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Marcadores de expresión génica para predecir la respuesta a la quimioterapia
ES2550614T3
Spain
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English - Inventor
Joffre B. Baker Steven Shak Luca Gianni - Current Assignee
- Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori
- Genomic Health Inc
Description
translated from
Marcadores de expresión génica para predecir la respuesta a la quimioterapia
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención proporciona conjuntos de genes cuya expresión es importante en el pronóstico del cáncer. En particular, la invención proporciona información de expresión génica útil para predecir si los pacientes con cáncer tienen probabilidad de presentar una respuesta de tratamiento beneficiosa a la quimioterapia.
Descripción de la técnica relacionada
Los oncólogos tienen varias opciones de tratamiento disponibles, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterapéuticos que están caracterizadas como el “estándar de atención” y varios fármacos que no llevan en la etiqueta una indicación para un cáncer particular, pero que han demostrado ser eficaces en ese cáncer. La mayor probabilidad de obtener un buen resultado del tratamiento requiere que los pacientes se asignen al tratamiento óptimo disponible para el cáncer en cuestión, y que esta asignación se haga tan rápido como sea posible después del diagnóstico. En particular, es importante determinar la probabilidad de la respuesta del paciente a la quimioterapia del “estándar de atención” porque ciertos fármacos quimioterapéuticos tales como las antraciclinas y los taxanos tienen una eficacia limitada y son tóxicos. De esta forma, la identificación de pacientes con más o menos probabilidad de respuesta podría aumentar el efecto beneficioso neto que ofrecen estos fármacos, y reducir la morbilidad neta y la toxicidad, mediante una selección más inteligente de los pacientes.
Actualmente, las pruebas de diagnóstico utilizadas en la práctica clínica son de un solo analito, y por lo tanto no capturan el valor potencial de las relaciones conocidas entre docenas de marcadores diferentes. Además, las pruebas de diagnóstico con frecuencia no son cuantitativas al estar basadas en inmunohistoquímica. Este método con frecuencia produce diferentes resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están estandarizados y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. A menudo no se han usado pruebas basadas en el ARN debido a los problemas de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y al hecho de que es difícil obtener muestras recientes de tejido de los pacientes para el análisis. El tejido incluido en bloques de parafina y fijado es más fácil de obtener y se han establecido métodos para detectar el ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos típicamente no permiten el estudio de grandes cantidades de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. De esta manera, tradicionalmente rara vez se ha usado el tejido fijado para otra cosa que no sea la detección inmunohistoquímica de proteínas.
En los últimos años, varios grupos han publicado estudios relacionados con la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante el análisis de la expresión génica en micromatrices (véase, por ejemplo, Golub et al., Science 286: 531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Supl. 1): S316-S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 15149-15154 (2001)). También se han presentado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basadas en patrones de expresión génica (Martin et al., Cancer Res. 60: 2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 11462-11467 (2001); Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 98: 10869-10874 (2001); Yan et al., Cancer Res. 61: 8375-8380 (2001)). Sin embargo, estos estudios principalmente se centran en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevas perspectivas a las relaciones de los genes expresados de forma diferencial, y no asocian los hallazgos a las estrategias de tratamiento para mejorar los resultados clínicos de la terapia para el cáncer.
Aunque la biología molecular moderna y la bioquímica han revelado cientos de genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de las células tumorales, su estado de diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha explotado para la toma rutinaria de decisiones clínicas sobre los tratamientos con fármacos. Una excepción importante es el uso de la expresión de la proteína del receptor de estrógenos (ER) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes para el tratamiento con fármacos antiestrogénicos, tales como el tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA).
A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento del cáncer sigue siendo dirigir los regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente distintos, y finalmente personalizar el tratamiento del tumor para maximizar el resultado. Por lo tanto, existe la necesidad de pruebas que proporcionen simultáneamente una información predictiva sobre las respuestas de los pacientes a la diversidad de opciones de tratamiento. Esto ocurre particularmente en el caso del cáncer de mama, cuya biología se entiende poco. Es evidente que la clasificación del cáncer de mama en algunos subgrupos, tales como el subgrupo positivo para ErbB2, y subgrupos caracterizados por una expresión génica baja o ausente del receptor de estrógenos (ER) y unos pocos factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature 406: 747-752 (2000)), no refleja la heterogeneidad celular y molecular
del cáncer de mama y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta de los pacientes.
El cáncer de mama es el tipo más común de cáncer entre las mujeres en los Estados Unidos y es la causa principal de muertes por cáncer entre las mujeres de 40 a 59 años de edad. Por lo tanto, existe una necesidad particularmente grande de una prueba de cáncer de mama validada clínicamente que sea predictiva de la respuesta de la paciente a la quimioterapia.
Ding et al. (2000) Proceedings of the American Association for Cancer Research 41, 404, proponen que la resistencia multifármaco en células cervicales humanas está asociada con una mayor expresión de las proteínas antiapoptóticas BAG-1 y BCL-XL y una actividad reducida de la caspasa 3.
Kitada et al. (1998) Blood 91, 3379-89 desvelan la expresión de proteínas que regulan la apoptosis en la leucemia linfocítica crónica y correlaciones con quimiorrespuestas in vitro e in vivo.
El documento WO 2004/111603 desvela marcadores de expresión génica para predecir la respuesta a la quimioterapia.
Muss et al. (1994) desvela la expresión de c-erbB-2 y la respuesta a una terapia adyuvante en mujeres con cáncer de mama incipiente positivo para ganglios (Muss et al. (1994) N. Eng. J. Med. 330, 1260-6).
Sjöström et al. (2002) desvela un estudio del valor predictivo de bc1-2, bax, bc1-xL, bag-1, fas, y fasL para la respuesta a la quimioterapia en el cáncer de mama avanzado (Sjöström et al. (2002) Clin. Cancer Res. 8, 811-6).
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar si un nivel de transcrito de ARN está asociado con una respuesta beneficiosa a un tratamiento de quimioterapia que comprende una antraciclina y un taxano como se especifica en la reivindicación 1.
El cáncer de mama puede ser, por ejemplo, un cáncer de mama invasivo o un cáncer de mama en estadio II o estadio III.
En una realización particular, la quimioterapia es una quimioterapia adyuvante.
En otra realización, la quimioterapia es una quimioterapia neoadyuvante.
La quimioterapia puede comprender, por ejemplo, la administración de docetaxel y/o paclitaxel y/o doxorrubicina.
La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra de tejido que comprende células cancerosas, donde el tejido puede estar fijado, incluido en parafina, estar fresco o estar congelado.
El nivel de expresión de dicho transcrito o transcritos de ARN de pronóstico puede determinarse, por ejemplo, por RT-PCR o cualquier otro método basado en PCR, inmunohistoquímica, técnicas de proteómica o cualquier otro método conocido en la técnica o su combinación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la relación entre la puntuación de recurrencia (RS) y la probabilidad de respuesta de los pacientes a la quimioterapia, basándose en los resultados de un ensayo clínico con la respuesta patológica completa como criterio de valoración. La Tabla 1 muestra una lista de genes cuya expresión se correlaciona, de forma positiva o negativa, con la respuesta del cáncer de mama a adriamicina y taxano como quimioterapia neoadyuvante. Los resultados proceden de un ensayo clínico con la respuesta patológica completa como criterio de valoración. El análisis estadístico utilizó modelos lineales generalizados univariantes con una función de enlace probit. La Tabla 2 presenta una lista de genes cuya expresión predice la respuesta del cáncer de mama a la quimioterapia. Los resultados proceden de un ensayo clínico retrospectivo. La tabla incluye los números de registro de los genes, las secuencias de los cebadores directos e inversos (indicados como “f” y “r” respectivamente) y las sondas (indicadas como “p”) usadas para la amplificación por PCR. La Tabla 3 muestra las secuencias de amplicones usadas en la amplificación por PCR de los genes indicados.
Descripción detallada
A. Definiciones
A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed., John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992) proporcionan a un experto en la materia una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la puesta en práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no está limitada de forma alguna a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.
El término “micromatriz” se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridables, preferentemente sondas polinucleotídicas, sobre un sustrato.
El término “polinucleótido”, se use en singular o en plural, se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. De esta manera, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen en el presente documento incluyen, sin limitación, ADN mono-y bicatenario, ADN que incluye regiones mono-y bicatenarias, ARN mono-y bicatenario y ARN que incluye regiones mono-y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o incluyen regiones mono-y bicatenarias. Además, el término “polinucleótido” como se usa en el presente documento se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden proceder de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir una o más de las moléculas, pero lo más típico es que incluyan solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región triple helicoidal con frecuencia es un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente ADNc. El término incluye ADN (incluyendo ADNc) y ARN que contienen una
o más bases modificadas. De esta manera, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas por razones de estabilidad o por otras razones son “polinucleótidos” como se entiende dicho término en el presente documento. Además, dentro del término “polinucleótidos” como se define en el presente documento se incluyen ADN o ARN que comprenden bases poco habituales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas. En general, el término “polinucleótido” incluye todas las formas modificadas química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células sencillas y complejas.
El término “oligonucleótido” se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono-o bicatenarios, híbridos de ARN:ADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos que son sondas de ADN monocatenarias, con frecuencia se sintetizan por métodos químicos, por ejemplo, usando sintetizadores de oligonucleótidos automáticos que están disponibles en el mercado. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden obtenerse por una diversidad de métodos distintos, que incluyen técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y por expresión de ADN en células y organismos.
Las expresiones “gen expresado de forma diferencial”, “expresión génica diferencial” y sus sinónimos, que se usan indistintamente, se refieren a un gen cuya expresión está activada a un mayor o menor nivel en un sujeto que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, con respecto a su expresión en un sujeto normal o de control. Los términos también incluyen genes cuya expresión está activada a un mayor o menor nivel en diferentes estadios de la misma enfermedad. También se entiende que un gen expresado de forma diferencial puede activarse o inhibirse a nivel del ácido nucleico o a nivel de la proteína, o puede someterse a un corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto polipeptídico diferente. Dichas diferencias pueden demostrarse, por ejemplo, por un cambio en los niveles de ARNm, expresión en la superficie, secreción u otra división de un polipéptido. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o una comparación de las relaciones de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos procesados de forma diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diversos estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye tanto diferencias cuantitativas como diferencias cualitativas en el patrón de expresión temporal o celular en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células normales y enfermas, o entre células que han experimentado diferentes acontecimientos de enfermedad o estadios de enfermedad. Para los fines de esta invención, se considera que está presente una “expresión génica diferencial” cuando hay al menos una diferencia de aproximadamente dos veces, preferentemente de al menos aproximadamente cuatro veces, más preferentemente de al menos aproximadamente seis veces, y aún más preferentemente de al menos aproximadamente diez veces entre la expresión de un gen dado en sujetos normales y enfermos, o en diversos estadios de desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo.
El término “normalizado”, con respecto a un transcrito de un gen o un producto de expresión génica, se refiere al nivel del transcrito o producto de expresión génica con respecto a los niveles medios de transcritos/productos de una serie de genes de referencia, donde los genes de referencia se seleccionan basándose en su variación mínima entre
los pacientes, tejidos o tratamientos (“genes constitutivos”), o los genes de referencia son la totalidad de genes ensayados. En este último caso, que se denomina comúnmente “normalización global”, es importante que el número total de genes ensayados sea relativamente grande, preferentemente mayor de 50. Específicamente, el término “normalizado” con respecto a un transcrito de ARN se refiere al nivel de transcrito con respecto a la media de niveles de transcrito de una serie de genes de referencia. Más específicamente, el nivel medio de un transcrito de ARN medido por RT-PCR TaqMan® se refiere al valor de Ct menos los valores medios de Ct de una serie de transcritos de genes de referencia.
Las expresiones “umbral de expresión” y “umbral de expresión definida” se usan indistintamente y se refieren al nivel de un gen o producto génico en cuestión por encima del cual el gen o producto génico sirve como un marcador predictivo de la respuesta del paciente o la resistencia a un fármaco. El umbral típicamente se define de forma experimental a partir de estudios clínicos. El umbral de expresión puede seleccionarse para una sensibilidad máxima (por ejemplo, para detectar todos los respondedores a un fármaco) o para una selectividad máxima (por ejemplo, para detectar solo respondedores a un fármaco) o para un error mínimo.
La frase “amplificación génica” se refiere a un proceso mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento génico en una célula o línea celular particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) con frecuencia se denomina “amplicón”. A menudo, la cantidad del ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en proporción al número de copias realizadas del gen particular.
