ES2812105T3 - Algoritmo y evaluación del perfil de expresión génica para determinar el pronóstico del cáncer de próstata - Google Patents

Abstract

Un método para predecir una probabilidad de un resultado clínico seleccionado de recurrencia del cáncer, aumento de grado o estadificación del cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado y/o enfermedad de alto grado no confinada a órganos para un paciente con cáncer de próstata, que comprende: determinar un nivel de transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, normalizados con respecto a la media de uno o más genes de referencia en una muestra biológica que contiene células cancerosas obtenidas de dicho paciente, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, comprenden BGN y COL1A1; calcular una puntuación de recurrencia para el paciente mediante el uso de cualquiera de los algoritmos RS0, RS1, RS2, RS3, RS4, RS17, RS18, RS19, RS20, RS21, RS22, RS23, RS24, RS25, RS26 o RS27 mostrados en la Tabla 4; y predecir la probabilidad de recurrencia del cáncer, aumento de grado o estadificación del cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado, y/o enfermedad de alto grado no confinada a órganos para el paciente en base a la puntuación de recurrencia.

Description

DESCRIPCIÓN

Algoritmo y evaluación del perfil de expresión génica para determinar el pronóstico del cáncer de próstata Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de las Solicitudes Provisionales de los EE.UU. núms. 61/593 106, presentada el 31 de enero de 2012; 61/672679, presentada el 17 de julio de 2012; y 61/713 734, presentada el 15 de octubre de 2012.

Campo técnico

La presente descripción se refiere a ensayos de diagnóstico molecular que proporcionan información relacionada con los perfiles de expresión génica para determinar información pronóstica para pacientes con cáncer. Específicamente, la presente descripción proporciona un algoritmo que comprende genes, o genes coexpresados, cuyos niveles de expresión pueden usarse para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer de próstata experimente un resultado clínico positivo o negativo.

Introducción

La introducción de la detección del antígeno prostático específico (PSA) en 1987 condujo al diagnóstico y al tratamiento agresivo de muchos casos de cáncer de próstata indolente que nunca se habrían convertido en clínicamente significativos o causantes de la muerte. La razón de esto es que la historia natural del cáncer de próstata es inusual entre los tumores malignos, ya que la mayoría de los casos son indolentes e incluso si no se tratan no progresarían durante el curso de la vida de un hombre para causar sufrimiento o muerte. Mientras que aproximadamente la mitad de los hombres desarrollan cáncer de próstata invasivo durante sus vidas (como se detectó por los estudios de autopsia) (B. Halpert y otros, Cáncer 16: 737-742 (1963); B. Holund, Scand J Urol Nephrol 14: 29-35 (1980); S. Lundberg y otros, Scand J Urol Nephrol 4: 93-97 (1970); M. Yin y otros, J Urol 179: 892-895 (2008)), solo el 17 % será diagnosticado con cáncer de próstata y solo el 3 % morirá como resultado del cáncer de próstata. Cancer Facts and Figures. Atlanta, GA: American Cancer Society (2010); JE Damber y otros, Lancet 371: 1710-1721 (2008).

Sin embargo, actualmente, más del 90 % de los hombres a los que se les diagnostica cáncer de próstata, incluso cáncer de próstata de bajo riesgo, se tratan ya sea con prostatectomía radical inmediata o con radioterapia definitiva. MR Cooperberg y otros, J Clin Oncol 28: 1117-1123 (2010); MR Cooperberg y otros, J Clin Oncol 23: 8146-8151 (2005). La cirugía y la radioterapia reducen el riesgo de recurrencia y muerte por cáncer de próstata (AV D'Amico y otros, Jama 280: 969-974 (1998); M Han y otros, Urol Clin North Am 28: 555-565 (2001); w U Shipley y otros, Jama 281: 1598-1604 (1999); AJ Stephenson y otros, J Clin Oncol 27: 4300-4305 (2009)), sin embargo, los estimados del número de hombres que deben tratarse para prevenir una muerte por cáncer de próstata varía de 12 a 100. A Bill-Axelson y otros, J Natl Cancer Inst 100: 1144-1154 (2008); J Hugosson y otros, Lancet Oncol 11: 725-732 (2010); LH Klotz y otros, Can J Urol 13 Suppl 1: 48-55 (2006); S Loeb y otros, J Clin Oncol 29: 464-467 (2011); FH Schroder y otros, N Engl J Med 360: 1320-1328 (2009). Este tratamiento excesivo del cáncer de próstata tiene un costo de dinero y toxicidad. Por ejemplo, la mayoría de los hombres que se someten a prostatectomía radical sufren incontinencia e impotencia como resultado del procedimiento (MS Litwin y otros, Cancer 109: 2239-2247 (2007); MG Sanda y otros, N Engl J Med 353: 1250-1261 (2008)), y hasta el 25 % de los hombres lamentan su elección de tratamiento para el cáncer de próstata. FR Schroeck y otros, Eur Urol 54: 785-793 (2008).

Una de las razones para el tratamiento excesivo del cáncer de próstata es la falta de herramientas de pronóstico adecuadas para distinguir a los hombres que necesitan una terapia definitiva inmediata de aquellos que son candidatos apropiados para diferir la terapia inmediata y en su lugar someterse a una vigilancia activa. Por ejemplo, de los hombres que parecen tener una enfermedad de bajo riesgo en base a los resultados de la estadificación clínica, el PSA previo al tratamiento, y la puntuación de Gleason de la biopsia, y que se manejaron con vigilancia activa en los protocolos, el 30-40 % experimenta progresión de la enfermedad (diagnosticada por aumento del PSA, un aumento en la puntuación de Gleason en la biopsia repetida, o la progresión clínica) durante los primeros años de seguimiento, y algunos de ellos pueden haber perdido la oportunidad de una terapia curativa. HB Carter y otros, J Urol 178: 2359­ 2364 y discusión 2364-2355 (2007); MA Dall'Era y otros, Cancer 112: 2664-2670 (2008); L Klotz y otros, J Clin Oncol 28: 126-131 (2010). Además, de los hombres que parecen ser candidatos para la vigilancia activa, pero que de todos modos se someten a una prostatectomía inmediata, se encuentra que el 30-40 % en la cirugía tiene una enfermedad de mayor riesgo de lo esperado como se define por tener un alto grado (puntuación de Gleason de 3+4 o mayor) o enfermedad no confinada a órganos (extensión extracapsular (ECE) o afectación de vesículas seminales (SV1)). SL y otros, J Urol 181: 1628-1633 y discusión 1633-1624 (2009); CR Griffin y otros, J Urol 178: 860-863 (2007): PW Mufarrij y otros, J Urol 181: 607-608 (2009).

Los estimados del riesgo de recurrencia y las decisiones de tratamiento en el cáncer de próstata se basan actualmente principalmente en los niveles de PSA y/o el estadio clínico del tumor. Aunque se ha demostrado que el estadio clínico del tumor tiene una asociación significativa con el resultado, suficiente para incluirse en los informes de patología, la Declaración de Consenso del Colegio de Patólogos Americanos señaló que existen variaciones en el enfoque para la adquisición, interpretación, informe, y análisis de esta información. C. Compton, y otros, Arch Pathol Lab Med 124:979-992 (2000). Como una consecuencia, los métodos de estadificación patológica existentes se han criticados por carecer de reproducibilidad y, por lo tanto, pueden proporcionar estimados imprecisos del riesgo individual del paciente.

Resumen

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier tema descrito en la presente descripción que esté fuera del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención. Esta solicitud describe ensayos moleculares que implican la medición del nivel(es) de expresión de uno o más genes o subconjuntos de genes a partir de una muestra biológica que se obtiene de un paciente con cáncer de próstata, y el análisis de los niveles de expresión medidos para proporcionar información sobre la probabilidad de un resultado clínico. Por ejemplo, la probabilidad de un resultado clínico puede describirse en términos de una puntuación cuantitativa en base al intervalo clínico o bioquímico libre de recurrencia, la supervivencia general, la supervivencia específica del cáncer de próstata, el aumento de estadificación/grado de la biopsia para la prostatectomía radical, o la presencia de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos en la prostatectomía radical.

Además, esta solicitud describe ensayos moleculares que implican la medición del nivel(es) de expresión de uno o más genes o subconjuntos de genes a partir de una muestra biológica que se obtiene para identificar una clasificación de riesgo para un paciente con cáncer de próstata. Por ejemplo, los pacientes pueden estratificarse mediante el uso del nivel(es) de expresión de uno o más genes, positivamente o negativamente, con resultados clínicos positivos de cáncer de próstata, o con un factor pronóstico. En una modalidad ilustrativa, el factor pronóstico es la puntuación de Gleason.

En la presente descripción se describe un método para predecir la probabilidad de un resultado clínico para un paciente con cáncer de próstata que comprende la determinación de un nivel de uno o más transcritos de ARN, o un producto de expresión de estos, en una muestra biológica que contiene células tumorales que se obtienen del paciente, en donde el transcrito de ARN, o su producto de expresión, se selecciona de los 81 genes que se muestran en la Figura 1 y que se enumeran en las Tablas 1A y 1B. El método comprende asignar uno o más transcritos de ARN, o un producto de expresión de estos, a uno o más grupos de genes seleccionados de un grupo de genes de organización celular, grupo de genes de epitelios basales, un grupo de genes de respuesta al estrés, un grupo de genes de andrógenos, un grupo de genes de respuesta estromal, y un grupo de genes de proliferación. El método comprende, además, calcular una puntuación cuantitativa para el paciente ponderando el nivel de uno o más transcritos de ARN o un producto de expresión de estos, por su contribución a un resultado clínico y mediante la predicción de la probabilidad de un resultado clínico para el paciente en base a la puntuación cuantitativa. En una modalidad de la invención, un aumento en la puntuación cuantitativa se correlaciona con una mayor probabilidad de un resultado clínico negativo.

FLNC, ITGA7, C0L6A1, PPP1R12A, GSTM1, GSTM2, PAGE4, PPAP2B, SRD5A2, PRKCA, IGFBP6, GPM6B, 0LFML3, HLF, CYP3A5, KRT15, KRT5, LAMB3, SDC1, DUSP1, EGFR1, FOS, JUN, EGR3, GADD45B, ZFP36, FAM13C, KLK2, ASPN, SFRP4, BGN, THBS2, INHBA, COL1A1, COL3A1, COL1A2, SPARC, COL8A1, COL4A1, FN1, FAP, COL5A2, CDC20, TPX2, UBE2T, MYBL2, y CDKN2C. BINI, IGF1, C7, GSN, DES, TGFB1I1, TPM2, VCL, FLNC, ITGA7, COL6A1, PPP1R12A, GSTM1, GSTM2, PAGE4, PPAP2B, SRD5A2, PRKCA, IGFBP6, GPM6B, 0LFML3, y HLF se asignan al grupo de genes de organización celular. CYP3A5, KRT15, KRT5, LAMB3, y SDC1 se asignan al grupo de genes de epitelios basales. DUSP1, EGFR1, FOS, JUN, EGR3, GADD45B, y ZFP36 se asignan al grupo de genes de respuesta al estrés. FAM13C, KLK2, AZGP1, y SRD5A2 se asignan al grupo de genes de andrógenos. ASPN, SFRP4, BGN, THBS2, INHBA, C0L1A1, C0L3A1, COL1A2, SPARC, COL8A1, C0L4A1, FN1, FAP y COL5A2 se asignan al grupo de genes de respuesta estromal. CDC20, TPX2, UBE2T, MYBL2, y CDKN2C se asignan al grupo de genes de proliferación. El método puede comprender, además, determinar el nivel de al menos un transcrito de ARN, o un producto de expresión de este, seleccionado de STAT5B, NFAT5, AZGP1, ANPEP, IGFBP2, SLC22A3, ERG, AR, SRD5A2, GSTM1, y GSTM2.

En una variante de la descripción, se determina el nivel de uno o más transcritos de ARN, o un producto de expresión de estos, de cada uno de los grupos de genes de respuesta estromal y el grupo de genes de organización celular. En otra modalidad, se determina el nivel de uno o más transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, de cada uno de los grupos de genes de respuesta estromal y grupos de genes de PSA. Además, puede determinarse el nivel de uno o más transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, del grupo de genes de organización celular y/o del grupo de genes de proliferación. En esta modalidad, los genes que se analizarán del grupo de genes de respuesta estromal pueden seleccionarse de ASPN, BGN, COLI Al, SPARC, FN1, COL3A1, COL4A1, INHBA, THBS2, y SFRP4; los genes que se analizarán del grupo de genes de andrógenos pueden seleccionarse de FAM13C y KLK2; los genes que se analizarán del grupo de genes de organización celular pueden seleccionarse de FLNC, GSN, GSTM2, IGFBP6, PPAP2B, PPP1R12A, BINI, VCL, IGF1, TPM2, C7, y GSTM1; y los genes que se analizarán del grupo de genes de proliferación pueden seleccionarse de TPX2, CDC20, y MYBL2.

En una modalidad particular, los transcritos de ARN, o sus productos de expresión, se seleccionan de BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, TPM2, TPX2, FAM13C, KLK2, AZGP1, GSTM2, y SRD5A2. BGN, COL1A1, y SFRP4 se asignan al grupo de genes de respuesta estromal; FLNC, GSN y TPM2 se asignan al grupo de genes de organización celular; y FAM13C y KLK2 se asignan al grupo de genes de andrógenos. El nivel de los transcritos de ARN, o sus productos de expresión, que comprenden al menos uno de los grupos de genes seleccionados del grupo de genes de respuesta estromal, del grupo de genes de organización celular, y del grupo de genes de andrógenos, puede determinarse por el método de la invención. En cualquiera de las modalidades, el grupo de genes de andrógenos puede comprender, además, AZGP1 y SRD5A2.

Además, puede determinarse el nivel de cualquiera de las combinaciones de genes que se muestran en la Tabla 4. Por ejemplo, el modelo RS0 en la Tabla 4 comprende determinar los niveles de los transcritos de ARN, o productos de expresión génica de estos, de ASPN, BGN, COL1A1, SPARC, FLNC, GSN, GSTM2, IGFBP6, PPAP2B, PPP1R12A, TPX2, CDC20, MYBL2, FAM13C, KLK2, STAT5B, y NFAT5. Además, cualquiera de los algoritmos mostrados en la Tabla 4 puede usarse para calcular la puntuación cuantitativa para el paciente.

Breve descripción de los figuras

La Figura 1 es un dendrograma que representa la asociación de los 81 genes seleccionados del estudio de identificación de genes.

Las Figuras 2A-2E son gráficos de dispersión que muestran la comparación de la expresión génica normalizada (Cp) para muestras pareadas de cada paciente donde el eje x es la expresión génica de la muestra primaria de r P de patrón de Gleason (PGP) y el eje y es la expresión génica de la muestra de biopsia (BX). Figura 2A: Todos los genes ECM (respuesta estromal): Figura 2B: Todos los genes de migración (organización celular); Figura 2C: Todos los genes de proliferación; Figura 2D: genes de PSA (andrógenos); Figura 2E: otros genes de la lista de 81 genes que no pertenecen a ninguno de estos cuatro grupos de genes.

Las Figuras 3A-3D son gráficos del intervalo de expresión génica de genes individuales dentro de cada grupo de genes en las muestras de biopsia (BX) y PGP RP. Figura 3A: Todos los genes ECM (respuesta estromal); Figura 3B: Todos los genes de migración (organización celular); Figura 3C: Todos los genes de proliferación; Figura 3D: otros genes de la lista de 81 genes que no pertenecen a ninguno de los grupos de genes.

La Figura 4 es una ilustración esquemática del método de camarillas y pilas usado para identificar genes coexpresados.

