CN101452001B - 化学发光磁酶免疫法定量检测rbp4试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种化学发光磁酶免疫法定量检测人血清RBP4水平的医用检验试剂盒。该试剂盒由四个试剂部分组成：特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫磁珠、酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体II、化学发光底物、相应的标准液和质控液。本试剂盒使用方法为以磁珠微粒作为固相载体，在其表面结合特异性鼠抗人RBP4抗体I而成为RBP4特异性免疫活性磁珠，以酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体II捕获样本中待测抗原RBP4，并在磁珠表面形成双抗体夹心复合物，该复合物上标记的酶能与反应体系中相应的发光底物反应形成稳定发光信号，通过检测光信号的强度从而达到定量检测分析RBP4的目的，具有高灵敏度，高特异性，操作简单迅速的优点。

Description

化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒
技术领域
本发明涉及一种化学发光磁酶免疫分析技术，特别是涉及一种化学发光磁酶免疫法定量检测血清视黄醇结合蛋白4(RBP4)的试剂盒。
背景技术
随着人们生活水平的提高、生活方式的改变，2型糖尿病已经成为一种严重危害人类健康的慢性疾病，在过去的20年间，糖尿病的发病率在全世界范围内增加。据估计，2010年全球糖尿病人数将增加至2.2亿左右，糖尿病前期人数，包括糖耐量异常和空腹血糖受损，也将达到甚至超过糖尿病人数，2型糖尿病及其并发症的治疗已经成为沉重的经济负担，因此对其早期诊断和积极预防具有重要意义。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键环节和主要病理生理基础，所谓胰岛素抵抗是指胰岛素作用的靶组织中胰岛素信号转导障碍及胰岛素的生物学作用降低。目前研究显示，90％以上的2型糖尿病患者都存在胰岛素抵抗，其在糖尿病前期阶段即可出现。不仅如此，现有资料还证实胰岛素抵抗是冠心病，高血压等多种心血管疾病的高危因素，因此对胰岛素抵抗的早期识别和正确评价不仅有助于早期诊断和积极预防2型糖尿病，而且对于冠心病，高血压等心血管疾病风险评价和一级预防也具有重要意义。目前临床上对于胰岛素抵抗多采用血清C肽测定，胰岛素释放试验，葡萄糖耐量试验等间接指标进行评价和诊断，这些检测方法相对容易受患者饮食及药物治疗情况的干扰，从而影响检查结果的准确性和客观性，另一方面操作过程复杂，一次检测中患者需要多次反复抽血。因此寻求客观、准确、灵敏、简便的评价胰岛素抵抗的指标成为临床迫切需要解决的问题。
视黄醇结合蛋白4(RBP4)是近年来Nature(2005 Jul 21；436(7049)：356-62)和New England J Med(2006 Jun15；354(24)：2596-8.)等杂志报道的与2型糖尿病患者胰岛素抵抗形成密切相关的血清蛋白分子。人RBP4基因位于染色体10q，其转录的mRNA全长为941bp，编码的RBP4蛋白由181个氨基酸组成。RBP4蛋白是一血清转运蛋白，其主要功能是在血液循环中转运视黄醇，正常情况下RBP4主要由肝细胞分泌，其次为脂肪组织。现有动物试验已经证实，在脂肪组织特异性葡萄糖转运子4(GLUT4)基因敲除的胰岛素抵抗小鼠模型中RBP4水平选择性增加，通过转基因技术提高小鼠RBP4的血清水平，可导致胰岛素抵抗的发生，而对其表达的抑制可改善小鼠胰岛素敏感性和增加血糖稳定性；RBP4在血液循环中与甲状腺素运载蛋白结合成大分子的复合物，不易从肾脏代谢，而人工合成的视黄醇衍生物芬维A胺能解除RBP4与甲状腺素运载蛋白的结合，促进RBP4从肾脏的排泄，可以降低胰岛素抵抗肥胖鼠模型血清RBP4水平，从而改善胰岛素抵抗状态。这些研究结果显示RBP4为一种新的脂肪源性信号，参与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生。在动物试验的基础上多个临床观察亦显示血清RBP4水平与2型糖尿病患者胰岛素抵抗状态密切相关，在胰岛素抵抗患者其血清水平显著升高，而治疗后RBP4水平的下降，则提示患者胰岛素抵抗状态的改善和胰岛素敏感性增加。目前研究结果显示血清RBP4水平可成为直接评价2型糖尿病患者胰岛素抵抗的独立相关性指标，并有可能成为改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗状态的治疗靶点。由于RBP4蛋白在正常人群有基础量表达和分泌，因此对血清RBP4水平精确、灵敏的定量检测，是确保其可成为临床辅助诊断和评价胰岛素抵抗实验室指标的关键环节。
化学发光免疫分析技术是继酶免疫测定，放射免疫测定之后发展起来的一种新型免疫标记诊断技术。其在继承了放射免疫测定高灵敏度优点的同时，克服了其放射性污染及半衰期短的缺点。在20余年的发展应用中，其方法的敏感性，准确性，操作的简捷性和可重复性均得到了认可。化学发光磁酶免疫分析法是在化学发光免疫分析技术的基础上，同时结合磁酶免疫技术，以磁性微珠为固相载体，增加吸附面积，使抗原抗体得以最大程度的结合，大大提高检测的灵敏度和精确性。