El término “pronóstico” se usa en el presente documento para hacer referencia a la predicción de la probabilidad de muerte o progresión atribuible a un cáncer, incluyendo la recurrencia, la extensión metastásica y la resistencia a fármacos de una enfermedad neoplásica, tal como un cáncer de mama. El término “predicción” se usa en el presente documento para hacer referencia a la probabilidad de que un paciente responda de forma favorable o desfavorable a un fármaco o serie de fármacos, y también el grado de esas respuestas, o de que un paciente sobreviva después de la eliminación quirúrgica del tumor primario y/o quimioterapia durante un cierto periodo de tiempo sin recurrencia del cáncer. Los métodos predictivos de la presente invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento mediante la elección de las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como una intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco dado o combinación de fármacos y/o radioterapia, o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente después de la cirugía y/o terminación de la quimioterapia y otras modalidades de tratamiento.
La expresión supervivencia “a largo plazo” se usa en el presente documento para hacer referencia a la supervivencia durante al menos 3 años, más preferentemente durante al menos 8 años y aún más preferentemente durante al menos 10 años después de la cirugía u otro tratamiento.
El término “tumor”, como se usa en el presente documento, se refiere al crecimiento y la proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer cerebral.
La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, un crecimiento celular anómalo o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anómalos, supresión o agravamiento de una respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.
La “respuesta de los pacientes” puede evaluarse usando cualquier criterio de valoración que indique un efecto beneficioso para el paciente, incluyendo, sin limitación (1) inhibición, en alguna medida, del crecimiento tumoral, incluyendo la ralentización y la detención completa del crecimiento; (2) reducción del número de células tumorales;
(3) reducción del tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración de células tumorales en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de metástasis; (6) potenciación de una respuesta inmunitaria antitumoral, que puede dar como resultado, pero no necesariamente, la regresión o rechazo del tumor; (7) alivio, en alguna medida, de uno o más síntomas asociados con el tumor; (8) aumento de la duración de la supervivencia después del tratamiento; y/o (9) reducción de la mortalidad en un punto dado de tiempo después del tratamiento.
“Terapia neoadyuvante” es una terapia adyuvante o complementaria proporcionada antes de la terapia primaria (principal). La terapia neoadyuvante incluye, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia y terapia hormonal. De esta
manera, la quimioterapia puede administrarse antes de una cirugía para reducir el tamaño del tumor, de forma que la cirugía pueda ser más eficaz o, como en el caso de tumores no operables previamente, posible.
La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas de mayor tamaño requieren mayores temperaturas para una hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de volverse a hibridar cuando están presentes cadenas complementarias en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las mayores temperaturas relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas inferiores harían lo contrario. Si se desean más detalles y una explicación adicional de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience Publishers, (1995).
Las “condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, como se definen en el presente documento, típicamente: (1) emplean una baja fuerza iónica y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1 % a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean formamida al 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1 %, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1 % SDS, y sulfato de dextrano al 10 % a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50 % a 55 ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en EDTA que contiene SSC 0,1 x a 55 ºC.
Las “condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y porcentaje de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante una noche a 37 ºC en una solución que comprende: formamida al 20 %, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., cuando sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
En el contexto de la presente invención, la referencia a “al menos uno”, “al menos dos”, “al menos cinco”, etc. de los genes indicados en cualquier conjunto de genes particular significa una cualquiera o todas y cada una de las combinaciones de los genes indicados.
B. Descripción detallada
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro de la experiencia en este campo. Dichas técnicas se explican con detalle en la biografía, tal como “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology”, 4ª edición (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., eds., 1994).
1. Perfilado de expresión génica
Los métodos de perfilado de expresión génica incluyen métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en secuenciación de polinucleótidos y métodos basados en proteómica. Los métodos usados más comúnmente conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión del ARNm en una muestra incluyen transferencia de northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de RNAsa (Hod, Biotechniques 13: 852-854 (1992)); y métodos basados en PCR, tales como reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)). Como alternativa, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADNproteína. Los métodos representativos para el análisis de la expresión génica basada en la secuenciación incluyen Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) y análisis de la expresión génica por secuenciación masiva paralela (MPSS, massively parallel signature sequencing).
2. Métodos de perfilado de expresión génica basados en PCR
a. PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Uno de los métodos de perfilado de expresión génica basados en PCR cuantitativa más sensible y más flexible es la RT-PCR, que puede usarse para comparar los niveles de ARNm en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento con fármacos, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar entre ARNm muy relacionados y para analizar la estructura del ARN.
La primera etapa es el aislamiento del ARNm a partir de una muestra diana. El material de partida típicamente es ARN total aislado de tumores o líneas de células tumorales humanas, y tejidos o células y lineales normales correspondientes, respectivamente. De esta manera, el ARN puede aislarse de una diversidad de tumores primarios, incluyendo tumores o líneas celulares de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, útero, etc., con ADN reunido de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm puede extraerse, por ejemplo, partir de muestras de tejido incluidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas en formalina) congeladas o archivadas.
En la técnica son bien conocidos métodos generales para la extracción del ARNm y se desvelan en libros de texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Se desvelan métodos para la extracción de ARN a partir de tejidos incluidos en parafina, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Andress et al., BioTechniques 18:4 2044 (1995). En particular, el aislamiento del ARN puede realizarse usando un kit de purificación, un conjunto tampón y proteasa procedente de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de células en cultivo puede aislarse usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles en el mercado incluyen el kit purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE, Madison, WI), y el Kit de Aislamiento de ARN en Bloque de Parafina (Ambion, Inc.). El ARN total procedente de muestras de tejido puede aislarse usando RNA Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir del tumor puede aislarse, por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio.
Como el ARN no puede servir como plantilla para la PCR, la primera etapa en el perfilado de la expresión génica por RT-PCR es la transcripción inversa de la plantilla de ARN en ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas usadas más comúnmente son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa típicamente se inicia usando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores de oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo del perfilado de la expresión. Por ejemplo, el ARN extraído puede someterse a transcripción inversa usando un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido después puede usarse como plantilla en la siguiente reacción de PCR.
Aunque la etapa de PCR puede usar una diversidad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, típicamente emplea la ADN polimerasa de Taq, que tiene actividad nucleasa 5’-3’ pero carece de actividad endonucleasa correctora 3’-5’. De esta manera, la PCR de TaqMan típicamente utiliza la actividad nucleasa 5’ de la polimerasa de Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con una actividad nucleasa 5’ equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no se puede extender por la enzima ADN polimerasa de Taq, y está marcada con un colorante fluorescente indicador y un colorante fluorescente inactivador. Cualquier emisión inducida por láser procedente del colorante indicador se inactiva por el colorante inactivador cuando los dos colorantes están situados cerca cuando están sobre la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima ADN polimerasa de Taq escinde la sonda de una manera dependiente de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante indicador liberado carece del efecto de inactivación del segundo fluoróforo. Por cada nueva molécula sintetizada se libera una molécula de colorante indicador, y la detección del colorante indicador no inactivado proporciona la base de una interpretación cuantitativa de los datos.
La RT-PCR de TaqMan puede realizarse usando un equipo disponible en el mercado, tal como, por ejemplo, Sequence Detection System™ de ABI PRISM 7700™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, el procedimiento de la nucleasa 5’ se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como Sequence Detection System™ de ABI PRISM 7700™. El sistema consiste en un aparato de ciclos térmicos, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un aparato de ciclos térmicos. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye un software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.
Los datos de ensayo de la nucleasa 5’ inicialmente se expresan como Ct, o el ciclo umbral. Como se ha analizado anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante todos los ciclos y representan la cantidad de
producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que primero se registra la señal fluorescente como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).
Para minimizar los errores y el efecto de la variación de una muestra a otra, la RT-PCR normalmente se realiza usando un ARN de referencia que idealmente se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN usados con más frecuencia para normalizar los patrones de expresión génica son ARNm para los genes constitutivos gliceraldehído-3-fosfafo-deshidrogenasa (GAPD) y -actina (ACTB).
Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación del producto de PCR a través de una sonda fluorigénica marcada doblemente (es decir, sonda TaqMan). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, en la que se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con la PCR comparativa cuantitativa que usa un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen constitutivo para la RT-PCR. Si se desean más detalles, véase, por ejemplo, Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996).
b. Sistema MassARRAY
En el método de perfilado de la expresión génica basado en MassARRAY, desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA) después del aislamiento del ARN y la transcripción inversa, al ADNc obtenido se le añade una molécula de ADN sintética (competidor), que corresponde a la región de ADNc diana en todas las posiciones excepto una sola base, y sirve como patrón interno. La mezcla de ADNc/competidor se amplifica por PCR y se somete a un tratamiento con enzima fosfatasa alcalina de gamba después de la PCR (SAP), que da como resultado la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Después de la inactivación de la fosfatasa alcalina, los productos de PCR del competidor y el ADNc se someten a una extensión de cebadores, que genera distintas señales de masa para los productos de PCR derivados del competidor y del ADNc. Después de la purificación, estos productos se distribuyen en una matriz de chips, que está precargada con componentes necesarios para el análisis con espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo y desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS). El ADNc presente en la reacción después se cuantifica analizando las relaciones de las áreas de los picos en el espectro de masas generado. Si se desean más detalles, véase, por ejemplo, Ding y Cantor, Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 100: 3059-3064 (2003).
c. Otros métodos basados en PCR
Otras técnicas basadas en PCR incluyen, por ejemplo, presentación diferencial (Liang y Pardee, Science 257: 967971 (1992)); polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (iAFLP) (Kawamoto et al., Genome Res. 12: 13051312 (1999)); tecnología BeadArray™ (IIlumina, San Diego, CA; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), junio 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72: 5618 (2000)); BeadsArray para la detección de la expresión génica (BADGE), usando el sistema LabMAP de Luminex100 disponible en el mercado y múltiples microesferas codificadas por colores (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido para la expresión génica (Yang et al., Genome Res. 11: 1888-1898 (2001)); y análisis del perfilado de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003)).
3. Micromatrices
La expresión génica diferencial también puede identificarse o confirmarse usando la técnica de micromatrices. De esta manera, el perfil de expresión de genes asociados al cáncer de mama puede medirse en tejido tumoral fresco o incluido en parafina, usando la tecnología de micromatrices. En este método, se cultivan en placas o se disponen en serie sobre un sustrato de microchip las secuencias polinucleotídicas de interés (incluyendo ADNc y oligonucleótidos). Las secuencias dispuestas en serie después se hibridan con sondas de ADN específicas de las células o tejidos de interés. Como ocurre en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm típicamente es ARN total aislado de tumores o líneas de células tumorales humanas, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes. De esta manera, el ARN puede aislarse a partir de una diversidad de tumores o líneas de células tumorales primarias. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm puede extraerse, por ejemplo, a partir de muestras de tejido fijado (por ejemplo fijado con formalina) e incluido en bloques de parafina, congelado o archivado, que se preparan rutinariamente y se conservan en la práctica clínica diaria.
En una realización específica de la técnica de micromatriz, se aplican los insertos de los clones de ADNc amplificados por PCR en un sustrato en una matriz densa. Preferentemente, se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótidos en el sustrato. Los genes dispuestos en la micromatriz, inmovilizados en el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc marcadas con colorantes fluorescentes mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción inversa del ARN extraído de los tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip hibridan con especificidad con cada mancha de ADN en la matriz. Después de un lavado riguroso para retirar las sondas unidas de forma no específica, el chip se explora por microscopía láser confocal o por otro método de detección, tal como una cámara de CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento dispuesto permite la
evaluación de la abundancia del ARNm correspondiente. Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN se hibridan por parejas con la matriz. De esta manera, se determina simultáneamente la abundancia relativa de los transcritos procedentes de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado. La escala miniaturizada de la hibridación proporciona una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Se ha demostrado que dichos métodos tienen la sensibilidad necesaria para detectar transcritos raros, que se expresan a unas pocas copias por célula, y para detectar reproduciblemente al menos diferencias de aproximadamente dos veces en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93(2): 106-149 (1996)). Los análisis de micromatrices pueden realizarse por un equipo disponible en el mercado, siguiendo los protocolos del fabricante, tales como mediante el uso de la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de micromatrices de Incyte.
El desarrollo de métodos de micromatrices para el análisis a gran escala de la expresión génica hace que sea posible buscar sistemáticamente marcadores moleculares de clasificación de cánceres y predecir los resultados en una diversidad de tipo tumorales.
4. Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)
El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcritos génicos, sin necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera un marcador de secuencia corta (de aproximadamente 10-14 pb) que contiene suficiente información para identificar de forma única un transcrito, siempre que el marcador se obtenga a partir de una única posición dentro de cada transcrito. Después, se unen entre sí muchos transcritos para formar moléculas seriadas largas, que pueden secuenciarse revelando la identidad de los múltiples marcadores simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de marcadores individuales, e identificando el gen que corresponde a cada marcador. Si se desean más detalles, véase, por ejemplo, Velculescu et al., Science 270: 484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88: 243-51 (1997).