La Figura 5 muestra ejemplos de camarillas y pilas. La Figura 5(a) es un ejemplo de un gráfico que no es una camarilla; la Figura 5(b) es un ejemplo de una camarilla; la Figura 5(c) es un ejemplo de una camarilla pero no es una camarilla máxima.

La Figura 6 es un gráfico que muestra dos camarillas máximas: 1-2-3-4-5 y 1-2-3-4-6.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente el apilamiento de dos camarillas máximas.

La Figura 8 es un gráfico que muestra que los grupos de riesgo RS27 y CAPRA predicen la ausencia de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos.

La Figura 9 es un gráfico que muestra que los grupos de riesgo RS27 y AUA predicen la ausencia de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos.

La Figura 10 es un gráfico que muestra el tiempo hasta la recurrencia clínica de pacientes con PTEN bajo y PTEN normal, del estudio de identificación de genes.

La Figura 11 es un gráfico que muestra el tiempo hasta la recurrencia clínica de pacientes del estudio de identificación de genes estratificados en PTEN bajo/normal y TMPRSS-ERG negativo/positivo.

Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que se entiende habitualmente en la técnica a la que pertenece la invención. Singleton y otros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2da ed., J, Wiley & Sons (New York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ta ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. Ciertamente, la presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos en la presente descripción. Para los propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen más abajo.

Los términos "tumor" y "lesión", como se usan en la presente descripción, se refieren a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los expertos en la técnica comprenderán que una muestra de tejido tumoral puede comprender múltiples elementos biológicos, tales como una o más células cancerosas, células parciales o fragmentadas, tumores en varias etapas, tejido de aspecto histológicamente normal circundante y/o tejidos macro o micro disecados.

Los términos "cáncer' y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer en la presente descripción incluyen cáncer del tracto urogenital, tal como cáncer de próstata.

Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer de próstata" se usa en el sentido más amplio y se refiere a todas las etapas y todas las formas de cáncer que surgen del tejido de la glándula prostática.

La estadificación del cáncer ayuda al médico a evaluar cuánto ha progresado la enfermedad y a planificar un tratamiento para el paciente. La estadificación puede realizarse clínicamente (estadificación clínica) mediante un examen físico, análisis de sangre, o respuesta a la radioterapia, y/o patológicamente (estadificación patológica) basada en cirugía, tal como la prostatectomía radical. De acuerdo con el sistema de estadificación de tumor, ganglios linfáticos y metástasis (TNM) del Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC), el Manual de Estadificación del AJCC (7ma Ed., 2010), las diversas etapas del cáncer de próstata se definen de la siguiente manera: Tumor: T1: tumor clínicamente inaparente no palpable o visible por imagen, T1a: hallazgo histológico incidental tumoral en 5 % o menos de tejido resecado, T1b: hallazgo histológico incidental tumoral en más del 5 % de tejido resecado, T1c: tumor identificado por biopsia con aguja; T2: tumor confinado dentro de la próstata, T2a: el tumor involucra la mitad de un lóbulo o menos, T2b: el tumor involucra más de la mitad de un lóbulo, pero no ambos lóbulos, T2c: el tumor involucra ambos lóbulos; T3: el tumor se extiende a través de la cápsula prostática, T3a: extensión extracapsular (unilateral o bilateral), T3b: el tumor invade las vesículas seminales; T4: el tumor se fija o invade estructuras adyacentes que no son vesículas seminales (cuello vesical, esfínter externo, recto, músculos elevadores, o pared pélvica). Generalmente, un estadio T (cT) clínico es T1 o T2 y el estadio T (pT) patológico es T2 o superior. Ganglios linfáticos: NO: sin metástasis en los ganglios linfáticos regionales; N1: metástasis en ganglios linfáticos regionales. Metástasis: M0: sin metástasis a distancia; M1: metástasis a distancia presente.

El sistema de clasificación de Gleason se usa para ayudar a evaluar el pronóstico de los hombres con cáncer de próstata. Junto con otros parámetros, se incorpora a una estrategia de estadificación del cáncer de próstata, que predice el pronóstico y ayuda a guiar la terapia. Se otorga una "puntuación" o "calificación" de Gleason al cáncer de próstata en base a su apariencia microscópica. Los tumores con una puntuación baja de Gleason generalmente crecen lo suficientemente lento como para no representar una amenaza significativa para los pacientes en sus vidas. Estos pacientes son monitoreados ("espera vigilante" o "vigilancia activa") a lo largo del tiempo. Los cánceres con una puntuación de Gleason más alta son más agresivos y tienen un peor pronóstico, y estos pacientes generalmente son tratados con cirugía (por ejemplo, prostatectomía radical) y, en algunos casos, terapia (por ejemplo, radiación, hormonas, ultrasonido, quimioterapia). Las puntuaciones de Gleason (o sumas) comprenden grados de los dos patrones tumorales más comunes. Estos patrones se denominan patrones 1-5 de Gleason, con el patrón 1 como el más bien diferenciado. La mayoría tiene una mezcla de patrones. Para obtener una puntuación o calificación de Gleason, el patrón dominante se añade al segundo patrón más frecuente para obtener un número entre 2 y 10. Los Grados de Gleason incluyen: G1: bien diferenciado (ligera anaplasia) (Gleason 2-4); G2: moderadamente diferenciado (anaplasia moderada) (Gleason 5-6); G3-4: pobremente diferenciado/indiferenciado (anaplasia marcada) (Gleason 7­ 10).

Agrupaciones de Estadios: Estadio I: T1a N0 M0 G1; Estadio II: (T1a N0 M0 G2-4) o (T1b, c, T1, T2, N0 M0 cualquier G); Estadio III: T3 N0 M0 cualquier G; Estadio IV: (T4 N0 M0 cualquier G) o (cualquier T N1 M0 cualquier G) o (cualquier T cualquier N M1 cualquier G).

El término "aumento de grado", como se usa en la presente descripción, se refiere a un aumento en el grado de Gleason determinado a partir de la biopsia al grado de Gleason determinado a partir de la prostatectomía radical (RP). Por ejemplo, el aumento de grado incluye un cambio en el grado de Gleason de 3+3 o 3+4 en la biopsia a 3+4 o más en Rp. "Aumento de grado significativo" o "aumento de grado 2", como se usa en la presente descripción, se refiere a un cambio en el grado de Gleason de 3+3 o 3+4 determinado a partir de una biopsia a 4+3 o más, o compromiso de las vesículas seminales (SVI) o compromiso extracapsular (ECE) como se determina por RP.

El término "alto grado", como se usa en la presente descripción, se refiere a una puntuación de Gleason de >=3+4 o >=4+3 en RP. El término "bajo grado", como se usa en la presente descripción, se refiere a una puntuación de Gleason de 3+3 en RP. En una modalidad particular, la enfermedad de "alto grado" se refiere a la puntuación de Gleason de al menos un patrón mayor 4, un patrón menor 5, o un patrón terciario 5.

El término "aumento en la estadificación" como se usa en la presente descripción se refiere a un aumento en el estadio tumoral a partir de la biopsia hasta el estadio tumoral en la RP. Por ejemplo, el aumento en la estadificación es un cambio en el estadio tumoral del estadio clínico T1 o T2 en la biopsia al estadio patológico T3 en la RP.

El término "enfermedad no confinada a órganos", como se usa en la presente descripción, se refiere a tener la enfermedad en estadio T3 patológico en la RP. El término "confinado a órgano" como se usa en la presente descripción se refiere al estadio patológico pT2 en la RP.

El término "patología adversa", como se usa en la presente descripción, se refiere a una enfermedad de alto grado como se definió anteriormente, o enfermedad no confinada a órganos como se definió anteriormente. En una modalidad particular, "patología adversa" se refiere al cáncer de próstata con una puntuación de Gleason de >=3+4 o >=4+3 o el estadio patológico T3.

En otra modalidad, el término "enfermedad de alto grado o no confinada a órganos" se refiere al cáncer de próstata con una puntuación de Gleason de al menos a un patrón principal 4, un patrón menor 5, o un patrón terciario 5, o el estadio patológico T3.

Como se usa en la presente descripción, los términos "vigilancia activa" y "espera vigilante" significan monitorear de cerca la afección del paciente sin administrar ningún tratamiento hasta que los síntomas aparezcan o cambien. Por ejemplo, en el cáncer de próstata, la espera vigilante generalmente se usa en hombres mayores con otros problemas médicos y en la enfermedad en etapa temprana.

Como se usa en la presente descripción, el término "cirugía" se aplica a los métodos quirúrgicos realizados para la extracción de tejido canceroso, que incluye la linfadenectomía pélvica, la prostatectomía radical, la resección transuretral de la próstata (TURP), la escisión, la disección y la biopsia/extracción del tumor. El tejido tumoral o las secciones usadas para el análisis de la expresión génica pueden obtenerse de cualquiera de estos métodos.

Como se usa en la presente descripción, el término "muestra biológica que contiene células cancerosas" se refiere a una muestra que comprende material tumoral que se obtiene de un paciente con cáncer. El término abarca muestras de tejido tumoral, por ejemplo, tejido que se obtiene mediante prostatectomía radical y tejido que se obtiene mediante biopsia, tal como por ejemplo, una biopsia central o una biopsia con aguja fina. La muestra biológica puede ser una muestra de tejido fresca, congelada, o fijada, embebida en cera, tal como una muestra de tejido embebida en parafina y fijada en formalina. Una muestra biológica abarca, además, fluidos corporales que contienen células cancerosas, tales como sangre, plasma, suero, orina, y similares. Además, el término "muestra biológica que contiene células cancerosas" abarca una muestra que comprende células tumorales que se obtienen de sitios distintos al del tumor primario, por ejemplo, células tumorales circulantes. El término abarca, además, células que son la progenie de las células tumorales del paciente, por ejemplo, muestras de cultivo celular derivadas de células tumorales primarias o células tumorales circulantes. El término abarca, además, muestras que pueden comprender proteínas o material de ácido nucleico desprendido de células tumorales in vivo, por ejemplo, médula ósea, sangre, plasma, suero, y similares. El término abarca, además, muestras que se han enriquecido para células tumorales o se manipularon de cualquier otra manera después de su obtención y muestras que comprenden polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtienen del material tumoral de un paciente.

Los factores pronósticos son aquellas variables relacionadas con la historia natural del cáncer que influyen en las tasas de recurrencia y en el resultado de los pacientes una vez que han desarrollado cáncer. Los parámetros clínicos que se han asociado con un peor pronóstico incluyen, por ejemplo, aumento del estadio tumoral, alto nivel de PSA en la presentación, y alto grado o patrón de Gleason. Los factores pronósticos se usan con frecuencia para clasificar a los pacientes en subgrupos con diferentes riesgos de recaída en el momento inicial.

El término "pronóstico" se usa en la presente descripción para referirse a la probabilidad de que un paciente con cáncer tenga una muerte o progresión atribuible al cáncer. Incluye la recurrencia, la diseminación metastásica, y la resistencia a los fármacos de una enfermedad neoplásica, tal como el cáncer de próstata. Por ejemplo, un "buen pronóstico" incluiría la supervivencia a largo plazo sin recurrencia y un "mal pronóstico" incluiría la recurrencia del cáncer.

Puede evaluarse un "resultado clínico positivo" mediante el uso de cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para el paciente, que incluye, sin limitación, (1) inhibición, en cierta medida, del crecimiento tumoral, que incluye la desaceleración y la detención completa del crecimiento; (2) reducción en el número de células tumorales; (3) reducción en el tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, desaceleración, o detención completa) de la infiltración de células tumorales en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) inhibición de metástasis; (6) mejora de la respuesta inmunitaria antitumoral, que posiblemente resulte en la regresión o el rechazo del tumor; (7) alivio, en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el tumor; (8) aumento en la duración de la supervivencia después del tratamiento; y/o (9) disminución de la mortalidad en un momento dado después del tratamiento. El resultado clínico positivo puede considerarse, además, en el contexto del resultado de un individuo en relación con el resultado de una población de pacientes que tienen un diagnóstico clínico comparable, y puede evaluarse mediante el uso de diversos criterios de valoración, tal como un aumento en la duración del Intervalo Libre de Recurrencia (RFI), un aumento en el tiempo de supervivencia (Supervivencia General (SG)) o el tiempo de supervivencia específico del cáncer de próstata (Supervivencia Específica del Cáncer de Próstata (PCSS)) en una población, sin aumento en la estadificación o el grado en el estadio del tumor o grado de Gleason entre la biopsia y la prostatectomía radical, presencia de enfermedad de grado 3+3 y enfermedad confinada a órganos en la prostatectomía radical, y similares.

El término "clasificación de riesgo" significa una agrupación de sujetos por el nivel de riesgo (o probabilidad) de que el sujeto experimente un resultado clínico negativo particular. Un sujeto puede clasificarse en un grupo de riesgo o clasificarse a un nivel de riesgo en base a los métodos de la presente descripción, por ejemplo, riesgo alto, medio, o bajo. Un "grupo de riesgo" es un grupo de sujetos o individuos con un nivel de riesgo similar para un resultado clínico particular.

El término supervivencia a "largo plazo" se usa en la presente descripción para referirse a la supervivencia durante un período de tiempo particular, por ejemplo, durante al menos 5 años, o durante al menos 10 años.

El término "recurrencia" se usa en la presente descripción para referirse a la recurrencia local o distante (es decir, metástasis) del cáncer. Por ejemplo, el cáncer de próstata puede reaparecer localmente en el tejido próximo a la próstata o en las vesículas seminales. El cáncer puede, además, afectar los ganglios linfáticos circundantes en la pelvis o los ganglios linfáticos fuera de esta área. El cáncer de próstata puede extenderse, además, a los tejidos próximos a la próstata, tal como los músculos pélvicos, los huesos, u otros órganos. La recurrencia puede determinarse mediante la recurrencia clínica detectada, por ejemplo, mediante un estudio de imagen o biopsia, o la recurrencia bioquímica detectada mediante, por ejemplo, niveles de antígeno prostático específico (PSA) de seguimiento sostenido > 0,4 ng/mL o el inicio de la terapia de rescate como resultado de un aumento en el nivel de PSA.

El término "intervalo libre de recurrencia clínica (cRFI)" se usa en la presente descripción como tiempo desde la cirugía hasta la primera recurrencia clínica o muerte debido a la recurrencia clínica del cáncer de próstata. Si el seguimiento terminó sin la aparición de recurrencia clínica, u otros cánceres primarios o la muerte se produjo antes de la recurrencia clínica, el tiempo hasta cRFI se considera censurado; cuando esto ocurre, la única información conocida es que hasta el momento de la censura, no ocurrió recurrencia clínica en este sujeto. Las recidivas bioquímicas se ignoran a los efectos de calcular el cRFI.

El término "intervalo libre de recurrencia bioquímica (bRFI)" se usa en la presente descripción para referirse al tiempo desde la cirugía hasta la primera recurrencia bioquímica del cáncer de próstata. Si la recurrencia clínica ocurrió antes de la recurrencia bioquímica, el seguimiento finalizó sin la aparición de bRFI, u otros cánceres primarios o la muerte ocurrió antes de la recurrencia bioquímica, el tiempo hasta la recurrencia bioquímica se considera censurado al primero de estos.

El término "Supervivencia General (SG)" se usa en la presente descripción para referirse al tiempo transcurrido desde la cirugía hasta la muerte por cualquier causa. Si el sujeto aún está vivo en el momento del último seguimiento, el tiempo de supervivencia se considera censurado al momento del último seguimiento. La recurrencia bioquímica y la recurrencia clínica se ignoran a los efectos del cálculo de la OS.

El término "Supervivencia específica del cáncer de próstata (PCSS)" se usa en la presente descripción para describir el tiempo desde la cirugía hasta la muerte por cáncer de próstata. Si el paciente no muere de cáncer de próstata antes del final del seguimiento, o muere debido a otras causas, PCSS se considera censurado en este momento. La recurrencia clínica y la recurrencia bioquímica se ignoran a los efectos de calcular PCSS.

