CN111077321B - 抗mcv抗体定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒及其制备方法。所述抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法包括:分别制备包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液。本发明的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,容易操作,原料成本低,制得的抗MCV抗体定量检测试剂盒使用方便,能够准确定量检测样本中的抗MCV抗体含量,可用于类风湿性关节炎的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析领域,尤其涉及一种抗MCV抗体定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种异质性多病因疾病,患者约占全世界人口的0.5%~1.0%,其特点是滑膜关节的慢性炎症导致身体残疾,而且,关节炎症的发展以及药物治疗可能带来的副作用,使得类风湿性关节炎患者的死亡率上升。越来越多证据表明,对类风湿性关节炎疾病的早期干涉治疗可以更有效地控制病情、减轻关节损伤、对疾病结果起到更好的预后。
类风湿性关节炎的诊断标志物主要有:类风湿因子(RF)、抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗纤聚蛋白抗体(AFA)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、抗RA33抗体、抗Sa抗体、6-磷酸葡萄糖异构酶等。尽管CCP抗体具有良好的免疫检测特性,但对于类风湿性关节炎活动度的分析会产生不一致的结果;此外,该指标尚未揭示抗原结构,不能用于描述受影响组织,且未涉及发病机理。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,容易操作,原料成本低,制得的抗MCV抗体定量检测试剂盒能够准确定量检测样本中的抗MCV抗体含量。
本发明的目的还在于提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒,使用方便,能够准确定量检测样本中的抗MCV抗体含量,可用于类风湿性关节炎的诊断。
为实现以上目的,本发明首先提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,包括:分别制备包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液;其中,
制备包被板的步骤包括:将含有突变型瓜氨酸波形蛋白的包被液加入微孔板条的微孔中进行包被,之后弃去孔内液体,将封闭液加入微孔板条的微孔中进行封闭,之后弃去孔内液体,对微孔板条进行干燥;
制备酶标液的步骤包括:将酶标物和酶联抗体进行偶联;其中,所述酶联抗体为采用抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的抗体;
制备系列校准品的步骤包括:在校准品基质液中分别加入不同浓度的抗MCV抗体,得到不同浓度的校准品,其中,所述校准品基质液为含有8wt%~12wt%体检健康人血清的缓冲液;以缓冲液作为零点校准品;所述零点校准品选用的缓冲液与所述校准品基质液中的缓冲液相同;
制备质控品的步骤包括:在质控品基质液中加入已知浓度的抗MCV抗体,其中,所述质控品基质液为体检健康人血清;
制备底物液的步骤包括:在缓冲液中加入所述酶标物的反应底物;
制备样本稀释用缓冲液的步骤包括:在缓冲液中加入表面活性剂,混合均匀;
制备洗涤液的步骤包括:在缓冲液中加入盐与表面活性剂,混合均匀。
具体的,制备包被板的步骤中:
可选的,所述包被液为含有0.5wt%~1.5wt%突变型瓜氨酸波形蛋白的碳酸盐缓冲液,所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为8.8~11.8;
可选的,所述封闭液为含有0.8wt%~1.2wt%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9;
可选的,将包被液加入微孔板条中进行包被的条件为:2℃~8℃,包被16小时~24小时;将封闭液加入微孔板条中进行封闭的条件为:34℃~40℃,封闭1.5小时~2小时。
具体的,制备包被板的步骤中:
可选的,对微孔板条进行干燥的方式为:将微孔板条置于干燥箱中35℃~40℃干燥1.5小时~2小时;
可选的,所述微孔板条的材质为聚苯乙烯。
具体的,制备酶标液的步骤中:
可选的,将酶标物和酶联抗体进行偶联后,用缓冲液将酶标物和酶联抗体的偶联产物稀释至工作浓度;
可选的,将偶联产物稀释至工作浓度用的缓冲液为含有0.5wt%~1.5wt%表面活性剂的Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液;所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9;
可选的,所述酶标物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯中的至少一种;
优选的,所述酶联抗体为采用抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的IgG类抗体。
在本发明一些实施例中,所述包被板上包被的突变型瓜氨酸波形蛋白为人源性突变型瓜氨酸波形蛋白;
所述酶联抗体为采用人源性抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的抗体;
可选的,所述酶联抗体包括羊抗人抗体、兔抗人抗体和鼠抗人抗体中的至少一种。
具体的,制备系列校准品的步骤中:
可选的,所述缓冲液为Tris缓冲液,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3;