但对于以上技术的结合利用在检测视黄醇结合蛋白4，还处于初期的研究起步阶段，本发明人对此进行了精心的研究，并完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、快速、简便的与2型糖尿病患者胰岛素抵抗形成密切相关的RBP4蛋白作为辅助诊断和评价胰岛素抵抗的新血清学指标，选用化学发光磁酶免疫分析技术作为检测方法，构建可定量检测人血清RBP4蛋白水平的化学发光磁酶免疫分析检测试剂盒。本试剂盒可作为临床辅助诊断2型糖尿病及某些心血管疾病患者胰岛素抵抗状态的新型实验室检查手段。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒，其特征在于，包括试剂一特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫磁珠，用量为5-10ul/ul样品，试剂二酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体II，用量为1-5ul/ul样品，试剂三化学发光底物，用量为10--15ul/ml，试剂四相应的标准液和质控液，标准液为梯度浓度的RBP4蛋白标准品溶液，用量为5-10ul；质控液分为质控A液和质控B液：质控A液为针对特异性鼠抗人RBP4抗体的二抗(兔抗鼠IgG)，用量为5ul/ml；质控B液为已知浓度的RBP4样品，用量为10ul。
一种化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒制备步骤如下：
a.RBP4免疫磁珠制备：选用超顺磁聚合物磁性微球作为磁珠(该磁珠可以成品的方式得到)载体，其内部分散着平均直径8-10纳米左右的超顺磁性四氧化三铁，其表面易于修饰上活性基团；经活性基团修饰的磁珠通过PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗，加入到体积比为5∶100的5％戊二醛/PBS溶液中室温避光振荡反应后进行磁性分离，多次清洗后制得活化磁珠；取活化磁珠与特异性鼠抗人RBP4抗体I以比例100-150ug抗体/mg磁珠在室温下孵育，磁性分离后，加入过量的10％牛血清白蛋白(BSA)溶液以封闭未结合抗体的游离醛基，即得到特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫活性磁珠。
b.酶标抗体制备：根据不同标记酶的要求，将相应量特异性鼠抗人RBP4抗体II溶于相应溶剂中进行预处理，标记酶溶于相应溶剂后所形成的酶溶液，以相应比例与上述抗体混合均匀并反应，所得酶标抗体产物经透析或层析纯化后，-20℃冻存于甘油中。
c.标准液和质控液制备：准确称量RBP4蛋白标准品，用二甲亚砜(DMSO)溶解，用校准品稀释液稀释成0～160mg/L标准溶液；质控A液：准确称量二抗(兔抗鼠IgG)1mg，以0.5ml PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)  溶解后，-20℃冻存；质控B液为已知浓度的RBP4样品。
d.化学发光底物工作液制备：化学发光底物溶解在相应(不同的化学发光底物所选的溶剂并不相同)的溶剂中，得到系列浓度的溶液，然后作化学发光底物-发光强度曲线，确定该发光底物的最稳定浓度和加入反应体系的最佳时间。以3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)为例，以AMPPD浓度-发光强度作一曲线，筛选出发光信号最稳定的AMPPD浓度，并以此作为AMPPD工作浓度。在确定的AMPPD浓度下，根据AMPPD反应时间-发光强度的曲线，确定AMPPD加入反应体系的最佳反应时间。
步骤a中所述的磁珠表面修饰上的活性基团为氨基。
步骤b中所述的标记酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶。
步骤c中所述的标准液是用来绘制标准曲线的，而质控液是用来监测上述试剂一，二，三的有效性。
步骤d中所述的化学发光底物为二氧杂环丁烷类化学发光剂或胺类化学发光剂等，其中优选二氧杂环丁烷类化学发光剂中的AMPPD。
质控液的使用：
质控A液用法：质控A液5ul加入特异性RBP4免疫磁珠25ul，室温孵育20min，质控A液中的二抗(兔抗鼠IgG)能与免疫磁珠上的鼠抗人RBP4抗体结合，再加入酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体5ul，室温孵育20min，同样酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体与质控A液中的二抗(兔抗鼠IgG)结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入化学发光底物10ul/ml，作用30min，通过复合物中的酶作用于化学发光底物，使其分解，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号的有无及强度来监测以上主要试剂(试剂一，二，三)是否有效。