En la práctica, el cálculo de las medidas de tiempo hasta el evento enumeradas anteriormente puede variar de un estudio a otro en dependencia de la definición de eventos a considerar censurados.

Como se usa en la presente descripción, el término "nivel de expresión" como se aplica a un gen se refiere al nivel normalizado de un producto génico, por ejemplo, el valor normalizado determinado para el nivel de ARN de un gen o para el nivel del polipéptido de un gen.

El término "producto génico" o "producto de expresión" se usa en la presente descripción para referirse a los productos de transcripción de ARN (ácido ribonucleico) (transcritos) del gen, que incluye ARNm, y los polipéptidos productos de la traducción de tales transcritos de ARN. Un producto génico puede ser, por ejemplo, un a Rn no empalmado, un ARNm, una variante de empalme de ARNm, un microARN, un ARN fragmentado, un polipéptido, un polipéptido modificado postraduccionalmente, un polipéptido variante de empalme, etcétera.

El término "transcrito de ARN", como se usa en la presente descripción, se refiere a los productos de la transcripción del ARN de un gen, que incluyen, por ejemplo, ARNm, un ARN no empalmado, una variante de empalme de ARNm, un microARN, y un ARN fragmentado.

A menos que se indique lo contrario, cada nombre de gen usado en la presente descripción corresponde al Símbolo Oficial asignado al gen y proporcionado por Entrez Gene (URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/ sites/entrez) a partir de la fecha de presentación de esta solicitud.

El término "microarreglo" se refiere a una disposición ordenada de elementos de arreglos hibridizables, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos o polinucleótidos, sobre un sustrato.

El término "polinudeótido" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxribonudeótido, que puede ser a Rn o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por lo tanto, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen en la presente descripción incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido", como se usa en la presente descripción, se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente involucran solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente los ADNc. El término incluye ADN (incluidos ADNc) y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones, son "polinucleótidos" como el término se entiende en la presente descripción. Además, los ADN o a Rn que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiadas, se incluyen dentro del término "polinucleótidos" como se define en la presente descripción. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas modificadas químicamente, enzimáticamente y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen las células simples y complejas.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, híbridos de ARNrADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos de sonda de ADN monocatenario, a menudo se sintetizan mediante métodos químicos, por ejemplo, mediante el uso de sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están disponibles comercialmente. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden prepararse mediante una variedad de otros métodos, que incluyen técnicas in vitro mediadas por ADN recombinante y mediante la expresión de los ADN en células y organismos.

El término "Ct", como se usa en la presente descripción, se refiere al ciclo umbral, el número de ciclo en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en el que la fluorescencia generada dentro de una reacción supera con creces el umbral definido, es decir, el punto durante la reacción en el que un número suficiente de amplicones se han acumulado para alcanzar el umbral definido.

El término "Cp", como se usa en la presente descripción, se refiere a "punto de cruce". El valor de Cp se calcula mediante la determinación de las segundas derivadas de las curvas de amplificación qPCR completas y su valor máximo. El valor de Cp representa el ciclo en el que el aumento de fluorescencia es más alto y donde comienza la fase logarítmica de una PCR.

Los términos "umbral" o "valor del umbral" se refieren a un procedimiento usado para tener en cuenta las relaciones no lineales entre las mediciones de expresión génica y la respuesta clínica, así como también para reducir aún más la variación en las puntuaciones informadas de los pacientes. Cuando se aplica el valor umbral, todas las mediciones por debajo o por encima de un umbral se establecen en ese valor de umbral. Podría examinarse una relación no lineal entre la expresión génica y el resultado mediante el uso de suavizadores o polinomios cúbicos para modelar la expresión génica en el intervalo libre de recurrencia mediante el uso de la regresión de Cox PH o sobre el estado patológico adverso mediante el uso de la regresión logística. D. Cox, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 34:187-220 (1972). La variación en las puntuaciones de pacientes informadas podría examinarse en función de la variabilidad en la expresión génica en el límite de cuantificación y/o detección de un gen en particular.

Como se usa en la presente descripción, el término "amplicón" se refiere a fragmentos de ADN que se han sintetizado mediante el uso de las técnicas de amplificación, tales como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y las reacciones en cadena de la ligasa.

El "rigor" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por un experto en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridar nuevamente cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas lo harán menos. Para detalles adicionales y explicación del rigor de las reacciones de hibridación, ver Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers, 1995).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en la presente descripción, típicamente: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para los lavados, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 °C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con 750 mM cloruro de sodio, citrato de sodio 75 mM a 42 ° C; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, Solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 |jg/mL), SDS al 0,1 %, y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0,2x (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50 %, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1x que contiene EDTA a 55 °C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos riguroso que los descritos anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida 20 %, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano 10 % y ADN desnudo desnaturalizado de esperma de salmón 20 mg/mL, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 °C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etcétera, como sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

Los términos "empalme" y "empalme de ARN" se usan indistintamente y se refieren al procesamiento del ARN que elimina intrones y une exones para producir el ARNm maduro con secuencia codificante continua que se mueve hacia el citoplasma de una célula eucariota.

Como se usa en la presente descripción, el término "fusión TMPRSS" y "fusión TMPRSS2" se usan indistintamente y se refieren a una fusión del gen TMPRSS2 conducido por andrógenos con el oncogén ERG, que se ha demostrado que tiene una asociación significativa con el cáncer de próstata. S. Perner, y otros, Urologe A. 46(7):754-760 (2007); S.A. Narod, y otros, Br J Cancer 99(6):847-851 (2008). Como se usa en la presente descripción, el estado de fusión TMPRSS positivo indica que la fusión TMPRSS está presente en una muestra de tejido, mientras que el estado de fusión TMPRSS negativo indica que la fusión TMPRSS no está presente en una muestra de tejido. Los expertos en la técnica reconocerán que existen numerosas formas de determinar el estado de fusión de TMPRSS, tales como la PCR cuantitativa en tiempo real o la secuenciación de alto rendimiento. Ver, por ejemplo, K. Mertz, y otros, Neoplasis 9(3):200-206 (2007); C. Maher, Nature 458(7234):97-101 (2009).

Los términos "correlacionado" y "asociado" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a la asociación entre dos mediciones (o entidades medidas). La descripción proporciona genes o subconjuntos de genes, cuyos niveles de expresión se asocian con el resultado clínico. Por ejemplo, el aumento del nivel de expresión de un gen puede correlacionarse positivamente (asociado positivamente) con un resultado clínico bueno o positivo. Tal correlación positiva puede demostrarse estadísticamente de diversas maneras, por ejemplo, por una relación de riesgo de recurrencia del cáncer menor que uno o por una relación de probabilidades de aumento de estadificación o del grado del cáncer menor de uno. En otro ejemplo, el mayor nivel de expresión de un gen puede correlacionarse negativamente (asociado negativamente) con un resultado clínico bueno o positivo. En ese caso, por ejemplo, el paciente puede experimentar una recurrencia del cáncer o aumento del grado/estadificación del cáncer, y esto puede demostrarse estadísticamente de diversas maneras, por ejemplo, una relación de riesgo mayor que 1 o una relación de probabilidades mayor que uno. La "correlación" se usa, además, en la presente descripción para referirse a la fuerza de la asociación entre los niveles de expresión de dos genes diferentes, de manera que el nivel de expresión de un primer gen puede sustituirse con un nivel de expresión de un segundo gen en un algoritmo dado si sus niveles de expresión están altamente correlacionados. Tal "expresión correlacionada" de dos genes que son sustituibles en un algoritmo generalmente son niveles de expresión génica que se correlacionan positivamente entre sí, por ejemplo, si una mayor expresión de un primer gen se correlaciona positivamente con un resultado (por ejemplo, una mayor probabilidad de un buen resultado clínico), entonces el segundo gen que se coexpresa y muestra una expresión correlacionada con el primer gen también se correlaciona positivamente con el mismo resultado.

Los términos "coexpresar" y "coexpresado", como se usan en la presente descripción, se refieren a una correlación estadística entre las cantidades de diferentes secuencias de transcritos en una población de pacientes diferentes. La expresión conjunta por pares puede calcularse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el cálculo de los coeficientes de correlación de Pearson o los coeficientes de correlación de Spearman. Las camarillas de genes coexpresados pueden identificarse, además, mediante la siembra y el apilamiento de la enumeración máxima de la camarilla (MCE) descrita en el Ejemplo 4 en la presente descripción. Puede calcularse un análisis de la coexpresión mediante el uso de los datos de expresión normalizados. Los genes dentro del mismo subconjunto de genes también se consideran coexpresados.

Un "sistema basado en computadora" se refiere a un sistema de los componentes físicos de una computadora, el programa informático y los medios de almacenamiento de datos usados para analizar información. Los mínimos componentes físicos de una computadora de un sistema basado en computadora del paciente comprende una unidad central de procesamiento (CPU) y los componentes físicos de una computadora para la entrada de datos, salida de datos (por ejemplo, pantalla) y almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que cualquier sistema basado en computadora y/o sus componentes actualmente disponibles son adecuados para usar en relación con los métodos de la presente descripción. El medio de almacenamiento de datos puede comprender cualquier fabricación que comprenda un registro de la presente información como se describió anteriormente, o un dispositivo de acceso a memoria que puede acceder a tal fabricación.

Para "registro" de datos, programación u otra información en un medio legible por computadora se refiere a un proceso para almacenar información, mediante el uso de cualquiera de tales métodos conocidos en la técnica. Puede elegirse cualquier estructura conveniente de almacenamiento de datos, en base a los medios usados para acceder a la información almacenada. Puede usarse una diversidad de programas y formatos de procesador de datos para el almacenamiento, por ejemplo, archivos de texto de procesamiento de texto, formatos de bases de datos, etcétera.

Un "procesador" o "medio informático" se refiere a cualquier combinación de componentes físicos de una computadora y/o el programa informático que realizará las funciones requeridas. Por ejemplo, un procesador adecuado puede ser un microprocesador digital programable tal como el disponible en forma de controlador electrónico, computadora central, servidor o computadora personal (de escritorio o portátil). Cuando el procesador es programable, la programación adecuada puede comunicarse desde una ubicación remota al procesador, o guardarse previamente en un producto de programa de computadora (tal como un medio de almacenamiento legible por computadora portátil o fijo, ya sea basado en un dispositivo de estado sólido, óptico o magnético). Por ejemplo, un medio magnético o un disco óptico pueden portar la programación, y pueden leerse mediante un lector adecuado que se comunique con cada procesador en su estación correspondiente.

Métodos Basados en Algoritmos y Subconjuntos de Genes

La presente invención proporciona un ensayo de diagnóstico molecular basado en algoritmos para predecir un resultado clínico para un paciente con cáncer de próstata. El nivel de expresión de uno o más genes puede usarse solo u organizarse en subconjuntos de genes funcionales para calcular una puntuación cuantitativa que puede usarse para predecir la probabilidad de un resultado clínico. El ensayo basado en algoritmos y la información asociada proporcionada por la práctica de los métodos de la presente invención facilitan la toma de decisiones de tratamiento óptimo en el cáncer de próstata. Por ejemplo, tal herramienta clínica permitiría a los médicos identificar pacientes que tienen una baja probabilidad de tener un cáncer agresivo y, por lo tanto, no necesitarían RP, o a quienes tienen una alta probabilidad de tener un cáncer agresivo y, por lo tanto, necesitarían RP.

Como se usa en la presente descripción, una "puntuación cuantitativa" es un valor numérico calculado aritmética o matemáticamente para ayudar a simplificar o revelar o informar el análisis de información cuantitativa más compleja, tal como la correlación de determinados niveles de expresión de los genes o subconjuntos de genes descritos a una probabilidad de un resultado clínico de un paciente con cáncer de próstata. Una puntuación cuantitativa puede determinarse mediante la aplicación de un algoritmo específico. El algoritmo usado para calcular la puntuación cuantitativa en los métodos descritos en la presente descripción puede agrupar los valores del nivel de expresión de los genes. La agrupación de genes puede realizarse, al menos en parte, en base al conocimiento de la contribución relativa de los genes de acuerdo con las funciones fisiológicas o características de los componentes celulares, tales como en los grupos discutidos en la presente descripción. Puede determinarse una puntuación cuantitativa para un grupo de genes ("puntuación de grupo de genes"). La formación de grupos, además, puede facilitar la ponderación matemática de la contribución de varios niveles de expresión de genes o subconjuntos de genes a la puntuación cuantitativa. La ponderación de un gen o grupo de genes que representa un proceso fisiológico o características de los componentes celulares puede reflejar la contribución de ese proceso o característica a la patología del cáncer y el resultado clínico, tal como la recurrencia o aumento del grado/estadificación del cáncer. La presente invención proporciona una serie de algoritmos para calcular las puntuaciones cuantitativas, por ejemplo, como se establece en la Tabla 4. En una modalidad de la invención, un aumento en la puntuación cuantitativa indica una mayor probabilidad de un resultado clínico negativo.

En una modalidad, una puntuación cuantitativa es una "puntuación de recurrencia", que indica la probabilidad de una recurrencia del cáncer, el aumento de grado o la estadificación de un cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado, y/o enfermedad de alto grado o no confinada a órganos. Un aumento en la puntuación de recurrencia puede correlacionarse con un aumento en la probabilidad de recurrencia del cáncer, el aumento de grado o la estadificación de un cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado y/o enfermedad de alto grado o no confinada a órganos.

Los subconjuntos de genes de la presente invención incluyen un grupo de genes ECM, un grupo de genes de migración, un grupo de genes de andrógenos, un grupo de genes de proliferación, un grupo de genes de epitelios, y un grupo de genes de estrés.

Los subconjuntos de genes a los que se hace referencia en la presente descripción como el "grupo de genes ECM", "grupo de genes del estroma," y "grupo de genes de la respuesta estromal" se usan indistintamente e incluyen genes que se sintetizan predominantemente por las células del estroma y están involucrados en la respuesta estromal y los genes que se coexpresan con los genes del grupo de genes ECM. En la presente descripción, las "células del estroma" se denominan células de tejido conectivo que constituyen la estructura de soporte de los tejidos biológicos. Las células del estroma incluyen fibroblastos, células inmunitarias, pericitos, células endoteliales, y células inflamatorias. La "respuesta estromal" se refiere a una respuesta desmoplástica de los tejidos del huésped en el sitio de un tumor primario o invasión. Ver, por ejemplo, E. Rubin, J. Farber, Pathlogy, 985-986 (Ed. final 1994). El grupo de genes ECM incluye, por ejemplo, ASPN, SFRP4, BGN, THBS2, INHBA, COL1A1, COL3A1, COLI A2, SPARC, COL8A1, COL4A1, FN1, FAP, y COL5A2, y genes coexpresados de estos. Los ejemplos de genes coexpresados incluyen los genes y/o las camarillas de genes que se muestran en la Tabla 8.

Los subconjuntos de genes a los que se hace referencia en la presente descripción como "grupo de genes de migración" o "grupo de genes de regulación de la migración" o "grupo de genes del citoesqueleto" o "grupo de genes de organización celular" se usan indistintamente e incluyen genes y genes coexpresados que son parte de una dinámica de la red de microfilamentos de actina y proteínas accesorias y que proporcionan soporte intracelular a las células, generan las fuerzas físicas para el movimiento celular y la división celular, así como también facilitan el transporte intracelular de vesículas y orgánulos celulares. El grupo de genes de migración incluye, por ejemplo, BIN1, IGF1, C7, GSN, DES, TGFB1I1, TPM2, VCL, FLNC, ITGA7, COL6A1, PPP1R12A, GSTM1, GSTM2, PAGE4, PPAP2B, SRD5A2, PRKCA, IGFBP6, GPM6B, OLFML3, y HLF, y genes coexpresados de estos. Se proporcionan genes coexpresados y/o camarillas de genes ilustrativos en la Tabla 9.