可选的,所述系列校准品包括抗MCV抗体浓度分别为0U/mL、20U/mL、40U/mL、100U/mL、300U/mL、1000U/mL的校准品。
在本发明一些实施例中,制备质控品的步骤中:
所述质控品包括抗MCV抗体浓度为0U/mL~20U/mL的第一水平质控品与抗MCV抗体浓度为100U/mL~300U/mL的第二水平质控品。
具体的,制备底物液的步骤中:
所述酶标物的反应底物为化学发光底物;
可选的,所述酶标物为辣根过氧化物酶和/或吖啶酯时,所述酶标物的反应底物包括过氧化物;所述酶标物为碱性磷酸酶时,所述酶标物的反应底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐;
可选的,所述底物液中的缓冲液为柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液,所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为4.8~6.4,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3。
可选的,制备样本稀释用缓冲液的步骤中,在Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中加入0.5wt%~1.5wt%的表面活性剂,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9;
可选的,所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。
具体的,制备洗涤液的步骤中:
可选的,在磷酸盐缓冲液中加入160~200g/L的氯化钠和0.5wt%~1.5wt%的表面活性剂,混合均匀,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.3mol/L~0.7mol/L,pH为7.3~8.3;
可选的,所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。
本发明还提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒,由上述抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法制得,包括:包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液。
本发明的有益效果:
本发明的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,容易操作,原料成本低,制得的抗MCV抗体定量检测试剂盒使用方便,能够准确定量检测样本中的抗MCV抗体含量,可用于类风湿性关节炎的诊断。优选的,所述试剂盒的底物液中的反应底物为化学发光底物,化学发光法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、反应时间短、成本低等特征,可以快速方便的检测样本中抗MCV抗体的变化水平,对类风湿性关节炎的预测和预后辅助判断起到重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为实施例1制备的抗MCV抗体定量检测试剂盒的校准曲线;
图2为实施例4中ORGENTEC测定结果与本发明试剂盒测定结果的相关方程的曲线图。
具体实施方式
如本文所用之术语:
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中,此短语将使权利要求为封闭式,使其不包含除那些描述的材料以外的材料,但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时,其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1~5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1~4”、“1~3”、“1~2”、“1~2和4~5”、“1~3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中,除非另有指明,所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位,1份可表示任意的单位质量,如可以表示为1g,也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份,B组分的质量份为b份,则表示A组分的质量和B组分的质量之比a:b。或者,表示A组分的质量为aK,B组分的质量为bK(K为任意数,表示倍数因子)。不可误解的是,与质量份数不同的是,所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生,例如,A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本文中,所述“多个”指的是两个或两个以上。
研究表明,突变型瓜氨酸波形蛋白(MCV)抗体相较于其他针对含有瓜氨酸化抗原决定簇的抗体对类风湿性关节炎的诊断具有更好的敏感性,在类风湿性关节炎发展进程中突变型瓜氨酸波形蛋白(MCV)抗体的水平变化甚至比抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体水平变化提早6个月出现,所以该抗体是早期类风湿性关节炎诊断更为优秀的标志物。
本发明首先提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,包括:分别制备包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液。
其中,制备包被板的步骤包括:将含有突变型瓜氨酸波形蛋白的包被液加入微孔板条的微孔中进行包被,之后弃去孔内液体,将封闭液加入微孔板条的微孔中进行封闭,之后弃去孔内液体,对微孔板条进行干燥。
具体的,制备包被板的步骤中:
可选的,所述包被液为含有0.5wt%~1.5wt%突变型瓜氨酸波形蛋白的碳酸盐缓冲液,所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为8.8~11.8。
在本发明一些实施例中,所述包被液为含有1wt%突变型瓜氨酸波形蛋白的碳酸盐缓冲液。优选的,所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.3。
可选的,所述封闭液为含有0.8wt%~1.2wt%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9。
在本发明一些实施例中,所述封闭液为含有1wt%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。优选的,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为7.4。
可选的,将包被液加入微孔板条中进行包被的条件为:2℃~8℃,包被16小时~24小时;将封闭液加入微孔板条中进行封闭的条件为:34℃~40℃(优选为37℃),封闭1.5小时~2小时。
可选的,对微孔板条进行干燥的方式为:将微孔板条置于干燥箱中35℃~40℃(例如37℃)干燥1.5小时~2小时。
可选的,对微孔板条进行干燥后,将微孔板条装入铝箔袋中,放入干燥剂后封口。
可选的,所述微孔板条的材质为聚苯乙烯。
优选的,所述包被板放置于2℃~8℃储存备用。
制备酶标液的步骤包括:将酶标物和酶联抗体进行偶联;其中,所述酶联抗体为采用抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的抗体。
具体的,制备酶标液的步骤中:
具体的,酶标物和酶联抗体进行偶联后得到的偶联产物需要储存时,在偶联产物中加入占总体系0.05wt%~0.2wt%(例如0.1wt%)的甘油,将所述偶联产物于-20℃温度条件下储存备用。
可选的,为提高酶标液的使用便捷性,将酶标物和酶联抗体进行偶联后,用缓冲液将酶标物和酶联抗体的偶联产物稀释至工作浓度,从而在使用时不需要再对酶标液进行稀释。
可选的,将偶联产物稀释至工作浓度用的缓冲液为含有0.5wt%~1.5wt%(例如1wt%)表面活性剂的Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液;所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9。可选的,所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。优选的,所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.8;所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为7.4。
可选的,采用高碘酸钠氧化法对酶标物和酶联抗体进行偶联。
可选的,所述酶标物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯中的至少一种。
优选的,所述酶联抗体为采用抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的IgG类抗体,这是因为IgG类抗体是生物体液内主要的Ig(免疫球蛋白),是动物感染抗原后产生的较稳定的Ig,约占血液中Ig总量的70 wt%~75wt%,量多易纯化;其他类型Ig,如IgM为急性感染后产生的Ig,量少且不稳定,约占血液中Ig总量的10wt%。
可选的,所述包被板上包被的突变型瓜氨酸波形蛋白为人源性突变型瓜氨酸波形蛋白,所述酶联抗体为采用人源性抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的抗体。
可选的,所述酶联抗体包括羊抗人抗体、兔抗人抗体和鼠抗人抗体中的至少一种。
可选的,所述酶标液于2℃~8℃温度条件下储存备用。
制备系列校准品的步骤包括:在校准品基质液中分别加入不同浓度的抗MCV抗体,得到不同浓度的校准品,其中,所述校准品基质液为含有8wt%~12wt%体检健康人血清的缓冲液;以缓冲液作为零点校准品;所述零点校准品选用的缓冲液与所述校准品基质液中的缓冲液相同。
具体的,制备系列校准品的步骤中:
可选的,所述缓冲液为Tris缓冲液,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3。
在本发明一些实施例中,所述校准品基质液为含有10wt%体检健康人血清的Tris缓冲液。优选的,所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.8。
可选的,所述系列校准品包括抗MCV抗体浓度分别为0U/mL、20U/mL、40U/mL、100U/mL、300U/mL、1000U/mL的校准品。
可选的,所述系列校准品放置于2℃~8℃储存备用。
制备质控品的步骤包括:在质控品基质液中加入已知浓度的抗MCV抗体,其中,所述质控品基质液为体检健康人血清。
制备质控品的步骤中:
在本发明一些实施例中,所述质控品包括抗MCV抗体浓度为0U/mL~20U/mL(健康人群含量范围)的第一水平质控品与抗MCV抗体浓度为100U/mL~300U/mL(类风湿性关节炎重症患者含量范围)的第二水平质控品。
可选的,所述质控品放置于2℃~8℃储存备用。
制备底物液的步骤包括:在缓冲液中加入所述酶标物的反应底物。
具体的,制备底物液的步骤中:
优选的,所述酶标物的反应底物为化学发光底物。
化学发光法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、反应时间短、成本低等特征,可以快速方便的检测样本中抗MCV抗体的变化水平,对类风湿性关节炎的预测和预后辅助判断起到重要的作用。
可选的,所述酶标物为辣根过氧化物酶和/或吖啶酯时,所述酶标物的反应底物包括过氧化物(例如过氧化氢、过氧化脲等),所述底物液包含8mmol/L~12mmol/L的过氧化脲;优选的,所述底物液还包含3wt%~8wt%的曲拉通X-100,所述曲拉通X-100能够对过氧化物起到稳定作用,避免过氧化物分解。