质控B液用法：质控B液10ul(已知浓度的RBP4样品)加入特异性RBP4免疫磁珠50ul，室温孵育20min，以结合质控B液中的已知RBP4抗原，再加入酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体10ul，室温孵育20min，酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与质控B液中的已知RBP4抗原结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入化学发光底物10ul/ml，作用30min，通过复合物中的酶作用于化学发光底物，使其分解，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号的强度获得质控B液中的RBP4浓度并与已知浓度进行比较。
超顺磁聚合物磁性微球是近几年来才出现的一种新型磁性载体，8-10纳米左右的超顺磁性四氧化三铁的表面易于修饰上活性基团，超顺磁性材料则可以使磁性微球不象普通磁珠那样会因剩磁而聚集成团，从而避免因聚集产生的非特异性误差。
本发明的另一个目的是提供化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4的试剂盒的使用方法，其上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒的使用方法，待测血清标本稀释后成待检样品，取一定量样品，加入特异性RBP4免疫磁珠，室温孵育20～30min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体，室温孵育20～30min，酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入化学发光底物，作用30min，通过双抗体夹心复合物中的酶作用于化学发光底物，使其分解，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号强度来定量分析血清RBP4浓度。
本发明的优点：本试剂盒设计为以化学发光磁酶免疫分析技术定量检测胰岛素抵抗评价新指标一血清RBP4蛋白。例如本试剂盒所优选的发光底物AMPPD是一种新型的二氧杂环丁烷类化学发光剂，与传统的化学发光剂相比具有发光性能稳定，检测范围大，背景干扰小，试剂存放时间长等优点。由于本试剂盒适用于全自动仪器分析，实验条件标准化，人为影响因素小；试剂及标本采样均采用无吸附材料，相互间交叉率低；而且每个经过质控液质控的试剂盒可用于多份和多次的血清检测，具有用量少，成本低的特点；另外本发明还具有高灵敏度，高特异性，操作检测快速，简便的优点，总之，本试剂盒是以定量检测血清RBP4水平为目的，以最新的微粒子化学发光磁酶免疫技术为方法，对血清RBP4水平进行精确定量检测分析，从而最终对于糖尿病患者机体胰岛素抵抗状态做出客观、准确评价和诊断，因此，其在临床应用上具有广阔的前景。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步阐述，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
具体实施方式
试剂盒技术指标：
1.标准曲线：采用RBP4标准液七点定标，每点做5次重复测定，取均值。以纵坐标为光强度，横坐标为RBP4浓度，仪器自动绘出标准曲线。
标准曲线是用来说明所检测的光信号强度和血清样本中待测抗原RBP4浓度的良好线性关系，此线性关系良好即说明所检测到的光信号的强度能准确的反应血清样本中待测抗原浓度。
2.灵敏度：对标准品RBP4零浓度重复测定10次，以零浓度均值±2SD确定其最低检测线。
3.精密度：取浓度呈梯度增加的六种血清标本，分别同批测定10次，批内变异为2.67％、2.89％、1.97％、2.03％、3.12％、 2.34％，均低于3％；同样6份血清，隔天测定一次，连续测定10次，批间变异为3.03％、3.35％、2.97％、3.14％、3.21％、3.54％，均低于4％；符合试剂盒检测精密度要求。
4.准确性：以回收率试验进行测定。将已知浓度的血清样本分成多份，分别加入不同浓度的标准溶液，算出理论浓度值，用本试剂盒检测以上样本，得到测定浓度值，用测定值/理论值，得到本试剂盒回收率。
5.参考值确定：收集并检测300份以上正常人空腹血清样本，确定正常参考值范围为25.1-32.5ug/ml。
实施例1
1.试剂盒的制备：
a.RPB4免疫磁珠制备：选用超顺磁聚合物磁性微球作为磁珠(商品名Bruker，BioSciences Corporation制造)载体，其内部分散着平均直径8-10纳米左右的超顺磁性四氧化三铁；将氨基修饰活化的磁珠经PBS缓冲液进行清洗，然后加入到5％戊二醛/PBS溶液中室温避光振荡反应后进行磁性分离，清洗多次后制备得到活化磁珠；取活化磁珠与特异性鼠抗人RBP4抗体I以100ug抗体/mg磁珠比例在室温下孵育，磁性分离后，加入过量的10％BSA溶液以封闭未结合抗体的游离醛基，即得到特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫活性磁珠。