5. Análisis de la expresión génica por secuenciación masiva paralela (MPSS)
Este método, descrito por Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000), es una estrategia de secuenciación que combina la secuenciación de firmas genéticas no basada en gel con la clonación in vitro de millones de plantillas en microperlas separadas de 5 m de diámetro. En primer lugar, se construye una biblioteca de microperlas de plantillas de ADN por clonación in vitro. Esto se continúa por el ensamblaje de una matriz plana de las microperlas que contienen plantillas en una celda de flujo a alta densidad (típicamente mayor de 3 x 106 microperlas/cm2). Los extremos libres de las plantillas clonadas en cada microperla se analizan simultáneamente, usando un método de secuenciación de firmas genéticas basado en fluorescencia que no requiere separación de fragmentos de ADN. Se ha demostrado que este método proporciona de forma simultánea y precisa, en una sola operación, cientos de miles de secuencias de firmas genéticas a partir de una biblioteca de ADNc de levadura.
6. Inmunohistoquímica
Los métodos de inmunohistoquímica también son adecuados para detectar los niveles de expresión de los marcadores de pronóstico de la presente invención. De esta manera, se usan anticuerpos o antisuero, preferentemente antisuero policlonal, y aún más preferentemente anticuerpos monoclonales específicos para cada marcador, para detectar la expresión. Los anticuerpos pueden detectarse por marcaje directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores haptenos tales como biotina o una enzima tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Como alternativa, se usa un anticuerpo primario no marcado junto con un anticuerpo secundario marcado, que comprende antisuero, antisuero policlonal o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. Los protocolos y los kits de inmunohistoquímica son bien conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado.
7. Proteómica
El término “proteoma” se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo tejido, organismo o cultivo celular) en un cierto punto de tiempo. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (también denominada “proteómica de expresión”). La proteómica típicamente incluye las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra por electroforesis en gel 2-D (PAGE 2-D); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ejemplo, por espectrometría de masas o secuenciación N-terminal y (3) análisis de los datos usando bioinformática. Los métodos de proteómica son suplementos valiosos para otros métodos de perfilado de expresión génica, y pueden usarse solos o en combinación con otros métodos para detectar los productos de los marcadores de pronóstico de la presente invención.
8. Descripción general de aislamiento, purificación y amplificación de ARNm
En diversos artículos de revista publicados (por ejemplo T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001]) se proporcionan las etapas de un protocolo representativo para perfilar la expresión génica usando tejidos incluidos en parafina y fijados como fuente de ARN, incluyendo el aislamiento de ARNm, purificación, extensión de cebadores y amplificación. En resumen, un proceso representativo empieza con el corte de secciones de aproximadamente 10 m de espesor de muestras de tejido tumoral incluidas en parafina. Después se extrae el ARN y se retiran el ADN y las proteínas. Después del análisis de la concentración de ARN, pueden incluirse etapas de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y el ARN se somete a transcripción inversa usando promotores con especificidad de gen seguido de RT-PCR. Finalmente, los datos se analizan para identificar la mejor opción de tratamiento disponible para el paciente basándose en el patrón de expresión génica característico identificado en la muestra de tumores examinada.
9. Quimioterapia de cáncer
Los agentes quimioterapéuticos usados en el tratamiento del cáncer pueden dividirse en varios grupos, dependiendo de su mecanismo de acción. Algunos agentes quimioterapéuticos directamente dañan el ADN y el ARN. Al detener la replicación del ADN, dichos agentes quimioterapéuticos detienen completamente la replicación o dan como resultado la producción de ADN o ARN sin sentido. Esta categoría incluye, por ejemplo, el cisplatino (Platinol®), daunorrubicina (Cerubidine®), doxorrubicina (Adriamycin®) y etopósido (VePesid®). Otro grupo de agentes quimioterapéuticos para el cáncer interfieren con la formación de nucleótidos o desoxirribonucleótidos, de tal forma que se bloquea la síntesis de ARN y la replicación celular. Los ejemplos de fármacos en esta clase incluyen metotrexato (Abitrexate®), mercaptopurina (Purinethol®), fluorouracilo (Adrucil®) e hidroxiurea (Hydrea®). Una tercera clase de agentes quimioterapéuticos realiza la síntesis o ruptura de haces mitóticos y, como resultado, interrumpen la división celular. Los ejemplos de fármacos de esta clase incluyen Vinblastina (Velban®), Vincristina (Oncovin®) y taxenos tales como Pacitaxel (Taxol®) y Tocetaxel (Taxotere®). El tocetaxel está aprobado actualmente en los Estados Unidos para tratar a pacientes con cáncer de mama metastásico o localmente avanzado después del fallo de una quimioterapia previa, y a pacientes con cáncer de pulmón no microcítico metastásico o localmente avanzado después del fallo de una quimioterapia previa basada en platino.
Un problema común con la quimioterapia es la alta toxicidad de los agentes quimioterapéuticos, tales como antraciclinas y taxenos, que limita los efectos clínicos beneficiosos de esta estrategia de tratamiento.
La mayoría de los pacientes reciben quimioterapia inmediatamente después de la eliminación quirúrgica del tumor. Esta estrategia se denomina comúnmente terapia adyuvante. Sin embargo, la quimioterapia también puede administrarse antes de la cirugía, en lo que se denomina tratamiento neoadyuvante. Aunque el uso de la quimioterapia neoadyuvante procede del tratamiento del cáncer de mama avanzado e inoperable, también ha conseguido aceptación en el tratamiento de otros tipos de cánceres. La eficacia de la quimioterapia adyuvante se ha ensayado en varios ensayos clínicos. En el ensayo multicéntrico National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-18 (NSAB B-18) (Fisher et al., J. Clin. Oncology 15: 2002-2004 (1997); Fisher et al., J. Clin. Oncology 16: 2672-2685 (1998)) se realizó una terapia neoadyuvante con una combinación de adriamicina y ciclofosfamida (“régimen AC”). En otro ensayo clínico, la terapia neoadyuvante se administró usado una combinación de 5 fluorouracilo, epirubicina y ciclofosfamida (“régimen FEC”) (van Der Hage et al., J. Clin. Oncol. 19: 4224-4237 (2001)). Los ensayos clínicos más nuevos también han usado regímenes de tratamiento neoadyuvantes que contienen taxano. Véase, por ejemplo Holmes et al., J. Natl. Cancer Inst. 83: 1797-1805 (1991) y Moliterni et al., Seminars in Oncology, 24: S17-10-S-17-14 (1999). Para más información sobre la quimioterapia neoadyuvante para el cáncer de mama, véase Cleator et al., Endocrine-Related Cancer 9: 183-195 (2002).
10. Conjunto de genes de cáncer, subsecuencias de genes ensayadas y aplicación clínica de datos de expresión de genes
Un aspecto importante de la presente invención es usar la expresión medida de ciertos genes por tejido de cáncer de mama para proporcionar información de pronóstico. Para este fin es necesario corregir (normalizar) las diferencias en la cantidad de ARN ensayado y la variabilidad en la calidad del ARN usado, y otros factores tales como diferencias en máquinas y operador. Por lo tanto, el ensayo típicamente mide e incorpora el uso de ARN de referencia, incluyendo los transcritos a partir de genes constitutivos bien conocidos tales como GAPD y ACTB. En “User Bulletin Nº 2” se proporciona un método preciso para la normalización de datos de expresión génica para el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM (Applied Biosystems; 1997). Como alternativa, la normalización puede basarse en la señal media o mediana (Ct) de todos los genes ensayados o en una gran subserie de los mismos (estrategia de normalización global). En el estudio descrito en el siguiente ejemplo, se usó la denominada estrategia de normalización central, que utilizó una subserie de los genes explorados, seleccionada basándose en la ausencia de correlación con resultados clínicos, para la normalización.
11. Recurrencia y respuesta a las puntuaciones de terapia y sus aplicaciones
La solicitud en trámite junto con la presente, con el Nº de Serie 60/486.302, presentada el 10 de julio de 2003, describe un ensayo de pronóstico basado en algoritmos para determinar la probabilidad de recurrencia de cáncer y/o la probabilidad de que un paciente responda bien a una modalidad de tratamiento. Las características del algoritmo
que lo distinguen de otros métodos de pronóstico de cáncer incluyen: 1) un único conjunto de ARNm de ensayo (o los productos de expresión génica correspondientes) usado para determinar la probabilidad de recurrencia, 2) ciertos pesos usados para combinar los datos de expresión en una fórmula y 3) umbrales usados para dividir a los pacientes en grupos de diferentes niveles de riesgo, tales como grupos de riesgo bajo, medio y alto. El algoritmo produce una puntuación de recurrencia numérica (RS) o, si se evalúa la respuesta del paciente al tratamiento, la puntuación de respuesta a la terapia (RTS).
La prueba requiere un ensayo de laboratorio para medir los niveles de los ARNm especificados o sus productos de expresión, pero puede utilizar cantidades muy pequeñas de tejido fresco, de tejido congelado, o de especímenes de biopsias de tumor incluidos en parafina y fijados que ya se han recogido necesariamente de los pacientes y archivado. De esta manera, la prueba puede ser no invasiva. También es compatible con varios métodos diferentes de recolección de tejido tumoral, por ejemplo, mediante biopsia central o aspiración con aguja fina.
De acuerdo con el método, la puntuación de recurrencia del cáncer (RS) se determina:
- (a)
- sometiendo una muestra biológica que comprende células cancerosas obtenidas a partir de dicho sujeto a perfilado de expresión génica o de proteínas;
- (b)
- cuantificando el nivel de expresión de múltiples genes individuales [es decir, niveles de ARNm o proteínas] para determinar un valor de expresión para cada gen;
- (c)
- creando subseries de los valores de expresión génica, comprendiendo cada subserie valores de expresión para genes asociados por una función biológica relacionada con el cáncer y/o por coexpresión;
- (d)
- multiplicando el nivel de expresión de cada gen dentro de una subserie por un coeficiente que refleja su contribución relativa a la recurrencia del cáncer o respuesta a la terapia dentro de dicha subserie y añadiendo los productos de multiplicación para producir un término para dicha subserie;
- (e)
- multiplicando el término de cada subserie por un factor que refleja su contribución a la recurrencia de cáncer
- o respuesta a la terapia, y
- (f)
- produciendo la suma de términos para cada subserie multiplicada por dicho factor para producir una puntuación de recurrencia (RS) o una puntuación de respuesta a la terapia (RTS),
donde la contribución de cada subserie que no muestra una correlación lineal con la recurrencia del cáncer o la respuesta a la terapia se incluye solo por encima de un nivel umbral predeterminado; y donde a las subseries en las que la mayor expresión de los genes especificados reduce el riesgo de recurrencia de cáncer se les asigna un valor negativo, y a la subseries en las que la expresión de los genes especificados aumenta el riesgo de recurrencia de cáncer se les asigna un valor positivo.
En una realización particular, la RS se determina:
- (a)
- determinando los niveles de expresión de GRB7, HER2, EstR1, PR, Bc12, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, CD68, GSTM1 y BAG1, o sus productos de expresión, en una muestra biológica que contiene células tumorales obtenidas a partir de dicho sujeto; y
- (b)
- calculando la puntuación de recurrencia (RS) mediante la siguiente ecuación: RS = (0,23 a 0,70) x GRB7axisthresh -(0,17 a 0,51) x ERaxis + (0,53 a 1,56) x prolifaxisthresh + (0,07 a 0,21) x invasionaxis + (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1 donde
- (i)
- GRB7 axis = (0,45 a 1,35) x GRB7 + (0,05 a 0,15) x HER2;
- (ii)
- si GRB7 axis < -2, entonces GRB7 axis thresh = -2, y si GRB7 axis ≥ -2, entonces GRB7 axis thresh = GRB7 axis;
(iii) ER axis = (Est1 + PR + Bc12 + CEGP1)/4;
- (iv)
- prolifaxis = (SURV + Ki.67 + MYBL2 + CCNB1 + STK15)/5;
- (v)
- si prolifaxis < -3,5, entonces prolifaxisthresh = -3,5, si prolifaxis -3,5, entonces prolifaxishresh = prolifaxis; y
- (vi)
- invasionaxis = (CTSL2 + STMY3)/2,
donde los términos para todos los genes individuales para los cuales no se han mostrado específicamente intervalos pueden variar entre aproximadamente 0,5 y 1,5, y donde un mayor valor de RS representa una mayor probabilidad de recurrencia del cáncer.
En el siguiente Ejemplo no limitante se describirán más detalles de la invención.
Ejemplo
A. Estudio retrospectivo de quimioterapia neoadyuvante en cáncer de mama invasivo: perfilado de expresión génica de tejido de biopsia central incluido en parafina
Este fue un estudio colaborativo en el que estaba implicado Genomic Health, Inc., (Redwood City California), y Institute Tumori, Milán, Italia. El objetivo principal del estudio fue explorar la correlación entre los perfiles moleculares previos al tratamiento y la respuesta patológica completa (pCR) a la quimioterapia neoadyuvante en cáncer de mama localmente avanzado.