El subconjunto de genes al que se hace referencia en la presente descripción como el "grupo de genes de andrógenos", "grupo de genes de PSA" y "grupo de genes de regulación de PSA" se usan indistintamente e incluyen genes que son miembros de la familia de serina proteasas de calicreína (por ejemplo, calicreína 3 [PSA]), y genes que se coexpresan con genes del grupo de genes andrógenos. El grupo de genes de andrógenos incluye, por ejemplo, FAM13C y KLK2, y genes coexpresados de estos. El grupo de genes de andrógenos puede comprender, además, AZGP1 y SRD5A2, y genes coexpresados de estos.

Los subconjuntos de genes a los que se hace referencia en la presente descripción como el "grupo de genes de proliferación" y el "grupo de genes del ciclo celular" se usan indistintamente e incluyen genes que están involucrados con las funciones del ciclo celular y genes que se coexpresan con genes del grupo de genes de proliferación. "Funciones del ciclo celular", como se usa en la presente descripción, se refiere a la proliferación celular y al control del ciclo celular, por ejemplo, punto de control/transición de fase G1 a S. El grupo de genes de proliferación incluye, por ejemplo, CDC20, TPX2, UBE2T, MYBL2, y CDKN2C, y genes coexpresados de estos. Los genes coexpresados y/o camarillas de genes ilustrativos se proporcionan en la Tabla 10.

Los subconjuntos de genes a los que se hace referencia en la presente descripción como el "grupo de genes de epitelios" y "grupo de genes de epitelios basales" se usan indistintamente e incluyen genes que se expresan durante la diferenciación de un epitelio polarizado y que proporcionan integridad estructural intracelular para facilitar las interacciones físicas con las células epiteliales vecinas, y los genes que se coexpresan con los genes del grupo de genes epiteliales. El grupo de genes de epitelios incluye, por ejemplo, CYP3A5, KRT15, KRT5, LAMB3, y SDC1 y genes coexpresados de estos.

El subconjunto de genes al que se hace referencia en la presente descripción como el "grupo de genes de estrés", "grupo de genes de respuesta al estrés" y "grupo de genes de respuesta temprana" se usan indistintamente e incluye genes y genes coexpresados que son factores de transcripción y proteínas de unión al ADN activadas rápidamente y transitoriamente en respuesta al estrés celular y a otras señales extracelulares. Estos factores, a su vez, regulan la transcripción de una amplia gama de genes. El grupo de genes de estrés incluye, por ejemplo, DUSP1, EGR1, FOS, JUN, EGR3, GADD45B, and ZFP36, y genes coexpresados de estos. Los genes coexpresados y/o las camarillas de genes ilustrativos se proporcionan en la Tabla 11.

Los niveles de expresión de otros genes y sus genes coexpresados pueden usarse con uno más de los subconjuntos de genes anteriores para predecir la probabilidad de un resultado clínico de un paciente con cáncer de próstata. Por ejemplo, el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados de los 81 genes de la Figura 1 o la Tabla 1A o 1B que no pertenecen a ninguno de los subconjuntos de genes descritos puede usarse con uno o más de los subconjuntos de genes descritos. En una modalidad de la invención, uno o más de STAT5B, NFAT5, AZGP1, ANPEP, IGFBP2, SLC22A3, ERG, AR, SRD5A2, GSTM1, y GSTM2 pueden usarse en uno o más subconjuntos de genes descritos anteriormente para predecir la probabilidad de un resultado clínico.

La presente invención proporciona, además, métodos para determinar un nivel de expresión umbral para un gen particular. Puede calcularse un nivel de expresión umbral para un gen específico. Un nivel de expresión umbral para un gen puede basarse en un nivel de expresión normalizado. En un ejemplo, puede calcularse un nivel de expresión de umbral de Cp por la evaluación de formas funcionales mediante el uso de la regresión logística o regresión de riesgos proporcionales de Cox.

La presente invención proporciona, además, métodos para determinar genes que se coexpresan con genes particulares identificados mediante, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR), como biomarcadores validados relevantes para un tipo particular de cáncer. Los propios genes coexpresados son biomarcadores útiles. Los genes coexpresados pueden sustituirse por los genes con los que se coexpresan. Los métodos pueden incluir la identificación de camarillas de genes a partir de datos de microarreglos, normalizar los datos de microarreglos, calcular una matriz de correlación de Spearman por pares para las sondas de los arreglos, filtrar sondas coexpresadas significativas en diferentes estudios, construir un gráfico, mapear la sonda con respecto a los genes, y generar un informe de camarillas de genes. Un método ilustrativo para identificar genes coexpresados se describe en el Ejemplo 3 más abajo, y los genes coexpresados identificados mediante el uso de este método se proporcionan en las Tablas 8-11. Los niveles de expresión de uno o más genes de una camarilla de genes pueden usarse para calcular la probabilidad de que un paciente con cáncer de próstata experimente un resultado clínico positivo, tal como una probabilidad reducida de recurrencia del cáncer.

Puede analizarse una cualquiera o más combinaciones de grupos de genes en el método de la presente invención. Por ejemplo, puede analizarse un grupo de genes de respuesta estromal, solo o en combinación, con un grupo de genes de organización celular, un grupo de genes de proliferación, y/o un grupo de genes de andrógenos. Además, puede analizarse cualquier número de genes dentro de cada grupo de genes.

En una modalidad específica de la invención, un método para predecir un resultado clínico para un paciente con cáncer de próstata comprende medir un nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de respuesta estromal, o un gen coexpresado de este, y al menos un gen de un grupo de genes de organización celular, o un gen coexpresado de este. En otra modalidad, se mide el nivel de expresión de al menos dos genes de un grupo de genes de respuesta estromal, o un gen coexpresado de este, y al menos dos genes de un grupo de genes de organización celular, o un gen coexpresado de estos. En aún otra modalidad, los niveles de expresión de al menos tres genes se miden a partir de cada uno de los grupos de genes de respuesta estromal y del grupo de genes de organización celular. En una modalidad adicional, los niveles de expresión de al menos cuatro genes se miden a partir de cada uno de los grupos de genes de respuesta estromal y del grupo de genes de organización celular. En otra modalidad, los niveles de expresión de al menos cinco genes se miden a partir de cada uno de los grupos de genes de respuesta estromal y del grupo de genes de organización celular. En otra modalidad adicional, los niveles de expresión de al menos seis genes se miden a partir de cada uno de los grupos de genes de respuesta estromal y del grupo de genes de organización celular.

En otra modalidad específica, el nivel de expresión de al menos un gen del grupo de genes de respuesta estromal, o un gen coexpresado de este, puede medirse además del nivel de expresión de al menos un gen de un grupo de genes de andrógenos, o un gen coexpresado de este. En una modalidad particular, pueden medirse los niveles de expresión de al menos tres genes, o genes coexpresados de estos, del grupo de genes de respuesta estromal, y el nivel de expresión de al menos un gen, o genes coexpresados de estos, del grupo de genes de andrógenos.

En una modalidad adicional, puede medirse el nivel de expresión de al menos un gen de cada uno del grupo de genes de respuesta estromal, del grupo de genes de andrógenos, y del grupo de genes de organización celular, o genes coexpresados de estos. En una modalidad particular, puede medirse el nivel de al menos tres genes del grupo de genes de respuesta estromal, al menos un gen del grupo de genes de andrógenos, y al menos tres genes del grupo de genes de organización celular. En otra modalidad, puede medirse el nivel de expresión de al menos un gen de cada uno del grupo de genes de respuesta estromal, del grupo de genes de andrógenos, y del grupo de genes de proliferación, o genes coexpresados de estos. En una modalidad particular, puede medirse el nivel de al menos tres genes del grupo de genes de respuesta estromal, al menos un gen del grupo de genes de andrógenos, y al menos un gen del grupo de genes de proliferación. En cualquiera de estas combinaciones, pueden medirse, además, al menos dos genes del grupo de genes de andrógenos. En cualquiera de las combinaciones, pueden medirse, además, al menos cuatro genes del grupo de genes de andrógenos.

En otra modalidad, pueden medirse el nivel de expresión de al menos un gen de cada uno del grupo de genes de respuesta estromal, del grupo de genes de andrógenos, del grupo de genes de organización celular, y del grupo de genes de proliferación, o genes coexpresados de estos. En una modalidad particular, puede medirse el nivel de al menos tres genes del grupo de genes de respuesta estromal, al menos tres genes del grupo de genes de organización celular, al menos un gen del grupo de genes de proliferación, y al menos dos genes del grupo de genes de andrógenos. En cualquiera de las modalidades, pueden medirse al menos cuatro genes del grupo de genes de andrógenos.

Además, los niveles de expresión de uno o más genes que no pertenecen a los subconjuntos de genes descritos en la presente descripción pueden medirse con cualquiera de las combinaciones de los subconjuntos de genes descritos en la presente descripción. Alternativamente, cualquier gen que pertenezca a un subconjunto de genes puede analizarse por separado del subconjunto de genes, o en otro subconjunto de genes. Por ejemplo, los niveles de expresión de al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos 4 genes pueden medirse además de los subconjuntos de genes descritos la presente descripción. En una modalidad de la invención, los genes adicionales se seleccionan de STAT5B, NFAT5, AZGP1, ANPEP, IGFBP2, SLC22A3, ERG, AR, SRD5A2, GSTM1, y GSTM2.

En una modalidad específica, el método de la invención comprende medir los niveles de expresión de las combinaciones específicas de genes y subconjuntos de genes mostrados en la Tabla 4. En una modalidad adicional, las puntuaciones del grupo de genes y las puntuaciones cuantitativas se calculan de acuerdo con los algoritmos mostrados en la Tabla 4.

En esta especificación se exponen varios enfoques tecnológicos para la determinación de los niveles de expresión de los genes descritos, que incluyen, sin limitación, RT-PCR, microarreglos, secuenciación de alto rendimiento, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y Expresión Génica Digital (DGE), que se discutirá en detalle más abajo. En aspectos particulares, el nivel de expresión de cada gen puede determinarse en relación con diversas características de los productos de expresión del gen, que incluyen exones, intrones, epítopos proteicos y actividad proteica.

El producto de expresión que se analiza puede ser, por ejemplo, ARN o un polipéptido. El producto de expresión puede estar fragmentado. Por ejemplo, el ensayo puede usar cebadores que son complementarios a las secuencias diana de un producto de expresión y, por lo tanto, podría medir transcritos completos, así como también aquellos productos de expresión fragmentados que contienen la secuencia diana. Se proporciona información adicional en la Tabla A.

El producto de expresión de ARN puede analizarse directamente o mediante la detección de un producto de ADNc resultante de un método de amplificación basado en PCR, por ejemplo, transcripción inversa y reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qRT-PCR). (Ver, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. núm. 7,587,279). El producto de expresión de polipéptidos puede analizarse mediante el uso de inmunohistoquímica (IHC) por técnicas de proteómica. Además, tanto los productos de expresión de ARN como de polipéptidos pueden analizarse, además, mediante el uso de microarreglos.

Métodos de Ensayo de Niveles de Expresión de un Producto Génico

Los métodos de elaboración de perfiles de expresión génica incluyen métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos, y métodos basados en proteómica. Los métodos ilustrativos conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARN en una muestra incluyen transferencia Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); Ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y métodos basados en PCR, tal como transcripción inversa y PCR (RT-p Cr ) (Weis y otros, Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos de secuencia, que incluye dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbrido de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los métodos representativos para el análisis de expresión génica basado en secuenciación incluyen el Análisis en Serie de la Expresión Génica (SAGE), y el análisis de expresión génica por secuenciación masiva paralela de la firma (MPSS). Pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica.

PCR con Transcripción Inversa (RT-PCR)

Típicamente, el ARNm se aísla de una muestra de prueba. El material de partida es, típicamente, ARN total aislado de un tumor humano, habitualmente de un tumor primario. Opcionalmente, pueden usarse tejidos normales del mismo paciente como control interno. Tal tejido normal puede ser tejido normal histológicamente adyacente a un tumor. El ARNm puede extraerse de una muestra de tejido, por ejemplo, de una muestra que está fresca, congelada (por ejemplo, fresca congelada), o embebida en parafina y fijada (por ejemplo, fijada en formalina).

Los métodos generales para la extracción de ARNm se conocen bien en la técnica y se describen en los libros de texto estándar de biología molecular, que incluyen Ausubel y otros, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997), Los métodos para la extracción de ARN de los tejidos embebidos en parafina se describen, por ejemplo, en Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), y De Andrés y otros, BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN puede realizarse mediante el uso de un kit de purificación, un conjunto de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de las células en cultivo puede aislarse mediante el uso de minicolumnas Qiagen RNeasy. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen el Kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI) y el Kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (Ambion, Inc.). El ARN total de las muestras de tejido puede aislarse mediante el uso de ARN Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir de tumor puede aislarse, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Después, la muestra que contiene el ARN se somete a transcripción inversa para producir ADNc a partir del molde de ARN, seguido de amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas usadas más comúnmente son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa se ceba, típicamente, mediante el uso de cebadores específicos, hexámeros aleatorios, o cebadores oligo-dT, en dependencia de las circunstancias y del objetivo del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN que se extrae puede transcribirse de forma inversa mediante el uso de un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc derivado puede usarse como molde en la reacción de PCR posterior.

Los métodos basados en PCR usan una ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN, tal como una ADN polimerasa Taq. Por ejemplo, la PCR TaqMan® utiliza típicamente la actividad 5'-nucleasa de la polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad 5'-nucleasa equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de un producto de reacción de PCR. Puede diseñarse un tercer oligonucleótido, o sonda, para facilitar la detección de una secuencia de nucleótidos del amplicón ubicado entre los sitios de hibridación de los dos cebadores de PCR. La sonda puede marcarse de manera detectable, por ejemplo, con un colorante reportero, y puede proporcionarse además con un colorante fluorescente, y un inactivador del colorante fluorescente, tal como en una configuración de sonda Taqman®.

Cuando se usa una sonda Taqman®, durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución y la señal del colorante reportero liberado está libre del efecto de inactivación del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante reportero por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reportero no inactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

RT-PCR TaqMan® puede realizarse mediante el uso de equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, plataformas de alto rendimiento tales como ABI PRISM 7700 Sequence Detection System® (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una modalidad preferida, el procedimiento se ejecuta en un sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 480 (Roche Diagnostics), que es una plataforma cicladora basada en placas de micropocillos.

Los datos del ensayo de 5'-nucleasa se expresan comúnmente inicialmente como un ciclo umbral ("Ct"). Los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El ciclo umbral (Ct) se describe generalmente como el punto en el que la señal fluorescente se registra por primera vez como estadísticamente significativa. Alternativamente, los datos pueden expresarse como un punto de cruce ("Cp"). El valor de Cp se calcula determinando las segundas derivadas de las curvas de amplificación qPCR completas y su valor máximo. El valor de Cp representa el ciclo en el que el aumento de fluorescencia es más alto y donde comienza la fase logarítmica de una PCR.

