menos un gen de un grupo de genes de respuesta inmunitaria. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de estos, y al menos dos genes de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de estos, y al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta inmunitaria. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes a partir de cada uno de los grupos de genes de normalización vascular, el grupo de genes de crecimiento/división celular, y el grupo de genes de respuesta inmunitaria. En una modalidad adicional, se miden los niveles de expresión de al menos cuatro genes del grupo de genes de normalización vascular, al menos tres genes del grupo de genes de crecimiento/diferenciación celular, y al menos tres genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria.

En otra modalidad de la invención, se miden un nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de este, al menos un gen de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de este, al menos un gen de un grupo de genes de respuesta inmunitaria e IL-6. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de normalización vascular, o un gen coexpresado de estos, al menos dos genes de un grupo de genes de crecimiento/división celular, o un gen coexpresado de estos, al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta inmunitaria e IL-6. En aún otra modalidad, se miden los niveles de expresión de al menos tres genes a partir de cada uno de los grupos de genes de normalización vascular, el grupo de genes de crecimiento/división celular, y el grupo de genes de respuesta inmunitaria e IL-6. En una modalidad adicional, se miden los niveles de expresión de al menos cuatro genes del grupo de genes de normalización vascular, al menos tres genes del grupo de genes de crecimiento/diferenciación celular, al menos tres genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria, e IL-6.

Además, los niveles de expresión de uno o más genes que no pertenecen a los subconjuntos de genes descritos en la presente descripción pueden medirse con cualquiera de las combinaciones de los subconjuntos de genes descritos en la presente descripción. Alternativamente, cualquier gen que pertenezca a un subconjunto de genes puede analizarse por separado del subconjunto de genes, o en otro subconjunto de genes.

En una modalidad específica, el método de la invención comprende medir los niveles de expresión de las combinaciones específicas de genes y subconjuntos de genes mostrados en los Ejemplos. En una modalidad adicional, la(s) puntuación(ones) del grupo de genes y la(s) puntuación(ones) cuantitativas se calculan de acuerdo con los algoritmos mostrados en los Ejemplos. En ciertas modalidades de la descripción, el método de la invención comprende medir los niveles de expresión de los genes relacionados con el cáncer APOLD1, CCL5, CEACAM1, CX3CL1, EDNRB, EIF4EBP1, IL6, LMNB1, NOS3, PPAP2B, y TUBB2A, y los genes de referencia AAMP, ARF1, ATP5E, GPX1, y RPFP1, mediante la normalización de los niveles de expresión de uno o más de los genes relacionados con el cáncer frente a los niveles de expresión de uno o más de los genes de referencia, tras asignar los niveles de expresión normalizados a subconjuntos de genes, ponderar el subconjunto de genes de acuerdo con su contribución a la recurrencia del cáncer, calcular una puntuación de recurrencia mediante el uso del subconjunto de genes ponderados y los niveles normalizados, y crear un informe que comprenda la puntuación de recurrencia.

En ciertas modalidades, el método de la descripción comprende medir los niveles de expresión de ciertos subgrupos de genes relacionados con el cáncer seleccionados del grupo que consiste en: (1) APOLD1, NOS3, y EMCN; (2) APOLD1 NOS3 IL6 IL8 EMCN 3 CEACAM1 CX3CL1 IL6 e IL8 4 EIF4EBP1 LMNB1 5 APOLD1 EDNRB

2B, 2B,

2B, CEACAM1, CX3CL1, y TUBB2A y los genes de referencia AAMP, ARF1, ATP5E, GPX1, y RPLP1, mediante la normalización de los niveles de expresión de uno o más de los subgrupos de genes relacionados con el cáncer frente a los niveles de expresión de uno o más de los genes de referencia, y la creación de un informe que comprenda el riesgo de recurrencia. En ciertas modalidades, el riesgo de recurrencia se estima a partir de un índice de riesgos calculado mediante el uso de los niveles de expresión normalizados de uno o más subgrupos de genes relacionados con el cáncer.

En esta especificación se exponen varios enfoques tecnológicos para la determinación de los niveles de expresión de los genes descritos, que incluyen, sin limitación, RT-PCR, micromatrices, secuenciación de alto rendimiento, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y Expresión Génica Digital (DGE), que se discutirá en detalle más abajo. En aspectos particulares, el nivel de expresión de cada gen puede determinarse en relación con diversas características de los productos de expresión del gen, que incluyen exones, intrones, epítopos proteicos y actividad proteica.

El producto de expresión que se analiza puede ser, por ejemplo, ARN o un polipéptido. El producto de expresión puede estar fragmentado. Por ejemplo, el ensayo puede usar cebadores que son complementarios a las secuencias diana de un producto de expresión y, por lo tanto, podría medir transcritos completos, así como también aquellos productos de expresión fragmentados que contienen la secuencia diana. Se proporciona información adicional en las Tablas A y B.

El producto de expresión de ARN puede analizarse directamente o mediante la detección de un producto de ADNc resultante de un método de amplificación basado en PCR, por ejemplo, transcripción inversa y reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qRT-PCR). (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,587,279). El producto de expresión de polipéptidos puede analizarse mediante el uso de inmunohistoquímica (IHC) por técnicas de proteómica. Además, tanto los productos de expresión de ARN como de polipéptidos pueden analizarse, además, mediante el uso de micromatrices.

Utilidad clínica

Actualmente, el resultado clínico esperado para los pacientes con RCC se basa en determinaciones subjetivas de las características clínicas y patológicas de un tumor. Por ejemplo, los médicos toman decisiones sobre los procedimientos quirúrgicos apropiados y la terapia adyuvante en base al estadio, el grado y la presencia de necrosis del tumor renal. Aunque existen medidas estandarizadas para orientar a los patólogos en la toma de estas decisiones, el nivel de concordancia entre los laboratorios de patología es bajo. (Véase Al-Ayanti M y otros (2003) Arch Pathol Lab Med 127, 593-596). Sería útil tener un ensayo molecular reproducible para determinar y/o confirmar estas características tumorales.

Además, los criterios clínicos estándar, por sí mismos, tienen una capacidad limitada para estimar con precisión el pronóstico de un paciente. Sería útil disponer de un ensayo molecular reproducible para evaluar el pronóstico de un paciente en base a la biología de su tumor. Dicha información podría usarse con el propósito de asesorar al paciente, seleccionar pacientes para ensayos clínicos (por ejemplo, ensayos adyuvantes), y comprender la biología del carcinoma de células renales. Además, dicha prueba ayudaría a los médicos a hacer recomendaciones quirúrgicas y de tratamiento basadas en la biología del tumor de cada paciente. Por ejemplo, una prueba genómica podría estratificar a los pacientes con RCC en base al riesgo de recurrencia y/o la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recurrencia (recaída, metástasis, etc.). Existen varios ensayos clínicos en curso y planificados para terapias de RCC, que incluyen radiación adyuvante y quimioterapias. Sería útil tener una prueba genómica capaz de identificar a los pacientes de alto riesgo con mayor precisión que los criterios clínicos estándar, lo que por consiguiente enriquecería una población de RCC adyuvante para el estudio. Esto reduciría el número de pacientes necesarios para un ensayo adyuvante y el tiempo necesario para la prueba definitiva de estos nuevos agentes en el entorno adyuvante.

