CN104569415A

CN104569415A - 一种胃蛋白酶原ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN104569415A
Application number: CN201510032770.9A
Authority: CN
Inventors: 赵焕朝; 俞宁; 胡锰鸽; 翟秋菊; 张喜娟
Original assignee: HENAN MAINCARE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HENAN MAINCARE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明涉及免疫检测领域，具体地涉及一种胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其方法。发明所述胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒，包括：1）胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板；2）HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体；3）校准品稀释液稀释后的系列胃蛋白酶原Ⅱ校准品；4）发光底物A；5）发光底物B；6）固体洗液。发明的试剂盒可以检测出血清中胃蛋白酶原Ⅱ的含量，血清中胃蛋白酶原Ⅱ水平与萎缩性胃炎、消化性溃疡呈正相关；在幽门螺杆菌的治疗中，通过监测除菌后的胃蛋白酶原变化能够判定治疗效果。它具有无创、检测方法简单快速、灵敏度高、检测范围宽等优点。

Description

一种胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是胃分泌的一种消化酶前体，是胃液中胃蛋白酶的无活性前体，为一个由375个氨基酸组成的蛋白多肽链，平均相对分子质量为42,000，人胃粘膜中有7组胃蛋白同工酶原。PG在核糖体上合成，由高尔基体分泌出细胞，被盐酸激活后变成胃蛋白酶。根据生化性质、免疫原性、细胞来源及组织内分布可分成PGⅠ、PGⅡ两个亚群，其中6~7组分免疫原性近似，称为PGⅡ，除由胃体和胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌外，泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ，胃粘膜合成的PGⅡ约为总量的25%。

胃蛋白酶原Ⅱ是胃蛋白酶原的一种，主要由胃底主细胞所分泌。亦有研究认为PG可由胃粘膜颈部粘液细胞或幽门腺粘液细胞所分泌，被盐酸激活后变成小分子的胃蛋白酶。胃蛋白酶只在酸性环境中发挥作用，pH>6即失去活性，pH=2时优先作用于天然蛋白质，pH=4时能消化某些特异性的肽。在体外，胃蛋白酶的持续作用可使蛋白分子的肽键约有30%分裂。胃蛋白酶不作用于角蛋白和黏蛋白，亦不作用于低相对分子质量的蛋白衍生物。在复合维生素与蛋白质结合和释放上，胃蛋白酶亦起主要作用。

血清PG浓度可作为胃酸分泌的检测指标，在幽门螺杆菌阳性体内，PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ比值与胃酸分泌量显著相关，其中后者与胃酸分泌量相关性更强。在幽门螺杆菌阴性体内，PGⅠ的水平与胃酸分泌量显著相关，但PGⅠ/PGⅡ比值与胃酸分泌量无相关性。通过血清PG浓度估计胃酸分泌量具有临床实用价值。

PG含量与良、恶性胃溃疡的鉴别有关，血清PGⅠ水平与萎缩性胃炎和消化性溃疡呈正相关，血清PGⅠ水平升高者，应注意其是否存在溃疡的可能性，对于临床上无症状溃疡的鉴别具有意义。血清PGⅠ与胃泌酸腺细胞功能相关，PGⅡ与胃底粘膜病变的相关性较大，血清PG反映胃总体分泌PG水平。胃酸分泌过多引起的浅表性胃炎和幽门螺杆菌感染引起的萎缩性胃炎都会导致PGⅠ和PGⅡ的分泌增加；慢性严重萎缩性胃炎当主细胞减少时PGⅠ含量下降；萎缩性胃炎当伴有肠化、胃窦宪假幽门腺化生时，PGⅡ含量会随之增高。

胃蛋白酶原对胃部疾病的发展历程，一般可表述为：浅表性胃炎→胃粘膜糜烂溃疡→萎缩性胃炎，及其它疾病具有良好的诊断和筛选作用。胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ检测试剂盒用于检测血清中的胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的含量，具有简便、快速的优势，避免了X-射线对人体的侵害和胃镜的不便。

20世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行分析检测，即利用发光的化学反应（chemiluminescence，CL）和生物反应（bioluminescence，BL）分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。这一方法从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段，近十年来获得了很大的发展。化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）灵敏度高（10~18mol）、快速（几秒钟内产生化学发光信号，有的情况下信号可持续几小时）、简便、测试中不使用有害试剂，因此成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

