CN104880565A - Zfp36前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒，其试剂组成如下(20人份)：H₂O₂1-1.5ml、非免疫羊血清工作液1-1.5ml、一抗：兔源抗ZFP36多克隆抗体2.5-20ul、二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液1ml、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液1ml、DAB显色剂2-3ml。本用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒，包含检测肿瘤炎症状态的检测试剂。本发明能检测肿瘤炎症状态，为前列腺癌的诊断及前列腺癌患者术后复发转移率，术后复发转移时间和生存时间的预测提供了一种切实可行的方法。

Description

ZFP36前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及的是一种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂，同时还涉及该用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒。

 背景技术

前列腺癌是全球男性生殖系统最常见的恶性肿瘤疾病，对老年男性而言，其发病率在所有恶性肿瘤中居第二位。不同国家的前列腺癌的发病率存在较大差异。美国的前列腺癌发病率已经超越肺癌，成为发病率最高的男性恶性肿瘤。而我国的前列腺癌发病率虽然远低于欧美国家，但近年来呈明显的上升趋势。

当前的临床诊断中主要以前列腺特异抗原（PSA）对前列腺癌和前列腺增生进行鉴别，依据格利森（Gleason）评分来进行前列腺癌病理分级。然而，作为前列腺癌的诊断指标，尽管PSA的敏感性较强，但其特异性不足，研究显示前列腺增生、前列腺炎、急性尿潴留等多种疾病均可引起血浆中PSA增多。因此，开发敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标记物是前列腺癌的诊断工作的重点研究方向。

核转录因子（NF-κB）是免疫和炎症过程重要的调节因子，同时也是重要的肿瘤启动子。早期肿瘤组织中存在炎症微环境，同时与肿瘤相互作用的巨噬细胞可使NF-κB失活。NF-κB 可通过诱导IL-6、IL-1和TNF-a的表达而作用于免疫系统，进而提高肿瘤细胞生存能力并促进其增殖。

 ZFP36是真核生物基因组中最丰富的一类转录因子，具有广泛的生物学功能：如DNA识别、RNA包装、转录及转录后调控、蛋白折叠和装配及脂质结合，并参与肿瘤的形成和机体免疫干预等。最早在1989年被发现时将其描述为由瞬时早期反应基因—ZFP36基因编码的转录调控因子。ZFP36通过NF-κB/p65 介导的两个途径参与炎症应答的调节：1) 降解细胞因子 mRNA：虽然其本身无酶活性，但可通过 N 末端和 C 末端来降解多种细胞因子的 mRNA，此过程通过控制NF-κB/p65 相关基因亚型的选择及转录起始来进行，并可作为负反馈调节器参与NF-κB/p65相关的病理生理学过程，2) 阻滞NF-κB/p65细胞核移位，参与转录后调节.

研究显示ZFP36 的含量在多种肿瘤组织中出现明显下降，其原因可能是在肿瘤形成过程中，炎症细胞促进肿瘤生长，产生有利于肿瘤生长的微环境，诱发基因突变，促进血管生成。在肿瘤微环境中，炎症细胞、炎症趋化因子、细胞因子调节肿瘤生长、转移和分化，这种调节作用决定着肿瘤的发展方向。因此，研究肿瘤细胞差异的炎症反应调节机制，有望对前列腺癌预后诊断提供新的辅助诊断标记物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能检测肿瘤炎症状态，用于前列腺癌预后诊断的检测试剂。

另一目的在于提供包含该用于前列腺癌预后诊断的检测试剂的试剂盒。

本发明的用于前列腺癌预后诊断的检测试剂，其试剂组成如下(20人份)：

        H₂O₂                               1-1.5ml

       非免疫羊血清工作液                 1-1.5ml

一抗：兔源抗ZFP36多克隆抗体             2.5-20ul

二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG 工作液       1ml

链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液              1ml

DAB显色剂                                 2-3ml

本发明的用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒，包含检测肿瘤炎症状态的检测试剂。

本试剂盒使用方法如下：

(1) 将经拷片脱蜡、水化和抗原修复后的切片置于孵育盒中，用阻水笔把组织圈住，以免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，加H₂O₂ 50ul覆盖组织后室温孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；