在一些实施例中,所述酶标物为辣根过氧化物酶和/或吖啶酯时,所述底物液为包含10mmol/L的过氧化物和5wt%的曲拉通X-100的Tris缓冲液。优选的,所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.8。
可选的,所述酶标物为碱性磷酸酶时,所述酶标物的反应底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)所述底物液包含3~10mmol/L的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐。
在一些实施例中,所述酶标物为碱性磷酸酶时,所述底物液为包含5.5mmol/L的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐的Tris缓冲液。优选的,所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.8。
辣根过氧化物酶与吖啶酯催化过氧化物反应发光的原理为:酶催化过氧化物脱氧的过程中,酶会形成不稳定的中间体,这个中间体分解发射光子。
碱性磷酸酶催化AMPPD反应发光的原理为:碱性磷酸酶催化AMPPD脱去磷酸根基团,形成不稳定的中间体,这个中间体分解发射光子。
可选的,所述底物液中的缓冲液为柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液,所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为4.8~6.4,柠檬酸缓冲液用于吖啶酯反应体系,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,Tris缓冲液用于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶反应体系。优选的,所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为5.6,所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.8。
可选的,所述底物液放置于2℃~8℃储存备用。
制备样本稀释用缓冲液的步骤包括:在缓冲液中加入表面活性剂,混合均匀。
具体的,制备样本稀释用缓冲液的步骤中:
可选的,在Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中加入0.5wt%~1.5wt%的表面活性剂,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9。
可选的,在Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中加入1wt%的表面活性剂,混合均匀(例如以搅拌的方式),得到样本稀释用缓冲液。优选的,所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为10.8,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L,pH为7.4。
可选的,所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。
可选的,所述样本稀释用缓冲液放置于2℃~8℃储存备用。
制备洗涤液的步骤包括:在缓冲液中加入盐与表面活性剂,混合均匀。
具体的,制备洗涤液的步骤中:
可选的,在磷酸盐缓冲液中加入160~200g/L的氯化钠和0.5wt%~1.5wt%的表面活性剂,混合均匀(例如以搅拌的方式),所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.3mol/L~0.7mol/L,pH为7.3~8.3。
在洗涤液中添加氯化钠等盐类物质的作用在于增加洗涤液的离子强度,进而增强洗涤效果。
可选的,所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。
在本发明一些实施例中,在磷酸盐缓冲液中加入180g/L的氯化钠和1wt%的吐温-80,混合均匀。优选的,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.5mol/L,pH为7.8。
可选的,所述洗涤液放置于2℃~8℃或室温(20℃~28℃)储存备用。
优选的,所述酶标液、系列校准品、质控品、缓冲液、底物液和洗涤液中均添加防腐剂,优选的,所述防腐剂为Proclin300,所述防腐剂的用量为0.5wt%~1.5wt%(例如1wt%)。
可选的,所述抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法还包括:将包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液组合装入包装盒内形成抗MCV抗体定量检测试剂盒。
可选的,所述抗MCV抗体定量检测试剂盒放置于2℃~8℃储存备用。
基于上述抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,本发明还提供一种抗MCV抗体定量检测试剂盒,由上述抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法制得,其包括:包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液。
可选的,所述抗MCV抗体定量检测试剂盒还包括包装盒,所述包装盒用于容纳包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液。
本发明的抗MCV抗体定量检测试剂盒通过固相酶免疫法进行检测:样本中的抗MCV抗体与包被板上的抗突变型瓜氨酸波形蛋白结合,再与加入的酶标液中的酶标抗体形成三明治复合结构,该复合结构的数量与样本中抗MCV抗体的含量成正比,酶标抗体中的酶催化底物反应后,使用发光仪读取数值,通过使用校准品定标绘制校准曲线,可以计算出样本中抗MCV抗体的含量。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1 抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备