Criterios de inclusión de pacientes:
Diagnóstico histológico de cáncer de mama invasivo (fecha de cirugía 1998-2002); diagnóstico de cáncer de mama localmente avanzado definido por infiltración de la piel y/o estado axilar N2 y/o ganglios supraclaviculares homolaterales positivos; biopsia central, quimioterapia neoadyuvante y resección quirúrgica realizada en el Instituto Nazionale Tumori, Milán; consentimiento informado por escrito de que el material biológico obtenido para el diagnóstico histológico o los procedimientos de diagnóstico se usaría para investigación; y evaluación histopatológica que indica cantidades adecuadas de tejido tumoral para la inclusión en este estudio de investigación.
Criterios de exclusión:
Metástasis distante; ningún bloque de tumor disponible de la biopsia central inicial o de la resección quirúrgica; o ningún tumor o un tumor muy pequeño (<5 %) del tejido total en el portaobjetos) en el bloque evaluado por el examen del portaobjetos con H&E por el patólogo.
Diseño del estudio
Se identificaron y se estudiaron ochenta y nueve pacientes evaluables (de un conjunto de 96 pacientes evaluables clínicamente). Los niveles de 384 especies de ARNm se midieron por RT-PCR, representando productos de genes relacionados con cánceres candidatos que se seleccionaron a partir de la bibliografía de investigación biomédica. Solo un gen se perdió debido a una señal inadecuada.
Las características de los pacientes fueron las siguientes: edad media 50 años; Grados de tumor: 24 % Bien, 55 % Moderado y 21 % Mal; Sesenta y tres % de los pacientes eran ER positivos {por inmunohistoquímica}; Setenta % de los pacientes tenían ganglios linfáticos positivos.
Todos los pacientes recibieron una quimioterapia neoadyuvante primaria: doxorrubicina más Taxol 3 semanas/3 ciclos seguido de Taxol® (paclitaxel) 1 semana/12 ciclos. Después de finalizar la quimioterapia se realizó la eliminación quirúrgica del tumor. Se tomaron muestras de biopsias de tumor centrales antes de empezar la quimioterapia, y sirvieron como fuente de ARN para el ensayo de RT-PCR.
Materiales y métodos
Se obtuvo tejido tumoral incluido en parafina y fijado (FPE) de la biopsia antes y después de la quimioterapia. Se tomaron biopsias centrales antes de la quimioterapia. En ese caso, el patólogo seleccionó el bloque de tumor primario más representativo y presentó nueve secciones de 10 micrómetros para el análisis de ARN. Específicamente, se preparó un total de 9 secciones (de 10 micrómetros de espesor cada una) y se pusieron en tres Tubos de Microcentrífuga de marca Costar (Polipropileno, tubos de 1,7 ml, transparente; 3 secciones en cada tubo) y se reunieron.
Se extrajo ARN mensajero usando el Kit de Purificación de ARN MasterPure™ (Epicentre Technologies) y se cuantificó por el método de fluorescencia RiboGreen® (Molecular probes). Los ensayos moleculares de la expresión génica cuantitativa se realizó por RT-PCR usando el Sequence Detection System™ de ABI PRISM 7900™ (PerkinElmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). ABI PRISM 7900™ consiste en un aparato de ciclos térmicos, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos en un aparato de ciclos térmicos. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real para los 384 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye el software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.
Análisis y resultados
Se analizó el tejido tumoral de 384 genes. Los valores del ciclo umbral (CT) para cada paciente se normalizaron basándose en la mediana de una subserie de los genes explorados para ese paciente particular, seleccionada basándose en la ausencia de correlación con resultados clínicos (estrategia de normalización central). La respuesta beneficiosa del paciente a la quimioterapia se definió como una respuesta patológica completa (PCR). En los pacientes se evaluó formalmente la respuesta al finalizar toda la quimioterapia. Una respuesta clínica completa (cCR) requiere la desaparición completa de toda la enfermedad clínicamente detectable, por examen físico u obtención de imágenes de diagnóstico de mama.
Una respuesta patológica completa (pCR) requiere la ausencia de cáncer de mama residual tras el examen histológico de tejido tratado y sometido a biopsia, especímenes de lumpectomía o mastectomía después de la quimioterapia primaria. Puede estar presente un carcinoma ductal residual in situ (DCTS).
Es posible que no esté presente un cáncer residual en ganglios regionales. De los 89 pacientes evaluables, 11 (el 12 %) tuvieron una respuesta patológica completa (pCR). Siete de estos pacientes eran ER negativos.
Una respuesta clínica parcial se definió como una reducción 50 % en el área del tumor (suma de los productos de los mayores diámetros perpendiculares) o una reducción 50 % en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares más grandes de lesiones múltiples en la mama y la axila. Ningún área de enfermedad puede aumentar en > 25 % y no puede aparecer ninguna nueva lesión.
El análisis se realizó comparando la relación entre la expresión génica normalizada y los resultados binarios de pCR
o no pCR. Se usaron modelos generalizados univariantes con funciones de enlace probit o logit. Véase, por ejemplo, Van K. Borooah, LOGIT y PROBIT, Ordered Multinominal Models, Sage University Paper, 2002.
La tabla 1 presenta correlaciones de respuestas patológicas con la expresión génica, e indica los 86 genes para los que el valor de p para las diferencias entre los grupos era <0,1. La segunda columna (con el encabezado “Dirección”) indica si la mayor expresión se correlaciona con una reducción o aumento de la probabilidad de respuesta a la quimioterapia. El significado estadístico del valor predictivo para cada gen se proporciona por el valor de P (columna de la derecha)
Enlace Probit
- Gen
- Dirección Intersección Pendiente Valor de P
- TBP
- Reducción 0,0575 2,4354 0,0000
- ILT.2
- Aumento 0,5273 -0,9489 0,0003
- ABCC5
- Reducción 0,9872 0,8181 0,0003
- CD18
- Aumento 3,4735 -1,0787 0,0007
- GATA3
- Reducción 0,6175 0,2975 0,0008
- DICER1
- Reducción -0,9149 1,4875 0,0013
- MSH3
- Reducción 2,6875 0,9270 0,0013
- GBP1
- Aumento 1,7649 -0,5410 0,0014
- IRS1
- Reducción 1,3576 0,5214 0,0016
- CD3z
- Aumento 0,1567 -0,5162 0,0018
- Fasl
- Aumento -0,6351 -0,4050 0,0019
- TUBB
- Reducción 1,2745 0,8267 0,0025
- BAD
- Reducción 0,9993 1,1325 0,0033
- ERCC1
- Reducción 0,0327 1,0784 0,0039
- MCM6
- Aumento 0,1371 -0,8008 0,0052
- PR
- Reducción 1,6079 0,1764 0,0054
- APC
- Reducción 0,7264 1,0972 0,0061
- GGPS1
- Reducción 1,0906 0,8124 0,0062
- KRT18
- Reducción -0,8029 0,4506 0,0063
- ESRRG
- Reducción 2,0198 0,2262 0,0063
- E2F1
- Aumento 0,2188 -0,5277 0,0068
- AKT2
- Reducción -1,3566 1,1902 0,0074
- A.Catenina
- Reducción -0,6859 0,9279 0,0079
- CEGP1
- Reducción 1,3355 0,1875 0,0091
- NPD009
- Reducción 1,3996 0,2971 0,0092
- MAPK14
- Reducción 2,6253 1,6007 0,0093
- RUNX1
- Reducción -0,4138 0,7214 0,0103
- ID2
- Aumento 1,7326 -0,7032 0,0104
- G.Catenina
- Reducción -0,1221 0,5954 0,0110
- FBXO5
- Aumento 0,3421 -0,4935 0,0110
- FHIT
- Reducción 1,9966 0,4989 0,0113
- MTA1
- Reducción 0,3127 0,6069 0,0133
Enlace Probit 5
- Gen
- Dirección Intersección Pendiente Valor de P
- ERBB4
- Reducción 1,4591 0,1436 0,0135
- FUS
- Reducción -0,6150 0,9415 0,0137
- BBC3
- Reducción 2,4796 0,6495 0,0138
- IGF1R
- Reducción 1,1998 0,3116 0,0147
- CD9
- Reducción -0,9292 0,5747 0,0156
- TP53BP1
- Reducción 1,4325 0,8122 0,0169
- MUC1
- Reducción 0,8881 0,2140 0,0175
- IGFBP5
- Reducción -0,6180 0,4880 0,0181
- rhoC
- Reducción -0,1726 0,6860 0,0184
- RALBP1
- Reducción 0,2383 0,9509 0,0185
- CDC20
- Aumento 1,3204 -0,4390 0,0186
- STAT3
- Reducción -0,9763 0,7023 0,0194
- ERK1
- Reducción 0,8577 0,6496 0,0198
- HLA.DPB1
- Aumento 3,6300 -0,6035 0,0202
- SGCB
- Reducción 0,6171 0,7823 0,0208
- CGA
- Aumento 0,0168 -0,1450 0,0209
- DHPS
- Reducción 0,2957 0,7840 0,0216
- MGMT
- Reducción 0,9238 0,6876 0,0226
- CRIP2
- Reducción 0,5524 0,4394 0,0230
- MMP12
- Aumento 0,4208 -0,2419 0,0231
- ErbB3
- Reducción 0,9438 0,2798 0,0233
- RAP1GDS1
- Reducción 0,2617 0,7672 0,0235
- CDC25B
- Aumento 1,6965 -0,5356 0,0264
- IL6
- Aumento 0,0592 -0,2388 0,0272
- CCND1
- Reducción 0,2260 0,2992 0,0272
- CYBA
- Aumento 2,6493 -0,5175 0,0287
- PRKCD
- Reducción 0,2125 0,6745 0,0291
- DR4
- Aumento 0,3039 -0,5321 0,0316
- Hepsina
- Reducción 1,9211 0,1873 0,0318
- CRABP1
- Aumento 1,0309 -0,1287 0,0320
- AK055699
- Reducción 2,0442 0,1765 0,0343
- Contig.51037
- Aumento 0,7857 -0,1131 0,0346
- VCAM1
- Aumento 1,1866 -0,3560 0,0346
- FYN
- Aumento 1,5502 -0,5624 0,0359
- GRB7
- Aumento 1,3592 -0,1646 0,0375
- AKAP.2
- Aumento 1,7946 -0,7008 0,0382
- RASSF1
- Aumento 1,1972 -0,0390 0,0384
- MCP1
- Aumento 1,3700 -0,3805 0,0388
- ZNF38
- Reducción 1,7957 0,4993 0,0395
- MCM2
- Aumento 1,0574 -0,4695 0,0426
- GBP2
- Aumento 1,4095 -0,4559 0,0439
- SEMA3F
- Reducción 1,2706 0,3725 0,0455
- CD31
- Aumento 1,9913 -0,5955 0,0459
- COL1A1
- Reducción -1,9861 0,3812 0,0466
- ER2
- Aumento -0,5204 -0,2617 0,0471
- BAG1
- Reducción 0,6731 0,5070 0,0472
- AKT1
- Reducción -0,4467 0,5768 0,0480
- COL1A2
- Reducción -1,0233 0,3804 0,0490
- STAT1
- Aumento 1,9447 -0,4062 0,0498
A-Catenina NM_00190 S21381A, Cate.f2
A-Catenina NM_00190 S2139/A-Cate.r2
A-Catenina NM_00190 S4725/A'-Cate.p2
ABCC5 NM_00568 S5605/ABCC5.f1
ABCC5 NM_00568 S5606/ABCC5.r1
ABCC5 NM_00568 S5607/ABCC5.p1
AK055699 AK055699 S2097/AK0556.f1
AK055699 AK055699 S2098/AK0556.r1
AK055699 AK055699 S5057/AK0556.p1
Enlace Probit
- Gen
- Dirección Intersección Pendiente Valor de P
- Wnt.5a
- Reducción 2,2244 0,2983 0,0518
- PTPD1
- Reducción 1,2950 0,4834 0,0552
- RAB6C
- Reducción 0,4841 0,5635 0,0717
- TK1
- Aumento 0,6127 -0,3625 0,0886
- Bcl2
- Reducción 1,1459 0,2509 0,0959
Basándose en los datos expuestos en la Tabla 1, la mayor expresión de los siguientes genes se correlaciona con una mayor probabilidad de respuesta patológica completa al tratamiento: ILT.2; CD18; GBP1; CD3z; fasl; MCM6; E2F1; ID2; FBXO5; CDC20; HLA.DPB1; CGA; MMP12; CDC25B; IL6; CYBA; DR4; CRABP1; Contig.51037; VCAM1; FYN; GRB7; AKAP.2; RASSF1; MCP1; MCM2; GBP2; CD31; ER2; STAT1; TK1; mientras que la mayor expresión de los siguientes genes se correlaciona con una menor probabilidad de respuesta patológica completa al tratamiento: TBP; ABC5; GATA3; DICER1; MSH3; IRS1; TUBB; BAD; ERCC1; PR; APC; GGPS1; KRT18; ESRRG; AKT2; A.Catenina; CEGP1; NPD009; MAPK14; RUNX1; G.Catenina; FHIT; MTA1; ErbB4; FUS; BBC3; IGF1R; CD9; TP53BP1; MUC1; IGFBP5; rhoC; RALBP1; STAT3; ERK1; SGCB; DHPS; MGMT; CRISP2; ErbB3; RAP1GDS1; CCND 1; PRKCD; Hepsina, AK055699; ZNF38; SEMA3F; COL1A1; BAG1; AKT1; COL1A2; Wnt.5a; PTPD1; RAB6C; Bcl2.