(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3min，重复 3次；

(3) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul非免疫羊血清工作液，室温下孵育15分钟；

(4) 轻轻甩去血清，不漂洗，滴加50ul一抗（2mg/ml兔源抗ZFP36多克隆抗体）（ZFP36抗体:PBS =1:100），室温下孵育60分钟或4℃过夜；

(5) PBS冲洗5min， 重复3次；

(6) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液，室温下孵育20分钟；

(7) PBS冲洗5min，重复3次；

(8) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15分钟；

(9) PBS冲洗3min，重复 3次；

(10) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加100ul新鲜配制的DAB显色剂（20×DAB缓冲液、20×DAB底物、20×DAB色原各50ml滴加至850ml双蒸水中配制成1ml新鲜显色液，有效使用时间为30min）显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片；

(11)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞质和（或）细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分. 两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明采用ZFP36作为检测前列腺癌肿瘤炎症状态的生物标记物，弥补了PSA诊断特异性不足的缺点，为前列腺癌的诊断及前列腺癌患者术后复发转移率，术后复发转移时间和生存时间的预测提供了一种切实可行的方法。

附图说明

图1：ZFP36表达与生化复发生存率的关系。

图2：ZFP36表达与总体生存率的关系。

图3：PS刺激Du145、LNCap细胞后ZFP36的表达情况。

图4：大鼠炎症模型中前列腺癌细胞ZFP36的表达情况。

图5：前列腺癌组织与癌旁组织中ZFP36的表达情况。

具体实施方式

以下通过实验例来进一步证实本发明的有益效果。

实验例：指示前列腺癌的肿瘤炎症状态的标记物的选择实验

一：生物信息学数据挖掘

1．利用基因芯片微列阵数据集(Taylor dataset)，采用SPSS13.0对150例前列腺癌组织进行ZFP36表达水平芯片数据分析，结果发现ZFP36的表达量同血清PSA（P < 0.001），Gleason评分（P < 0.001），病理分期（P = 0.016），转移（P < 0.001）及生化复发（P < 0.001）显著相关，即血清PSA低，Gleason评分低，病理分期低，无转移，无生化复发的患者体内ZFP36表达量更高（见表1）。因此，研究表明，ZFP36参与了前列腺癌复杂的演进过程，可作为前列腺癌炎症状态判断的分子标记物。

2.结果表明：ZFP36高表达组的生化复发生存率和无转移生化复发生存率显著高于ZFP36低表达组（P < 0.001）（图1），但ZFP36高表达组与低表达组总体生存率无显著性差异（P > 0.05）（图2）。当Gleason评分为7时，ZFP36高表达组的生化复发生存率高于低表达组，且差异显著（P = 0.016），表明ZFP36具有作为判断前列腺肿瘤炎症状态分子标记物的潜力。

二：体外实验（细胞）

采用脂多糖(LPS)刺激人前列腺癌细胞（Du145、LNCap），通过实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)检测Du145、LNCap细胞中ZFP36的表达情况，结果显示，随着LPS浓度的增加，Du145、LNCap细胞中ZFP36表达量均增加，当LPS刺激量为10ng/ml时，ZFP36表达量达到最高，表明炎症可促进ZFP36在Du145、LNCap细胞中的表达（图3）。

1.细胞培养及处理

Du145、LNCap细胞加入含10%胎牛血清、2mM左旋谷酰胺，1%的抗生素的1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3-4天换液或传代。实验选用生长良好的对数生长期细胞，分别用0,10,100,1000ng/ml的LPS(E. coli, 055:B5, Sigma) 刺激Du145、LNCap细胞24h。

2.RNA提取及qPCR反应

离心收集培养的Du145，LNCap细胞沉淀，每一皿细胞加入1ml TRIzol试剂，提取总RNA，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度。参照RT-PCR Master Mix (#QPK-201, Toyobo Co, Ltd, Osaka, Japan)说明书，将RT-PCR Master Mix、上、下游引物和模板加入到20ml反应体系中，于实时荧光定量 PCR 仪进行实时荧光定量 PCR 扩增。

荧光定量PCR扩增程序如下：94℃预变性1min；94℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸45 s，共进行40个循环。

三：体内实验（大鼠前列腺炎症模型）

建立SD大鼠前列腺炎症模型，通过免疫组化检测ZFP36在前列腺组织中的表达情况，结果显示，与阴性对照组（saline）相比，实验组（E.coli）中ZFP36表达量显著上调， 实验进一步表明炎症可促进SD大鼠前列腺中ZFP36的表达（P < 0.05）（图4）。