第一步,包被有突变型瓜氨酸波形蛋白(人源性蛋白)的包被板的制备
将突变型瓜氨酸波形蛋白用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH 10.3)稀释成1wt%的包被液,再将包被液加入到聚苯乙烯微孔板条中置于2℃~8℃,包被16小时~24小时。弃去孔内液体,用含有1wt%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH 7.4)作为封闭液,加入到微孔板条中置于37℃,封闭1.5小时~2小时。弃去孔内液体,将微孔板条置于干燥箱中37℃干燥1.5小时~2小时,最后将微孔板条装入铝箔袋中,放入干燥剂后封口。包被板半成品放置于2℃~8℃储存备用。
第二步,酶标液的制备
采用高碘酸钠氧化法将辣根过氧化物酶和酶联抗体进行偶联后加入0.1wt%的甘油,于-20℃储存备用。生产时,用缓冲液(含有1wt%吐温-20的Tris缓冲液(0.05mol/L,pH10.8))将偶联液稀释至工作浓度,并加入1wt%的Proclin300作为防腐剂。酶标液半成品放置于2℃~8℃储存备用。其中,所述酶联抗体为采用人源性抗MCV抗体作为抗原对兔进行免疫后,经过分离纯化兔血清获得的IgG类抗体。
第三步,系列校准品的制备
用含有10wt%体检健康人血清与Tris缓冲液(0.05mol/L,pH 10.8)混匀作为校准品基质液,分别加入抗MCV抗体制成如下浓度的系列校准品:0U/mL、20U/mL、40U/mL、100U/mL、300U/mL、1000U/mL。校准品半成品放置于2℃~8℃储存备用。
第四步,质控品的制备
用体检健康人血清作为质控品基质液,分别加入抗MCV抗体制成如下浓度的质控品:水平1:0U/mL~20U/mL、水平2:100U/mL~300U/mL。质控品半成品放置于2℃~8℃储存备用。
第五步,底物液的制备
将10mmol/L的过氧化脲和5wt%的曲拉通X-100加入到Tris缓冲液(0.05mol/L,pH10.8)中,然后加入1wt%的Proclin300作为防腐剂,搅拌均匀。底物液半成品放置于2℃~8℃储存备用。
第六步,缓冲液的制备
在Tris缓冲液(0.05mol/L,pH 10.8)或磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH 7.4)中加入1wt%的吐温-80,搅拌均匀。缓冲液半成品放置于2℃~8℃储存备用。
第七步,洗涤液的制备
在磷酸盐缓冲液(0.5mol/L,pH 7.8)中加入180g/L的氯化钠和1wt%的吐温-20,搅拌均匀。洗涤液半成品放置于室温(20℃~28℃)储存备用。
第八步,将上述步骤制备的半成品组合装入包装盒内,形成抗MCV抗体定量检测试剂盒成品。
实施例2 抗MCV抗体定量检测试剂盒的使用
第一步,样本要求
检测样本为采用常规医学技术收集的血清、血浆或全血样本。样本应无污染、无溶血、无脂血。
第二步,试剂准备
将实施例1制备的抗MCV抗体定量检测试剂盒放置在室温(20℃~28℃)平衡至少30分钟,用纯化水将洗涤液做50倍稀释备用,用纯化水将缓冲液做5倍稀释备用。
第三步,样本准备
吸取10μL样本加入990μL稀释后的缓冲液,充分混匀备用。
第四步,试验步骤
在包被板内各孔中分别加入100μL的校准品、质控品和稀释后的样本,室温(20℃~28℃)放置10分钟或37℃温浴5分钟。之后吸出包被板各孔内组分,用300μL稀释后的洗涤液冲洗3次。
在包被板内各孔中加入100μL酶标液,室温(20℃~28℃)放置10分钟或37℃温浴5分钟。之后吸出包被板内各孔内组分,用300μL稀释后的洗涤液冲洗3次。
在包被板各孔中加入100μL底物液,室温(20℃~28℃)放置3~5分钟。之后在包被板条各孔中加入100μL终止液,室温(20℃~28℃)放置3~5分钟。
将包被板放入化学发光免疫分析仪中读取数值,使用四参数法拟合校准曲线(如图1所示),计算样本中抗MCV抗体的含量。
图1中校准曲线的相关系数R2为0.9985,非常接近1,说明抗MCV抗体定量检测试剂盒中的试剂性能较好,检测准确性较高。图1中,横坐标X表示抗MCV抗体的浓度,单位是U/mL;纵坐标Y表示光量子数。
实施例3 抗MCV抗体定量检测试剂盒测定临床样本
用本发明实施例1制备的抗MCV抗体定量检测试剂盒与ORGENTEC DiagnostikaGmbH公司生产的Anti-MCV试剂盒同时测定200例临床样本,以ORGENTEC的测定结果为X轴,本发明抗MCV抗体定量检测试剂盒的测定结果为Y轴(x轴与y轴的单位均为U/mL),进行回归分析,将测定结果进行比对(如表1所示)。如图2所示,为ORGENTEC测定结果与本发明试剂盒测定结果的相关方程的曲线图,相关方程为Y=0.9964X + 0.0402,相关系数R² = 0.9994,可以看出,经统计学验证,两种方法测值相关性良好,也即是说,本发明的抗MCV抗体定量检测试剂盒检测结果准确可靠。
表1. ORGENTEC测定结果与本发明试剂盒测定结果比对
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外,本领域的技术人员能够理解,尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征,但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如,在上面的权利要求书中,所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (14)
1.一种抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括:分别制备包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液;其中,