También se investigó la relación entre el algoritmo de riesgo de recurrencia (descrito en la solicitud de Patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente, con el Nº de Serie 60/486.302) y pCR también. El algoritmo incorpora los niveles medidos de 21 especies de ARNm. Dieciséis ARNm (nombrados más adelante) fueron marcadores clínicos candidatos y los 5 restantes (ACTB, GAPD, GUSB, RPLPO, y TFRC) fueron genes de referencia. Las mediciones de expresión normalizadas con respecto a la referencia varían de 0 a 15, donde una unidad refleja un aumento de 2 veces en el ARN.
La Puntuación de Recurrencia (RS) se calcula a partir de la expresión cuantitativa de cuatro conjuntos de genes marcadores (un grupo de receptores de estrógenos de 4 genes -ESR1, PGR, BCL2 y SCUBE2; un conjunto de proliferación de 5 genes -MKI67, MYBL2, BIRC5, CCNB1 y STK6; un conjunto HER2 de 2 genes ERBB2 y GRB7, un grupo de invasión de 2 genes MMP11 y CTSL2) y 3 genes individuales distintos -GSTM1, BAG1 y CD68.
Aunque los genes y los factores de multiplicación usados en la ecuación pueden variar, en una realización típica, puede usarse la siguiente ecuación para calcular RS:
RS (intervalo, 0-100) = + 0,47 x Puntuación de Grupo HER2 -0,34 x Puntuación de Grupo ER
- +
- 1,04 x Puntuación de Grupo de Proliferación
- +
- 0,10 x Puntuación de Grupo de Invasión
- +
- 0,005 x CD68 -0,08 x GSTM1 -0,07 x BAG1
La aplicación de este algoritmo para estudiar los datos de expresión clínica y génica produce una curva continua que relaciona la RS con los valores de pCR, como se muestra en la Figura 1. El examen de estos datos muestra que pacientes con RS > 50 están en el percentil 50 superior de los pacientes en términos de probabilidad de respuesta a la quimioterapia, y que los pacientes con RS < 35 están en el percentil 50 inferior de los pacientes en términos de probabilidad de respuesta a la quimioterapia.
Aunque la invención se ha descrito dando énfasis a ciertas realizaciones específicas, será evidente para los expertos en la materia que son posibles variaciones y modificaciones en los métodos y técnicas específicas. Por consiguiente, la presente invención incluye todas las modificaciones incluidas dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las siguientes reivindicaciones.
- TABLA 2
- CGTTCCGATCCTCTATACTGCAT
- 23
- AGGTCCCTGTTGGCCTTATAGG
- 22
- ATGCCTACAGCACCCTGATGTCGCA
- 25
- TGCAGACTGTACCATGCTGA
- 20
- GGCCAGCACCATAATCCTAT
- 20
- CTGCACACGGTTCTAGGCTCCG
- 22
- CTGCATGTGATTGAATAAGAAACAAGA
- 27
- TGTGGACCTGATCCCTGTACAC
- 22
- TGACCACACCAAAGCCTCCCTGG
- 23
AKAP-2 NM_00720 S13741AKAP-2.f1 ACGAATTGTCGGTGAGGTCT 20 AKAP-2 NM_00720 S1375/AKAP-2.r1 GTCCATGCTGAAATCATTGG 20 AKAP-2 NM_00720 S4934/AKAP-2.p1 CAGGATACCACAGTCCTGGAGACCC 25 AKT1 NM_00516 S0010/AKT1.f3 CGCTTCTATGGCGCTGAGAT 20 AKT1 NM_00516 S0012IAKT1.r3 TCCCGGTACACCACGTTCTT 20 AKT1 NM_00516 S4776/AKT1.p3 CAGCCCTGGACTACCTGCACTCGG 24 AKT2 NM_00162 S0828/AKT2.f3 TCCTGCCACCCTTCAAACC 19 AKT2 NM_00162 S0829/AKT2.r3 GGCGGTAAATTCATCATCGAA 21 AKT2 NM_00162 S4727/AKT2.p3 CAGGTCACGTCCGAGGTCGACACA 24 APC NM_00003 S00221APC.f4 GGACAGCAGGAATGTGTTTC 20 APC NM_00003 S0024/APC.r4 ACCCACTCGATTTGTTTCTG 20 APC NM_00003 S4888/APC.p4 CATTGGCTCCCCGTGACCTGTA 22 BAD NM_03298 S2011/BAD.f1 GGGTCAGGTGCCTCGAGAT 19 BAD NM_03298 S2012BAD.r1 CTGCTCACTCGGCTCAAACTC 21 BAD NM_03298 S5058/BAD.p1 TGGGCCCAGAGCATGTTCCAGATC 24 BAG1 NM_00432 S1386/BAG1.f2 CGTTGTCAGCACTTGGAATACAA 23 BAG1 NM_00432 S1387/BAG1.r2 GTTCAACCTCTTCCTGTGGACTGT 24 BAG1 NM_00432 S4731/BAG1.p2 CCCAATTAACATGACCCGGCAACCAT 26 BBC3 NM_01441 S1584/BBC3.f2 CCTGGAGGGTCCTGTACAAT 20 BBC3 NM_01441 S1585/BBC3.r2 CTAATTGGGCTCCATCTCG 19 BBC3 NM_01441 S4890/BBC3.p2 CATCATGGGACTCCTGCCCTTACC 24 Bcl2 NM_00063 S0043/Bcl2.f2 CAGATGGACCTAGTACCCACTGAGA 25 Bcl2 NM_00063 S0045/Bcl2.r2 CCTATGATTTAAGGGCATTTTTCC 24 Bcl2 NM_00063 S4732/Bcl2.p2 TTCCACGCCGAAGGACAGCGAT 22 CCND1 NM_00175 S0058/CCND1.f3 GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA 21 CCND1 NM_00175 S0060/CCND1.r3 CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC 22 CCND1 NM_00175 S4986/CCND1.p3 AAGGAGACCATCCCCCTGACGGC 23 CD18 NM_00021 S0061/CD18.f2 CGTCAGGACCCACCATGTCT 20 CD18 NM_00021 S0063/CD18.r2 GGTTAATTGGTGACATCCTCAAGA 24 CD18 NM_00021 S4987/CD18.p2 CGCGGCCGAGACATGGCTTG 20 CD31 NM_00044 S1407/CD31.f3 TGTATTTCAAGACCTCTGTGCACTT 25 CD31 NM_00044 S1408/CD31.r3 TTAGCCTGAGGAATTGCTGTGTT 23 CD31 NM_00044 S4939/CD31.p3 TTTATGAACCTGCCCTGCTCCCACA 25 CD3z NM_00073 S0064/CD3z.f1 AGATGAAGTGGAAGGCGCTT 20 CD3z NM_00073 S0066/CD3z.r1 TGCCTCTGTAATCGGCAACTG 21 CD3z NM_00073 S4988/CD3z.p1 CACCGCGGCCATCCTGCA 18 CD9 NM_00176 S0686/CD9.f1 GGGCGTGGAACAGTTTATCT 20 CD9 NM_00176 S06871CD9.r1 CACGGTGAAGGTTTCGAGT 19 CD9 NM_00176 S4792/CD9.p1 AGACATCTGCCCCAAGAAGGACGT 24 CDC20 NM_00125 S4447/CDC20.f1 TGGATTGGAGTTCTGGGAATG 21 CDC20 NM_00125 S4448/CDC20.r1 GCTTGCACTCCACAGGTACACA 22 CDC20 NM_00125 S4449/CDC20.p1 ACTGGCCGTGGCACTGGACAACA 23 CDC25B NM_02187 S1160/CDC25B.f1 AAACGAGCAGTTTGCCATCAG 21 CDC25B NM_02187 S1161/CDC25B.r1 GTTGGTGATGTTCCGAAGCA 20 CDC25B NM_02187 S4842/CDC25B.p1 CCTCACCGGCATAGACTGGAAGCG 24 CEGP1 NM_02097 S1494/CEGP1.f2 TGACAATCAGCACACCTGCAT 21 CEGP1 NM_02097 S1495/CEGP1.r2 TGTGACTACAGCCGTGATCCTTA 23 CEGP1 NM_02097 S4735/CEGP1.p2 CAGGCCCTCTTCCGAGCGGT 20 CGA (CHG NM_00127 S3221/CGA (C.f3 CTGAAGGAGCTCCAAGACCT 20 CGA (CHG NM_00127 S3222/CGA (C.r3 CAAAACCGCTGTGTTTCTTC 20 CGA (CHG NM_00127 S3254/CGA (C.p3 TGCTGATGTGCCCTCTCCTTGG 22 COL1A1 NM_00008 S4531/COL1A1.f1 GTGGCCATCCAGCTGACC 18 COL1A1 NM_00008 S4532/COL1A1.r1 CAGTGGTAGGTGATGTTCTGGGA 23 COL1A1 NM_00008S4533/COL1A1.p1 TCCTGCGCCTGATGTCCACCG 21 COL1A2 NM_00008 S4534/COL1A2.f1 CAGCCAAGAACTGGTATAGGAGCT 24 COL1A2 NM_00008 S4535/COL1A2.r1 AAACTGGCTGCCAGCATTG 19 COL1A2 NM_00008 S4536/COL1A2.p1 TCTCCTAGCCAGACGTGTTTCTTGTCCTTG 30 Cóntigo 510 XM_05894 S2070/Contig.f1 CGACAGTTGCGATGAAAGTTCTAA 24 Cóntigo 510 XM_05894 S2071/Contig.r1 GGCTGCTAGAGACCATGGACAT 22 Cóntigo 510 XM_05894 S5059/Contig.p1 CCTCCTCCTGTTGCTGCCACTAATGCT 27 CRABP1 NM_00437 S5441/CRABP1.f3 AACTTCAAGGTCGGAGAAGG 20 CRABP1 NM_00437 S5442/CRABP1.r3 TGGCTAAACTCCTGCACTTG 20 CRABP1 NM_00437 S5443/CRABP1.p3 CCGTCCACGGTCTCCTCCTCA 21 CRIP2 NM_00131 S5676/CRIP2.f3 GTGCTACGCCACCCTGTT 18 CRIP2 NM_00131 S5677/CRIP2.r3 CAGGGGCTTCTCGTAGATGT 20 CRIP2 NM_00131 S5678/CRIP2.p3 CCGATGTTCACGCCTTTGGGTC 22
CYBA NM_00010 S5300/CYBA.f1 GGTGCCTACTCCATTGTGG 19 CYBA NM_00010 S53011CYBA.r1 GTGGAGCCCTTCTTCCTCTT 20 CYBA NM_00010 S5302/CYBA.p1 TACTCCAGCAGGCACACAAACACG 24 DHPS NM_01340 S4519/DHPS.f3 GGGAGAACGGGATCAATAGGAT 22 DHPS NM_01340 S4520/DHPS.r3 GCATCAGCCAGTCCTCAAACT 21 DHPS NM_01340 S4521/DHPS.p3 CTCATTGGGCACCAGCAGGTTTCC 24 DICER1 NM_17743 S5294/DICER1.f2 TCCAATTCCAGCATCACTGT 20 DICER1 NM_17743 S5295/DICER1.r2 GGCAGTGAAGGCGATAAAGT 20 DICER1 NM_17743 S5296/DICER1.p2 AGAAAAGCTGTTTGTCTCCCCAGCA 25 DR4 NM_00384 S2532/DR4.f2 TGCACAGAGGGTGTGGGTTAC 21 DR4 NM_00384 S2533/DR4.r2 TCTTCATCTGATTTACAAGCTGTACATG 28 DR4 NM_00384 S4981/DR4.p2 CAATGCTTCCAACAATTTGTTTGCTTGCC 29 E2F1 NM_00522 S3063/E2F1.f3 ACTCCCTCTACCCTTGAGCA 20 E2F1 NM_00522 S3064/E2F1.r3 CAGGCCTCAGTTCCTTCAGT 20 E2F1 NM_00522 S4821/E2F1.p3 CAGAAGAACAGCTCAGGGACCCCT 24 ER2 NM_00143 S0109/ER2.f2 TGGTCCATCGCCAGTTATCA 20 ER2 NM_00143 S0111/ER2.r2 TGTTCTAGCGATCTTGCTTCACA 23 ER2 NM_00143 S5001/ER2.p2 ATCTGTATGCGGAACCTCAAAAGAGTCCCT 30 ErbB3 NM_00198 S0112/ErbB3.f1 CGGTTATGTCATGCCAGATACAC 23 ErbB3 NM_00198 S0114/ErbB3.r1 GAACTGAGACCCACTGAAGAAAGG 24 ErbB3 NM_00198 S5002/ErbB3.p1 CCTCAAAGGTACTCCCTCCTCCCGG 25 ERBB4 NM_00523 S1231/ERBB4.f3 TGGCTCTTAATCAGTTTCGTTACCT 25 ERBB4 NM_00523 S1232/ERBB4.r3 CAAGGCATATCGATCCTCATAAAGT 25 ERBB4 NM_00523 S4891/ERBB4.p3 TGTCCCACGAATAATGCGTAAATTCTCCAG 30 ERCC1 NM_00198 S2437/ERCC1.f2 GTCCAGGTGGATGTGAAAGA 20 ERCC1 NM_00198 S2438/ERCC1.r2 CGGCCAGGATACACATCTTA 20 ERCC1 NM_00198 S4920/ERCC1.p2 CAGCAGGCCCTCAAGGAGCTG 21 ERK1 Z11696 S1560/ERK1.f3 ACGGATCACAGTGGAGGAAG 20 ERK1 Z11696 S1561/ERK1.r3 CTCATCCGTCGGGTCATAGT 20 ERK1 Z11696 ; S4882/EkK1.p3 CGCTGGCTCACCCCTACCTG 20 ESRRG NM_00143 S6130/ESRRG.f3 CCAGCACCATTGTTGAAGAT 20 ESRRG NM_00143S6131/ESRRG.r3 AGTCTCTTGGGCATCGAGTT 20 ESRRG NM_00143 S6132/ESRRG.p3 CCCCAGACCAAGTGTGAATACATGCT 26 fasl NM_00063 S0121/fasl.f2 GCACTTTGGGATTCTTTCCATTAT 24 fasl NM_00063 S0123/fasl.r2 GCATGTAAGAAGACCCTCACTGAA 24 fasl NM_00063 S5004/fasl.p2 ACAACATTCTCGGTGCCTGTAACAAAGAA 29 FBXO5 NM_01217 S52017/FBXO5.r1 GGATTGTAGACTGTCACCGAAATTC 25 FBXO5 NM_01217 S2018/FBXO5.f1 GGCTATTCCTCATTTTCTCTACAAAGTG 28 FBXO5 NM_01217 S5061/FBXO5.p1 CCTCCAGGAGGCTACCTTCTTCATGTTCiAC 30 FHIT NM_00201 S2443/FHIT.f1 CCAGTGGAGCGCTTCCAT 18 FHIT NM_00201 S2444/FHIT.r1 CTCTCTGGGTCGTCTGAAACAA 22 FHIT NM_00201 S4921/FHIT.p1 TCGGCCACTTCATCAGGACGCAG 23 FUS NM_00496 S2936/FUS.f1 GGATAATTCAGACAACAACACCATCT 26 FUS NM_00496 S2937/FUS.r1 TGAAGTAATCAGCCACAGACTCAAT 25 FUS NM_00496 S4801/FUS.p1 TCAATTGTAACATTCTCACCCAGGCCTTG 29 FYN NM_00203 S5695/FYN.f3 GAAGCGCAGATCATGAAGAA 20 FYN NM_00203 S5696/FYN.r3 CTCCTCAGACACCACTGCAT 20 FYN NM_00203 S5697/FYN.p3 CTGAAGCACGACAAGCTGGTCCAG 24 G-Catenina NM_00223 S2153/G.Cate.f1 TCAGCAGCAAGGGCATCAT 19 G-Catenina NM_00223 S2154/G-Cate.r1 GGTGGTTTTCTTGAGCGTGTACT 23 G-Catenina NM_00223 S5044/G-Cate.p1 CGCCCGCAGGCCTCATCCT 19 GATA3 NM_00205 S0127/GATA3.f3 CAAAGGAGCTCACTGTGGTGTCT 23 GATA3 NM_00205 S0129/GATA3.r3 GAGTCAGAATGGCTTATTCACAGATG 26 GATA3 NM 00205 S5005/GATA3.p3 TGTTCCAACCACTGAATCTGGACC 24 GBP1 NM_00205 S5698/GBP1.f1 TTGGGAAATATTTGGGCATT 20 GBP1 NM_00205 S5899/GBP1.r1 AGAAGCTAGGGTGGTTGTCC 20 GBP1 NM_00205 S5700/GBP1.p1 TTGGGACATTGTAGACTTGGCCAGAC 26 GBP2 NM_00412 S5707/GBP2.f2 GCATGGGAACCATCAACCA 19 GBP2 NM_00412 S5708/GBP2.r2 TGAGGAGTTTGCCTTGATTCG 21 GBP2 NM_00412 S5709/GBP2.p2 CCATGGACCAACTTCACTATGTGACAGAGC 30 GGPS1 NM_00483 S1590/GGPS1.f1 CTCCGACGTGGCTTTCCA 18 GGPS1 NM_00483 S1591/GGPS1.r1 CGTAATTGGCAGAATTGATGACA 23 GGPS1 NM_00483 S4896/GGPS1.p1 TGGCCCACAGCATCTATGGAATCCC 25 GRB7 NM_00531 S0130/GRB7.f2 CCATCTGCATCCATCTTGTT 20 GRB7 NM_00531 S0132/GRB7.r2 GGCCACCAGGGTATTATCTG 20 GRB7 NM_00531 S4726/GRB7.p2 CTCCCCACCCTTGAGAAGTGCCT 23
Hepsina NM_00215 S2269/Hepsin.f1 Hepsina NM_00215 S2270/Hepsin.r1 Hepsina NM_00215 S2271/Hepsin.p1 HLA-DPB1 NM_00212 S4573/HLA-DP.f1 HLA-DPB1 NM_00212 S4574/HLA-DP.r1 HLA-DPB1 NM_00212 S4575/HLA-DP.p1 ID2 NM_00216 S0151/ID2.f4 ID2 NM_00216 S0153/ID2.r4 ID2 NM_00216 S5009/ID2.p4 IGF1R NM_00087 S1249/IGF1R.f3 IGF1R NM_00087 S1250/IGF1R.r3 IGF1R NM_00087 S4895/IGF1R.p3 IL6 NM_00060 S0760/IL6.f3 IL6 NM_00060 S0761/IL6.r3 IL6 NM_00060 S4800/IL6.p3 ILT-2 NM_00666 S1811/ILT-2.f2 ILT-2 NM_00666S1612/ILT-2.r2 ILT-2 NM_00666 S4904/ILT-2.p2 IRS1 NM_00554 S1943/IRS1.f3 IRS1 NM_00554 S1944/IRS1.r3 IRIS1 NM_00554 S5050/IRS1.p3 KRT18 NM_00022 S17101KRT18.f2 KRT18 NM_00022 S1711/KRT18.r2 KRT18 NM_00022 S4762/KRT18.p2 MAPK14 NM_13901 S5557/MAPK14.f2 MAPK14 NM_13901 S5558/MAPK14.r2 MAPK14 NM_13901 S5559/MAPK14.p2 MCM2 NM_00452 S1602/MCM2.f2 MCM2 NM_00452 S1603/MCM2.r2 MCM2 NM_00452 S4900/MCM2.p2 MCM6 NM_00591 S1704/MCM6.f3 MCM6 NM_00591 S1705/MCM6.r3 MCM6 NM_00591 S4919/MCM6.p3 MCP1 NM_00298 S1955/MCP1.f1 MCP1 NM_00298 S1956/MCP1.r1 MCP1 NM_00298 S5052/MCP1.p1 MGMT NM_00241 S1922/MGMT.f1 MGMT NM_00241 S1923/MGMT.r1 MGMT NM_00241 S5045/MGMT.p1 MMP12 NM_00242 S4381/MMP12.f2 MMP12 NM_00242 S4382/MMP12.r2 MMP12 NM_00242 S4383/MMP12.p2 MSH3 NM_00243 S5940/MSH3.f2 MSH3 NM_00243 S5941/MSH3.r2 MSH3 NM_00243 S5942/MSH3.p2 MTA1 NM_00468 S2369/MTA1.f1 MTA1 NM_00468 S2370/MTA1.r1 MTA1 NM_00468 S4855/MTA1.p1 MUC1 NM_00245 S0782/MUC1.f2 MUC1 NM_00245 S0783/MUC1.r2 MUC1 NM_00245 S4807/MUC1.p2 NPD009 (ANM_02068 S4474/NPD009.f3 NPD009 (ANM_02068 S4475/NPD009.r3 NPD009 (ANM_02068 S4476/NPD009.p3. PR NM_00092S1336/PR.f6 PR NM_00092 S1337/PR.r6 PR NM_00092 S4743/PR.p6 PRKCD NM_00625 S1738/PRKCD.f2 PRKCD NM_00625 S1739/PRKCD.r2 PRKCD NM_00625 S4923/PRKCD.p2 PTPD1 NM_00703 S3069/PTPD1.f2 PTPD1 NM_00703 S3070/PTPD1.r2 PTPD1 NM_00703 S4822/PTPD1.p2 RAB6C NM_03214 S5535/RAB6C.f1 RAB6C NM_03214 S5537/RAB6C.p1 RAB6C NM_03214 S5538/RAB6C.r1