b.酶标抗体制备：将0.2mg特异性鼠抗人RBP4抗体II溶于1.5ml N’N-二甲基甲酰胺中，加入2ml 10mg/ml的碱性磷酸酶溶液，将10.8mg EDC(1-乙基-3-(二甲基丙基)碳二亚胺盐酸)分三次加入，每次间隔1小时，混合物不断搅拌，4℃过夜，于0.01MTris缓冲液PH7.0条件下进行透析，直至将EDC透析完全除去，加入等体积甘油，-20℃冻存。
C.标准液制备：准确称量RBP4蛋白标准品，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用校准品稀释液进行系列稀释后成0、5、10、20、40、80、160mg/L标准溶液。
d.化学发光底物工作液制备：将剂量范围的1-20ul AMPPD分别溶解在1mlNaHCO3/Na2CO3缓冲液中，得到梯度浓度的AMPPD溶液。以发光底物浓度(1-20ul/ml)-发光强度作一曲线，筛选出发光信号最稳定的发光底物浓度10ul/ml，并以此浓度配制发光底物工作液。在此AMPPD浓度下，根据发光底物反应时间-发光强度的曲线，确定发光底物加入反应体系的最佳反应时间为30min。
并按照上述质控液的使用方法利用质控液对该试剂盒中试剂一、二、三的有效性进行检测。
RBP4浓度的测定：
将待测血清标本1(52岁女性，有2型糖尿病病史10余年)稀释后成待检样品，取样品20ul，加入特异性RBP4免疫磁珠100ul，室温孵育20min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体20ul，室温孵育20min，碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入10ul/ml上述的AMPPD/碳酸盐溶液，作用30min，通过双抗体夹心复合物中碱性磷酸酶作用于AMPPD，使其去磷酸化分解成AMPD，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号强度达到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的测定值为123.9ug/ml。
技术指标：本试剂盒最低检测线为0.62ng/ml；批内变异均低于3％，批间变异均低于5％，符合试剂盒检测精密度要求；本试剂盒回收率为99.76％±4.97％。
实施例2
使用与实施例1相同的试剂盒，对待测血清标本进行测定.
RBP4浓度的测定
待测血清标本2(26岁健康女性)。待测血清标本稀释后成待检样品，取样品20ul，加入特异性RBP4免疫磁珠100ul，室温孵育20min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体20ul，室温孵育20min，碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入10ul/ml的AMPPD/碳酸盐溶液，作用30min，通过双抗体夹心复合物中碱性磷酸酶作用于发光化学底物AMPPD，使其去磷酸化分解AMPD，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号强度达到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的测定值为23.4ug/ml。
技术指标：本试剂盒最低检测线为0.62ng/ml；批内变异均低于3％，批问变异均低于5％，符合试剂盒检测精密度要求；本试剂盒回收率为99.76％±4.97％；
实施例3
使用与实施例1相同的试剂盒，对待测血清标本进行测定。
RBP4浓度的测定
待测血清标本3(60岁男性，超体重，有胰岛素抵抗，但尚未达到2型糖尿病诊断标准)。待测血清标本稀释后成待检样品，取样品20ul，加入特异性RBP4免疫磁珠100ul，室温孵育20min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体20ul，室温孵育20min，碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入10ul/ml的AMPPD/碳酸盐溶液，作用30min，通过双抗体夹心复合物中碱性磷酸酶作用于发光化学底物AMPPD，使其去磷酸化分解AMPD，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号强度达到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的测定值为76.4ug/ml。
技术指标：本试剂盒最低检测线为0.62ng/ml；批内变异均低于3％，批间变异均低于5％，符合试剂盒检测精密度要求；本试剂盒回收率为99.76％±4.97％。
实施例4
试剂盒的制备：