我公司采用的化学发光免疫分析方法，是利用酶催化发光底物使其发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子，利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成比例，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。与几种传统的免疫学检测方法对比而言，无论从最低检测限、检测时间、线性范围、试剂的稳定性、有无环境污染等方面对比，化学发光法的优势都显得极为突出。

发明内容

本发明的目的是提供一种胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。

本发明所述的胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒，包括：1）胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板；2）HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体；3）校准品稀释液稀释后的系列胃蛋白酶原Ⅱ校准品；4）发光底物A；5）发光底物B；6）固体洗液。

所述胃蛋白酶原Ⅱ抗体为鼠源或兔源人胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体。

所述包被的微孔板为48孔或96孔的微孔板条。

所述校准品稀释液的配方为：

去离子水 1L

三羟甲基氨基甲烷 6.06g

NaH₂PO₄ 0.2g

NaCl 8.2g

复合蛋白保护剂PHD 0.5g

5%酪蛋白 10g

Tween-20 10mL

0.1%叠氮钠 1mL

调节胃蛋白酶原Ⅱ校准品的稀释液pH为7.4。

所述发光底物A为鲁米诺和氢氧化钠溶液。

所述发光底物B为过氧化氢和对碘苯酚溶液。

所述固体洗液为PBST，PBST固体洗液配方为

KH₂PO₄ 4.8g

Na₂HPO₄•12H₂O 28.8g

NaCl 155g

Tween-20 10mL。

本发明的胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：1）配制PBST固体洗液及其稀释液；2）胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板的制备；3）HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体的制备；4）胃蛋白酶原Ⅱ校准品的制备；5）配制发光底物A、发光底物B；6）分装固体洗液、酶标抗体、校准品、发光底物A和发光底物B并组装为成品。其中：

所述配制PBST固体洗液及其稀释液的步骤为：混合均匀后的PBST固体洗液在气压500Pa、温度10℃、湿度30%状态下减压低温干燥，1h后用铝箔袋分装，使用时每5g的PBST固体洗液溶解在500mL去离子水中混匀。

所述制备胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板的步骤为：采用包被缓冲液将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体稀释至浓度为0.5~3μg/mL，将其吸附于微孔板上，再用固体洗液稀释液洗板两次，采用封闭液对包被后的微孔板进行封闭和保护。

所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

所述HRP标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体的制备的步骤为：配制酶标抗体稀释液，用过碘酸盐法将HRP标记在单克隆抗体上，经试验证明，胃蛋白酶原Ⅱ酶标抗体的工作浓度范围为50ng/mL以上。

所述胃蛋白酶原Ⅱ校准品的制备的步骤为：配制胃蛋白酶原Ⅱ校准品稀释液，将人工合成的胃蛋白酶原Ⅱ用校准品稀释液稀释成含量分别为2μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的系列浓度，建立定量校准品。

所述HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体所用的酶标抗体稀释液的配方为：

去离子水 1L

Na₂HPO₄ 2.9g

NaH₂PO₄ 0.2g

NaCl 8.2g

25%BSA 10g

酶稳定剂 1g

0.1%叠氮钠 1mL。

本发明的技术方案：一种血清胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测方法，基于化学发光免疫分析法。胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体包被化学发光微孔板，形成固相抗体。检测时向包被微孔中加入血清样品或胃蛋白酶原Ⅱ校准品，再加入HRP标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体进行反应，形成抗体-抗原-抗体-HRP复合物。反应后用固体洗液稀释液洗去未结合的HRP-胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体，然后加入发光底物，检测发光信号的强度。

根据本发明的试剂盒，HRP标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体与固相载体上包被的抗体同被测样品中的胃蛋白酶原Ⅱ形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”的夹心复合物结构，因此本发明采用的“双抗体夹心法”反应模式，既有效地利用抗原-抗体反应的高特异性，又结合了化学发光免疫分析技术的高灵敏度，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

根据本发明的试剂盒，反应模式为：微孔内先加入20µL胃蛋白酶原Ⅱ校准品或者血清，然后加入50µL的HRP标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体，在微量振荡器上混合30s，37℃温育1h，然后用固体洗液稀释液洗板5次，在吸水纸上轻轻拍干，加入发光底物A和B各50µL混匀5s，室温避光放置5分钟，用化学发光免疫分析仪检测发光值。