制备包被板的步骤包括:将含有突变型瓜氨酸波形蛋白的包被液加入微孔板条的微孔中进行包被,之后弃去孔内液体,将封闭液加入微孔板条的微孔中进行封闭,之后弃去孔内液体,对微孔板条进行干燥;
制备酶标液的步骤包括:将酶标物和酶联抗体进行偶联;其中,所述酶联抗体为采用抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的抗体;
制备系列校准品的步骤包括:在校准品基质液中分别加入不同浓度的抗MCV抗体,得到不同浓度的校准品,其中,所述校准品基质液为含有8wt%~12wt%体检健康人血清的缓冲液;以缓冲液作为零点校准品;所述零点校准品选用的缓冲液与所述校准品基质液中的缓冲液相同;
制备质控品的步骤包括:在质控品基质液中加入已知浓度的抗MCV抗体,其中,所述质控品基质液为体检健康人血清;
制备底物液的步骤包括:在缓冲液中加入所述酶标物的反应底物;
制备样本稀释用缓冲液的步骤包括:在缓冲液中加入表面活性剂,混合均匀;
制备洗涤液的步骤包括:在缓冲液中加入盐与表面活性剂,混合均匀;
制备酶标液的步骤中:
将酶标物和酶联抗体进行偶联后,用缓冲液将酶标物和酶联抗体的偶联产物稀释至工作浓度;
将偶联产物稀释至工作浓度用的缓冲液为含有0.5wt%~1.5wt%表面活性剂的Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液;所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9;
所述酶标物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯中的至少一种;
所述酶联抗体为采用抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的IgG类抗体。
2.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备包被板的步骤中:
所述包被液为含有0.5wt%~1.5wt%突变型瓜氨酸波形蛋白的碳酸盐缓冲液,所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为8.8~11.8;
所述封闭液为含有0.8wt%~1.2wt%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9;
将包被液加入微孔板条中进行包被的条件为:2℃~8℃,包被16小时~24小时;将封闭液加入微孔板条中进行封闭的条件为:34℃~40℃,封闭1.5小时~2小时。
3.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备包被板的步骤中:
对微孔板条进行干燥的方式为:将微孔板条置于干燥箱中35℃~40℃干燥1.5小时~2小时;
所述微孔板条的材质为聚苯乙烯。
4.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述包被板上包被的突变型瓜氨酸波形蛋白为人源性突变型瓜氨酸波形蛋白;
所述酶联抗体为采用人源性抗MCV抗体作为抗原对机体进行免疫后获得的抗体;
所述酶联抗体包括羊抗人抗体、兔抗人抗体和鼠抗人抗体中的至少一种。
5.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备系列校准品的步骤中:
所述缓冲液为Tris缓冲液,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3。
6.如权利要求5所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,
所述系列校准品包括抗MCV抗体浓度分别为0U/mL、20U/mL、40U/mL、100U/mL、300U/mL、1000U/mL的校准品。
7.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备质控品的步骤中:
所述质控品包括抗MCV抗体浓度为0U/mL~20U/mL的第一水平质控品与抗MCV抗体浓度为100U/mL~300U/mL的第二水平质控品。
8.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备底物液的步骤中:
所述酶标物的反应底物为化学发光底物。
9.如权利要求8所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述酶标物为辣根过氧化物酶和/或吖啶酯时,所述酶标物的反应底物包括过氧化物;所述酶标物为碱性磷酸酶时,所述酶标物的反应底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐。
10.如权利要求8所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,
所述底物液中的缓冲液为柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液,所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为4.8~6.4,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3。
11.如权利要求1所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备样本稀释用缓冲液的步骤中,在Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中加入0.5wt%~1.5wt%的表面活性剂,所述Tris缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为9.3~12.3,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L~0.07mol/L,pH为6.9~7.9。