AGGCTGCTGGAGGTCATCTC 20 CTTCCTGCGGCCACAGTCT 19 CCAGAGGCCGTTTCTTGGCCG 21 TCCATGATGGTTCTGCAGGTT 21 TGAGCAGCACCATCAGTAACG 21 CCCCGGACAGTGGCTCTGACG 21 AACGACTGCTACTCCAAGCTCAA 23 GGATTTCCATCTTGCTCACCTT 22 TGCCCAGCATCCCCCAGAACAA 22 GCATGGTAGCCGAAGATTTCA 21 TTTCCGGTAATAGTCTGTCTCATAGATATC 30 CGCGTCATACCAAAATCTCCGATTTTGA 28 CCTGAACCTTCCAAAGATGG 20 ACCAGGCAAGTCTCCTCATT 20 CCAGATTGGAAGCATCCATCTTTTTCA 27 AGCCATCACTCTCAGTGCAG 20 ACTGCAGAGTCAGGGTCTCC 20 CAGGTCCTATCGTGGCCCCTGA 22 CCACAGCTCACCTTCTGTCA 20 CCTCAGTGCCAGTCTCTTCC 20 TCCATCCCAGCTCCAGCCAG 20 AGAGATCGAGGCTCTCAAGG 20 GGCCTTTTACTTCCTCTTCG 20 TGGTTCTTCTTCATGAAGAGCAGCTCC 27 TGAGTGGAAAAGCCTGACCTATG 23 GGACTCCATCTCTTCTTGGTCAA 23 TGAAGTCATCAGCTTTGTGCCACCACC 27 GACTTTTGCCCGCTACCTTTC 21 GCCACTAACTGCTTCAGTATGAAGAG 26 ACAGCTCATTGTTGTCACGCCGGA 24 TGATGGTCCTATGTGTCACATTCA 24 TGGGACAGGAAACACACCAA 20 CAGGTTTCATACCAACACAGGCTTCAGCAC 30 CGCTCAGCCAGATGCAATC 19 GCACTGAGATCTTCCTATTGGTGAA 25 TGCCCCAGTCACCTGCTGTTA 21 GTGAAATGAAACGCACCACA 20 GACCCTGCTCACAACCAGAC 20 CAGCCCTTTGGGGAAGCTGG 20 CCAACGCTTGCCAAATCCT 19 ACGGTAGTGACAGCATCAAAACTC 24 AACCAGCTCTCTGTGACCCCAATT 24 TGATTACCATCATGGCTCAGA 21 CTTGTGAAAATGCCATCCAC 20 TCCCAATTGTCGCTTCTTCTGCAG 24 CCGCCCTCACCTGAAGAGA 19 GGAATAAGTTAGCCGCGCTTCT 22 CCCAGTGTCCGCCAAGGAGCG 21 GGCCAGGATCTGTGGTGGTA 20 CTCCACGTCGTGGACATTGA 20 CTCTGGCCTTCCGAGAAGGTACC 23 GGCTGTGGCTGAGGCTGTAG 20 GGAGCATTCGAGGTCAAATCA 21 TTCCCAGAGTGTCTCACCTCCAGCAGAG 28 GCATCAGGCTGTCATTATGG 20 AGTAGTTGTGCTGCCCTTCC 20 TGTCCTTACCTGTGGGAGCTGTAAGGTC 28 CTGACACTTGCCGCAGAGAA 20 AGGTGGTCCTTGGTCTGGAA 20 CCCTTTCTCACCCACCTCATCTGCAC 26 CGCTTGCCTAACTCATACTTTCC 23 CCATTCAGACTGCGCCACTT 20 TCCACGCAGCGTGGCACTG 19 GCGACAGCTCCTCTAGTTCCA 21 TTCCCGAAGTCTCCGCCCG 19 GGAACACCAGCTTGAATTTCCT 22
RALBP1 NM_00678 S5853/RALBP1.f1 GGTGTCAGATATAAATGTGCAAATGC 26 RALBP1 NM_0067855854/RALBP1.r1 TTCGATATTGCCAGCAGCTATAAA 24 RALBP1 NM_00678 S5855/RALBP1.p1 TGCTGTCCTGTCGGTCTCAGTACGTTCA 28 RAP1GDS NM_02115S5306/RAP1GD.f2 TGTGGATGCTGGATTGATTT 20 RAP1GDS NM_02115 S5307/RAP1GD.r2 AAGCAGCACTTCCTGGTCTT 20 RAP1GDS NM_02115 S5308/RAP1GD.p2 CCACTGGTGCAGCTGCTAAATAGCA 25 RASSF1 NM_00718 S2393/RASSF1.f3 AGTGGGAGACACCTGACCTT 20 RASSF1 NM_00718 S2394/RASSF1.r3 TGATCTGGGCATTGTACTCC 20 RASSF1 NM_00718 S4909/RASSF1.p3 TTGATCTTCTGCTCAATCTCAGCTTGAGA 29 rhoC NM_00516 S2162/rhoC.f1 CCCGTTCGGTCTGAGGAA 18 rhoC NM_00516 S2163/rhoC.r1 GAGCACTCAAGGTAGCCAAAGG 22 rhoC NM_00516 S5042/rhoC.p1 TCCGGTTCGCCATGTCCCG 19 RUNX1 NM_00175 S4588/RUNX1.f2 AACAGAGACATTGCCAACCA 20 RUNX1 NM_00175 S4589/RUNX1.r2 GTGATTTGCCCAGGAAGTTT 20 RUNX1 NM_00175 S4590/RUNX1.p2 TTGGATCTGCTTGCTGTCCAAACC 24 SEMA3F NM_00418 S2857/SEMA3F.f3 CGCGAGCCCCTCATTATACA 20 SEMA3F NM_00418 S2858/SEMA3F.r3 CACTCGCCGTTGACATCCT 19 SEMA3F NM_00418 S4972/SEMA3F.p3 CTCCCCACAGCGCATCGAGGAA 22 SGCB NM_00023 S5752/SGCB.f1 CAGTGGAGACCAGTTGGGTAGTG 23 SGCB NM_00023 S5T53/SGCB.r1 CCTTGAAGAGCGTCCCATCA 20 SGCB NM_00023 S5754/SGCB.p1 CACACATGCAGAGCTTGTAGCGTACCCA 28 STAT1 NM_00731 S1542/STAT1.f3 GGGCTCAGCTTTCAGAAGTG 20 STAT1 NM_00731 S1543/STAT1.r3 ACATGTTCAGCTGGTCCACA 20 STAT1 NM_00731 S4878/STAT1.p3 TGGCAGTTTTCTTCTGTCACCAAAA 25 STAT3 NM_00315 S1545/STAT3.f1 TCACATGCCACTTTGGTGTT 20 STAT3 NM_00315 S1546/STAT3.r1 CTTGCAGGAAGCGGCTATAC 20 STAT3 NM_00315 S4881/STAT3.p1 TCCTGGGAGAGATTGACCAGCA 22 TBP NM_00319 S0262/TBP.f1 GCCCGAAACGCCGAATATA 19 TBP NM_00319 S0264/TBP.r1 CGTGGCTCTCTTATCCTCATGAT 23 TBP NM 00319 S4751/TBP.p1 TACCGCAGCAAACCGCTTGGG 21 TK1 NM_00325 S0866/TK1.f2 GCCGGGAAGACCGTAATTGT 20 TK1 NM_00325 S0927/TK1.r2 CAGCGGCACCAGGTTCAG 18 TK1 NM_00325 S4798/TK1.p2 CAAATGGCTTCCTCTGGAAGGTCCCA 26 TP53BP1 NM_00565 S1747/TP53BP.f2 TGCTGTTGCTGAGTCTGTTG 20 TP53BP1 NM_00565 S1748/TP53BP.r2 CTTGCCTGGCTTCACAGATA 20 TP53BP1 NM_00565 S4924/TP53BP.p2 CCAGTCCCCAGAAGACCATGTCTG 24 TUBB NM 00106 S826/TUBB.f3 TGTGGTGAGGAAGGAGTCAG 20 TUBB NM_00106 S5827/TUBB.r3 CCCAGAGAGTGGGTCAGC 18 TUBB NM_00106 S5828/TUBB.p3 CTGTGACTGTCTCCAGGGCTTCCA 24 VCAM1 NM_00107 S3505/VCAM1.f1 TGGCTTCAGGAGCTGAATACC 21 VCAM1 NM_00107 S3506/VCAM1.r1 TGCTGTCGTGATGAGAAAATAGTG 24 VCAM1 NM_00107 S3507/VCAM1.p1 CAGGCACACACAGGTGGGACACAAAT 26 Wnt-5a NM_00339 S6183/Wnt-5a.f1 GTATCAGGACCACATGCAGTACATC 25 Wnt-5a NM_00339 S6184/Wnt-5a.r1 TGTCGGAATTGATACTGGCATT 22 Wnt.5a NM_00339 S6185/Wnt-5a.p1 TTGATGCCTGTCTTCGCGCCTTCT 24 ZNF38 NM_14591 S5593/ZNF38.f3 TTTCCAAACATCAGCGAGTC 20 ZNF38 NM_14591 S5594/ZNF38.r3 AACAGGAGCGCTTGAAAGTT 20 ZNF38 NM_14591 S5595/ZNF38.p3 ACGGTGCTTCTCCCTCTCCAGTG 23
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GENOMIC HEALTH, INC.
BAKER, JOFFRE B.
5 SHAK, STEVEN
GIANNI, LUCA
<120> MARCADORES DE EXPRESIÓN DE GENES PARA PREDECIR LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA
<130> H64514PCEPT1
<140> Divisional de 05735478.9
<141> 15
<160> 340
<170> FastSEQ para windows versión 4.0
<210> 1
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 1
cgttccgatc ctctatactg cat 23
<210> 2
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 2
aggtccctgt tggccttata gg 22
<210> 3
<211> 25
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 3
atgcctacag caccctgatg tcgca 25
<210> 4
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 4
tgcagactgt accatgctga 20
<210> 5 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 5 ggccagcacc ataatcctat 20
<210> 6
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 6 ctgcacacgg ttctaggctc cg 22
<210> 7
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 7 ctgcatgtga ttgaataaga aacaaga 27
<210> 8
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 8 tgtggacctg atccctgtac ac 22
<210> 9
<211> 23
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 9 tgaccacacc aaagcctccc tgg 23
<210> 10
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 10 acgaattgtc ggtgaggtct 20
<210> 11 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 11 gtccatgctg aaatcattgg 20
<210> 12
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 12 caggatacca cagtcctgga gaccc 25
<210> 13
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 13 cgcttctatg gcgctgagat 20
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 14 tcccggtaca ccacgttctt 20
<210> 15
<211> 24
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 15 cagccctgga ctacctgcac tcgg 24
<210> 16
<211> 19 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 16 tcctgccacc cttcaaacc 19
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 17 ggcggtaaat tcatcatcga a 21
<210> 18
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 18 caggtcacgt ccgaggtcga caca 24
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 19 ggacagcagg aatgtgtttc 20
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 20 acccactcga tttgtttctg 20
<210> 21
<211> 22
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 21 cattggctcc ccgtgacctg ta 22
<210> 22
<211> 19 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 22 gggtcaggtg cctcgagat 19
<210> 23 65 <211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 23 ctgctcactc ggctcaaact c 21
<210> 24
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 24 tgggcccaga gcatgttcca gatc 24
<210> 25
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 25 cgttgtcagc acttggaata caa 23
<210> 26
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 26 gttcaacctc ttcctgtgga ctgt 24
<210> 27
<211> 26
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 27 cccaattaac atgacccggc aaccat 26
<210> 28
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 28 cctggagggt cctgtacaat 20
<210> 29 65 <211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<210> 30
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 30 catcatggga ctcctgccct tacc 24
<210> 31
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 31 cagatggacc tagtacccac tgaga 25
<210> 32
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 32 cctatgattt aagggcattt ttcc 24
<210> 33
<211> 22
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 33 ttccacgccg aaggacagcg at 22
<210> 34
<211> 21 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 34 gcatgttcgt ggcctctaag a 21
<210> 35 65 <211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 35 cggtgtagat gcacagcttc tc 22
<210> 36
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 36 aaggagacca tccccctgac ggc 23
<210> 37
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 37 cgtcaggacc caccatgtct 20
<210> 38
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 38 ggttaattgg tgacatcctc aaga 24
<210> 39
<211> 20
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 39 cgcggccgag acatggcttg 20
<210> 40
<211> 25 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 40 tgtatttcaa gacctctgtg cactt 25
<210> 41 65 <211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 41 ttagcctgag gaattgctgt gtt 23
<210> 42
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 42 tttatgaacc tgccctgctc ccaca 25
<210> 43
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 43 agatgaagtg gaaggcgctt 20
<210> 44
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 44 tgcctctgta atcggcaact g 21
<210> 45
<211> 18
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 45 caccgcggcc atcctgca 18
<210> 46
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 46 gggcgtggaa cagtttatct 20
<210> 47 65 <211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 47 cacggtgaag gtttcgagt 19
<210> 48
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 48 agacatctgc cccaagaagg acgt 24
<210> 49
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 49 tggattggag ttctgggaat g 21
<210> 50
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 50 gcttgcactc cacaggtaca ca 22
<210> 51
<211> 23
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 51 actggccgtg gcactggaca aca 23
<210> 52
<211> 21 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 52 aaacgagcag tttgccatca g 21
<210> 53 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 53 gttggtgatg ttccgaagca 20
<210> 54
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 54 cctcaccggc atagactgga agcg 24
<210> 55
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 55 tgacaatcag cacacctgca t 21
<210> 56
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 56 tgtgactaca gccgtgatcc tta 23
<210> 57
<211> 20
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 57 caggccctct tccgagcggt 20
<210> 58
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 58 ctgaaggagc tccaagacct 20
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 59 caaaaccgct gtgtttcttc 20
<210> 60
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 60 tgctgatgtg ccctctcctt gg 22
<210> 61
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 61 gtggccatcc agctgacc 18
<210> 62
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 62 cagtggtagg tgatgttctg gga 23
<210> 63
<211> 21
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 63 tcctgcgcct gatgtccacc g 21
<210> 64
<211> 24 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 64 cagccaagaa ctggtatagg agct 24
<210> 65 65 <211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<210> 66