Para minimizar los errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR habitualmente se realiza mediante el uso de un estándar interno. El gen estándar interno ideal (también conocido como gen de referencia) se expresa a un nivel bastante constante entre los tejidos cancerosos y no cancerosos del mismo origen (es decir, un nivel que no es significativamente diferente entre los tejidos normales y cancerosos), y no se afecta significativamente por el tratamiento experimental (es decir, no exhibe una diferencia significativa en el nivel de expresión en el tejido relevante como resultado de la exposición a la quimioterapia), y se expresa a un nivel bastante constante entre el mismo tejido tomado de diferentes pacientes. Por ejemplo, los genes de referencia útiles en los métodos descritos la presente descripción no debería mostrar niveles de expresión significativamente diferentes en la próstata cancerosa en comparación con el tejido de la próstata normal. Los ejemplos de genes de referencia usados para la normalización comprenden uno o más de los siguientes genes: AAMP, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1, y PGK1. Las medidas de expresión génica pueden normalizarse con relación a la media de uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) genes de referencia. Las mediciones de expresión normalizadas de referencia pueden variar de 2 a 15, donde un aumento de una unidad generalmente refleja un aumento de 2 veces en la cantidad de ARN.

La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, donde se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, y con la PCR comparativa cuantitativa que usa un gen de normalización contenido en la muestra, o un gen de expresión constitutiva para la RT-PCR. Para más detalles, ver, por ejemplo, Held y otros, Genome Research 6:986-994 (1996).

Las etapas de un protocolo representativo para usar en los métodos de la presente descripción usan tejidos fijados, embebidos en parafina como la fuente de ARN. Por ejemplo, el aislamiento de ARNm, la purificación, la extensión del cebador y la amplificación pueden realizarse de acuerdo con los métodos disponibles en la técnica. (Ver, por ejemplo, Godfrey y otros, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht y otros, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Brevemente, un proceso representativo comienza con el corte de secciones de tejido tumoral embebido en parafina de aproximadamente 10 pm de grosor. Después, se extrae el ARN, y las muestras que contienen ARN se depletan de proteínas y de ADN. Después del análisis de la concentración de ARN, el ARN se transcribe de manera inversa mediante el uso de cebadores específicos del gen seguido de RT-PCR para proporcionar productos de amplificación del ADNc.

Diseño de Cebadores y Sondas de PCR Basados en Intrones

Los cebadores y las sondas de PCR pueden diseñarse en base a secuencias de exón o de intrón presentes en el transcrito de ARNm del gen de interés. El diseño del cebador/sonda puede realizarse mediante el uso de un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático DNA BLAT desarrollado por Kent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002), o por el programa informático BLAST, que incluye sus variaciones.

Cuando sea necesario o conveniente, las secuencias repetitivas de la secuencia diana pueden enmascararse para mitigar las señales no específicas. Las herramientas ilustrativas para lograr esto incluyen el programa Repeat Masker disponible en línea a través del Colegio de Medicina Baylor, que analiza las secuencias de ADN contra una biblioteca de elementos repetitivos y devuelve una secuencia de consulta mediante el uso del programa informático disponible públicamente, como el programa informático DNA BLAT desarrollado por Kent, W. J, Genome Res. 12(4):656-64 (2002), o por el programa informático BLAST, que incluye sus variaciones.

Cuando sea necesario o conveniente, las secuencias repetitivas de la secuencia diana pueden enmascararse para mitigar las señales no específicas. Las herramientas ilustrativas para lograr esto incluyen el programa Repeat Masker disponible en línea a través del Colegio de Medicina Baylor, que analiza las secuencias de ADN contra una biblioteca de elementos repetitivos y devuelve una secuencia de consulta en la que los elementos repetitivos se enmascaran. Las secuencias de intrón enmascaradas pueden usarse después para diseñar secuencias de cebadores y sondas mediante el uso de cualquier paquete de diseño de cebadores/sondas disponible comercialmente o de cualquier otra manera, tal como Primer Express (Applied Biosystems); MGB ensayo por diseño (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 en la WWW para usuarios generales y para biólogos programadores. Ver, S. Rrawetz, S. Misener, Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, pp. 365-386 (Humana Press).

Otros factores que pueden influir en el diseño de cebadores de PCR incluyen la longitud del cebador, la temperatura de fusión (Tm), y el contenido de G/C, la especificidad, secuencias de cebadores complementarias, y secuencia de extremo 3. En general, los cebadores de PCR óptimos tienen generalmente 17-30 bases de longitud, y contienen aproximadamente 20-80 %, tal como, por ejemplo, aproximadamente 50-60 % de bases G+C, y exhiben su Tm entre 50 y 80 °C, por ejemplo, aproximadamente 50 a 70 °C.

Para directrices adicionales para el diseño del cebador y sonda de PCR, ver, por ejemplo, Dieffenbach, CW. Y otros, “General Concepts for PCR Primer Design” in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, “Optimization of PCRs” en: Pc R Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; y Plasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997).

La tabla A proporciona más información sobre las secuencias del cebador, sonda, y amplicón asociadas con los Ejemplos descritos en la presente descripción.

Sistema Mass ARRAY®

En los métodos basados en MassARRAY, tales como el método ilustrativo desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA) después del aislamiento de ARN y la transcripción inversa, el ADNc que se obtiene, se enriquece con una molécula de a Dn sintético (competidor), que coincide con la región de ADNc diana en todas las posiciones, excepto en una sola base, y sirve como un estándar interno. La mezcla de ADNc/competidor se amplifica mediante PCR y se somete a un tratamiento con enzima fosfatasa alcalina (SAP) de camarón posterior a la PCR, que resulta en el análisis de la desfosforilación de las relaciones de las áreas de los pico en el espectro de masas generado. Para más detalles ver, por ejemplo, Ding and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003).

Otros Métodos basados en PCR

Otras técnicas basadas en PCR que pueden encontrar uso en los métodos descritos en la presente descripción incluyen, por ejemplo, la tecnología BeadArray® (Illumina, San Diego, CA; Oliphant y otros, Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson y otros, Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); BeadsArray for Detection of Gene Expression® (BADGE), mediante el uso del sistema LuminexlOO LabMAP® disponible comercialmente y múltiples microesferas codificadas por colores (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido para expresión génica (Yang y otros, Genome Res. 11:1888-1898 (2001)); y análisis de perfil de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura y otros, Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003).

Microarreglos

Los niveles de expresión de un gen o microarreglos de interés pueden evaluarse, además, mediante el uso de la técnica de microarreglos. En este método, las secuencias de polinucleótidos de interés (que incluye los ADNc y los oligonucleótidos) se disponen en un sustrato. Las secuencias ordenadas se ponen en contacto en condiciones adecuadas para la hibridación específica con ADNc marcado detectablemente generado a partir de ARN de una muestra de prueba. Al igual que en el método RT-PCR, la fuente de ARN, típicamente, es el ARN total aislado de una muestra tumoral, y opcionalmente del tejido normal del mismo paciente como un control interno o líneas celulares. El ARN puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina).

Por ejemplo, los insertos amplificados por PCR de clones de ADNc de un gen a analizar se aplican a un sustrato en una matriz densa. Usualmente se aplican al sustrato al menos 10 000 secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, los genes de microarreglos, inmovilizados en el microchip a 10 000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Las sondas de ADNc marcadas con fluorescencia pueden generarse mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa del ARN que se extrae de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto del ADN en el arreglo. Después de lavar en condiciones rigurosas para eliminar sondas unidas de forma no específica, el chip se escanea mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento en el arreglo permite evaluar la abundancia del ARN correspondiente.

Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN se hibridan por pares con el arreglo. Por lo tanto, la abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Se ha demostrado que tales métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcritos raros, que se expresan en unas pocas copias por célula, y para detectar de manera reproducible al menos aproximadamente dos veces las diferencias en los niveles de expresión (Schena y otros, Proc. Natl. Acad, ScL USA 93(2): 106-149 (1996)). El análisis de microarreglos puede realizarse mediante equipos disponibles en el mercado, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como mediante el uso de la tecnología Affymetrix GenChip® o la tecnología de microarreglos de Incyte. Análisis en Serie de la Expresión Génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de una gran cantidad de transcritos de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. Primero, se genera una secuencia corta de etiqueta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de forma única un transcrito, siempre que la etiqueta se obtenga desde una posición única dentro de cada transcrito. Después, muchos transcritos se unen para formar moléculas seriales largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de etiquetas individuales, e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles, ver, por ejemplo, Velculescu y otros, Science 270:484-487 (1995); y Velculescu y otros, Cell 88:243-51 (1997).

Análisis de la Expresión Génica mediante Secuenciación de Ácido Nucleico

Las tecnologías de secuenciación de ácido nucleico son métodos adecuados para el análisis de la expresión génica. El principio subyacente en estos métodos es que el número de veces que se detecta una secuencia de ADNc en una muestra está directamente relacionado con la expresión relativa del ARN correspondiente a esa secuencia. En ocasiones, el término Expresión Digital de Genes (DGE) hace referencia a estos métodos para reflejar la propiedad numérica discreta de los datos resultantes. Los primeros métodos que aplicaron este principio fueron el Análisis en Serie de la Expresión Génica (SAGE) y la Secuenciación Masiva Paralela de Firma (MPSS). Ver, por ejemplo, S. Brenner, y otros, Nature Biotechnology 18(6):630-634 (2000). Más recientemente, el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de "próxima generación" ha hecho que la DGE sea más simple, de mayor rendimiento, y más asequible. Como resultado, más laboratorios pueden utilizar la DGE para detectar la expresión de más genes en más muestras de pacientes individuales de lo que anteriormente era posible. Ver, por ejemplo, J. Marioni, Genome Research 18(9):1509-1517 (2008); R. Morin, Genome Research 18(4):610-621 (2008); A. Mortazavi, Nature Methods 5(7):621-628 (2008); N. Cloonan, Nature Methods 5(7):613-619 (2008).

Aislamiento de ARN de Fluidos Corporales

Se han descrito los métodos de aislamiento de ARN para análisis de expresión a partir de sangre, plasma y suero (ver, por ejemplo, K. Enders, y otros, Clin Chem 48,1647-53 (2002) (y las referencias citadas allí) y de orina (ver, por ejemplo, R. Boom, y otros, J Clin Microbiol. 28, 495-503 (1990) y las referencias citadas allí).

Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica son adecuados, además, para detectar los niveles de expresión de genes y se aplican al método descrito en la presente descripción. Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que se unen específicamente a un producto génico de un gen de interés pueden usarse en tales métodos. Los anticuerpos pueden detectarse mediante el marcado directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de hapteno tales como biotina, o una enzima tal como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina. Alternativamente, el anticuerpo primario no marcado puede usarse junto con un anticuerpo específico secundario marcado para el anticuerpo primario. Los protocolos y kits de inmunohistoquímica se conocen bien en la técnica y están disponibles comercialmente.

Proteómica

El término "proteoma" se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo, o cultivo celular) en un determinado momento. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (referida además, como "proteómica de la expresión"). La proteómica, típicamente, incluye las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra mediante electroforesis en gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ejemplo, por espectrometría de masas o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos mediante el uso de la bioinformática.

Descripción General del Aislamiento, Purificación y Amplificación de ARNm

Las etapas de un protocolo representativo para determinar el perfil de la expresión génica mediante el uso de tejidos fijados embebidos en parafina como fuente de ARN, que incluye el aislamiento de ARNm, la purificación, la extensión y la amplificación del cebador se proporcionan en varios artículos publicados en revistas. (Ver, por ejemplo, T.E. Godfrey, y otros, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht y otros, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001), M. Cronin, y otros, Am J Pathol 164:35-42 (2004)). Brevemente, un proceso representativo comienza con el corte de una sección de muestra de tejido (por ejemplo, secciones de aproximadamente 10 pm de grosor de una muestra de tejido tumoral embebido en parafina). Después, se extrae el ARN y se eliminan las proteínas y el ADN. Después del análisis de la concentración de ARN, la reparación del ARN se realiza si es conveniente. La muestra puede someterse a análisis, por ejemplo, por transcripción inversa mediante el uso de promotores específicos de genes seguidos de RT-PCR.

Análisis Estadístico de los Niveles de Expresión en la Identificación de Genes

Un experto en la técnica reconocerá que existen muchos métodos estadísticos que pueden usarse para determinar si existe una relación significativa entre un resultado clínico de interés (por ejemplo, recurrencia) y los niveles de expresión de un gen marcador como se describe la presente descripción. En una modalidad ilustrativa, la presente invención incluye tres estudios. El primer estudio es un diseño de muestreo de cohorte estratificado (una forma de muestreo de casos y controles) mediante el uso de tejidos y datos de pacientes con cáncer de próstata. La selección de las muestras se estratificó por estadio T clínico (T1, T2), año de cirugía (<1993, >1993), y puntuación de Gleason de prostatectomía (baja/intermedia, alta). Se seleccionaron todos los pacientes con recurrencia clínica y se seleccionó una muestra aleatoria estratificada de pacientes que no experimentaron una recurrencia clínica. Para cada paciente, se analizaron hasta dos muestras abundantes de tumor y una muestra de tejido de apariencia normal. El segundo estudio usó un subconjunto de 70 pacientes del primer estudio de los cuales se analizaron los tejidos tumorales pareados de biopsia de próstata. El tercer estudio incluye a todos los pacientes (170 pacientes evaluables) que se sometieron a cirugía para el cáncer de próstata entre 1999 y 2010 en la Clínica Cleveland (CC) y tenían un riesgo bajo o intermedio (por AUA) de cáncer de próstata clínicamente localizado, que podrían haber sido candidatos razonables para vigilancia activa pero que se sometieron a RP en la CC dentro de los 6 meses posteriores al diagnóstico de cáncer de próstata mediante biopsia. Se analizó el tejido tumoral de biopsia de estos pacientes.

Todas las pruebas de hipótesis se informaron mediante el uso de valores de p de dos colas. Para investigar si existe una relación significativa de los resultados (por ejemplo, intervalo libre de recurrencia clínica (cRFI), intervalo libre de recurrencia bioquímica (bRFI), supervivencia específica del cáncer de próstata (PCSS), supervivencia general (OS)) con genes individuales, y covariables demográficas o clínicas), se usaron modelos de Riesgos Proporcionales de Cox (PH) mediante el uso de estimadores de probabilidad pseudo parcial ponderada máxima y se informaron los valores de p de las pruebas de Wald de la hipótesis nula, de que la relación de riesgo (HR) es uno. Para investigar si existe una relación significativa entre los genes individuales y el patrón de Gleason de una muestra en particular, se usaron modelos de regresión logística ordinal mediante el uso de métodos de pseudoprobabilidad de ponderación máxima y se informaron los valores de p de las pruebas de Wald de la hipótesis nula, de que la relación de probabilidades (OR) es uno. Para investigar si existe una relación significativa entre los genes individuales y el aumento de grado y/o estadificación o la patología adversa en la RP, se usaron modelos de regresión logística mediante el uso de los métodos de pseudoprobabilidad de ponderación máxima y se informaron los valores de p de las pruebas de Wald de la hipótesis nula, de que la relación de probabilidades (OR) es uno.

Existe una relación significativa entre los genes individuales y el aumento de grado y/o estadificación o la patología adversa en la RP, se usaron modelos de regresión logística mediante el uso de los métodos de pseudoprobabilidad de ponderación máxima y se informaron los valores de p de las pruebas de Wald de la hipótesis nula, de que la relación de probabilidades (OR) es uno.

Análisis de Coexpresión

En una modalidad ilustrativa, puede evaluarse la correlación conjunta de niveles de expresión génica entre las muestras de cáncer de próstata en estudio. Para este propósito, las estructuras de correlación entre genes y muestras pueden examinarse mediante los métodos de agrupamiento jerárquico. Esta información puede usarse para confirmar que los genes que se conoce que están altamente correlacionados en las muestras de cáncer de próstata se agrupan como se esperaba. Solo los genes que exhiben una relación nominalmente significativa (sin ajustar p <0,05) con cRFI en el análisis de regresión univariado de Cox PH se incluyen en estos análisis.