根据本发明的试剂盒，对读取的发光值采取线性拟合方式进行处理，可选对对数和四参数两种拟合方式计算样本中胃蛋白酶原Ⅱ的含量。

本发明的胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）化学发光定量检测试剂盒可以检测出血清中的胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）含量。血清浓度PG可作为胃酸分泌的检测指标，在幽门螺杆菌阳性体内，PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ比值与胃酸分泌量显著相关，其中后者与胃酸分泌量相关性更强。在幽门螺杆菌阴性体内，PGⅠ的水平与胃酸分泌量显著相关，但PGⅠ/PGⅡ比值与胃酸分泌量无相关性。故通过血清PG浓度估计胃酸分泌量具有临床实用价值。PG含量还与良、恶性胃溃疡的鉴别有关；血清PGⅠ水平与萎缩性胃炎、消化性溃疡呈正相关；在幽门螺杆菌的治疗中，通过监测除菌后的PG变化能够判定治疗效果。它具有无创、检测方法简单快速、灵敏度高、检测范围宽等优点。同时该胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）化学发光定量检测试剂盒的各项指标均已达到技术要求。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒的校准品线性图。

具体实施方式

实施例 1 应用碳酸盐包被缓冲液制备本发明的胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒

一、PBST固体洗液及稀释液的配制：

1）PBST固体洗液配方为

KH₂PO₄ 4.8g

Na₂HPO₄•12H₂O 28.8g

NaCl 155g

Tween-20 10mL。

2）混合均匀后的PBST固体洗液在气压500Pa、温度10℃、湿度30%状态下减压低温干燥，1h后用铝箔袋分装，使用时每5g的PBST固体洗液溶解在500mL去离子水中混匀，制得PBST固体洗液稀释液。

二、包被微孔板的制备：

1）抗体的选择：采用鼠源单克隆抗体。

2）微孔板的包被：用0.02mol/L的pH值为9.6的碳酸盐缓冲液将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体稀释至浓度为3μg/mL，配制成包被液，并以100μL/孔将其吸附于微孔板上。所述pH值为9.6的碳酸盐包被缓冲液的配方为：

去离子水 1L

Na₂CO₃ 0.636g

NaHCO₃ 1.172g

溶解混匀后，调pH至9.6。

3）封闭保护：用固体洗液稀释液洗板两次，以150μL/孔加封闭液于洗涤后的微孔板上，在21℃~25℃封闭3h，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24h封袋。然后贴签置2℃~8℃保存备用。封闭液的配方为：

去离子水 1L

Na₂CO₃ 1.59g

NaHCO₃ 2.93g

NaCl 8g

BSA 10g

0.1%叠氮钠 1mL

蔗糖 25g。

三、HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体的制备：

用过碘酸盐法将HRP标记在单克隆抗体上，酶标抗体稀释液的配方为：

去离子水 1L

Na₂HPO₄ 2.9g

NaH₂PO₄ 0.2g

NaCl 8.2g

25%BSA 10g

酶稳定剂 1g

0.1%叠氮钠 1mL。

四、酶标抗体浓度的选定：

经试验证明，胃蛋白酶原Ⅱ酶标抗体的工作浓度范围为50ng/mL以上。

五、校准品的制备：

将人工合成的胃蛋白酶原Ⅱ用校准品稀释液稀释成含量分别为2μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的系列浓度，建立定量校准品。校准品稀释液的配方为：

去离子水 1L

三羟甲基氨基甲烷 6.06g

NaH₂PO₄ 0.2g

NaCl 8.2g

复合蛋白保护剂PHD 0.5g

5%酪蛋白 10g

Tween-20 10mL

0.1%叠氮钠 1mL

调节胃蛋白酶原Ⅱ校准品稀释液pH为7.4。

六、发光底物A、发光底物B的制备

所述制备发光底物A的步骤为：10mg鲁米诺加入1000mL去离子水，再用氢氧化钠调pH至8.6。

所述制备发光底物B的步骤为：在去离子水中加入过氧化氢和对碘苯酚，使溶液中过氧化氢终浓度为3mmol/L，对碘苯酚终浓度为5mg/mL。

七、半成品及成品的组装

上述步骤所得产品分装即为半成品，随机抽取三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检测合格后组装成试剂盒。

实施例 2 应用磷酸盐包被缓冲液制备本发明的胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒

包被：用0.2mol/L的pH值为6.5的磷酸盐包被缓冲液将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体稀释至浓度为2μg/mL，配制成包被液，并以100μL/孔将其吸附于微孔板上，于37℃条件下包被4h。具体地，所述pH值为6.5的磷酸盐包被缓冲液的制备方法为：68.5mL的0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液和31.5mL的0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液混合即可。