Finalmente, sería útil tener un ensayo molecular que pudiera predecir la probabilidad de que un paciente responda a tratamientos específicos. Una vez más, esto facilitaría las decisiones de tratamiento individual y el reclutamiento de pacientes para ensayos clínicos, y aumentaría la confianza del médico y del paciente en la toma de decisiones de atención médica después de ser diagnosticado con cáncer.

Métodos de ensayo de niveles de expresión de un producto génico

Los métodos de obtención de perfiles de expresión incluyen métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos, métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos, y métodos basados en proteómica. Los métodos representativos para el análisis basado en la secuenciación incluyen la Secuenciación Masiva Paralela (véase, por ejemplo, Tucker y otros, The American J. Human Genetics 85:142-154, 2009) y el análisis en serie de expresión génica (SAGE). Los métodos ilustrativos conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia northern e hibridación in situ (Parker y Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y métodos basados en PCR, tal como la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Weis y otros, Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos de secuencia, que incluye dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbrido de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína.

Métodos basados en secuenciación de ácidos nucleicos

Las tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos son métodos adecuados para el análisis de la expresión. El principio subyacente en estos métodos es que el número de veces que se detecta una secuencia de ADNc en una muestra se relaciona directamente con los niveles relativos de ARN correspondientes a esa secuencia. En ocasiones, el término Expresión Digital de Genes (DGE) hace referencia a estos métodos para reflejar la propiedad numérica discreta de los datos resultantes. Los primeros métodos que aplicaron este principio fueron el Análisis en Serie de la Expresión Génica (SAGE) y la Secuenciación Masiva Paralela de Firma (MPSS). Véase, por ejemplo, S. Brenner, y otros, Nature Biotechnology 18(6):630-634 (2000).

Más recientemente, el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de "próxima generación" ha hecho que la DGE sea más simple, de mayor rendimiento, y más asequible. Como resultado, más laboratorios pueden utilizar la DGE para detectar la expresión de más ácidos nucleicos en más muestras de pacientes individuales de lo que anteriormente era posible. Véase, por ejemplo, J. Marioni, Genome Research 18(9):1509-1517 (2008); R. Morin, Genome Research 18(4):610-621 (2008); A. Mortazavi, Nature Methods 5(7):621-628 (2008); N. Cloonan, Nature Methods 5(7):613-619 (2008). Los métodos de secuenciación masiva paralela han permitido además la secuenciación del transcriptoma o del genoma completo, lo que permite el análisis no solo de secuencias codificantes sino además no codificantes. Como se revisó en Tucker y otros, The American J. Human Genetics 85:142-154 (2009), existen varias plataformas de secuenciación masiva paralela disponibles comercialmente, como Illumina Genome Analyzer (Illumina, Inc., San Diego, CA), Applied Biosystems SOLiD™ Sequencer (Life Technologies, Carlsbad, CA), Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer (Roche Applied Science, Alemania), y Helicos® Genetic Analysis Platform (Helicos Biosciences Corp., Cambridge, MA). Pueden usarse otras tecnologías en desarrollo.

PCR con Transcripción Inversa (RT-PCR)

El material de partida es, típicamente, ARN total aislado de un tumor humano, usualmente de un tumor primario. Opcionalmente, pueden usarse tejidos normales del mismo paciente como control interno. El ARN puede extraerse de una muestra de tejido, por ejemplo, de una muestra que está fresca, congelada (por ejemplo, fresca congelada), o embebida en parafina y fijada (por ejemplo, fijada en formalina).

Los métodos generales para la extracción de ARN se conocen bien en la técnica y se describen en los libros de texto estándar de biología molecular, que incluyen Ausubel y otros, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Los métodos para la extracción de ARN de tejidos embebidos en parafina se describen, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), y De Andrés y otros, BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN puede realizarse mediante el uso de un kit de purificación, un conjunto de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de las células en cultivo puede aislarse mediante el uso de minicolumnas Qiagen RNeasy. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen el kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI) y el kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (Ambion, Inc.). El ARN total de las muestras de tejido puede aislarse mediante el uso de RNA Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir de una muestra de tumor puede aislarse, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Después, el ARN aislado puede agotarse de ARN ribosómico como se describe en la publicación de Estados Unidos núm. 2011/0111409.

Después, la muestra que contiene el ARN se somete a transcripción inversa para producir ADNc a partir del molde de ARN, seguido de amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas usadas más comúnmente son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa se ceba, típicamente, mediante el uso de cebadores específicos, hexámeros aleatorios, o cebadores oligo-dT, en dependencia de las circunstancias y del objetivo del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN que se extrae puede transcribirse de forma inversa mediante el uso de un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido puede usarse como molde en la reacción de PCR posterior.

Los métodos basados en PCR usan una ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN, tal como una ADN polimerasa Taq. Por ejemplo, la PCR TaqMan® utiliza típicamente la actividad 5'-nucleasa de la polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad 5'-nucleasa equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de un producto de reacción de p Cr . Puede diseñarse un tercer oligonucleótido, o sonda, para facilitar la detección de una secuencia de nucleótidos del amplicón ubicada entre los sitios de hibridación de los dos cebadores del PCR. La sonda puede marcarse de manera detectable, por ejemplo, con un colorante reportero, y puede proporcionarse además con un colorante fluorescente, y un inactivador del colorante fluorescente, tal como en una configuración de sonda Taqman®. Cuando se usa una sonda Taqman®, durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución y la señal del colorante reportero liberado está libre del efecto de inactivación del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante reportero por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reportero no inactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

El RT-PCR TaqMan® puede realizarse mediante el uso de equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, ABI p RiSM 7700TM Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, Ee . UU.), o LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una modalidad preferida, el procedimiento de nucleasa 5 'se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real como el ABI PRISM 7700TM Sequence Detection SystemTM. El sistema consiste en un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. La RT-PCR puede realizarse en pocillos por triplicado con un equivalente de entrada de ARN de 2 ng por volumen de reacción de 10 pl. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye un programa informático para ejecutar el instrumento y analizar los datos.

Los datos del ensayo de 5'-nucleasa generalmente se expresan inicialmente como un ciclo umbral ("C^t"). Los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El ciclo umbral (C^t ) se describe generalmente como el punto en el que la señal fluorescente se registra por primera vez como estadísticamente significativa. El valor de Cp se calcula determinando las segundas derivadas de las curvas de amplificación qPCR completas y su valor máximo. El valor de Cp representa el ciclo en el que el aumento de fluorescencia es más alto y donde comienza la fase logarítmica de una PCR.

Para minimizar los errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR usualmente se realiza mediante el uso de un estándar interno. El gen estándar interno ideal (se refiere además como gen de referencia) se expresa a un nivel constante entre los tejidos cancerosos y no cancerosos del mismo origen (es decir, un nivel que no es significativamente diferente entre los tejidos normales y cancerosos), y no se afecta significativamente por el tratamiento experimental (es decir, no exhibe una diferencia significativa en el nivel de expresión en el tejido relevante como resultado de la exposición a la quimioterapia). Los ARN que se usan más frecuentemente para normalizar los patrones de expresión génica son los ARNm de los genes constitutivos de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y p-actina. Las mediciones de expresión génica pueden normalizarse con relación a la media de uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) genes de referencia. Las mediciones de expresión normalizadas de referencia pueden variar de 0 a 15, donde un aumento de una unidad generalmente refleja un aumento de 2 veces en la cantidad de ARN.