Los métodos de análisis de coexpresión pueden incorporar, por ejemplo, los coeficientes de correlación, análisis de red de coexpresión, análisis de camarillas, etcétera, y pueden basarse en datos de expresión de RT-PCR, microarreglos, secuenciación, y otras tecnologías similares. Por ejemplo, los grupos de expresión génica pueden identificarse mediante el uso de análisis de correlación por pares basados en los coeficientes de correlación de Pearson o Spearman. (Ver, por ejemplo, Pearson K. and Lee A., Biometrika 2, 357 (1902); C. Spearman, Amer. J. Psychol 15:72-101 (1904); J. Myers, A. Well, Research Design and Statistical Analysis, p. 508 (2da Ed., 2003).) En el Ejemplo 3 más abajo se describe un método ilustrativo para identificar genes coexpresados.

Normalización de los Niveles de Expresión

Los datos de expresión usados en los métodos descritos en la presente descripción pueden normalizarse. La normalización se refiere a un proceso para corregir (normalizar), por ejemplo, las diferencias en la cantidad de ARN analizado y la variabilidad en la calidad del ARN usado, para eliminar fuentes no deseadas de variación sistemática en las mediciones de Ct o Cp, y similares. Con respecto a los experimentos de RT-PCR que involucran muestras archivadas de tejidos fijados embebidos en parafina, se conoce que las fuentes de variación sistemática incluyen el grado de degradación del ARN en relación con la edad de la muestra del paciente y el tipo de fijador usado para almacenar la muestra. Otras fuentes de variación sistemática son atribuibles a las condiciones de procesamiento del laboratorio.

Los ensayos pueden proporcionar la normalización mediante la incorporación de la expresión de determinados genes de normalización, que no difieren significativamente en los niveles de expresión en las condiciones relevantes. Los genes de normalización ilustrativos descritos en la presente descripción incluyen genes de expresión constitutiva.

La expresión en el cáncer de próstata en comparación con el tejido de próstata no canceroso, y el seguimiento con diversas condiciones de muestra y proceso, por lo tanto permiten normalizar fuera de los efectos extraños.

En modalidades ilustrativas, uno o más de los siguientes genes se usaron como referencias mediante los cuales se normalizaron los datos de expresión de ARNm: AAMP, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1, y PGK1. Las mediciones de Ct o Cp promedio ponderado calibradas para cada uno de los genes pronósticos y predictivos pueden normalizarse con respecto a la media de cinco o más genes de referencia.

Los expertos en la técnica reconocerán que la normalización puede lograrse de numerosas maneras, y las técnicas descritas anteriormente pretenden ser solo ilustrativas, no exhaustivas.

Estandarización de los Niveles de Expresión

Los datos de expresión usados en los métodos descritos en la presente descripción pueden estandarizarse. La estandarización se refiere a un proceso para poner efectivamente todos los genes en una escala comparable. Esto se realiza porque algunos genes exhibirán más variación (un rango de expresión más amplio) que otros. La estandarización se realiza dividiendo cada valor de expresión por su desviación estándar en todas las muestras para ese gen. Las relaciones de riesgo se interpretan como el cambio proporcional en el riesgo para el criterio de valoración clínico (recurrencia clínica, recurrencia biológica, muerte por cáncer de próstata, o muerte por cualquier causa) por 1 aumento de la desviación estándar en la expresión.

Kits de la Invención

Los materiales para usar en los métodos de la presente invención son adecuados para la preparación de kits producidos de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Por lo tanto, la presente descripción proporciona kits que comprenden agentes, que pueden incluir sondas y/o cebadores específicos de genes o selectivos de genes, para cuantificar la expresión de los genes descritos para predecir el resultado pronóstico o la respuesta al tratamiento. Tales kits pueden contener opcionalmente reactivos para la extracción de ARN de muestras tumorales, en particular muestras de tejido fijadas en parafina y/o reactivos para amplificación de ARN. Además, los kits pueden comprender opcionalmente el (los) reactivo(s) con una descripción o etiqueta de identificación o instrucciones relacionadas con su uso en los métodos de la presente invención. Los kits pueden comprender recipientes (que incluyen placas de microlitros adecuadas para usar en una implementación automatizada del método), cada uno con uno o más de los diversos materiales o reactivos (típicamente, en forma concentrada) utilizados en los métodos, que incluye, por ejemplo, columnas cromatográficas, microarreglos prefabricados, tampones, los nucleótidos trifosfatos apropiados (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), transcriptasa inversa, ADN polimerasa, ARN polimerasa, y una o más sondas y cebadores de la presente invención (por ejemplo, cebadores de longitud apropiada de poli(T) o aleatorios unidos a un promotor reactivo con la ARN polimerasa). Los algoritmos matemáticos usados para estimar o cuantificar la información pronóstica o predictiva son, además, componentes potenciales de los kits.

Informes

Los métodos de esta invención, cuando se practican con propósitos de diagnóstico comercial, generalmente producen un informe o resumen de la información que se obtiene de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un informe puede incluir información sobre los niveles de expresión de uno o más genes, la clasificación del tumor o el riesgo de recurrencia del paciente, el pronóstico probable del paciente o la clasificación de riesgo, factores clínicos y patológicos, y/u otra información. Los métodos e informes de esta invención pueden incluir, además, almacenar el informe en una base de datos. El método puede crear un registro en una base de datos para el sujeto y llenar el registro con datos. El informe puede ser un informe en papel, un informe auditivo, o un registro electrónico. El informe puede mostrarse y/o almacenarse en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo de mano, computadora de escritorio, dispositivo inteligente, sitio web, etcétera). Se contempla que el informe se proporcione a un médico y/o al paciente. La recepción del informe puede incluir, además, establecer una conexión de red a una computadora servidor que incluya los datos e informes y solicitar los datos e informes de la computadora servidor.

Programa de Computadora

Los valores de los ensayos descritos anteriormente, tales como los datos de expresión, pueden calcularse y almacenarse manualmente. Alternativamente, las etapas descritas anteriormente pueden realizarse total o parcialmente mediante un producto de programa de computadora. La presente invención proporciona, por lo tanto, un producto de programa de computadora que incluye un medio de almacenamiento legible por computadora que tiene un programa de computadora almacenado en él. El programa puede, cuando lo lee una computadora, ejecutar cálculos relevantes en base a los valores que se obtienen del análisis de una o más muestras biológicas de un individuo (por ejemplo, niveles de expresión génica, normalización, estandarización, restricción a un umbral, y conversión de los valores del ensayos a una puntuación y/o texto o representación gráfica del estadio del tumor y la información relacionada). El producto del programa de computadora tiene almacenado en él un programa de computadora para realizar el cálculo.

La presente descripción proporciona sistemas para ejecutar el programa descrito anteriormente, cuyo sistema generalmente incluye: a) un entorno informático central; b) un dispositivo de entrada, conectado operativamente al entorno informático, para recibir datos del paciente, en donde los datos del paciente pueden incluir, por ejemplo, el nivel de expresión u otro valor que se obtiene de un ensayo mediante el uso de una muestra biológica del paciente, o datos de microarreglos, como se describió en detalle anteriormente;

La presente descripción proporciona sistemas para ejecutar el programa descrito anteriormente, cuyo sistema generalmente incluye: a) un entorno informático central; b) un dispositivo de entrada, conectado operativamente al entorno informático, para recibir datos del paciente, en donde los datos del paciente pueden incluir, por ejemplo, el nivel de expresión u otro valor que se obtiene de un ensayo mediante el uso de una muestra biológica del paciente, o datos de microarreglos, como se describió en detalle anteriormente; c) un dispositivo de salida, conectado al entorno informático, para proporcionar información a un usuario (por ejemplo, personal médico); y d) un algoritmo ejecutado por el entorno informático central (por ejemplo, un procesador), donde el algoritmo se ejecuta en base a los datos recibidos por el dispositivo de entrada, y en donde el algoritmo calcula una puntuación de expresión, restringe con respecto a un umbral, u otras funciones descritas en la presente descripción. Los métodos proporcionados por la presente invención pueden, además, automatizarse total o parcialmente.

Una vez descrita la invención, la misma se entenderá más fácilmente a través de la referencia a los siguientes Ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden limitar la invención de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1: selección de 81 genes para el desarrollo del algoritmo

Un estudio de identificación de genes para identificar los genes asociados con la recurrencia clínica, recurrencia bioquímica y/o la muerte por cáncer de próstata se describe en la solicitud provisional de los EE.UU. núms. 61/368 217, presentada el 27 de julio, 2010.; 61/414 310, presentada el 16 de noviembre de 2010; y 61/485 536, presentada el 12 de mayo de 2011, y en la Pub de EE.UU. núm. 20120028264, presentada el 25 de julio de 2011, y publicada el 2 de febrero de 2012. El análisis de RT-PCR se usó para determinar los niveles de expresión de ARN para 732 genes y genes de referencia en tejido de cáncer de próstata y tejido circundante de apariencia normal (NAT) en pacientes con cáncer de próstata en etapa temprana tratados con prostatectomía radical. Se determinaron los genes asociados significativamente (p <0,05) con el intervalo libre de recurrencia clínica (cRFI), el intervalo libre de recurrencia bioquímica (bRFI), la supervivencia específica del cáncer de próstata (PCSS), y el aumento de grado/ estadificación.

A partir de los genes que se identificaron como asociados con el resultado, se seleccionaron 81 genes para el desarrollo posterior de algoritmos. Los cebadores, las sondas, y las secuencias de amplicón de los 81 genes (y 5 genes de referencia) se enumeran en la Tabla A. Los genes seleccionados se encontraban entre los más pronósticos con respecto a cRFI y otras propiedades y se muestran en las Tablas 1A-1B. Otras propiedades consideradas fueron: 1) genes más fuertes con respecto a la regresión de la relación de riesgo estandarizada corregida media para la asociación de la expresión génica y cRFI en el tumor primario con patrón de Gleason; 2) Consistencia en la asociación (relación de riesgo) con cRFI mediante el uso de tumores con patrón de Gleason más alto; 3) Asociado con la variabilidad con mayor variabilidad entre pacientes que la variabilidad dentro del paciente, preferentemente; y 7) Altamente expresado.

El método de grado de asociación de tasa de descubrimiento verdadero (TDRDA) (Crager, Stat Med. 2010 Jan 15:29(l):33-45.) se usó en el análisis de la expresión génica y cRFI y los resultados se muestran en la Tabla 1A. La tasa de descubrimiento verdadero es la contrapartida de la tasa de descubrimiento falso. Se ajustaron los modelos de regresión de Cox PH univariado y se usó el método TDRDA para corregir las relaciones de riesgo estandarizadas estimadas para la regresión con respecto a la media (RM) y evaluar las tasas de descubrimiento falso para la identificación de genes con una relación de riesgo estandarizada absoluta de al menos un nivel especificado. Las tasas de descubrimiento falso se controlaron al 10 %. El método TDRDA identifica conjuntos de genes entre los cuales se espera que una proporción específica tenga una asociación absoluta (en la presente, la relación de riesgo estandarizada absoluta) de un grado específico o más. Esto conduce a un método de clasificación de genes que usa el grado máximo de asociación de límite inferior (MLB) para el que cada gen pertenece a un conjunto TDRDA. Los estimados del grado real de asociación de cada gen con la corrección aproximada del "sesgo de selección" debido a la regresión con respecto a la media pueden derivarse mediante el uso de la teoría normal bivariada simple y el enfoque empírico de Bayes de Efron y Tibshirani, Efron, Annals of Applied Statistics 2:197-223 (2008); Efron and Tibshirani. Genetic Epidemiology 23: 70-86. La Tabla 1A muestra el estimado corregido por RM de la relación de riesgo estandarizada y el MLB para cada gen mediante el uso de la expresión génica de la muestra con el patrón de Gleason primario (PGP) o el patrón de Gleason más alto (HGP). Los genes marcados con una dirección de asociación de -1 están asociados con una probabilidad reducida de recurrencia clínica, mientras que los marcados con una dirección de asociación de 1 se asocian con una mayor probabilidad de recurrencia clínica.

Los componentes de varianza dentro del paciente y entre pacientes se estimaron mediante el uso de un modelo mixto que trata el efecto del paciente como aleatorio. La media general y la desviación estándar de la expresión génica normalizada, así como también los componentes de varianza dentro y entre pacientes, se muestran en la Tabla 1A. Se usaron modelos de regresión de Cox PH univariada que usan la estimación de pseudoprobabilidad parcial ponderada máxima para estimar la asociación entre la expresión génica y la supervivencia específica del cáncer de próstata (PCSS). La relación de riesgo estandarizada (HR), el valor de p y el valor de q mediante el uso del método FDR de Storey se informan en la Tabla 1B, Storey, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 64:479-498 (2002). El valor de q puede interpretarse como la probabilidad posterior empírica de Bayes dados los datos de que el gen identificado es un descubrimiento falso, es decir, la probabilidad de que no tenga asociación con la recurrencia clínica. Se usaron modelos de regresión logística ordinal univariada para estimar la asociación entre la expresión génica y el patrón de Gleason, del patrón de Gleason del tumor primario (3, 4, 5). La relación de probabilidad (OR) estandarizada, el valor de p y el valor de q mediante el uso del método FDR de Storey se presentan en la Tabla IB.

La Figura 1 muestra un ejemplo de un dendrograma que representa la asociación de los 81 genes. El eje y corresponde a la distancia promedio entre grupos medidos como 1-Pearson r. Cuanto menor es el número (medida de distancia), más altamente correlacionados están los genes. El método de amalgamación es el promedio ponderado de grupos pareados, los genes que se coexpresaron se identificaron a partir del dendrograma y se agruparon en grupos de genes. En base a la Figura 1, los genes del estudio de identificación de genes se formaron en los siguientes grupos o subconjuntos de genes:

Grupo de genes de organización celular (BIN1; IGF1; C7; GSN; DES; TGFB1I1; TPM2; VCL; FLNC; ITGA7; COL6A1; PPP1R12A; GSTM1; GSTM2; PAGE4; PPAP2B; SRD5A2; PRKCA; IGFBP6; GPM6B; OLFML3; HLF)

Grupo de genes de epitelios basales (CYP3A5; KRT15; KRT5; LAMB3; SDC1)

Grupo de genes de respuesta al estrés (DUSP1; EGR1; FOS; JUN; EGR3; GADD45B; ZFP36)

Grupo de genes de andrógenos (FAM13C; KLK2; AZGP1; SRD5A2)

Grupo de genes del estroma (ASPN; SFRP4; BGN; THBS2; INHBA; COL1A1; COL3A1; COL1A2; SPARC; COL8A1; COL4A1; FN1; FAP; COL5A2)

Grupo de genes de proliferación (CDC20; TPX2; UBE2T; MYBL2; CDKN2C)

Ejemplo 2: Desarrollo de algoritmo basado en datos de un estudio complementario

El estudio complementario de la Clínica Cleveland ("CC") consta de tres cohortes de pacientes y análisis separados para cada cohorte como se describe en la Tabla 2. La primera cohorte (Tabla 2) incluye hombres con cáncer de próstata de bajo a alto riesgo (en base a los criterios de la AUA) del estudio Gene ID 09-002 que se sometieron a RP en la CC entre 1987 y 2004 y tenían tejido de biopsia de diagnóstico disponible en la CC. Las cohortes 2 y 3 incluyen hombres con cáncer de próstata de riesgo Bajo e Intermedio clínicamente localizado (en base a los criterios de la AUA), respectivamente, que podrían haber sido candidatos razonables para la vigilancia activa pero que se sometieron a prostatectomía radical (PR) dentro de los 6 meses posteriores al diagnóstico de cáncer de próstata por biopsia. El objetivo principal de la Cohorte 1 fue comparar el perfil molecular del tejido de biopsia con el del tejido de prostatectomía radical. El objetivo principal de las cohortes 2 y 3 fue desarrollar un predictor multigénico de aumento de grado/estadificación en la RP mediante el uso de tejido de biopsia en pacientes de riesgo bajo a intermedio en el momento del diagnóstico.

