CN101344525A - 一种amacr自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种AMACR自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用，涉及体外免疫检测领域。本发明提供一种AMACR自身抗体ELISA检测方法，用特异性抗原AMACR包被微孔反应板，加待测血清到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照；加酶标二抗，显色和终止反应并读数；酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。本发明优点在于相对于目前国内市场上利用检测人血液中PSA的浓度来诊断前列腺癌的方法，在灵敏度和特异性上都有很大的提高。
Description
技术领域
一种AMACR自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用，本发明涉及体外免疫检测领域。
背景技术
统计数据表明，美国男性每年有179,000人被诊断为前列腺癌，死亡率大约是25％。我国每年新增前列腺癌的病例为70,000-80,000人。晚期前列腺癌的死亡率很高，但如果发现得早，前列腺癌病人可以获得很高的五年生存率。因而，对前列腺癌的早期诊断十分重要。传统前列腺癌的诊断依靠病理学检查，需取活体组织，给病人带来痛苦和不便。PSA(前列腺特异性抗原)是仅发现于男性前列腺的一种蛋白酶。目前，血液中PSA浓度作为前列腺癌的重要指标。但是它的灵敏度和特异性都很低，不能作为大规模诊断普查之用。所以，新的肿瘤标志物的研究一直是肿瘤研究的重要领域。[参考文献：马乐、吴小晶、冉俊；前列腺癌肿瘤标记物研究的历史、现状和发展，中华检验医学杂志2001年7月第24卷第四期]
AMACR(α-甲基酰基辅酶A消旋酶)是最新研究发现的一种消旋酶，在前列腺癌组织中表达水平显著高于正常人，可以作为早期前列腺癌病变的诊断指标。AMACR的优点在于它是癌症特异性，只存在于癌症组织。AMACR亦可用作其他癌症，例如结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤等等的诊断标志物。以结肠直肠癌和前列腺癌表达最高。但是AMACR在血液中的浓度太低，不适合单独作前列腺癌标记物。最新的临床研究表明，AMACR引起血液中抗AMACR抗体的增加，前列腺癌病人血样中产生明显的抗AMACR自身抗体。如检测血液中抗AMACR抗体，检出前列腺癌的灵敏度是77％，特异性是80％(p＜0.001)，远远强于PSA作为前列腺癌的检测指标。[参考文献：Journalof the National Cancer Institute，Vol.96，No.11，June 2，2004]
发明内容
本发明的目的在于通过间接ELISA法检测人体内AMACR自身抗体来提供一种高灵敏、可大规模检查前列腺癌的方法。
本发明所说的AMACR自身抗体的检测是通过如下技术方案来实现的：
一种α-甲基酰基辅酶A消旋酶AMACR自身抗体的检测方法：
A、试剂的配制：
(1)0.05M、pH9.6包被缓冲液：1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3，加超纯水定容至1000mL；
(2)0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS：8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；
(3)0.15M，pH7.4磷酸盐-吐温缓冲液PBST：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4和0.5mL Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；
(4)封闭液：1.0g明胶溶于100mL 0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS中；
(5)0.05M、pH 5.6底物缓冲液：39.8g Na2HPO4·12H2O、6.3g柠檬酸，加超纯水定容至1000mL；
(6)显色液：10mL pH5.6底物缓冲液、0.1mL 1％四甲基联苯胺(10mg四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜)和32μL0.75％H2O2，混合均匀，现用现配；
(7)终止液：2M H2SO4；
(8)阳性对照血清：取筛出的阳性血清OD450≥0.500，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；
(9)阴性对照血清：取正常男性血清OD450≤0.100，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；
所述的试剂的配制可按照实际需要按比例来配制；
B、AMACR自身抗体ELISA检测方法
(1)包被：用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1～10μg/mL，在微孔反应板中每孔加入50μL，37℃水浴中反应2h或4℃冰箱过夜，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(2)封闭：微孔反应板中每孔加入150μL封闭液，37℃反应1.5小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(3)加待测血清：用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将待测血清稀释10～500倍后以每孔50μL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
所述的加待测血清过程中，空白对照、阴性对照、阳性对照分别为应加的稀释后的待测血清作如下替代：空白对照为：只加50μL PBST稀释液；阴性对照为：加相同于待测血清稀释倍数的阴性对照血清50μL；阳性对照为：加相同于待测血清稀释倍数的阳性对照血清50μL；其余操作均与待测血清的操作相同；
(4)加酶标二抗：用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将商品化的HRP-鼠抗人IgG(辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG)稀释至工作浓度(可以根据购买HRP-鼠抗人IgG时所附的说明书来稀释)，微孔反应板中每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(5)显色：微量反应板每孔加50μL的显色液，37℃显色反应10～15分钟；
(6)终止反应并读数：微量反应板每孔加2M的硫酸25μL终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。
所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。