A.RBP4免疫磁珠制备：选用超顺磁聚合物磁性微球作为磁珠(商品名：BrukerBioSciences Corporation制造)载体，其内部分散着平均直径8-10纳米左右的超顺磁性四氧化三铁，该磁珠微球表面易于修饰上活性基团；将氨基修饰的活化磁珠经PBS缓冲液进行清洗，加入到5％戊二醛/PBS溶液中室温避光振荡反应后进行磁性分离，清洗多次后制备得到活化磁珠；取活化磁珠与特异性鼠抗人RBP4抗体I以100ug抗体/mg磁珠比例在室温下孵育，磁性分离后，加入过量的10％BSA溶液以封闭未结合抗体的游离醛基，即得到特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫活性磁珠。b.酶标抗体制备：将0.2mg特异性鼠抗人RBP4抗体II溶于1.5ml N’N-二甲基甲酰胺中，加入2ml 10mg/ml的碱性磷酸酶溶液，将10.8mg EDC(1-乙基-3-(二甲基丙基)碳二亚胺盐酸)分三次加入，每次间隔1小时，混合物不断搅拌，4℃过夜，于0.01MTris缓冲液PH7.0条件下进行透析，直至将EDC透析完全除去，加入等体积甘油，-20℃冻存。
C.标准液制备：准确称量RBP4蛋白标准品，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用校准品稀释液进行系列稀释后成0、5、10、20、40、80、160mg/L标准溶液。
d.化学发光底物工作液制备：600ul乙醇胺，100ul 1NNaOH，100ul10％的NaN3，混匀后高压蒸汽灭菌即成。
并按照上述质控液的使用方法利用质控液对该试剂盒中试剂一、二、三的有效性进行检测。
待测血清标本4(52岁女性，有2型糖尿病病史10余年，同待测血清标本1)稀释后成待检样品，取样品20ul，加入特异性RBP4免疫磁珠100ul，室温孵育20min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体20ul，室温孵育20min，碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。然后在该体系中加入50ul的化学发光底物溶液，作用20min，通过双抗体夹心复合物中碱性磷酸酶作用于发光化学底物，通过检测光信号强度达到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的测定值为118.6ug/ml。
技术指标：该剂盒最低检测线为1.32ng/ml；批内变异均低于5％，批间变异均低于8％；本试剂盒回收率为93.54％±3.71％。
实施例5
本发明的试剂盒的制备：
a，RBP4免疫磁珠制备：选用超顺磁聚合物磁性微球作为磁珠(商品名：BrukerBioSciences Corporation制造)载体，其内部分散着平均直径8-10纳米左右的超顺磁性四氧化三铁，该磁珠微球表面易于修饰上活性基团；将氨基修饰的活化磁珠经经PBS缓冲液进行清洗，加入到5％戊二醛/PBS溶液中室温避光振荡反应后进行磁性分离，清洗多次后制备得到活化磁珠；取活化磁珠与特异性鼠抗人RBP4抗体I以100ug抗体/mg磁珠比例在室温下孵育，磁性分离后，加入过量的10％BSA溶液以封闭未结合抗体的游离醛基，即得到特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫活性磁珠。
b.过氧化物酶标抗体制备：采用高碘酸氧化法进行制备。过氧化物酶8mg溶于双蒸水中，加入0.1mol/L过碘酸钠0.8ml，搅拌20min，加入乙二醇0.3ml，搅拌5min，SephadexG-25分离，分步收集后，合并棕色部分，加入抗体0.5mg，滴加碳酸盐缓冲液至PH9.0，室温搅拌2小时，层析纯化后，加入等体积甘油，-20℃冻存。
C.标准液制备：准确称量RBP4蛋白标准品，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用校准品稀释液进行系列稀释后成0、5、10、20、40、80、160mg/L标准溶液。
d.化学发光底物工作液制备：1.25mmol/L鲁米诺，0.136mmol/L对碘苯酚，10mmol/LTris.HCl(PH8.6)，0.2％乙醇，0.3mmol/LNaCl，5mmol/L环己二胺四乙酸，4mmol/L的H2O2与4mmol/L的NaBO3混合配制。
并按照上述质控液的使用方法利用质控液对该试剂盒中试剂一、二、三的有效性进行检测。
待测血清标本5(66岁，男性，2型糖尿病病史初诊患者)稀释后成待检样品，取样品20ul，加入特异性RBP4免疫磁珠200ul，室温孵育30min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入过氧化物酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体50ul，室温孵育30min，过氧化物酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。然后在该体系中加入30ul的化学发光底物溶液，作用30min，通过双抗体夹心复合物中过氧化物酶作用于发光化学底物，通过检测光信号强度定量分析血清RBP4。RBP4的测定值165.3ug/ml。
技术指标：该剂盒最低检测线为1.33ng/ml；批内变异均低于5％，批间变异均低于8％；本试剂盒回收率为90.69％±5.27％。
实施例6
使用与实施例1相同的试剂盒，对待测血清标本进行测定.