抗体选用兔源人胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体，其他试剂与组分的配制方法与实施例1的方法一致。

实施例 3 应用Tris-HCl包被缓冲液制备本发明的胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒

包被：用0.05mol/L的pH值为7.4的Tris-HCl包被缓冲液将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体稀释至浓度为0.5μg/mL，配制成包被液，并以100μL/孔将其吸附于微孔板上，于37℃条件下包被4h。具体地，所述pH值为7.4的Tris-HCl包被缓冲液的制备方法为：50.0mL的0.1mol/L的Tris碱溶液和42.0mL的0.1mol/L的HCl溶液混合后，加水定容至100mL。

其他试剂与组分的配制方法与实施例1的方法一致。

本发明所述试剂盒的使用方法

一、实验前准备：

1）将试剂盒从冷藏环境中取出，放置室温（18℃~25℃）平衡至少30min；

2）将恒温箱或水浴锅调到37℃，待温度稳定后使用；

3）取固体洗液5g用500mL去离子水溶解后备用。

二、样本的要求：

1）采用正确医用技术收集血清样本；

2）样本中的沉淀物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用；

3）严重溶血或脂血的样本不能用于测定；

4）样本在24h内测定，则应存放于2℃~8℃冰箱中，如果长期使用，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融；使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。

三、检测方法：

使用实施例1所制胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒进行检测的具体操作步骤如下：

1）取出一定量的包被孔，每孔分别加入20µL校准品或血清样品；

2）每孔分别加入酶结合物50µL；

3）在微型振荡器上振荡30s使孔内液体混合均匀，置37℃温育60min。

4）用固体洗液稀释液洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

5）每孔分别加入发光底物A和B各50µL，室温（18℃~25℃）避光反应5min；

6）化学发光检测仪检测发光强度；

7）结果计算：选择适当的曲线拟合方式，本试剂盒推荐使用线性回归拟和方程建立标准曲线，但也可根据不同情况采用其他拟和方式。以系列校准品浓度的对数值为横坐标（X轴），以系列校准品发光强度值的对数值为纵坐标（Y轴）建立标准曲线（log-log）（图1），将测得的血清样品的发光强度值代入标准曲线（log-log）中，计算得出血清样品中的胃蛋白酶原Ⅱ含量。

四、参考值（参考范围）：

用本试剂盒测定1000份正常人空腹血清样本，得到正常人空腹状态参考范围为小于15μg/L。与胃蛋白酶原Ⅰ联合检测，正常人样本胃蛋白酶原Ⅰ与胃蛋白酶原Ⅱ比值的参考值大于7.5。各实验室应根据自己实际条件及接触人群建立正常参考值范围。本试剂盒仅作诊断的辅助手段之一，供临床医生参考。

本发明的胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒在方法学上的鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制造的试剂盒进行鉴定，经过大量的实验证明，本发明的试剂盒在用于胃蛋白酶原Ⅱ浓度水平测定时，该方法学指标如下：

1）准确度：将胃蛋白酶原Ⅱ高值样本A加入到低值样本B中，所加入样本A与样本B之间的体积比为1:9，根据下面公式计算回收率（R）。回收率为98%，在85%~115%范围内。

式中：

R-回收率；

V-加入A液体积；

V₀-血清或相应基质B的体积；

C-血清样品或相应基质加入A液后的检测浓度；

C₀-血清样品或相应基质B的检测浓度；

Cs-A液的浓度。

2）最低检测限：用零校准品或样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，求出对应的浓度值，即为最低检测限。最低检测限为0.5μg/L，小于1μg/L。

3）线性：将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值样本浓度须接近线性范围的下限。每一浓度重复检测2次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。在所规定的线性范围（1~100）μg/L内，试剂盒的相关系数r为0.9984，r≥0.9900。

4）重复性：用浓度分别为（20±5）μg/L和（50±10）μg/L的样本各重复检测10次，计算其浓度值，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV=SD/M×100%得出变异系数CV。变异系数（CV）为7.99%，小于15%。