12.如权利要求11所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,制备洗涤液的步骤中,在磷酸盐缓冲液中加入160~200g/L的氯化钠和0.5wt%~1.5wt%的表面活性剂,混合均匀,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.3mol/L~0.7mol/L,pH为7.3~8.3。
13.如权利要求11所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。
14.一种抗MCV抗体定量检测试剂盒,由如权利要求1-13任一项所述的抗MCV抗体定量检测试剂盒的制备方法制得,其特征在于,包括:包被板、酶标液、系列校准品、质控品、样本稀释用缓冲液、底物液和洗涤液。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN203838159U (zh) * | 2014-02-26 | 2014-09-17 | 郑州浪峰生物技术有限公司 | 一种检测抗环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子的胶体金试纸条 |
CN104569415A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-04-29 | 河南美凯生物科技有限公司 | 一种胃蛋白酶原ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 |
CN204347035U (zh) * | 2014-12-23 | 2015-05-20 | 天津瑞华生物科技有限公司 | 一种环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒 |
CN106771253A (zh) * | 2017-01-17 | 2017-05-31 | 安徽同致生物工程股份有限公司 | 肝素结合蛋白测定试剂盒 |
CN109270268A (zh) * | 2018-08-23 | 2019-01-25 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种组织多肽抗原tpa检测试剂盒及其制备和使用方法 |
CN109270272A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-01-25 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014135668A1 (de) * | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Universität Leipzig | Verfahren und kit zur zytokinanalyse aus einer menschlichen vollblutprobe |
-
2020
- 2020-01-02 CN CN202010002462.2A patent/CN111077321B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN203838159U (zh) * | 2014-02-26 | 2014-09-17 | 郑州浪峰生物技术有限公司 | 一种检测抗环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子的胶体金试纸条 |
CN204347035U (zh) * | 2014-12-23 | 2015-05-20 | 天津瑞华生物科技有限公司 | 一种环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒 |
CN104569415A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-04-29 | 河南美凯生物科技有限公司 | 一种胃蛋白酶原ⅱ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 |
CN106771253A (zh) * | 2017-01-17 | 2017-05-31 | 安徽同致生物工程股份有限公司 | 肝素结合蛋白测定试剂盒 |
CN109270268A (zh) * | 2018-08-23 | 2019-01-25 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种组织多肽抗原tpa检测试剂盒及其制备和使用方法 |
CN109270272A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-01-25 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Derganova Olga 等.Selected cyclic citrullinated peptides derived from the sequence of mutated and citrullinated vimentin (MCV) are targeted by different antibodies subclasses in patients with rheumatoid arthritis in Russian patients.Clinical and Experimental Rheumatology.2014,第32卷(第5期),第622-629页. * |
陈凤英 等.抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体对类风湿关节炎的诊断价值.郑州大学学报(医学版).2010,第45卷(第4期),第629-631页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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