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 66 tctcctagcc agacgtgttt cttgtccttg 30
<210> 67
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 67 cgacagttgc gatgaaagtt ctaa 24
<210> 68
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 68 ggctgctaga gaccatggac at 22
<210> 69
<211> 27
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 69 cctcctcctg ttgctgccac taatgct 27
<210> 70
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 70 aacttcaagg tcggagaagg 20
<210> 71 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 71 tggctaaact cctgcacttg 20
<210> 72
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 72 ccgtccacgg tctcctcctc a 21
<210> 73
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 73 gtgctacgcc accctgtt 18
<210> 74
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 74 caggggcttc tcgtagatgt 20
<210> 75
<211> 22
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 75 ccgatgttca cgcctttggg tc 22
<210> 76
<211> 19 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 76 ggtgcctact ccattgtgg 19
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<210> 78
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 78 tactccagca ggcacacaaa cacg 24
<210> 79
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 79 gggagaacgg gatcaatagg at 22
<210> 80
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 80 gcatcagcca gtcctcaaac t 21
<210> 81
<211> 24
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 81 ctcattgggc accagcaggt ttcc 24
<210> 82
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 82 tccaattcca gcatcactgt 20
<210> 83 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 83 ggcagtgaag gcgataaagt 20
<210> 84
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 84 agaaaagctg tttgtctccc cagca 25
<210> 85
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 85 tgcacagagg gtgtgggtta c 21
<210> 86
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 86 tcttcatctg atttacaagc tgtacatg 28
<210> 87
<211> 29
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 87 caatgcttcc aacaatttgt ttgcttgcc 29
<210> 88
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 88 actccctcta cccttgagca 20
<210> 89 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
5
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<210> 90
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 90 cagaagaaca gctcagggac ccct 24
<210> 91
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 91 tggtccatcg ccagttatca 20
<210> 92
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 92 tgttctagcg atcttgcttc aca 23
<210> 93
<211> 30
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 93 atctgtatgc ggaacctcaa aagagtccct 30
<210> 94
<211> 23 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 94 cggttatgtc atgccagata cac 23
<210> 95 65 <211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 95 gaactgagac ccactgaaga aagg 24
<210> 96
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 96 cctcaaaggt actccctcct cccgg 25
<210> 97
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 97 tggctcttaa tcagtttcgt tacct 25
<210> 98
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 98 caaggcatat cgatcctcat aaagt 25
<210> 99
<211> 30
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 99 tgtcccacga ataatgcgta aattctccag 30
<210> 100
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 100 gtccaggtgg atgtgaaaga 20
<210> 101 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 101 cggccaggat acacatctta 20
<210> 102
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 102 cagcaggccc tcaaggagct g 21
<210> 103
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 103 acggatcaca gtggaggaag 20
<210> 104
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 104 ctcatccgtc gggtcatagt 20
<210> 105
<211> 20
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 105 cgctggctca cccctacctg 20
<210> 106
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 106 ccagcaccat tgttgaagat 20
<210> 107 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 107 agtctcttgg gcatcgagtt 20
<210> 108
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 108 ccccagacca agtgtgaata catgct 26
<210> 109
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 109 gcactttggg attctttcca ttat 24
<210> 110
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 110 gcatgtaaga agaccctcac tgaa 24
<210> 111
<211> 29
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 111 acaacattct cggtgcctgt aacaaagaa 29
<210> 112
<211> 25 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 112 ggattgtaga ctgtcaccga aattc 25
<210> 113 65 <211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético 5
<400> 113 ggctattcct cattttctct acaaagtg 28
<210> 114
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 114 cctccaggag gctaccttct tcatgttcac 30
<210> 115
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 115 ccagtggagc gcttccat 18
<210> 116
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 116 ctctctgggt cgtctgaaac aa 22
<210> 117
<211> 23
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 117 tcggccactt catcaggacg cag 23
<210> 118
<211> 26 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 118 ggataattca gacaacaaca ccatct 26
<210> 119 65 <211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 119 tgaagtaatc agccacagac tcaat 25
<210> 120
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 120 tcaattgtaa cattctcacc caggccttg 29
<210> 121
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 121 gaagcgcaga tcatgaagaa 20
<210> 122
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 122 ctcctcagac accactgcat 20
<210> 123
<211> 24
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 123 ctgaagcacg acaagctggt ccag 24
<210> 124
<211> 19 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 124 tcagcagcaa gggcatcat 19
<210> 125 65 <211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 125 ggtggttttc ttgagcgtgt act 23
<210> 126
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 126 cgcccgcagg cctcatcct 19
<210> 127
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 127 caaaggagct cactgtggtg tct 23
<210> 128
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 128 gagtcagaat ggcttattca cagatg 26
<210> 129
<211> 24
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 129 tgttccaacc actgaatctg gacc 24
<210> 130
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 130 ttgggaaata tttgggcatt 20
<210> 131 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
5
<400> 131 agaagctagg gtggttgtcc 20
<210> 132
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 132 ttgggacatt gtagacttgg ccagac 26
<210> 133
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 133 gcatgggaac catcaacca 19
<210> 134
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 134 tgaggagttt gccttgattc g 21
<210> 135
<211> 30
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 135 ccatggacca acttcactat gtgacagagc 30
<210> 136
<211> 18 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 136 ctccgacgtg gctttcca 18
<210> 137 65 <211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 137 cgtaattggc agaattgatg aca 23
<210> 138
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 138 tggcccacag catctatgga atccc 25
<210> 139
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 139 ccatctgcat ccatcttgtt 20
<210> 140
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 140 ggccaccagg gtattatctg 20
<210> 141
<211> 23
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 141 ctccccaccc ttgagaagtg cct 23
<210> 142
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 142 aggctgctgg aggtcatctc 20
<210> 143 65 <211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 143 cttcctgcgg ccacagtct 19
<210> 144
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 144 ccagaggccg tttcttggcc g 21
<210> 145
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 145 tccatgatgg ttctgcaggt t 21
<210> 146
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 146 tgagcagcac catcagtaac g 21
<210> 147
<211> 21
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 147 ccccggacag tggctctgac g 21
<210> 148
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<400> 150 tgcccagcat cccccagaac aa 22
<210> 151
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 152 tttccggtaa tagtctgtct catagatatc 30
<210> 153
<211> 28
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 153 cgcgtcatac caaaatctcc gattttga 28
<210> 154
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<211> 22
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<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<211> 20
<212> ADN
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<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<211> 27
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<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 166 tgagtggaaa agcctgacct atg 23
<210> 167 65 <211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 167 ggactccatc tcttcttggt caa 23
<210> 168
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 168 tgaagtcatc agctttgtgc caccacc 27
<210> 169
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<210> 170
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 170 gccactaact gcttcagtat gaagag 26
<210> 171
<211> 24
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
5
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<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 174 caggtttcat accaacacag gcttcagcac 30
<210> 175
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 175 cgctcagcca gatgcaatc 19
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<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 176 gcactgagat cttcctattg gtgaa 25
<210> 177
<211> 21
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 177 tgccccagtc acctgctgtt a 21
<210> 178
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 180 cagccctttg gggaagctgg 20
<210> 181
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 181 ccaacgcttg ccaaatcct 19
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<210> 183
<211> 24
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<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 184 tgattaccat catggctcag a 21
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 185 cttgtgaaaa tgccatccac 20
<210> 186
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 186 tcccaattgt cgcttcttct gcag 24
<210> 187
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Secuencia directa oligonucleotídica sintética
<400> 187 ccgccctcac ctgaagaga 19
<210> 188
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Secuencia inversa oligonucleotídica sintética
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<210> 189
<211> 21
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 189 cccagtgtcc gccaaggagc g 21
<210> 190
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<210> 191 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
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<210> 192
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 192 ctctggcctt ccgagaaggt acc 23
<210> 193
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 193 ggctgtggct gaggctgtag 20
<210> 194
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 194 ggagcattcg aggtcaaatc a 21
<210> 195
<211> 28
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 195 ttcccagagt gtctcacctc cagcagag 28
<210> 196
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 196 gcatcaggct gtcattatgg 20