20只大鼠随机分为模型组和对照组，每组10只。2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在无菌条件下，在大鼠下腹正中靠近尿道口处切开一1.0-1.5 cm左右的切口，依次切开腹壁和腹膜，暴露并提起膀胱，即可清楚显露膀胱后颈部的前列腺(双叶)。将前列腺两叶轻轻夹起，用1ml注射器向前列腺内注入拟给入病原体。模型组：1.5×10⁸/ml的大肠埃希菌液0.2ml分别注射到10只SD大鼠左右双叶前列腺内; 对照组：0.2ml生理盐水分别注射到10只SD大鼠双侧前列腺内。轻轻将注射病原体的前列腺及膀胱置入腹腔使之复位，然后缝合腹膜及皮肤。将对照组与模型组大鼠前列腺组织迅速投入准备好的液氮中，冻存。冰冻切片则将组织直接用包埋机进行包埋，切片，HE染色，使用ZFP36抗体进行免疫组织化学检测样本蛋白表达水平。

实施例1

用于前列腺癌炎症状态的检测试剂盒，其组成（20例量）如下：

试剂名称	含量
		(1) H2O2	1-1.5ml
(2) 非免疫羊血清工作液	1-1.5ml
		(3) 一抗：兔源抗ZFP36多克隆抗体	2.5-20ul
(4) 二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液	1ml
		(5) 链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液	1ml
(6) DAB显色剂	2-3ml

本试剂盒使用方法如下：

(1) 将经拷片脱蜡、水化和抗原修复后的切片置于孵育盒中，用阻水笔把组织圈住，以免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，加H₂O₂ 50ul覆盖组织后室温孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；

(2) PBS冲洗3min，重复 3次；

(3) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul非免疫羊血清工作液，室温下孵育15分钟；

(4) 轻轻甩去血清，不漂洗，滴加50ul一抗（2mg/ml兔源抗ZFP36多克隆抗体）（ZFP36抗体:PBS =1:100），室温下孵育60分钟或4℃过夜；

(5) PBS冲洗5min， 重复3次；

(6) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液，室温下孵育20分钟；

(7) PBS冲洗5min，重复3次；

(8) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15分钟；

(9) PBS冲洗3min，重复 3次；

(10) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加100ul新鲜配制的DAB显色剂（20×DAB缓冲液、20×DAB底物、20×DAB色原各50ml滴加至850ml双蒸水中配制成1ml新鲜显色液，有效使用时间为30min）显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片；

(11)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞质和（或）细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分. 两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。

使用本试剂盒检测180例临床样本（99种前列腺癌组织和81种癌旁组织）中ZFP36的表达情况。所有临床组织样本在手术后经广州市第一人民医院病理科进行病理证实：99例前列腺癌组织标本中71例Gleason评分小于等于8, 28例Gleason评分大于8（图5）。

组织样本收集

广州市第一人民医院住院及门诊PCa患者，临床手术切下的前列腺癌组织或增生组织、穿刺活检组织，液氮速冻收集保存。患者平均年龄70.71岁，临床样本详细资料见表2。

上述临床验证的结果进一步表明：ZFP36可以作为判断前列腺癌炎症状态的分子标记物。运用本发明提供的试剂盒，检测人体前列腺组织ZFP36的表达水平，根据ZFP36表达水平可以方便快捷地为前列腺癌诊断提供帮助，并对肿瘤的恶性程度判断提供帮助。

Claims (3)

1.一种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂，其试剂组成如下(20人份)：

        H₂O₂                               1-1.5ml

       非免疫羊血清工作液                 1-1.5ml

一抗：兔源抗ZFP36多克隆抗体             2.5-20ul

二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液       1ml

链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液              1ml

二氨基联苯胺显色剂                        2-3ml。

2.如权利要求1所述的用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒，包含检测肿瘤炎症状态的检测试剂。

3.一种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒使用方法如下：

(1) 将经拷片脱蜡、水化和抗原修复后的切片置于孵育盒中，用阻水笔把组织圈住，以免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，加H₂O₂ 50ul覆盖组织后室温孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；

(2) 磷酸盐缓冲液冲洗3min，重复 3次；

(3) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul非免疫羊血清工作液，室温下孵育15分钟；

(4) 轻轻甩去血清，不漂洗，滴加50ul一抗（2mg/ml兔源抗ZFP36多克隆抗体）（ZFP36抗体:PBS =1:100），室温下孵育60分钟或4℃过夜；

(5) PBS冲洗5min， 重复3次；

(6) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液，室温下孵育20分钟；

(7) PBS冲洗5min，重复3次；

(8) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15分钟；

(9) PBS冲洗3min，重复 3次；

(10) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺显色剂（20×DAB缓冲液、20×DAB底物、20×DAB色原各50ml滴加至850ml双蒸水中配制成1ml新鲜显色液，有效使用时间为30min）显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片；

(11)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞质和（或）细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分. 两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。