La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, donde se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, y con la PCR comparativa cuantitativa que usa un gen de normalización contenido en la muestra, o un gen de expresión constitutiva para la RT-PCR. Para más detalles, Véase, por ejemplo, Held y otros, Genome Research 6:986-994 (1996).

Diseño de Cebadores y Sondas de PCR

Los cebadores y sondas de PCR pueden diseñarse en base a secuencias de exón, intrón o intergénicas presentes en el transcrito de ARN de interés. El diseño del cebador/sonda puede realizarse mediante el uso de un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático DNA BLAT desarrollado por Kent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002), o por el programa informático BLAST, que incluye sus variaciones.

Cuando sea necesario o conveniente, las secuencias repetitivas de la secuencia diana pueden enmascararse para mitigar las señales no específicas. Las herramientas ilustrativas para lograr esto incluyen el programa Repeat Masker disponible en línea a través del Colegio de Medicina Baylor, que analiza las secuencias de ADN contra una biblioteca de elementos repetitivos y devuelve una secuencia de consulta en la que los elementos repetitivos se enmascaran. Después, las secuencias enmascaradas pueden usarse para diseñar secuencias de cebadores y sondas mediante el uso de cualquier paquete de diseño de cebadores/sondas disponible comercialmente o de cualquier otra manera públicamente, tal como Primer Express (Applied Biosystems); ensayo por diseño MGB (Applied Biosystems); Primer3 en la WWW para usuarios generales y para biólogos programadores Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000). In: Rrawetz S, Misener S (eds) Bio informatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, págs. 365-386).

Otros factores que pueden influir en el diseño de cebadores de PCR incluyen la longitud del cebador, la temperatura de fusión (Tm), y el contenido de G/C, la especificidad, las secuencias de cebadores complementarias, y la secuencia del extremo 3'. En general, los cebadores de PCR óptimos generalmente tienen de 17-30 bases de longitud, y contienen aproximadamente de 20-80 %, tal como, por ejemplo, aproximadamente de 50-60 % de bases G+C, y exhiben Tm entre 50 y 80 °C, por ejemplo, aproximadamente de 50 a 70 °C.

Para pautas adicionales para el diseño de sonda y cebador de PCR, véase, por ejemplo, Dieffenbach, CW. y otros, “General Concepts for PCR Primer Design” en: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Nueva York, 1995, págs. 133-155; Innis y Gelfand, “Optimization of PCRs” en: Pc R Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, págs. 5-11; y Plasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods MoI. Biol. 70:520-527 (1997).

Las Tablas A y B proporcionan información adicional sobre las secuencias del cebador, la sonda, y el amplicón asociadas con los Ejemplos descritos en la presente descripción.

Sistema Mass ARRAY®

En los métodos basados en MassARRAY, tales como el método ilustrativo desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA) después del aislamiento de ARN y la transcripción inversa, el ADNc que se obtiene, se enriquece con una molécula de a Dn sintético (competidor), que coincide con la región de ADNc diana en todas las posiciones, excepto en una sola base, y sirve como un estándar interno. La mezcla de ADNc/competidor se amplifica mediante PCR y se somete a un tratamiento con la enzima fosfatasa alcalina (SAP) de camarón posterior a la PCR, que resulta en la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Después de la inactivación de la fosfatasa alcalina, los productos de PCR del competidor y el ADNc se someten a extensión del cebador, lo que genera señales de masa distintas para los productos de PCR derivados del competidor y del ADNc. Después de la purificación, estos productos se dispensan en una matriz de chip, que está precargada con los componentes necesarios para el análisis con análisis de espectrometría de ionización desorción láser asistida por matriz con detección de masas por tiempo de vuelo (MALDI-t Of MS). Después, el ADNc presente en la reacción se cuantifica analizando las relaciones de las áreas de los picos en el espectro de masas generado. Para más detalles véase, por ejemplo, Ding y Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003).

Otros métodos basados en PCR

Otras técnicas basadas en PCR que pueden encontrar uso en los métodos descritos en la presente descripción incluyen, por ejemplo, la tecnología BeadArray® (Illumina, San Diego, CA; Oliphant y otros, Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), junio de 2002; Ferguson y otros, Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); BeadsArray for Detection of Gene Expression® (BADGE), mediante el uso del sistema LuminexlOO LabMAP® disponible comercialmente y múltiples microesferas codificadas por colores (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido para expresión génica (Yang y otros, Genome Res. 11:1888-1898 (2001)); y análisis de perfil de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura y otros, Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003).

Micromatrices

En este método, las secuencias de polinucleótidos de interés (que incluye los ADNc y los oligonucleótidos) se disponen en un sustrato. Después, las secuencias dispuestas se ponen en contacto en condiciones adecuadas para la hibridación específica con ADNc marcado detectablemente generado a partir del ARN de una muestra. La fuente de ARN, típicamente, es el ARN total aislado de una muestra tumoral, y opcionalmente del tejido normal del mismo paciente que un control interno o de líneas celulares. El ARN puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina).

Por ejemplo, los insertos amplificados por PCR de clones de ADNc de un gen a analizar se aplican a un sustrato en una matriz densa. Usualmente se aplican al sustrato al menos 10 000 secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, los genes de micromatrices, inmovilizados en el microchip a 10 000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Las sondas de ADNc marcadas con fluorescencia pueden generarse mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa del ARN que se extrae de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto del ADN en la matriz. Después de lavar en condiciones rigurosas para eliminar sondas unidas de forma no específica, el chip se escanea mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento en la matriz permite evaluar la abundancia del ARNm correspondiente.

Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN se hibridan por pares con la matriz. Por lo tanto, la abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Se ha demostrado que dichos métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcritos raros, que se expresan en algunas copias por célula, y para detectar de manera reproducible al menos aproximadamente las diferencias de dos veces en los niveles de expresión (Schena y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149 (1996)). El análisis de micromatrices puede realizarse en equipos disponibles comercialmente, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como mediante el uso de la tecnología Affymetrix GenChip® o la tecnología de micromatrices de Incyte.

Aislamiento de ARN a partir de fluidos corporales

Se han descrito los métodos de aislamiento de ARN para análisis de expresión a partir de sangre, plasma y suero (véase, por ejemplo, Tsui NB y otros (2002) Clin. Chem. 48,1647-53 y las referencias citadas en ella) y a partir de orina (véase, por ejemplo, Boom R y otros (1990) J Clin Microbiol. 28, 495-503 y las referencias citadas en ella).

Métodos de aislamiento de ARN de tejido embebido en parafina

Las etapas de un protocolo representativo para determinar el perfil de expresión génica mediante el uso de tejidos fijados, embebidos en parafina como fuente de ARN, que incluye el aislamiento de ARNm, la purificación, la extensión del cebador y la amplificación se proporcionan en varios artículos publicados en revistas. (Véase, por ejemplo, T.E. Godfrey, y otros. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht y otros, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001), M. Cronin, y otros, Am J Pathol 164:35-42 (2004)).

Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica son adecuados, además, para detectar los niveles de expresión de genes y se aplican al método descrito en la presente descripción. Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que se unen específicamente a un producto génico de un gen de interés pueden usarse en dichos métodos. Los anticuerpos pueden detectarse mediante el marcado directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de hapteno tales como biotina, o una enzima tal como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina. Alternativamente, el anticuerpo primario no marcado puede usarse junto con un anticuerpo específico secundario marcado para el anticuerpo primario. Los protocolos y kits de inmunohistoquímica se conocen bien en la técnica y están disponibles comercialmente.

Proteómica

El término "proteoma" se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo, o cultivo celular) en un determinado momento. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (referida, además, como "proteómica de la expresión"). La proteómica, típicamente, incluye las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra mediante electroforesis en gel 2-D (PAGE 2-D); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ejemplo, por espectrometría de masas o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos mediante el uso de la bioinformática.

Descripción general del aislamiento, purificación y amplificación de ARNm

Las etapas de un protocolo representativo para determinar el perfil de la expresión génica mediante el uso de tejidos fijados embebidos en parafina como fuente de ARN, que incluye el aislamiento de ARNm, la purificación, la extensión y la amplificación del cebador se proporcionan en varios artículos publicados en revistas. (Véase, por ejemplo, T.E. Godfrey, y otros, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht y otros, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001), M. Cronin, y otros, Am J Pathol 164:35-42 (2004)). Brevemente, un proceso representativo comienza con el corte de una sección de muestra de tejido (por ejemplo, secciones de aproximadamente 10 pm de grosor de una muestra de tejido tumoral embebido en parafina). Después, se extrae el ARN y se eliminan las proteínas y el ADN. Después del análisis de la concentración de ARN, la reparación del ARN se realiza si es conveniente. La muestra puede someterse a análisis, por ejemplo, por transcripción inversa mediante el uso de promotores específicos de genes seguidos de RT-PCR. Análisis estadístico de niveles de expresión génica en la identificación de genes marcadores para uso en métodos pronósticos

Un experto en la técnica reconocerá que existen muchos métodos estadísticos que pueden usarse para determinar si existe una relación significativa entre un resultado de interés (por ejemplo, probabilidad de supervivencia, probabilidad de respuesta a la quimioterapia) y los niveles de expresión de un gen marcador como se describe aquí. Esta relación puede presentarse como una puntuación de recurrencia continua (RS), o los pacientes pueden estratificarse en grupos de riesgo (por ejemplo, bajo, intermedio, alto). Por ejemplo, un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox puede proporcionar un ajuste adecuado a un criterio de valoración clínico particular (por ejemplo, RFI, DFS, OS). Un supuesto del modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox es el supuesto de riesgos proporcionales, es decir, el supuesto de que los parámetros de efecto multiplican el riesgo subyacente. Pueden realizarse evaluaciones de la adecuación del modelo, que incluye, pero no se limita a, el examen de la suma acumulada de residuos martingala. Un experto en la técnica reconocería que existen numerosos métodos estadísticos que pueden usarse (por ejemplo, Royston y Parmer (2002), spline de suavizado, etc.) para ajustar un modelo paramétrico flexible mediante el uso de la escala de riesgo y la distribución de Weibull con spline natural suavizado de la función logarítmica de riesgos acumulados, con efectos para el tratamiento (quimioterapia u observación) y la RS dependiente del tiempo. (Véase P. Royston, M. Parmer, Statistics in Medicine 21(15:2175-2197 (2002)). La relación entre el riesgo de recurrencia y (1) los grupos de riesgo de recurrencia; y (2) las covariables clínicas/patológicas (por ejemplo, número de ganglios examinados, estadio T patológico, grado del tumor, invasión linfática o vascular, etc.) puede evaluarse además para determinar su significación.

En una modalidad ilustrativa, se realizaron cálculos de potencia para el modelo de riesgos proporcionales de Cox con una sola covariable no binaria mediante el uso del método propuesto por F. Hsieh y P. Lavori, Control Clin Trials 21:552-560 (2000) como se implementó en PASS 2008.

Descripción general de modalidades ilustrativas

Esta descripción proporciona un método para obtener una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón analizando los niveles de expresión de ciertos genes pronósticos a partir de una muestra de tumor obtenida del paciente. Dichos métodos involucran el uso de subconjuntos de genes que se crean en base a funciones similares de productos génicos. Por ejemplo, los métodos pronósticos descritos en la presente descripción involucran analizar los niveles de expresión de subconjuntos de genes que incluyen al menos un gen de cada grupo de normalización vascular, un grupo de respuesta inmunitaria, y un grupo de crecimiento/división celular, e IL-6, y calcular una puntuación de recurrencia (RS) para el paciente ponderando los niveles de expresión de cada uno de los subconjuntos de genes por sus respectivas contribuciones a la recurrencia del cáncer. La ponderación puede ser diferente para cada subconjunto de genes y puede ser positiva o negativa. Por ejemplo, la puntuación del grupo de genes de normalización vascular puede ponderarse multiplicando un factor de -0,45, la puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria puede ponderarse multiplicando un factor de -0,31, la puntuación del grupo de genes de crecimiento/división celular puede ponderarse por un factor de 0,27, y el valor de IL-6 puede multiplicarse por un factor de 0,04.

Normalización de los niveles de expresión

Los datos de expresión usados en los métodos descritos en la presente descripción pueden normalizarse. La normalización se refiere a un proceso para corregir (normalizar), por ejemplo, las diferencias en la cantidad de ARN analizado y la variabilidad en la calidad del ARN usado, para eliminar fuentes no deseadas de variación sistemática en las mediciones de C^t, y similares. Con respecto a los experimentos de RT-PCR que involucran muestras archivadas de tejidos fijados embebidos en parafina, se conoce que las fuentes de variación sistemática incluyen el grado de degradación del ARN en relación con la edad de la muestra del paciente y el tipo de fijador usado para almacenar la muestra. Otras fuentes de variación sistemática pueden ser atribuibles a las condiciones de procesamiento del laboratorio.

Los ensayos pueden proporcionar la normalización mediante la incorporación de la expresión de ciertos genes de normalización, cuyos genes son relativamente invariables en las condiciones relevantes. Los genes de normalización ilustrativos incluyen genes constitutivos. La normalización puede basarse en la señal media o mediana (CT) de todos los genes analizados o un gran subconjunto de estos (enfoque de normalización global). En general, los genes de normalización se refieren además como genes de referencia, deben ser genes que se conoce que son invariables en el cáncer de riñón en comparación con el tejido renal no canceroso, y que no se afectan significativamente por diversas condiciones de la muestra y del proceso, por lo que proporcionan la normalización de los efectos extraños.

A menos que se indique de cualquier otra manera, los niveles de expresión normalizados para cada ARNm/tumor analizado/paciente se expresarán como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. Un conjunto de referencia de un número suficientemente alto (por ejemplo, 40) de tumores produce una distribución de niveles normalizados de cada especie de ARNm. El nivel medido en una muestra de tumor particular a analizar cae en algún percentil dentro de este intervalo, que puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica.

En modalidades ilustrativas, uno o más de los siguientes genes se usan como referencias mediante los cuales se normalizaron los datos de expresión: AAMP, ARF1, ATP5E, GPX1 y RPLP1. Las mediciones de C^t promedio ponderado calibradas para cada uno de los genes pronósticos pueden normalizarse con respecto a la media de cinco o más genes de referencia.

