CN109270272A - 一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,包括包被有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的硝酸纤维素膜,偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物,抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体系列校准品和样本稀释液。本发明采用免疫层析方法结合荧光微球偶联技术,在免疫层析分析的基础上结合荧光微球信号放大技术,利用荧光信号测量仪器即可测量出光量子产额,该光量子产额与样品中的待测物质的量成比例关系,由此可建立校准曲线并计算出样品中待测物质的含量。本发明试剂盒具有较高等灵敏度和特异性,反应时间仅需10‑15min,方便快速,即适合大型医院检测,也适合基层医疗机构、社区医疗服务站、临床科室、门诊等即时检测。
Description
技术领域
本发明涉及临床免疫检测技术,尤其是涉及一种采用免疫荧光法检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,本发明还涉及该试剂盒的制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性全身性炎性疾病,是最常见的自身免疫疾病之一,在世界范围内发病率达 1%,在我国发病率约0.3%~0.6%。RA 的主要表现就是关节炎症导致的关节损伤和功能丧失。对RA 进行早期的诊断并立即采取适宜的治疗, 对于预防全部关节的损伤至关重要。而到目前为止,关节炎给机体带来的物理损伤还不能修复,所以要尽可能提前对疾病进行干涉治疗,以减少不可修复的损伤程度。这意味着RA的早期诊断和早期治疗对患者的生活质量至关重要。这也就要求我们要尽早对RA进行诊断,而血清学标记物的可检测阶段明显要早于临床指标。
RA的诊断标记物很多,主要包括类风湿因子RF、抗核周因子(APF)、抗角蛋白(AKA)、抗CCP、RA33,抗Sa、6-磷酸葡萄糖异构酶等等。类风湿因子RF及ACR标准对早期RA诊断效果并不好,而大部分标记物在特异性和敏感性方面都存在一些不足。目前应用得最为广泛的是抗CCP(环瓜氨酸肽),这是一种人工合成的多肽,其最显著的性能就是有很好的特异性,但其敏感性不够高(不到70%)。
最近几年,一种新的诊断标记物---抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(抗MCV)的出现给RA,特别是早期RA诊断提供了一个全新的选择。在获得与抗CCP同样高的特异性的同时,抗MCV抗体的检测可以获得极好的敏感性(80%左右)。此外,研究还发现,抗MCV的水平变化可以有效监控RA的治疗过程。在一项对类克药物治疗的监控研究显示,抗MCV的水平变化要比抗CCP水平变化提早6个月出现,也就是说可以提前半年对治疗方案和药物选择提供有效建议。这也是自身抗体定量检测相对于定性检测的重要价值之一。抗MCV抗体在患者血清中出现的阶段也比其他标记物要更早,这对于RA的尽早诊断是极具意义的。
目前,抗MCV抗体检测有ELISA法、胶体金法等。ELISA法需要专用设备,反应时间比较长,检测步骤繁杂;胶体金法灵敏度和特异性较低,应用受到限制。截至目前,利用荧光微球标记技术针对抗MCV抗体进行快速定量检测的试剂盒在我国还是空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用荧光法快速、灵敏、准确定量检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,本发明还提供该试剂盒的制备方法。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,包括包被有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的硝酸纤维素膜,偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物,抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体系列校准品和样本稀释液。
所述荧光微球包括不同粒径且能与活性物质结合的聚苯乙烯微球、Eu球或量子点微球。
所述抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体系列校准品以突变型瓜氨酸化波形抗体阴性血清或分析缓冲液为校准品基质,加入抗MCV-IgG抗体阳性配制而成。
所述样本稀释液由0.1M磷酸缓冲液、1%吐温-20和0.5%酪蛋白组成。
所述抗突变型瓜氨酸化波形蛋白为天然纯化或基因重组等抗原。
本发明检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒的制备方法包括下述步骤:
第一步,制备包被有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的硝酸纤维素膜
取硝酸纤维素膜30cm贴于不干胶衬板上,放置于划膜仪上,按照划膜仪操作规程,以1ul/ cm的喷量进行膜的包被;其中检测线包被有浓度为0.5-1mg/ml的MCV蛋白,质控线包被有浓度为1-2mg/ml的羊抗鼠IgG抗体,包被后置于37℃干燥5小时备用;