本发明的有益效果：
1.尽管肿瘤组织中AMACR表达很高，但病人的血液中的浓度却很低。本发明便是通过测定血液中AMACR自身抗体的浓度来预测肿瘤组织中AMACR蛋白的表达。
2.直接检测肿瘤组织中AMACR的表达需要从病人身上取活体标本，增加了病人的痛苦，不适用于健康检查。本发明的检测方式是无创检查，只要常规抽血即可。所以，可以用于大规模健康检查。
3.本发明的灵敏度和特异性好于临床上常用的PSA检测。
本发明的检测方式优点如下：
1.检测的是抗体，适合特定目的的特定需求；
2.包被的AMACR抗原纯度高，从而特异性高；
3.操作简单易行，可以标准化为产品；
4.检测成本低廉，适于推广；
5.通过酶标仪判读，减少主观性；
6.可以进行大批量检测。
具体实施方式
一、试剂的配制
(1)包被缓冲液(0.05M，pH9.6)：1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3，加超纯水定容至1000mL；
(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.15M，pH7.4)：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；
(3)磷酸盐-吐温缓冲液(PBST，0.15M，pH7.4)：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4、0.5ml Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；
(4)封闭液：1.0g明胶溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.15M，pH7.4)中；
(5)底物缓冲液(0.05M，pH5.6)：39.8g Na2HPO4·12H2O、6.3g柠檬酸，加超纯水定容至1000mL；
(6)显色液：10mL pH5.6底物缓冲液、0.1mL 1％四甲基联苯胺(10mg四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜)和32μL0.75％H2O2，混合均匀，现用现配；
(7)终止液：2M H2SO4；
(8)阳性对照血清：取筛出的阳性血清(OD450≥0.500)按1000单位/mL加青霉素和链霉素，无菌过滤；
(9)阴性对照血清：取正常男性血清(OD450≤0.100)按1000单位/mL加青霉素和链霉素，无菌过滤；
二、AMACR自生抗体ELISA检测方法
(1)包被：用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1～10μg/mL，按50μl每孔加入微孔反应板中，37℃水浴中反应2h，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(2)封闭：每孔加入150μL封闭液，37℃反应1.5小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(3)加待测血清：用磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)将待测血清稀释10～500倍后以每孔50μL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(4)加酶标二抗：用磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)将商品化的HRP-鼠抗人IgG(辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG)稀释至工作浓度(可以根据购买HRP-鼠抗人IgG时所附说明书来稀释)，微孔反应板每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(5)显色：微量分析板每孔加50μL的显色液，37℃显色反应10～15分钟；
(6)终止反应并读数：加2M的硫酸，微量分析板每孔加25μL终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。
三、临床上检测方法的应用
按上述实施步骤进行临床检测，表明本发明与传统PSA的检测方法相比，具有更高的灵敏度和特异性。
取前列腺癌病人血样30例、正常男性血样45例。
利用本发明所述方法进行检测，得出：真阳性23例、真阴性36例、假阳性9例、假阴性7例。
利用传统PSA的检测方法进行检测，得出：真阳性13例、真阴性23例、假阳性22例、假阴性17例。
经灵敏度公式：[真阳性数/(真阳性数+假阴性数)]×100％和特异性公式：[真阴性数/(假阳性数+真阴性数)]×100％可以得出：利用本发明检测前列腺癌灵敏度为76.7％，特异性为80％；利用PSA来检测前列腺癌灵敏度为43.3％，特异性为51.1％。
Claims (2)
1、一种α-甲基酰基辅酶A消旋酶AMACR自身抗体的检测方法，其特征是：
A、试剂的配制：
(1)0.05M、pH9.6包被缓冲液：1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3，加超纯水定容至1000mL；
(2)0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS：8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；
(3)0.15M，pH7.4磷酸盐-吐温缓冲液PBST：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4和0.5mL Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；
(4)封闭液：1.0g明胶溶于100mL 0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS中；
(5)0.05M、pH 5.6底物缓冲液：39.8g Na2HPO4·12H2O、6.3g柠檬酸，加超纯水定容至1000mL；
(6)显色液：10mL pH5.6底物缓冲液、10mg四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜配制的1％四甲基联苯胺0.1mL和32μL 0.75％H2O2混合均匀，现用现配；
(7)终止液：2M H2SO4；
(8)阳性对照血清：取筛出的阳性血清OD450≥0.500，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；
(9)阴性对照血清：取正常男性血清OD450≤0.100，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；
所述的试剂的配制按照实际需要按比例来配制；
B、AMACR自身抗体ELISA检测方法