Los expertos en la técnica reconocerán que la normalización puede lograrse de numerosas maneras, y las técnicas descritas anteriormente pretenden ser solo ilustrativas, no exhaustivas.

Estandarización de los niveles de expresión

Los datos de expresión usados en los métodos descritos en la presente descripción pueden estandarizarse. La estandarización se refiere a un proceso para poner efectivamente todos los genes en una escala comparable. Esto se realiza porque algunos genes exhibirán más variación (un rango de expresión más amplio) que otros. La estandarización se realiza dividiendo cada valor de expresión por su desviación estándar en todas las muestras para ese gen. Los índices de riesgos se interpretan como el cambio proporcional en el riesgo para el criterio de valoración clínico (recurrencia clínica, recurrencia biológica, muerte por cáncer de riñón, o muerte por cualquier causa) por un aumento de 1 desviación estándar en la expresión.

Puenteo de mediciones de expresión y calibración

Un conjunto de oligonucleótidos representa un cebador directo, un cebador inverso, y una sonda que se usan para construir una reserva de cebadores y sondas (P3) y una reserva de cebadores específicos de genes (GSP). Las diferencias sistemáticas en las mediciones del umbral del ciclo de RT-PCR (C^t ) pueden ser el resultado de diferentes conjuntos de oligonucleótidos debido a variaciones inherentes en las síntesis de oligonucleótidos. Por ejemplo, pueden existir diferencias en los conjuntos de oligonucleótidos entre el desarrollo, la producción (usada para la validación), y la producción futura de conjuntos de nucleótidos. Por tanto, puede ser deseable el uso de procedimientos de calibración estadística para ajustar las diferencias sistemáticas en conjuntos de oligonucleótidos que dan como resultado la traducción de los coeficientes génicos usados en el cálculo de RS. Por ejemplo, para cada uno de los genes analizados para su uso en un algoritmo, puede usarse un diagrama de dispersión de las mediciones de C^t para la producción de conjuntos de oligonucleótidos frente a las mediciones de C^t de una muestra correspondiente usada en diferentes conjuntos de oligonucleótidos para crear un modelo de regresión lineal que trata el efecto de las diferencias de lote a lote como un efecto aleatorio. El examen de dicho gráfico revelará que la varianza de las mediciones de C^t aumenta exponencialmente en función de la media de C^t . El modelo de regresión lineal de efectos aleatorios puede evaluarse con varianza log-lineal, para obtener una ecuación de calibración lineal. Un error cuadrático medio calculado (MSE) para las puntuaciones puede compararse con el MSE si no se usa ningún esquema de calibración.

Como otro ejemplo, una medición de variable latente de C^t (por ejemplo, componente del primer principio) puede derivarse de varios conjuntos de oligonucleótidos. La variable latente es una medida razonable de la medición de C^t subyacente "verdadera". De manera similar al método descrito anteriormente, puede ajustarse un modelo de regresión lineal a los pares de muestras que tratan los efectos de las diferencias como un efecto aleatorio, y el valor de C^t promedio ponderado se ajusta a un C^t calibrado.

Centrado y compresión/escalado de datos

Pueden existir diferencias sistemáticas en la distribución de la RS del paciente debido a diferencias analíticas o de muestra entre el desarrollo temprano, la validación clínica y las muestras comerciales. Puede usarse un parámetro de sintonización de centrado constante en el algoritmo para tener en cuenta dicha diferencia.

La compresión de datos es un procedimiento usado para reducir la variabilidad en los valores C^t normalizados observados más allá del límite de cuantificación (LOQ) del ensayo. Específicamente, para cada uno de los genes del ensayo de cáncer de riñón, la varianza en las mediciones de C^t aumenta exponencialmente a medida que el C^t normalizado para un gen se extiende más allá del LOQ del ensayo. Para reducir dicha variación, los valores de C^t normalizados para cada gen pueden comprimirse hacia el LOQ del ensayo. Además, los valores de C^t normalizados pueden reescalarse. Por ejemplo, los valores de C^t normalizados de los genes de pronóstico y de referencia pueden reescalarse a un intervalo de 0 a 15, donde un aumento de una unidad generalmente refleja un aumento de 2 veces en la cantidad de ARN.

Valores umbrales

La presente invención describe un método para determinar un valor umbral para la expresión de un gen relacionado con el cáncer, que comprende medir un nivel de expresión de un gen, o su producto de expresión, en una sección tumoral obtenida de un paciente con cáncer, normalizar el nivel de expresión para obtener un nivel de expresión normalizado, calcular un valor umbral para el nivel de expresión normalizado, y determinar una puntuación basada en la probabilidad de recurrencia o respuesta clínicamente beneficiosa al tratamiento, en donde si el nivel de expresión normalizado es menor que el valor umbral, se usa el valor umbral para determinar la puntuación, y en donde si el nivel de expresión normalizado es mayor o igual al valor umbral, el nivel de expresión normalizado se usa para determinar la puntuación.

Por ejemplo, puede determinarse un valor umbral para cada gen relacionado con el cáncer mediante el examen de la forma funcional de relación entre la expresión génica y el resultado. Se presentan ejemplos de dichos análisis para la regresión de Cox PH en el intervalo libre de recurrencia donde la expresión génica se modela mediante el uso de splines naturales y para la regresión logística en el estado de recurrencia donde la expresión génica se modela mediante el uso de un suavizador más bajo.

En algunas modalidades, si la relación entre el término y el riesgo de recurrencia no es lineal o la expresión del gen es relativamente baja, puede usarse un umbral. En una modalidad, cuando la expresión de IL6 es <Ct 4 el valor se fija en Ct 4.

Kits de la invención

Los materiales para usar en los métodos de la presente invención son adecuados para la preparación de kits producidos de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Por lo tanto, la presente descripción proporciona kits que comprenden agentes, que pueden incluir sondas y/o cebadores específicos de genes o selectivos de genes, para cuantificar la expresión de los genes descritos para predecir el resultado pronóstico o la respuesta al tratamiento. Dichos kits pueden contener opcionalmente reactivos para la extracción de ARN de muestras tumorales, en particular muestras de tejido fijadas embebidas en parafina y/o reactivos para la amplificación de ARN. Además, los kits pueden comprender opcionalmente el (los) reactivo(s) con una descripción o etiqueta de identificación o instrucciones relacionadas con su uso en los métodos de la presente invención. Los kits pueden comprender recipientes (que incluyen placas de microlitros adecuadas para usar en una implementación automatizada del método), cada uno con uno o más de los diversos reactivos (típicamente, en forma concentrada) utilizados en los métodos, que incluyen, por ejemplo, micromatrices prefabricadas, tampones, los nucleótidos trifosfatos apropiados (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), transcriptasa inversa, ADN polimerasa, ARN polimerasa, y una o más sondas y cebadores de la presente invención (por ejemplo, cebadores de longitud apropiada de poli(T) o aleatorios unidos a un promotor reactivo con la ARN polimerasa). Los algoritmos matemáticos usados para estimar o cuantificar la información pronóstica o predictiva son, además, componentes potenciales de los kits.