Se obtuvieron muestras de biopsia pareadas para un subconjunto de pacientes (70 pacientes) del estudio de identificación de genes. La expresión génica de los 81 genes seleccionados y los 5 genes de referencia (ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1, PGK1) se compararon en las muestras de RP y en el tejido de biopsia que se obtuvo de estos 70 pacientes.

Los 81 genes se evaluaron en las Cohortes 2 y 3 para su asociación con el aumento de grado y la estadificación. La asociación entre estos 81 genes y el aumento de grado y la estadificación en las Cohortes 2 y 3 se muestran en la Tabla 3. Se proporcionan valores de p y las relaciones de probabilidad estandarizados.

En este contexto, "aumento de grado" se refiere a un aumento en el grado de Gleason de 3+3 o 3+4 en el momento de la biopsia a mayor o igual a 3+4 en el momento de la RP. "Aumento de grado 2" se refiere a un aumento en el grado de Gleason de 3+3 o 3+4 en el momento de la biopsia a mayor o igual a 4+3 en el momento de la RP.

Tabla 2

Se exploraron varios modelos diferentes para comparar la expresión entre las muestras de RP y de biopsia. Los genes se escogieron en base a la consistencia de la expresión entre las muestras de RP y biopsia. Las Figuras 2A-2E son los gráficos de dispersión que muestran la comparación de la expresión génica normalizada (Cp) para muestras pareadas de cada paciente donde el eje x es la expresión génica normalizada de la muestra PGP RP (PGP) y el eje y es la expresión génica normalizada de la muestra de biopsia (BX). Las Figuras 3A-3D muestran gráficos del intervalo de expresión génica de genes individuales dentro de cada grupo de genes en las muestras de biopsia (BX) y de PGP RP.

Después de evaluar la concordancia de la expresión génica en muestras de biopsia y RP, se desarrollaron los siguientes algoritmos (modelos RS) que se muestran en la Tabla 4, donde los pesos se determinaron mediante el uso de datos no estandarizados, pero normalizados. Algunos genes, tales como SRD5A2 y GSTM2, que pertenecen al grupo de genes de organización celular, además se evaluaron por separado y se asignaron coeficientes independientes (ver la categoría "otros" en la Tabla 4). En otros casos, GSTM1 y GSMT2 se agruparon como un grupo de "estrés" oxidativo y se asignó un coeficiente a este grupo de "estrés" (ver modelos RS20 y RS22). Otros genes, tales como AZGP1 y SLC22A3, que no pertenecían a ninguno de los grupos de genes, también se incluyeron en determinados algoritmos (ver la categoría "otros" en la Tabla 4). Además, el grupo de genes de andrógenos se estableció para incluir FAM13C, KLK2, AZGP1, y SRD5A2. Algunos genes, tales como BGN, SPARC, FLNC, GSN, TPX2 y SRD5A2, se restringieron a un umbral antes de evaluarse en los modelos. Por ejemplo, los valores de expresión normalizados por debajo de 4,5 se establecieron en 4,5 para TPX2 y los valores de expresión normalizados por debajo de 5,5 se establecieron en 5,5 para SRD5A2.

La Tabla 5A muestra la relación de probabilidad estandarizada de cada uno de los modelos de RS que usan los datos del estudio original Gene ID descrito en el Ejemplo 1 durante el tiempo hasta cR y para el aumento de grado y estadificación y la combinación del aumento de grado y estadificación. La Tabla 5B muestra el rendimiento de cada uno de los modelos de RS mediante el uso de los datos del estudio complementario de la CC (Cohortes 2 y 3) para el aumento de grado y estadificación y la combinación del aumento de grado y estadificación. En este contexto, "aumento de grado" se refiere a un aumento en el grado de Gleason de 3+3 o 34-4 en la biopsia a mayor o igual a 3+4 en la prostatectomía radical. "Aumento de grado significativo" en este contexto se refiere al cambio de grado del grado de Gleason 3+3 o 3+4 en la biopsia a igual o mayor que 4+3 en la prostatectomía radical.

Además, los grupos de genes usados en el modelo RS25 se evaluaron solos y en diversas combinaciones. La tabla 6A muestra los resultados de este análisis mediante el uso de los datos del estudio de Identificación de Genes y la tabla 6B muestra los resultados de este análisis mediante el uso de los datos de las Cohortes 2 y 3 del Estudio Complementario de la CC.

La expresión génica de algunos genes puede restringirse, por ejemplo, SRD5A2 restringido = 5,5 si SRD5A2 <5,5 o SRD5A2 si SRD5A2 >5,5, y TPX2 restringido = 5,0 si TPX2 <5,0 o TpX2 si TPX2 >5,0, en donde los símbolos de los genes representan los valores de la expresión génica normalizada.

Además, las puntuaciones RS abiertas derivadas de la Tabla 4 pueden redimensionarse para estar entre 0 y 100. Por ejemplo, RS27 puede redimensionarse para que esté entre 0 y 100 de la siguiente manera:

RS (escalado) = 0 si 13,4 x (RSu+10,5)<0; 13,4 x (RSu+10,5) si 0<13,4x(RSu+10,5)<100; o 100 si 13,4 x (RSu+10,5)>100.

Mediante el uso del RS escalado, los pacientes pueden clasificarse en grupos de RS bajo, intermedio, y alto mediante el uso de puntos de corte especificados previamente, definidos más abajo en la Tabla B. Estos puntos de corte definen los límites entre los grupos de RS bajo e intermedio y entre los grupos de RS intermedio y alto. Los puntos de corte se derivaron del estudio de descubrimiento con la intención de identificar proporciones sustanciales de pacientes que en promedio tenían un riesgo clínicamente significativo bajo o alto de enfermedad agresiva. El RS escalado se redondea al número entero más cercano antes de que se apliquen los puntos de corte que definen los grupos RS.

Tabla B

Tabla 5A

Aumento de N Aumento de grado ^{Aumento de grado Aumento de Estadificación o Aumento} _{significativo Estadificación de Estadificación} Significativa RS OR Cl de 95 % OR Cl de 95 % OR Cl de 95 % OR Cl de 95 %

RSO 280 1,72 (1,22;2,41) 7,51 (4,37; 12,9) 2,01 (1,41;2,88) 2,91 (1,95;4,34)

RS1 287 1,73 (1,21;2,48) 5,98 (3,30; 10,8) 1,99 (1,40;2,82) 2,68 (1,80;3,97)

RS2 287 1,72 (1,19;2,48) 5,89 (3,18; 10,9) 2,02 (1,42;2,86) 2,67 (1,80;3,95)

RS3 287 1,71 (1,20;2,45) 6,30 (3,66; 10,8) 1,96 (1,38;2,80) 2,69 (1,84;3,93)

RS4 287 1,69 (1,18;2,42) 6,06 (3,48; 10,5) 1,99 (1,40;2,82) 2,65 (1,82:3,86)

RS5 288 1,78 (1,21;2,62) 5,60 (3,56; 8,81) 2,24 (1,59;3,15) 2,87 (1,93;4,28)

RS6 287 1,94 (1,37;2,74) 10,16 (5,82; 17,8) 2,07 (1,48;2,91) 3,11 (2,07;4,67)

RS7 288 1,91 (1,34;2,71) 9,34 (5,25; 16,6) 2,06 (1,47;2,89) 3,01 (2,02;4,48)

RS8 289 1,80 (1,27;2,55) 7,49 (4,02; 14,0) 2,09 (1,49;2.92) 2,86 (1,97;4,14)

RS9 288 2,00 (1,39;2,89) 9,56 (5,06; 18,0) 1,99 (1,42;2,79) 3,09 (2,08;4,60)

RS10 287 1,94 (1,37;2,75) 10,12 (5,79; 17,7) 2,09 (1,49;2,94) 3,14 (2,08;4,74)

RS11 288 2,09 (1,43;3,05) 9,46 (5,18; 17,3) 2,17 (1,54;3,05) 3,42 (2,24;5,23)

RS12 287 2,10 (1,45;3,04) 10,41 (2,92; 18,3) 2,17 (1,55;3,06) 3,52 (2,30;5,40)

RS13 287 2,10 (1,44;3,05) 9,40 (5,50; 16,1) 2,20 (1,55;3,13) 3,50 (2,25;5,43)

RS14 287 2,06 (1,42;2,99) 9,71 (5,65; 16,7) 2,18 (1,55;3,08) 3,53 (2,29;5,44)

RS15 288 1,92 (1,32;2,78) 7,93 (4,56; 13,8) 2,12 (1,51;2,99) 3,25 (2,20;4,80)

RS16 288 1,76 (1,23;2,52) 7,10 (4,12; 12,2) 1,99 (1,41;2,82) 2,94 (1,98;4,38)

RS17 286 2,23 (1,52;3,27) 7,52 (4,18; 13,5) 2,91 (1,93;4,38) 4,48 (2,72;7,38)

RS18 286 2,12 (1,46;3,08) 7,04 (3,87; 12,8) 2,89 (1,91;4,37) 4,30 (2,62:7,06)

RS19 287 2,14 (1,46;3,13) 6,90 (3,80;12,5) 2,88 (1,96;4,23) 4,20 (2,66;6,63)

RS20 286 2,30 (1,55;3,42) 8,41 (4,65;15,2) 2,90 (1,98;4,25) 4,78 (3,00;7;61)

RS21 287 2,23 (1,59;3,52) 8,83 (4,87;16,0) 2,63 (1,76;3,94) 4,93 (3,06;7,93)

RS22 286 2,16 (1,48;3,15) 7,57 (4,14; 13,8) 2,90 (1,96;4,27) 4,39 (2,75;7,01)

RS23 287 2,26 (1,53;3,35) 7,46 (4,24; 13,1) 2,80 (1,85;4,24) 4,79 (2,98;7,68)

RS24 286 2,21 (1,50;3,24) 8,01 (4,38; 17,7) 2,93 (1,99;4,31) 4,62 (2,89;7,39)

RS25 287 2,25 (1,53;3,31) 7,70 (4,25; 14,0) 2,76 (1,83;4,16) 4,76 (2,99;7,58)

RS26 287 2,23 (1,51;3,29) 6,67 (3,52; 12,7) 2,64 (1,81;3,86) 4,01 (2,56;6,28)

RS27 287 2,23 (1,51;3,29) 6,67 (3,52; 12,7) 2,64 (1,81;3,86) 4,01 (2,56;6,28)

Tabla 5B

(continuación)

Ejemplo 3: Análisis de Pilas de Camarillas para Identificar Genes Coexpresados

El propósito del método de pilas de camarillas descrito en este Ejemplo fue encontrar un conjunto de biomarcadores coexpresados (o sustitutos) que puedan usarse para predecir de manera confiable el resultado tan bien o mejor que los genes descritos anteriormente. El método usado para identificar los marcadores coexpresados se ilustra en la Figura 4. El conjunto de biomarcadores coexpresados se obtuvo sembrando la enumeración máxima de camarillas (MCE) con biomarcadores seleccionados que se extraen de la literatura científica. El método de enumeración máxima de camarillas (MCE) [Bron y otros, 1973]agrega genes en grupos que se coexpresan estrechamente de manera que todos los genes del grupo tienen un perfil de expresión similar. Cuando todos los genes en un grupo satisfacen una condición de similitud mínima, el grupo se llama camarilla. Cuando una camarilla es lo más grande posible sin admitir genes 'diferentes' en la camarilla, se dice que la camarilla es máxima. Mediante el uso del método de MCE, todas las camarillas máximas se buscan dentro de un conjunto de datos. Mediante el uso de este método, puede encontrarse casi cualquier grado de superposición entre las camarillas máximas, siempre que la superposición sea respaldada por los datos. Se ha demostrado que la enumeración máxima de camarillas [Borate y otros, 2009]es una forma efectiva de identificar módulos de genes coexpresados (MCG).

1 Definiciones

La siguiente tabla define algunos términos comúnmente usados en los análisis de pilas de camarillas de genes.

Tabla 7

2 Ejemplos de camarillas y pilas

La Figura 5 muestra una familia de tres gráficos diferentes. Un gráfico consta de nodos (numerados) y aristas de conexión (líneas). La Figura 5(a) no es una camarilla porque no hay aristas que conecten los nodos 3 y 4. La Figura 5(b) es una camarilla porque hay una arista que conecta todas las combinaciones de nodos por pares en el gráfico, la Figura 5(c) es una camarilla, pero no una camarilla máxima porque está contenida en la camarilla (b). Dado un gráfico con aristas de conexión, el algoritmo de MCE enumerará sistemáticamente todas las camarillas máximas con 3 o más nodos. Por ejemplo, el gráfico de la Figura 6 tiene dos camarillas máximas: 1-2-3-4-5 y 1-2-3-4-6.

Cuando se basa en datos de expresión génica, generalmente hay un gran número de camarillas máximas que son muy similares entre sí. Estas camarillas máximas pueden fusionarse en pilas de camarillas máximas. Las pilas son los módulos de genes finales de interés y, generalmente, son mucho menos numerosos que las camarillas máximas. La Figura 7 ilustra esquemáticamente el apilamiento de dos camarillas máximas.

3 Siembra

Con el fin de encontrar marcadores sustitutos coexpresados, pueden identificarse biomarcadores de la literatura y después usarlos para sembrar el MCE y los algoritmos de apilamiento. La idea básica es la siguiente: para cada semilla, calcule un conjunto de camarillas máximas (mediante el uso del algoritmo de MCE paralelo). Después, se forman pilas con las camarillas máximas que se obtienen para cada semilla, lo que produce un conjunto de pilas sembradas. Finalmente, se formas pilas con las pilas sembradas para obtener una "pila de pilas sembradas". La pila de pilas sembradas es una aproximación a las pilas que se obtendrían mediante el uso de los algoritmos de MCE/apilamiento convencionales (es decir, sin semillas). El método usado para identificar genes que se coexpresan con los genes descritos anteriormente se ilustra en la Figura 4 y se describe con más detalle a continuación.

3.1 Algoritmo de MCE de sembrado (etapas 1-4)

1. El proceso comienza mediante la identificación de un conjunto apropiado, Ss, de genes de siembra. En el presente caso, los genes de siembra se seleccionaron de los subconjuntos de genes descritos anteriormente.

2. Con los genes de siembra especificados, seleccione una medida de correlación, R(gi,g²), entre los perfiles de expresión génica de cualquiera de los dos genes, g¹ , g², junto con un umbral de correlación por debajo del cual g¹ , g², puede considerarse no correlacionado. Para cada gen de siembra s en el conjunto de siembra Ss, encuentre todos los pares de genes (s,g) en el conjunto de datos de manera que R(s,g) sea mayor o igual que el umbral de correlación. Supongamos que Gs es la unión de s y el conjunto de todos los genes correlacionados con s. Para el presente estudio, se usó el coeficiente de Spearman como medida de correlación y 0,7 como umbral de correlación.

3. Calcular el coeficiente de correlación para cada combinación de genes por pares (gi,gj) en Gs. Supongamos que Xs es el conjunto de todos los pares de genes para los cuales R(gi,gj) es mayor o igual al umbral de correlación. Si los genes se trazaran como en la Figura 5, habría una arista (línea) entre cada par de genes en Xs.

4. Ejecutar el algoritmo de MCE, como se describe en Schmidt y otros, (J. Parallel Distrib, Comput. 69 (2009) 417­ 428) sobre los pares de genes Xs para cada gen de siembra.