(1)包被：用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1～10μg/mL，在微孔反应板中每孔加入50μL，37℃水浴中反应2h或4℃冰箱过夜，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(2)封闭：微孔反应板中每孔加入150μL封闭液，37℃反应1.5小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(3)加待测血清：用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将待测血清稀释10～500倍后以每孔50μL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
所述的加待测血清过程中，空白对照、阴性对照、阳性对照分别为应加的稀释后的待测血清作如下替代：空白对照为：只加50μL PBST稀释液；阴性对照为：加相同于待测血清稀释倍数的阴性对照血清50μL；阳性对照为：加相同于待测血清稀释倍数的阳性对照血清50μL；其余操作均与待测血清的操作相同；
(4)加酶标二抗：用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将商品化的HRP-鼠抗人IgG稀释至工作浓度，根据购买HRP-鼠抗人IgG时所附的说明书来稀释，微孔反应板中每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(5)显色：微量反应板每孔加50μL的显色液，37℃显色反应10～15分钟；
(6)终止反应并读数：微量反应板每孔加2M的硫酸25μL终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。
2、权利要求1所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，其特征是在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102393458A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-03-28 | 绍兴市人民医院 | 一种早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法 |
| CN102393457A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-03-28 | 绍兴市人民医院 | 早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法 |
| US8213005B2 (en) | 2003-07-22 | 2012-07-03 | King Saud University | Method for discriminating between benign and malignant prostate tumors |
| CN104755926A (zh) * | 2012-08-24 | 2015-07-01 | 卡斯西部储备大学 | 用于检测α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)和前列腺癌的系统和方法 |
| CN104880565A (zh) * | 2015-05-04 | 2015-09-02 | 贵州省人民医院 | Zfp36前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒 |
| CN106749642A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 张静 | 一种病体抗体的制备方法 |
| CN113671179A (zh) * | 2021-09-02 | 2021-11-19 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种kcnab2自身抗体的检测用试剂盒及其检测方法和应用 |
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8213005B2 (en) | 2003-07-22 | 2012-07-03 | King Saud University | Method for discriminating between benign and malignant prostate tumors |
| CN102393458A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-03-28 | 绍兴市人民医院 | 一种早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法 |
| CN102393457A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-03-28 | 绍兴市人民医院 | 早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法 |
| CN102393458B (zh) * | 2011-08-24 | 2013-12-18 | 绍兴市人民医院 | 一种早期乳腺癌血清诊断试剂 |
| CN104755926A (zh) * | 2012-08-24 | 2015-07-01 | 卡斯西部储备大学 | 用于检测α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)和前列腺癌的系统和方法 |
| CN104755926B (zh) * | 2012-08-24 | 2017-12-01 | 卡斯西部储备大学 | 用于检测α‑甲酰基‑CoA消旋酶(AMACR)和前列腺癌的系统和方法 |
| CN104880565A (zh) * | 2015-05-04 | 2015-09-02 | 贵州省人民医院 | Zfp36前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒 |
| CN106749642A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 张静 | 一种病体抗体的制备方法 |
| CN113671179A (zh) * | 2021-09-02 | 2021-11-19 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种kcnab2自身抗体的检测用试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN113671179B (zh) * | 2021-09-02 | 2023-10-03 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种kcnab2自身抗体的检测用试剂盒及其检测方法和应用 |
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