Informes

Los métodos de esta invención, cuando se practican con propósitos de diagnóstico comercial, generalmente producen un informe o resumen de la información que se obtiene de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un informe puede incluir información relativa a los niveles de expresión de genes pronósticos, una puntuación de recurrencia, una predicción del resultado clínico previsto para un paciente particular, o umbrales. Los métodos e informes de esta invención pueden incluir, además, almacenar el informe en una base de datos. El método puede crear un registro en una base de datos para el sujeto y llenar el registro con datos. El informe puede ser un informe en papel, un informe auditivo, o un registro electrónico. El informe puede mostrarse y/o almacenarse en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo de mano, ordenador de escritorio, dispositivo inteligente, sitio web, etcétera). Se contempla que el informe se proporcione a un médico y/o al paciente. La recepción del informe puede incluir, además, establecer una conexión de red a un ordenador servidor que incluya los datos e informes y solicitar los datos e informes del ordenador servidor.

Programa informático

Los valores de los ensayos descritos anteriormente, tales como los datos de expresión, puntuación de recurrencia, puntuación de tratamiento y/o puntuación de beneficio, pueden calcularse y almacenarse manualmente. Alternativamente, las etapas descritas anteriormente pueden realizarse total o parcialmente mediante un producto de programa informático. La presente invención proporciona, por lo tanto, un producto de programa informático que incluye un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene un programa informático almacenado en él. El programa puede, cuando lo lee un ordenador, ejecutar cálculos relevantes en base a los valores obtenidos del análisis de una o más muestras biológicas de un individuo (por ejemplo, niveles de expresión génica, normalización, umbralización, y conversión de los valores de los ensayos a una puntuación y/o representación gráfica de la probabilidad de recurrencia/respuesta a la quimioterapia, coexpresión o análisis de camarillas de genes y similares). El producto de programa informático tiene almacenado en él un programa informático para realizar el cálculo.

La presente descripción proporciona sistemas para ejecutar el programa descrito anteriormente, cuyo sistema generalmente incluye: a) un entorno informático central; b) un dispositivo de entrada, conectado operativamente al entorno informático, para recibir datos del paciente, en donde los datos del paciente pueden incluir, por ejemplo, el nivel de expresión u otro valor obtenido de un ensayo mediante el uso de una muestra biológica del paciente, o datos de micromatrices, como se describió en detalle anteriormente; c) un dispositivo de salida, conectado al entorno informático, para proporcionar información a un usuario (por ejemplo, personal médico); y d) un algoritmo ejecutado por el entorno informático central (por ejemplo, un procesador), donde el algoritmo se ejecuta en base a los datos recibidos por el dispositivo de entrada, y en donde el algoritmo calcula una RS, la clasificación de grupo de beneficio o riesgo, el análisis de coexpresión de genes, la umbralización u otras funciones descritas en la presente descripción. Los métodos proporcionados por la presente invención pueden, además, automatizarse total o parcialmente.

Todos los aspectos de la presente invención además pueden ponerse en práctica de manera que un número limitado de genes adicionales que se coexpresan con los genes descritos, por ejemplo, como lo demuestran los coeficientes de correlación de Pearson y/o Spearman estadísticamente significativos, se incluyen en una prueba pronóstica además de y/o en lugar de los genes descritos.

Una vez descrita la invención, la misma se entenderá más fácilmente a través de la referencia a los siguientes Ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden limitar la invención de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1: selección de genes para el desarrollo del algoritmo

Un estudio de identificación de genes para identificar genes asociados con la recurrencia clínica se describe en las solicitudes provisionales de Estados Unidos núms. 61/294,038, presentada el 11 de enero de 2010, y 61/346,230, presentada el 19 de mayo de 2010, y en la publicación de solicitudes de Estados Unidos núm. 2011/0171633, presentada el 7 de enero de 2011, y publicada el 14 de julio de 2011. En resumen, se identificaron pacientes con ccRCC en estadio I-III que se sometieron a nefrectomía en la Clínica Cleveland entre 1985 y 2003 con muestras archivadas de nefrectomía embebidas en parafina. Se extrajo ARN de secciones tumorales disecadas de 6 x 10 pm y se cuantificó la expresión de ARN para 732 genes (incluidos 5 genes de referencia) mediante el uso de RT-PCR. El criterio de valoración principal fue el intervalo libre de recurrencia (RFI), definido como el tiempo desde la nefrectomía hasta la primera recurrencia o el indicio de muerte por RCC. Fueron evaluables 931 pacientes con datos clínicos/patológicos completos y bloques de tejido. Las características de los pacientes fueron: hombres 63 %, edad media 61, estadio I (68 %), II (10 %) y III (22 %), seguimiento de 5,6 años medios, tasas de recurrencia a 5 años en estadio I, II, y III fueron 10 %, 29 %, y 45 % respectivamente. Las covariables clínico-patológicas asociadas significativamente con RFI incluyeron necrosis microscópica, grado de Fuhrman, estadio, tamaño del tumor y compromiso de los ganglios linfáticos (todos p <0,001).

En base a los resultados del estudio de identificación, 448 genes se asociaron significativamente (p <0,05, sin ajustar; modelos de Cox) con RFI. Para la mayoría de estos genes (366 (82 %)), la expresión mayor se asoció con un mejor resultado. Muchos de los genes se asociaron significativamente (p <0,05) con necrosis (503 genes), grado de Fuhrman (494), estadio (482), tamaño del tumor (492), y estado ganglionar (183). 300 genes se asociaron significativamente (p <0,05, sin ajustar) con al menos 4 de las 5 covariables patológicas y clínicas descritas anteriormente.

Se seleccionó un conjunto más pequeño de 72 genes para desarrollar modelos de múltiples genes de la siguiente manera: 29 genes asociados con RFI después del ajuste por estadio de la enfermedad, grado de Fuhrman, tamaño del tumor, necrosis y estado ganglionar que controla la tasa de descubrimiento falso (FDR) al 10 %; los 14 genes principales asociados con RFI en análisis univariados; 12 genes que eran miembros de la vía de vascularización del factor de crecimiento endotelial vascular/objetivo de la rapamicina de mamífero (VEGF/mTOR); y 17 genes de vías biológicas adicionales que se identificaron mediante análisis de componentes principales (PCA). Estos datos se usaron para seleccionar los 11 genes finales relacionados con el cáncer y los 5 genes de referencia y para desarrollar un algoritmo de múltiples genes para predecir la recurrencia de ccRCC en pacientes con cáncer renal en estadio I/II/III. Ejemplo 2: desarrollo de algoritmos

Los genes identificados en los estudios descritos en el Ejemplo 1 se consideraron para su inclusión en la puntuación de recurrencia. Se seleccionó un conjunto más pequeño de 72 genes de la siguiente manera:

• 29 genes asociados con RFI después del ajuste de covariables y el control de FDR 10 % mediante el uso del procedimiento de Storey (Storey JD (2002) A direct approach to false discovery rates. Journal of the Royal Statistical Society: Series B 64:479-498; Storey JD, Taylor JE, Siegmund DO (2004) Strong control, conservative point estimation and simultaneous conservative consistency of false discovery rates: a unified approach. Journal of the Royal Statistical Society, Series B 66:187-205.).