<210> 197 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 197 agtagttgtg ctgcccttcc 20
<210> 198
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 198 tgtccttacc tgtgggagct gtaaggtc
<210> 199
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 199 ctgacacttg ccgcagagaa 20
<210> 200
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 200 aggtggtcct tggtctggaa 20
<210> 201
<211> 26
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 201 ccctttctca cccacctcat ctgcac 26
<210> 202
<211> 23 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 202 cgcttgccta actcatactt tcc 23
<210> 203 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 203 ccattcagac tgcgccactt 20
<210> 204
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 204 tccacgcagc gtggcactg 19
<210> 205
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 205 gcgacagctc ctctagttcc a 21
<210> 206
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 206 ttcccgaagt ctccgcccg 19
<210> 207
<211> 22
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 207 ggaacaccag cttgaatttc ct 22
<210> 208
<211> 26 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 208 ggtgtcagat ataaatgtgc aaatgc 26
<210> 209 65 <211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético 5
<400> 209 ttcgatattg ccagcagcta taaa 24
<210> 210
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 210 tgttgtcctg tcggtctcag tacgttca 28
<210> 211
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 211 tgtggatgct ggattgattt 20
<210> 212
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 212 aagcagcact tcctggtctt 20
<210> 213
<211> 25
<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 213 ccactggtgc agctgctaaa tagca 25
<210> 214
<211> 20 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 214 agtgggagac acctgacctt 20
<210> 215 65 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 215 tgatctgggc attgtactcc 20
<210> 216
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 216 ttgatcttct gctcaatctc agcttgaga 29
<210> 217
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 217 cccgttcggt ctgaggaa 18
<210> 218
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 218 gagcactcaa ggtagccaaa gg 22
<210> 219
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 219 tccggttcgc catgtcccg 19
<210> 220
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 220 aacagagaca ttgccaacca 20
<210> 221
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 221 gtgatttgcc caggaagttt 20
<210> 222
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 222 ttggatctgc ttgctgtcca aacc 24
<210> 223
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 223 cgcgagcccc tcattataca 20
<210> 224
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 224 cactcgccgt tgacatcct 19
<210> 225
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 225 ctccccacag cgcatcgagg aa 22
<210> 226
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 226 cagtggagac cagttgggta gtg 23
<210> 227
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 227 ccttgaagag cgtcccatca 20
<210> 228
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 228 cacacatgca gagcttgtag cgtaccca 28
<210> 229
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 229 gggctcagct ttcagaagtg 20
<210> 230
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 230 acatgttcag ctggtccaca 20
<210> 231
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 231 tggcagtttt cttctgtcac caaaa 25
<210> 232
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 232 tcacatgcca ctttggtgtt 20
<210> 233
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 233 cttgcaggaa gcggctatac 20
<210> 234
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 234 tcctgggaga gattgaccag ca 22
<210> 235
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
<400> 235 gcccgaaacg ccgaatata 19
<210> 236
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
<400> 236 cgtggctctc ttatcctcat gat 23
<210> 237
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
<400> 237 taccgcagca aaccgcttgg g 21
<210> 238
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<210> 243
<211> 24
<212> ADN
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<223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<210> 244
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<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
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<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético
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<210> 254
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<212> ADN
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<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda oligonucleotídica sintética
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<212> ADN
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<223> Amplicón
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
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<223> Amplicón
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<223> Amplicón
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<212> ADN
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<212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
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<223> Amplicón
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<212> ADN
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<211> 86
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<213> Secuencia artificial
<220>
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<212> ADN
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
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<223> Amplicón
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<212> ADN
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> Amplicón
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<220>
<223> Amplicón
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<210> 312
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<210> 313
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<213> Secuencia artificial
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<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<223> Amplicón
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<210> 321
<211> 85
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 322
<210> 323
<211> 81
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 323
<210> 324
<211> 78
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 324
<210> 325
<211> 84
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 326
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<212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 327
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<211> 68
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 328
<210> 329
<211> 69
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 329
<210> 330
<211> 86
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 330
<210> 331
<211> 77
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 331
<210> 332
<211> 81
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 332
<210> 333
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 333
<210> 334
<211> 65
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 334
<210> 335
<211> 84
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 335
<210> 336
<211> 74
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 336
<210> 337
<211> 66
<212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 337
<210> 338
<211> 89
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 338
<210> 339
<211> 75
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 339
<210> 340
<211> 65
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Amplicón
<400> 340
Claims (14)
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Claims (14)
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- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un método para determinar si un nivel de un transcrito de ARN está asociado con una respuesta beneficiosa a un tratamiento de quimioterapia que comprende una antraciclina y un taxano, comprendiendo el método:
determinar el nivel de un transcrito de ARN en una muestra biológica que comprende células de cáncer de mama obtenidas antes de la quimioterapia de un sujeto humano al que se le ha diagnosticado cáncer de mama, donde el transcrito de ARN es el transcrito de ARN de BAG1; normalizar el nivel del transcrito de ARN de BAG1 frente a un nivel de al menos un ARN de referencia para obtener un nivel de expresión normalizado de BAG1; comparar el nivel de expresión normalizado de BAG1 del sujeto con un nivel de expresión normalizado de BAG1 en muestras de pacientes con cáncer de mama de referencia obtenidas antes de la quimioterapia a partir de pacientes con cáncer de mama tratados con quimioterapia que comprende una antraciclina y un taxano; y determinar que el nivel de expresión normalizado de BAG1 del sujeto está asociado con una menor probabilidad de respuesta beneficiosa al tratamiento de quimioterapia que comprende una antraciclina y un taxano si el nivel de expresión normalizado de BAG1 del sujeto está aumentado en comparación con el nivel de expresión normalizado de BAG1 en las muestras de pacientes con cáncer de mama de referencia obtenidas a partir de pacientes que presentaron una respuesta beneficiosa al tratamiento de quimioterapia que comprende una antraciclina y un taxano. -
- 2.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha quimioterapia es quimioterapia adyuvante o quimioterapia neoadyuvante.
-
- 3.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho taxano es docetaxel o paclitaxel.
-
- 4.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha antraciclina es doxorrubicina.
-
- 5.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho cáncer de mama es un cáncer de mama invasivo.
-
- 6.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho cáncer de mama es un cáncer de mama en estadio II o en estadio III.
-
- 7.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha quimioterapia comprende además la administración de un agente anticanceroso adicional.
-
- 8.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho agente anticanceroso adicional es un inhibidor de la topoisomerasa.
-
- 9.
- Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha muestra biológica está fijada, incluida en parafina, o es reciente o congelada.
-
- 10.
- Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho ARN se aísla a partir de un espécimen de tejido de cáncer de mama incluido en parafina y fijado de dicho sujeto.
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- 11.
- Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la respuesta beneficiosa es una respuesta clínica completa.
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- 12.
- Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la respuesta beneficiosa es una respuesta patológica completa.
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- 13.
- Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el nivel de expresión de dicho transcrito de ARN se determina por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).
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- 14.
- Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además determinar el nivel de un trascrito de ARN de GRB7, HER2, EstR1, PR, Bcl2, CEGP1, SURV, Ki67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, CD68, GSTM1, y BAG1, o sus productos de expresión.