3.2 Algoritmo de apilamiento sembrado (etapas 5-6)

El propósito del apilamiento es reducir el número de camarillas a un número manejable de módulos de genes (pilas), Continuar con las etapas 5 y 6 de la Figura 4:

5. Para cada gen de siembra, clasifique las camarillas de mayor a menor, es decir, la mayor cantidad de nodos al menor número de nodos. De las camarillas restantes, encuentre la camarilla con la mayor superposición. Si la superposición excede un umbral T especificado por el usuario, combine las dos camarillas para formar la primera pila. Clasificar nuevamente las camarillas y la(s) pila(s) de mayor a menor y repetir la prueba de superposición y fusión. Repetir el proceso hasta que no se produzcan nuevas fusiones.

6. Uno ahora tiene un conjunto de pilas para cada gen de siembra. En la etapa final, todas las pilas sembradas se combinan en un conjunto de pilas, a. Como cálculo final, todas las pilas en a se apilaron, como en la etapa 5. Esta pila de pilas es el conjunto de módulos de genes usados para el presente estudio.

Los genes que se demostraron que se coexpresan con genes identificados por este método se muestran en las Tablas 8-11. "ID de pila" en las Tablas es simplemente un índice para enumerar las pilas y "sondaWt" se refiere al peso de la sonda, o al número de veces que aparece una sonda (gen) en la pila.

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Ejemplo 4: Estudio Prospectivo de Validación de RS27

Diseño del Estudio y Métodos Estadísticos

El algoritmo RS27 en la Tabla 4 se evaluó en un estudio prospectivo de validación clínica que incluyó a 395 pacientes evaluables que se sometieron a cirugía para el cáncer de próstata entre 1997 y 2010 en la Universidad de California, San Francisco (UCSF). Los pacientes tenían un riesgo bajo o intermedio (por CAPRA) de cáncer de próstata clínicamente localizado que podrían haber sido candidatos razonables para la vigilancia activa pero se sometieron a RP en la UCSF dentro de los 6 meses posteriores al diagnóstico de cáncer de próstata por biopsia. No se realizó aleatorización para la selección de los pacientes. Para cada paciente, se evaluaron muestras de biopsia de próstata de un bloque de tejido fijado embebido en parafina (FPET) que contenía uno o más núcleos de agujas que contenían tumores.

Para investigar si existe una relación significativa entre RS27 o cualquier componente de RS27 y la patología adversa en RP, se usaron modelos de regresión logística multinomial multivariable y univariable y valores de p de las pruebas de la relación de probabilidad (LR) de la hipótesis nula de que la relación de probabilidades (OR) se informó como uno. El modelo logístico multinomial se usó, además, para calcular estimaciones con intervalos de confianza de 95 % de la probabilidad de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos. Para evaluar la relación entre RS27, las covariables basales, y las combinaciones de estos factores con enfermedad de alto grado o no confinada a órganos, se usaron modelos de regresión logística binaria multivariable y univariable y se informaron valores de p de pruebas de relación de probabilidad de la hipótesis nula de que la relación de probabilidades (OR) es uno.

El criterio de valoración primario se formuló de la siguiente manera:

Tabla 12: Criterio de Valoración Clínica: Grado y Etapa en la RP

donde la puntuación de Gleason <3+3 y pT2 (denotado "1") es la categoría de referencia y todas las demás categorías (2-6) se comparan con la categoría de referencia.

Las combinaciones de celdas de la Tabla 12 evaluadas en modelos de regresión logística binaria incluyen lo siguiente: Celdas 2, 4, 6 vs. 1, 3, 5: Enfermedad no confinada a órganos

Celdas 5, 6 vs. 1, 2, 3, 4: Enfermedad de alto grado

Celdas 2, 4, 5, 6 vs. 1 y 3: Enfermedad de alto grado o no confinada a órganos

Algoritmo RS27

RS27 en una escala de 0 a 100 se derivó de las mediciones de expresión génica normalizadas de referencia de la siguiente manera.

RS27 abierta (RS27u) se definió como en la Tabla 4:

RS27u = 0,735*Grupo ECM (respuesta estromal) -0,368*Grupo de Migración (Organización Celular) -0,352*Grupo PSA (Andrógeno) 0,095*Proliferación (TPX2)

Dónde:

Puntuación del grupo ECM (respuesta estromal) = 0,527*BGN 0,457*COL1A1 0,156*SFRP4 Puntuación del grupo de Migración (Organización Celular) = 0,163*FLNC 0,504*GSN 0,421*TPM2

0,394*GSTM2

Puntuación del grupo de PSA (andrógeno) = 0,634*FAM13C 1,079*KLK2 O,642*AZGP1 0,997*SRD5A2

Restringido

Puntaje de proliferación (TPX2) = TPX2 Restringido

donde las puntuaciones restringidas de los genes de SRD5A2 y TPX2, se calculan de la siguiente manera:

5,5 siSRD5A2 <5,5 SRD5A2 Restringido = de otra manera SRD5A2

5,0 siTPX2 <5,0

TPX2 Restringido =

de otra manera

TPX2

RS27u después se redimensiona para estar entre 0 y 100 de la siguiente manera:

0 si 13,4 x (RS27u+10,5) <0

RS27

(redimensionado) 13,4 x (RS27u+10,5) si 0 < 13,4 x (RS27u+10,5) < 100

100 si 13,4 x (RS27u+10,5) > 100

Los pacientes se clasificaron en grupos RS27 bajos, intermedios y altos mediante el uso de puntos de corte especificados previamente definidos en la Tabla 13 más abajo. Estos puntos de corte definieron los límites entre los grupos RS27 bajos e intermedios y entre los grupos RS27 intermedios y altos. Los puntos de corte se derivaron del estudio de descubrimiento con la intención de identificar proporciones sustanciales de pacientes que en promedio tenían un riesgo significativo clínicamente bajo o alto de patología adversa. El RS27 se redondeó al número entero más cercano antes de aplicar los puntos de corte que definen los grupos RS27.

Tabla 13

Métodos de Ensayo

La parafina de las muestras se eliminó con un sustituto de Xileno Shandon (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). Los ácidos nucleicos se aislaron mediante el uso del kit Agencourt® FormaPure® XP (Beckman Coulter, Beverly, MA).

La cantidad de ARN se determinó mediante el uso del kit de ensayo de ARN Quant-iT™ RiboGreen® (Invitrogen ™, Carlsbad, CA). El ARN cuantificado se convirtió en ADN complementario mediante el uso del kit Omniscript® RT (Qiagen, Valencia, CA) y se combinó con los cebadores inversos para los 12 genes de RS27 y los 5 genes de normalización (ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1, PGK1) como se muestra en Tabla A. La reacción se incubó a 37 °C durante 60 minutos y luego se inactivó a 93 °C durante 5 minutos.

El ADNc se amplificó previamente mediante el uso de una mezcla maestra TaqMan® PreAmp Master hecha por Genomic Health, Inc. por Life Technologies (Carlsbad, CA) y los cebadores directo e inverso para todas las dianas como se muestra en la Tabla A. La reacción se colocó en un termociclador (DNA Engine® PTC 200G, Bio-Rad, Hercules, CA) y se incubó en las siguientes condiciones: A) 95 °C durante 15 segundos; B) 60 °C durante 4 minutos; C) 95 °C durante 15 segundos; y D) las etapas B y C se repitieron 8 veces. El producto amplificado se mezcló después con los cebadores y las sondas directas e inversas para cada una de las dianas como se muestra en la Tabla A y la mezcla maestra QuantiTect® Primer Assay (Qiagen, Valencia, CA) y se amplificó durante 45 ciclos en un LightCycler® 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). El nivel de expresión se calculó mediante el uso del método de punto de cruce (Cp).

Resultados

RS27 predijo significativamente la patología adversa, la enfermedad no confinada a órganos, la enfermedad de alto grado, y la enfermedad de alto grado o no confinada a órganos, y añade valor más allá de la puntuación de Gleason de las biopsias como se muestra en las Tablas 14, 15, 16, y 17, respectivamente.

Tabla 14 Predicción de Patología Adversa

Resultados obtenidos del modelo logístico multinomial multivariado para las celdas 2, 3, 4, 5, y 6 vs 1 en la Tabla 12. DF = grados de libertad

Tabla 15 Predicción de Enfermedad no confinada a órganos

Resultados obtenidos de modelos de regresión logística binaria univariable y multivariable para las celdas 2, 4, 6 vs.

1, 3, 5 en la Tabla 12

La relación de probabilidades para RS27 fue por aumento de 20 unidades

Tabla 16 Predicción de enfermedad de alto grado

Resultados obtenidos de modelos de regresión logística binaria univariable y multivariable para las celdas 5, 6 vs. 1­ 4 en la Tabla 12

La relación de probabilidades para RS27 fue por aumento de 20 unidades

Tabla 17 Predicción de enfermedad de alto grado o enfermedad no confinada a órganos

*Resultados obtenidos de modelos de regresión logística binaria univariable y multivariable para las celdas 2, 4, 5, 6 vs. 1, 3 en la Tabla 12

La relación de probabilidades para RS17 fue por aumento de 20 unidades

Además, RS27 predijo la patología adversa más allá de los factores de tratamiento clínico/patológico convencionales como se muestra en la Tabla 18.

Tabla 18 Predicción de Patología Adversa Más Allá de los Factores de Tratamiento Clínico/Patológico

Convencionales

Cuando se añadió a las herramientas clínicas/patológicas convencionales tales como CAPRA, RS27 refinó aún más el riesgo de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos. Mediante el uso de CAPRA solo, se identificó que el 5 % de los pacientes tenían más del 85 % de probabilidad de estar libres de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos en comparación con el 22 % de los pacientes identificados de estar libres de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos mediante el uso de RS27 además de CAPRA (Figura 8).

Cuando se añadió a las herramientas clínicas/patológicas convencionales tales como AUA (D'Amico y otros, JAMA 280:969-974, 1998), RS27 refinó aún más el riesgo de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos. Como se muestra en la Figura 9, mediante el uso de AUA solo, se identifica que el 0 % de los pacientes tienen más del 80 % de probabilidad de estar libres de enfermedad de alto grado o no confinada a órganos en comparación con el 27 % de los pacientes identificados que están libres enfermedad de alto grado o no confinada a órganos mediante el uso de GPS además de AUA.

Los genes individuales y los grupos de genes de RS27, además, se asociaron con patología adversa, enfermedad de alto grado, enfermedad no confinada a órganos, y enfermedad de alto grado o no confinada a órganos, en análisis univariable como se muestra en las Tablas 19, 20, 21, y 22, respectivamente.

Tabla 19 Asociación de Genes y Grupos de Genes con Patología Adversa, Análisis Univariable

Tabla 20 Asociación de Genes y Grupos de Genes con Enfermedad de Alto Grado, Análisis Univariable

Tabla 21 Asociación de Genes y Grupos de Genes con Enfermedad No Confinada a Órganos, Análisis

Univariable

Tabla 22 Asociación de Genes y Grupos de Genes con Enfermedad de Alto Grado o No Confinadas a Órganos,

Análisis Univariable

Ejemplo 5: RS27 Añade Valor Más Allá del Estado PTEN/TMPRSS2-ERG en la Predicción de Recurrencia Clínica La mutación PTEN y los genes de fusión TMPRSS2-ERG se asocian comúnmente con un mal pronóstico en el cáncer de próstata. En la presente, RS27 se analizó para determinar si puede proporcionar un valor más allá del estado Pt En /TMPRSS2-ERG para predecir la recurrencia clínica.

Los niveles de expresión de fusión de PTEN y TMPRSS2-ERG que se obtienen del estudio de identificación de genes descrito en el Ejemplo 1 anteriormente y en la publicación de los Ee .UU. Núm. 20120028264 se usaron para estratificar a los pacientes en grupos con PTEN bajo y PTEN normal. El estado PTEN y TMPRSS2-ERG ("T2-ERG") de los pacientes se encontró de la siguiente manera:

Tabla 23. Distribución de la Expresión de PTEN por el estado T2-ERG

Se estableció un punto de corte para "PTEN bajo" en <=8,5, que incluye aproximadamente el 13 % de los pacientes negativos para T2-ERG y el 28 % de los pacientes positivos para T2-ERG. PTEN normal se definió como >8,5. Se aplicaron Riesgos Proporcionales de Cox Univariable para evaluar la asociación entre el estado PTEN y el tiempo hasta la recurrencia clínica (cR). La Figura 10 y la Tabla 24 muestran que los pacientes con PTEN bajo tienen un mayor riesgo de recurrencia en comparación con los pacientes con PTEN normal.

Tabla 24

Chi Sq Valor de p H R Clde 95 %

12,44 <0,001 0,38 (0,22, 0,65)

Cuando los pacientes se estratificaron aún más en PTEN bajo/T2-ERG negativo ("categoría 0"), PTEN bajo/T2-ERG positivo ("categoría 1"), PTEN normal/T2-ERG negativo ("categoría 2"), y PTEN normal/T2-ERG positivo (“categoría 3”), ambas categorías bajas de PTEN tuvieron las tasas de recurrencia más bajas en comparación con los pacientes con PTEN normal como se muestra en la Figura 11 y en la Tabla 25.

Tabla 25

Categorías PTEN/T2-ERG CHISQ VALOR de P Clde 95 %

Cat 1 v 0 0,93 0,34 (0,28, 1,55)

Cat 2 v 0 11,80 <001 (0,12, 0,56)

Cat 3 v 0 7,05 0,01 (0,16, 0,78)

Las siguientes tablas resumen los resultados de un modelo multivariable con el estado PTEN/T2-ERG (Tabla 26) o el estado PTEN (Tabla 27), RS27, y la puntuación de Gleason de biopsia (Bx GS), lo que demuestra que RS27 añade valor más allá de los marcadores PTEn y T2-ERG y la GS Biopsia en la predicción de la recurrencia clínica.

Tabla 26

Tabla 27

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir una probabilidad de un resultado clínico seleccionado de recurrencia del cáncer, aumento de grado o estadificación del cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado y/o enfermedad de alto grado no confinada a órganos para un paciente con cáncer de próstata, que comprende:

determinar un nivel de transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, normalizados con respecto a la media de uno o más genes de referencia en una muestra biológica que contiene células cancerosas obtenidas de dicho paciente, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, comprenden BGN y COL1A1;

calcular una puntuación de recurrencia para el paciente mediante el uso de cualquiera de los algoritmos RS0, RS1, RS2, RS3, RS4, RS17, RS18, RS19, RS20, RS21, RS22, RS23, RS24, RS25, RS26 o RS27 mostrados en la Tabla 4; y predecir la probabilidad de recurrencia del cáncer, aumento de grado o estadificación del cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado, y/o enfermedad de alto grado no confinada a órganos para el paciente en base a la puntuación de recurrencia.

2. El método de la reivindicación 1, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, comprenden, además, STAT5B, NFAT5, AZGP1, ANPEP, IGFBP2, SLC22A3, ERG, AR, SRD5A2, GSTM1 o GSTM2.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde un aumento en la puntuación cuantitativa se correlaciona con una mayor probabilidad de recurrencia del cáncer, aumento de grado o estadificación del cáncer, patología adversa, enfermedad no confinada a órganos, enfermedad de alto grado, y/o enfermedad de alto grado no confinada a órganos.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el resultado clínico es el aumento de grado del cáncer de próstata.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el resultado clínico es el aumento de estadificación del cáncer de próstata.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el resultado clínico es la recurrencia del cáncer de próstata.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos, comprenden, además, ASPN, SPARC, FN1, COL3A1, COL4A1, INHBA, THBS2 o SFRP4.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos comprenden, además, FAM13C, KLK2, AZGP1, o SRD5A2.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos comprenden, además, FLNC, GSN, GSTM2, IGFBP6, PPAP2B, PPP1R12A, BIN1, VCL, IGF1, TPM2, C7 y GSTM1.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde los transcritos de ARN, o productos de expresión de estos comprenden, además, TPX2, CDC20 y MYBL2.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde se determina el nivel de cualquiera de las combinaciones de genes mostradas en la Tabla 4.