• 14 genes más significativos antes del ajuste de covariables

• 12 genes miembros de las vías VEGF/mTOR

• Se seleccionaron 17 genes mediante análisis de componentes principales para identificar genes de vías adicionales

Para determinar la asociación entre cada uno de los 72 genes y RFI, se usaron análisis univariados y multivariables. Las Tablas 1A (análisis univariado) y 1B (análisis multivariable) informan el índice de riesgos, el intervalo de confianza del 95 %, el Chi-cuadrado, el valor de p, y el valor de q para cada uno de los 72 genes.

Tabla 1A: Análisis univariado para 72 genes: asociación con RFI Asociación con RFI

(continuación)

(continuación)

Tabla 1B: Análisis multivariable para 72 genes: asociación con RFI Asociación con RFI ajustada para 5 covariables clínicas/patológicas

(continuación)

(continuación)

El conjunto de 72 genes se redujo adicionalmente a 14 genes mediante la exploración de la contribución de los genes a los modelos multigénicos, la coherencia del rendimiento a través de los puntos finales y el rendimiento analítico. La selección del conjunto final de 11 genes se basó en análisis multivariables que consideraron todas las combinaciones posibles de los 14 genes y clasificaron los modelos por índice de riesgos estandarizado para la puntuación de múltiples genes (Crager, Journal of Applied Statistics febrero de 2012; 36(2),399-417) corregido por regresión a la media (RM). Este método corrige la selección entre combinaciones de genes y considera combinaciones seleccionadas de los 732 genes investigados en el estudio de identificación de genes. El índice de riesgos máximo identificado con corrección de RM es imparcial (Crager, Stat Med. 15 de enero de 2010;29(1):33-45.)) y proporciona una estimación realista del rendimiento del modelo multigenético dado en un conjunto de datos independiente.

Las consideraciones adicionales para la selección de genes incluyeron el rendimiento del ensayo de genes individuales (heterogeneidad) cuando se evaluó en tejido tumoral fijado embebido en parafina, el nivel y la variabilidad de la expresión génica, y la forma funcional de la relación con el resultado clínico.

El panel de expresión génica incluyó genes relacionados con el cáncer y genes de referencia, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2: Panel de expresión génica

Descripción general del algoritmo para obtener una puntuación de recurrencia

Después de usar RT-PCR cuantitativo para determinar los niveles de expresión de ARNm de los genes elegidos, los genes se agruparon en subconjuntos. Los genes que se conoce que están asociados con funciones vasculares y/o angiogénesis se agruparon en un grupo de genes de "normalización vascular". Los genes que se conoce están asociados con la función inmunitaria se agruparon en un grupo de genes de "respuesta inmunitaria". Los genes asociados con la(s) vía(s) clave de crecimiento celular y división celular se agruparon en un grupo de genes de "crecimiento/división celular".

La expresión génica de algunos genes puede establecerse como umbral si la relación entre el término y el riesgo de recurrencia no es lineal o la expresión del gen es relativamente baja. Por ejemplo, cuando la expresión de IL6 se encuentra en < Ct 4 el valor se fija en Ct 4.

En la siguiente etapa, el nivel tumoral medido de cada ARNm en un subconjunto se multiplicó por un coeficiente que refleja su contribución relativa dentro del conjunto al riesgo de recurrencia del cáncer. Este producto se añadió a los otros productos entre los niveles de ARNm en el subconjunto y sus coeficientes, para producir un término, por ejemplo, un término de normalización vascular, un término de crecimiento/división celular, y un término de respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el término de respuesta inmunitaria es (CCL5 0,5 CEACAM1 CX3CL1)/3 (véase el Ejemplo a continuación).

Después, la contribución de cada término a la puntuación general de recurrencia se ponderó mediante el uso de un coeficiente. Por ejemplo, el término de respuesta inmunitaria se multiplicó por -0,31.

La suma de los términos obtenidos proporcionó la puntuación de recurrencia (RS).

Se encontró una relación entre la puntuación de recurrencia (RS) y el riesgo de recurrencia tras medir la expresión de los genes de prueba y de referencia en biopsias de muestras tumorales de una población de pacientes con carcinoma de células renales de células claras y aplicar el algoritmo.

La escala RS generada por el algoritmo de la presente invención puede ajustarse de varias formas. Por tanto, mientras que la escala RS descrita específicamente anteriormente va efectivamente de -3,2 a -0,2, el intervalo podría seleccionarse de modo que la escala vaya de 0 a 10, de 0 a 50, o de 0 a 100, por ejemplo. Por ejemplo, en un enfoque de escala particular, la puntuación de recurrencia escalada (RS) se calcula en una escala de 0 a 100. Por conveniencia, se añaden 10 unidades de Ct a cada valor de Ct medido, y la RS no sellada se calcula como se describió anteriormente. Los valores de puntuación de recurrencia escalados se calculan mediante el uso de las ecuaciones que se muestran a continuación.

La puntuación de recurrencia (RS) en una escala de 0 a 100 se derivó de las mediciones de expresión normalizadas de referencia de la siguiente manera:

RSu =

- 0,45 x Puntuación del grupo de genes de normalización vascular

- 0,31 x Puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria

0,27 x Puntuación del grupo de genes de división/crecimiento celular

0,04 x IL6

donde

Puntuación del grupo de genes de normalización vascular = (APOLD1 0,5 EDNRB 0,5 NOS3 PPA2B)/4 Puntuación del grupo de genes de crecimiento/división celular = (EIF4EBP1 LMNB1 1,3 TUBB2A)/3 Puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria = (CCL50,5 CEACAM1 CX3CL1)/3

El RSu (puntuación de recurrencia sin sellar) se reescala para que esté entre 0 y 100:

RS = (RSu 3,7) x 26,4,

Si (RSu 3,7) x 26,4 <0, entonces RS = 0.

Si (RSu 3,7) x 26,4>100, entonces RS = 100.

Ejemplo 3: rendimiento del algoritmo

El rendimiento de los genes finales incluidos en el algoritmo con y sin ajuste para la corrección de la regresión a la media con respecto al criterio de valoración de la recurrencia se resume en la Tabla 3.

Cuando se usan análisis que controlan la tasa de descubrimientos falsos, como el procedimiento de Storey, el aumento de la proporción de genes con poca o ninguna asociación disminuye el poder de identificación incluso para genes fuertemente asociados con el resultado. Por lo tanto, puede esperarse que analizar todos los genes juntos como un conjunto muy grande produzca un análisis con menor poder para identificar genes asociados verdaderamente. Para mitigar este problema, se realizó un análisis de “clase separada” (Efron B. Simultaneous inference: When should hypothesis testing problems be combined. Ann. Appl. Statist. 2008;2: 197-223.). En el análisis de clase separada, se calculan las tasas de descubrimiento falso dentro de cada clase de genes, mediante el uso de información de todos los genes para mejorar la precisión del cálculo. Se seleccionaron prospectivamente dos clases de genes sobre la base de información previa y/o creencias acerca de su asociación con la recurrencia del cáncer, y los genes restantes se ubican en la tercera clase.

En el modelo de Cox estratificado por estadio, la puntuación de recurrencia final arrojó una HR estandarizada absoluta = 2,16 (CI del 95 % 1,89; 2,48) y una regresión a la HR estandarizada absoluta corregida media = 1,91 (CI del 95 % 1,38; 2,30) para la asociación con la recurrencia.