5）特异性：用含量为200μg/L的PGⅠ样本重复检测2次，计算其浓度值。结果为0.2μg/L，小于1μg/L。

6）批间差：用三个批号试剂盒分别检测同一份样本，浓度为（50±10）μg/L，各重复10次，计算其浓度值，计算30次浓度值的平均值M和标准差SD，根据公式CV=SD/M×100%得出变异系数CV。三个批号试剂盒之间的批间变异系数（CV）为10.55%，小于15%。

7）热稳定性试验：取有效期内的试剂盒于37℃放置7天，检测准确度、最低检测限、线性和重复性仍符合要求。

本试剂盒线性范围为（1.0~100.0）μg/L。测定值超过100.0μg/L的样本，其结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果。如果要获得其更准确的结果，需对样本进行稀释。本发明所述胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒所用样本量少，来源简单方便，体外检测对测试对象没有任何毒副作用。同时本发明采用的化学发光免疫分析方法，不产生放射性污染。利用本发明方法进行检测，与几种传统的免疫学检测方法对比而言，无论从最低检测限、检测时间、线性范围、试剂的稳定性、有无环境污染等方面对比，化学发光法的优势都显得极为突出。本发明的试剂盒除具有检测方法简单快速的优点之外，还具有灵敏度高、检测范围宽等优点，因此越来越多的受到临床诊断实验室的关注，是近年来该领域的研究热点。因此本发明为临床检测血清中胃蛋白酶原Ⅱ含量，从而筛查胃癌和评价幽门螺旋杆菌（HP）根除治疗效果，为判定消化性溃疡复发和胃癌切除术后复发提供了一种简单、快速、灵敏的方法。

Claims

1.一种胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒，包括：1）胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板；2）HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体；3）校准品稀释液稀释后的系列胃蛋白酶原Ⅱ校准品；4）发光底物A；5）发光底物B；6）固体洗液；

所述胃蛋白酶原Ⅱ抗体为鼠源或兔源人胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体；

所述包被的微孔板为48孔或96孔的微孔板条；

所述校准品稀释液的配方为：

去离子水 1L

三羟甲基氨基甲烷 6.06g

NaH₂PO₄ 0.2g

NaCl 8.2g

复合蛋白保护剂PHD 0.5g

5%酪蛋白 10g

Tween-20 10mL

0.1%叠氮钠 1mL

所述发光底物A为鲁米诺和氢氧化钠溶液；

所述发光底物B为过氧化氢和对碘苯酚溶液；

所述固体洗液为磷酸盐吐温缓冲液（PBST），PBST固体洗液配方为

KH₂PO₄ 4.8g

Na₂HPO₄•12H₂O 28.8g

NaCl 155g

Tween-20 10mL。

2.权利要求1所述胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1）配制PBST固体洗液及其稀释液；2）胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板的制备；3）HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体的制备；4）胃蛋白酶原Ⅱ校准品的制备；5）配制发光底物A、发光底物B；6）分装固体洗液、酶标抗体、校准品、发光底物A和发光底物B并组装为成品；其中：

1）所述配制PBST固体洗液及其稀释液的步骤为：混合均匀后的PBST固体洗液在气压500Pa、温度10℃、湿度30%状态下减压低温干燥，1h后用铝箔袋分装，使用时每5g的PBST固体洗液溶解在500mL去离子水中混匀；

2）所述制备胃蛋白酶原Ⅱ抗体包被微孔板的步骤为：采用包被缓冲液将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体稀释至浓度为0.5~3μg/mL，将其吸附于微孔板上，再用固体洗液稀释液洗板两次，采用封闭液对包被后的微孔板进行封闭和保护；

3）所述HRP标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体的制备的步骤为：配制酶标抗体稀释液，用过碘酸盐法将HRP标记在单克隆抗体上，经试验证明，胃蛋白酶原Ⅱ酶标抗体的工作浓度范围为50ng/mL以上；

4）所述胃蛋白酶原Ⅱ校准品的制备的步骤为：配制胃蛋白酶原Ⅱ抗原校准品稀释液，将人工合成的胃蛋白酶原Ⅱ抗原用校准品稀释液稀释成含量分别为2μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的系列浓度，建立定量校准品。

3.权利要求2所述胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述HRP标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体所用的酶标抗体稀释液的配方为：

去离子水 1L

Na₂HPO₄ 2.9g

NaH₂PO₄ 0.2g

NaCl 8.2g

25%BSA 10g

酶稳定剂 1g

0.1%叠氮钠 1mL。

4.权利要求2所述胃蛋白酶原Ⅱ化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。