RBP4浓度的测定
待测血清标本6(66岁，男性，2型糖尿病病史初诊患者，同待测血清标本5相同)，将待测血清标本稀释后成待检样品，取样品20ul，加入特异性RBP4免疫磁珠200ul，室温孵育30min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体50ul，室温孵育30min，碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入10ul/ml的AMPPD/碳酸盐溶液，作用30min，通过双抗体夹心复合物中碱性磷酸酶作用于发光化学底物AMPPD，使其去磷酸化分解AMPD，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号强度达到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的测定值为170.2ug/ml。
技术指标：本试剂盒最低检测线为0.62ng/ml；批内变异均低于3％，批间变异均低于5％，符合试剂盒检测精密度要求；本试剂盒回收率为99.76％±4.97％。
实施例7
使用与实施例1相同的试剂盒，对待测血清标本进行测定.
RBP4浓度的测定
待测血清标本7(45岁，男性，体重指数正常，无糖尿病病史)，将待测血清标本稀释后成待检样品，取样品10ul，加入特异性RBP4免疫磁珠100ul，室温孵育20min以结合样品中的待测RBP4抗原，再加入碱性磷酸酶标记特异性鼠抗人RBP4抗体50ul，室温孵育20min，碱性磷酸酶标记特异鼠性抗人RBP4抗体与待测抗原的结合后，以磁性微珠为固相载体，在其表面形成RBP4双抗体夹心复合物。磁性分离洗涤后，在该体系中加入15ul/ml的AMPPD/碳酸盐溶液，作用30min，通过双抗体夹心复合物中碱性磷酸酶作用于发光化学底物AMPPD，使其去磷酸化分解AMPD，反应中释放出的化学能转化成稳定的光信号，通过检测光信号强度达到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的测定值为29.7ug/ml。
技术指标：本试剂盒最低检测线为0.62ng/ml；批内变异均低于3％，批间变异均低于5％，符合试剂盒检测精密度要求；本试剂盒回收率为99.76％±4.97％。

Claims (1)

1.一种化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒的制备方法，其特征在于，
a.RBP4免疫磁珠制备：选用商品名Bruker，BioSciences Corporation制造的超顺磁聚合物磁性微球作为磁珠载体，其内部分散着平均直径8-10纳米的超顺磁性四氧化三铁；将氨基修饰活化的磁珠经PBS缓冲液进行清洗，然后加入到5％戊二醛/PBS溶液中室温避光振荡反应后进行磁性分离，清洗多次后制备得到活化磁珠；取活化磁珠与特异性鼠抗人RBP4抗体I以100μg抗体/mg磁珠比例在室温下孵育，磁性分离后，加入过量的10％BSA溶液以封闭未结合抗体的游离醛基，即得到特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫活性磁珠；
b.酶标抗体制备：将0.2mg特异性鼠抗人RBP4抗体II溶于1.5mlN′，N-二甲基甲酰胺中，加入2ml10mg/ml的碱性磷酸酶溶液，将10.8mg1-乙基-3-(二甲基丙基)碳二亚胺盐酸分三次加入，每次间隔1小时，混合物不断搅拌，4℃过夜，于0.01M Tris缓冲液pH7.0条件下进行透析，直至将1-乙基-3-(二甲基丙基)碳二亚胺盐酸透析完全除去，加入等体积甘油，-20℃冻存；
C.标准液制备：准确称量RBP4蛋白标准品，用二甲基亚砜溶解，用校准品稀释液进行系列稀释后成0、5、10、20、40、80、160mg/L标准溶液;
d.化学发光底物工作液制备：将剂量范围的1～20μl AMPPD分别溶解在1ml NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，得到梯度浓度的AMPPD溶液；以发光底物浓度-发光强度作一曲线，筛选出发光信号最稳定的发光底物浓度10μl/ml，并以此浓度配制发光底物工作液，在此AMPPD浓度下，根据发光底物反应时间-发光强度的曲线，确定发光底物加入反应体系的反应时间为30min。
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