第二步,制备偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物垫
用EDC溶液和NHS溶液活化荧光微球(聚苯乙烯微球或Eu球或量子点),将活化后的荧光微球进行超声,然后加入一定量的鼠抗人IgG抗体,置于振荡器上反应1~2h,用低温高速离心机离心后,弃去上清,将沉淀用含有蛋白的荧光微球保存液稀释混匀,超声分散后,将偶联结合物按照3ul/cm的量喷涂于聚酯玻纤上,置于37℃干燥5小时备用;
第三步,荧光层析试剂组装
将第二步制得的偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物垫与第一步制得的包被有突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的硝酸纤维素膜的不干胶衬板进行组贴:依次粘贴偶联结合物垫、样品垫及手柄段吸水纸,并相互略有重叠,形成荧光层析卡;将组贴后的荧光层析卡切割成4.0mm宽的纸条,装配到塑料卡中并用铝箔袋密封包装;
第四步,制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体系列校准品
用抗突变型瓜氨酸化波形抗体阴性血清或分析缓冲液为校准品基质稀释抗MCV-IgG抗体高值阳性溶液,配置标定后的系列浓度为0U/ml、20U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml;
第五步:制备样本稀释液
采用0.1M磷酸缓冲液、1%吐温-20和0.5%酪蛋白配置样本稀释液。
本发明的优点在于采用免疫层析方法结合荧光微球偶联技术,在免疫层析分析的基础上结合荧光微球信号放大技术,利用荧光信号测量仪器即可测量出光量子产额,该光量子产额与样品中的待测物质的量成比例关系,由此可建立校准曲线并计算出样品中待测物质的含量。荧光微球包含聚苯乙烯微球、Eu球、量子点等,与高分子或无机材料等形成的一种胶体液态复合物,可通过表面的功能集团进行表面功能化修饰,具有宽激发、窄发射、发射峰可调以及荧光寿命长、亲和吸附高特异性等优良特性,以其标记单克隆抗体建立免疫吸附技术来定量检测,将大大提高检测方法的灵敏度和特异性,本检测试剂盒反应时间仅需10-15min,方便快速,即适合大型医院检测,也适合基层医疗机构、社区医疗服务站、临床科室、门诊等即时检测。
附图说明
图1是本发明试剂盒中荧光层析卡的结构示意图。
图2是本发明试剂盒的线性范围拟合图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细等说明,以便于本领域技术人员等理解。如无特殊说明,实施例中所用的试剂和测试仪器均为市售产品,所用方法均为本领域常规使用的方法。
实施例1 制备检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒
第一步,制备包被有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的硝酸纤维素膜
取硝酸纤维素膜30cm贴于不干胶衬板上,放置于划膜仪上,按照划膜仪操作规程,以1ul/ cm的喷量进行膜的包被;其中检测线包被有浓度为0.5-1mg/ml的MCV蛋白,质控线包被有浓度为1-2mg/ml的羊抗鼠IgG抗体,包被后置于37℃干燥5小时备用;
第二步,制备偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物垫(荧光微球采用量子点微球)
取2ml 0.5M PH8.0 Tris缓冲液于干净的玻璃瓶中,加入100-200ug量子点微球并超声分散。向量子点微球溶液中快速加入30ul活化剂EDC和NHS,常温反应20min后离心弃上清。向沉淀中加入2ml 0.5M PH8.0 Tris缓冲液复溶,再加入200ug鼠抗人IgG标记抗体,超声分散混匀,常温反应2h,离心(10000rmp,8min)弃上清。向沉淀中加入2ml含1%牛血清白蛋白、0.1%吐温-20/0.01%-0.02%的叠氮钠的磷酸盐缓冲液将偶联有鼠抗人IgG抗体的量子点结合物稀释,超声分散。将偶联结合物按照3ul/cm的量喷涂于聚酯玻纤上,置于37℃干燥5小时备用;
第三步,荧光层析试剂组装
将第二步制得的偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物垫与第一步制得的包被有突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的硝酸纤维素膜的不干胶衬板进行组贴:依次粘贴偶联结合物垫、样品垫及手柄段吸水纸,并相互略有重叠,形成荧光层析卡(如图1所示);将组贴后的荧光层析卡切割成4.0mm宽的纸条,装配到塑料卡中并用铝箔袋密封包装;
第四步,制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体系列校准品
用抗突变型瓜氨酸化波形抗体阴性血清或分析缓冲液为校准品基质稀释抗MCV-IgG抗体高值阳性溶液,配置标定后的系列浓度为0U/ml、20U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml;
第五步:制备样本稀释液
采用0.1M磷酸缓冲液、1%吐温-20和0.5%酪蛋白配置样本稀释液。
实施例2 实施例1制备的试剂盒的使用方法
一、试剂准备及配制:
1. 将试剂盒、样本放置室温(18~25℃)平衡至少30分钟。
2. 质控:确认芯片卡与检测卡批号匹配,插入荧光测量仪进行质控。
二、 实验操作:
1. 打开检测试剂和包装,取出检测卡及样本稀释液并编号。
2. 加样
吸取20μl血清/血浆/全血样本,加入样本稀释液中,充分混匀,用配套吸管吸取60μl加入到测试卡的加样孔中,开始计时。
3. 检测
测试卡加样10min后,立即将测试卡插入仪器中,点击“测试”按钮,系统自动读卡并显示测试结果,当检测试剂超过有效期或者试剂卡插反,检测仪将报告“检测无效”。
实施例3 本发明试剂盒的性能测试
1、分析灵敏度:最低检测限不高于0.5U/mL;
分析灵敏度以检测限表示,分析灵敏度的定义为:是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量0值校准品,计算其平均值(X)和标准差(SD),以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.5U/mL。
2、线性范围:0—1000 U/mL;
将接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本均重复检测2次,计算其平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,如下表1和图2所示,计算线性相关系数R2不低于0.95。
表1
3、精密性:如下表2所示,2份不同浓度样本测试的变异系数(n=10)为8.5%、7.8%,CV均小于10%,说明试剂盒精密性良好;
表2
4、稳定性:将试剂盒放置于37℃下加速稳定性考察30天,试剂盒性能无明显变化。
Claims (6)
1.一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,其特征在于:包括包被有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白的硝酸纤维素膜,偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物,抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体系列校准品和样本稀释液。
2.根据权利要求1所述的检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,其特征在于:所述荧光微球包括不同粒径且能与活性物质结合的聚苯乙烯微球、Eu球或量子点微球。
3.根据权利要求1所述的检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,其特征在于:所述抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体系列校准品以突变型瓜氨酸化波形抗体阴性血清或分析缓冲液为校准品基质,加入抗MCV-IgG抗体阳性配制而成。
4.根据权利要求1所述的检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,其特征在于:所述样本稀释液由0.1M磷酸缓冲液、1%吐温-20和0.5%酪蛋白组成。
5.根据权利要求1所述的检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒,其特征在于:所述抗突变型瓜氨酸化波形蛋白为天然纯化或基因重组等抗原。
6.一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒的制备方法,其特征在于:包括下述步骤:
第一步,制备包被有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白的硝酸纤维素膜
取硝酸纤维素膜贴于不干胶衬板上,放置于划膜仪上,按照划膜仪操作规程,以1ul/cm的喷量进行膜的包被;其中检测线包被有浓度为0.5-1mg/ml的MCV蛋白,质控线包被有浓度为1-2mg/ml的羊抗鼠IgG抗体,包被后置于37℃干燥5小时备用;
第二步,制备偶联有鼠抗人IgG抗体的荧光微球结合物垫
用EDC溶液和NHS溶液活化荧光微球,将活化后的荧光微球进行超声,然后加入一定量的鼠抗人IgG抗体,置于振荡器上反应1~2h,用低温高速离心机离心后,弃去上清,将沉淀用含有蛋白的荧光微球保存液稀释混匀,超声分散后,将偶联结合物按照3ul/cm的量喷涂于聚酯玻纤上,置于37℃干燥5小时备用;
第三步,荧光层析试剂组装
将第二步制得的荧光微球结合物垫与第一步制得的硝酸纤维素膜的不干胶衬板进行组贴,形成荧光层析卡;将荧光层析卡切割成4.0mm宽的纸条,装配到塑料卡中并用铝箔袋密封包装;
第四步,制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体系列校准品
用抗突变型瓜氨酸化波形抗体阴性血清或分析缓冲液为校准品基质稀释抗MCV-IgG抗体高值阳性溶液,配置标定后的系列浓度为0U/ml、20U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml;
第五步:制备样本稀释液
采用0.1M磷酸缓冲液、1%吐温-20和0.5%酪蛋白配置样本稀释液。
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