El rendimiento de la puntuación de recurrencia puede demostrarse además mediante las curvas de predictibilidad (Hung Y, Pepe MS, Feng Z. (2007). Evaluating the predictiveness of a continuous marker. Biometrics 63:1181-1188.) que se muestran en las Figuras 1A y 1B. Estas curvas son gráficos del riesgo estimado de recurrencia (eje vertical) frente al cuantil de población (intervalo) del riesgo. La curva en su conjunto muestra la distribución poblacional del riesgo. Los puntajes pronósticos más efectivos separan a los pacientes de riesgo menor de los pacientes de riesgo mayor, lo que se refleja en la curva que separa la línea de riesgo promedio. Después, pueden aplicarse puntos de corte de riesgo para describir cuántos pacientes caen en varios grupos de riesgo. Por ejemplo, los puntos de corte pueden usarse para describir cuántos pacientes con RCC en estadio 1 tienen un riesgo > 16 %.

Ejemplo 4: estudio de heterogeneidad

Se realizó un estudio interno que examina la variabilidad debida a la heterogeneidad del tejido en una muestra de bloques de tejido fijado embebido en parafina (FPET) de cáncer renal. Se evaluaron ocho (8) pacientes con dos (2) bloques para cada paciente y tres (3) secciones dentro de cada bloque mediante el uso de los métodos y algoritmos proporcionados en los Ejemplos anteriores. La heterogeneidad se midió tras evaluar la variabilidad entre bloques y la variabilidad dentro del bloque. La variabilidad entre bloques mide la variabilidad biológica entre bloques de FPET dentro del mismo paciente. Esto proporciona una estimación de la variabilidad a nivel de población. La variabilidad dentro del bloque captura tanto la heterogeneidad del tejido dentro de un bloque; así como también la variabilidad relacionada con el ensayo técnico. Se calcularon las puntuaciones génicas individuales normalizadas, así como también la puntuación de recurrencia, y se generaron estimaciones de variabilidad dentro del bloque, entre bloques y entre pacientes. Los resultados del análisis se enumeran en las tablas 4 y 5 a continuación. La alta relación de la variabilidad entre pacientes a la variabilidad entre y dentro del bloque generalmente es favorable. Esto indica que la heterogeneidad del tejido y la variabilidad relacionada con el ensayo técnico es baja en comparación con la variabilidad clínicamente informativa de paciente a paciente en las mediciones de genes individuales y la puntuación de recurrencia.

Tabla 4: Estimados del componente de varianza de la puntuación de recurrencia

Tabla 5: Estimados individuales de componentes de varianza génica normalizada

(continuación)

Ejemplo 5: combinaciones adicionales de múltiples genes

Además, se evaluaron varios modelos alternativos de múltiples genes, mediante el uso del conjunto de datos del estudio de identificación de genes o el conjunto de datos del estudio de validación. Las combinaciones de genes representativas adicionales evaluadas en el conjunto de datos del estudio de identificación de genes se muestran en la Tabla 6. Las combinaciones de genes representativas adicionales evaluadas en el conjunto de datos del estudio de validación se muestran en la Tabla 7. Los modelos 1-4 que se muestran en la Tabla 6 no se evaluaron en el conjunto de datos del estudio de validación, por lo que se omitieron de la Tabla 7. Ambas Tablas enumeran los coeficientes calculados que reflejan el peso relativo de cada gen en un algoritmo para predecir el riesgo de recurrencia del cáncer. El nivel tumoral medido de cada ARNm que codifica los genes específicos usados en los diversos modelos evaluados (por ejemplo, el modelo 11 incluía APOLD1, NOS3, PPAP2B y CEACAM1) se multiplicó por el coeficiente enumerado para producir una puntuación alternativa. El desempeño de cada puntuación alternativa, medido por los índices de riesgos estándar absolutos y los intervalos de confianza del 95 % correspondientes, se muestra además en las Tablas. Cuando se enumeran dos genes en la fila de encabezado (por ejemplo, APOLD1-EDNRB, IL6-IL8), esa columna enumera el coeficiente del nivel tumoral medido promedio del ARNm que codifica esos dos genes.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un método para clasificar a un paciente con cáncer de riñón que tiene un riesgo mayor de recurrencia o un riesgo menor de recurrencia que comprende:

   medir un nivel de transcritos de ARN a partir de cada uno de los genes de cada uno de los siguientes subconjuntos de genes en una muestra de tumor obtenida del paciente:

   un grupo de genes de normalización vascular, un grupo de genes de respuesta inmunitaria, un grupo de genes de crecimiento/división celular e IL-6; en donde los genes del grupo de genes de normalización vascular son: APOLD1, EDNRB, NOS3 y PPAP2B, y los genes del grupo de genes de respuesta inmunitaria son: CCL5, CEACAM1 y CX3CL1, y los genes del grupo de genes de crecimiento/división celular son: EIF4EBP1, LMNB1 y TUBB2A;

   calcular una puntuación de recurrencia mediante el uso del siguiente algoritmo:

   RS =

   -0,45 x puntuación del grupo de genes de normalización vascular

   -0,31 x puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria

   0,27 x puntuación del grupo de genes de crecimiento/división celular

   0,04 x IL6

   donde:

   puntuación del grupo de genes de normalización vascular = (0,5APOLD1 0,5EDNRB NOS3 PPAP2B)/4

   puntuación del grupo de genes de crecimiento/división celular = (EIF4EBP1 1,3LMNB1 TUBB2A)/3; y puntuación del grupo de genes de respuesta inmunitaria = (0,5CCL5 CEACAM1 CX3CL1)/3; y

   clasificar al paciente como de riesgo menor o riesgo mayor en base a la puntuación de recurrencia en comparación con el riesgo poblacional promedio de pacientes con cáncer de riñón.
2. 2. El método de la reivindicación 1, que comprende además escalar la puntuación RS mediante el uso del siguiente algoritmo:

   RS (escalado) = (RS (sin escalar) 3,7) x 26,4

   donde:

   Si RS = <0, entonces RS = 0; y

   Si RS => 100, entonces RS = 100.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde el nivel de los transcritos de ARN se determina mediante RT-PCR cuantitativa.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde medir un nivel de transcritos de ARN comprende:

   extraer ARN de una muestra de tumor obtenida del paciente;

   realizar la transcripción inversa de un transcrito de ARN de los genes pronósticos de uno o más subconjuntos de genes para producir un ADNc de los genes pronósticos;

   amplificar el ADNc de los genes pronósticos;

   producir un amplicón del transcrito de ARN de los genes pronósticos;

   analizar un nivel del amplicón de los genes pronósticos;

   normalizar el nivel frente al nivel de un amplicón de al menos un transcrito de ARN de referencia en la muestra de tumor para proporcionar un nivel de amplicón normalizado de los genes pronósticos; y asignar el nivel de amplicón normalizado al uno o más subconjuntos de genes; y en donde el método comprende, además

   generar un informe que comprende el RS.
5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cáncer de riñón es carcinoma de células renales (RCC), en donde opcionalmente el RCC es carcinoma de células renales de células claras (ccRCC).
6. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra de tumor se obtiene de una biopsia.
7. 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra de tumor está fresca, congelada o embebida en parafina y fijada.