CN102213724A

CN102213724A - 一种基于化学发光的痕量蛋白快速检测方法

Info

Publication number: CN102213724A
Application number: CN201010145084XA
Authority: CN
Inventors: 刘儒平; 蔡新霞; 刘军涛; 刘春秀; 罗金平; 王蜜霞
Original assignee: Institute of Electronics of CAS
Current assignee: Institute of Electronics of CAS
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2011-10-12

Abstract

本发明公开了一种基于化学发光的痕量蛋白快速检测方法，主要步骤为：1)待测蛋白与酶标抗体的反应形成免疫复合物；2)抗体修饰的磁性微纳粒子与上述免疫复合物反应，形成双抗体夹心复合物；3)在磁场中对双抗体夹心复合物洗涤，去除多余酶标抗体。本发明不仅操作简单，所用试剂量少，成本低廉，适合心肌标志物类、内分泌激素类、肿瘤标志物类等蛋白的快速检测。

Description

一种基于化学发光的痕量蛋白快速检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，是一种采用化学发光法并适于产业化的蛋白快速检测技术，具体地涉及一种痕量蛋白快速检测的方法。

背景技术

痕量蛋白的检测对疾病的早期诊断，早期治疗有重要的参考价值和临床意义。目前，已出现多种检测痕量蛋白的方法，如化学发光法、放射免疫法、试条半定量法等。其中推出的化学发光酶免疫法检测因具有快速、准确、重复性好、安全无毒等优点，受到临床和实验室的关注。但目前的化学发光酶免疫检测痕量蛋白法主要依赖于大型进口化学发光仪和检测试剂，缺点是仪器与试剂成本高，给患者带来的经济负担相对较重。如，较为常用的Biosite公司检测脑钠肽(BNP)需样品量为250μL，其测试线性相关系数R＝0.950。

发明内容

本发明的目的就是提供一种痕量蛋白快速检测方法，该方法操作简单，成本低廉，耗样量少，检测速度快，适合痕量蛋白的快速检测。

为实现上述目的，本发明提供的基于化学发光的痕量蛋白快速检测方法，主要步骤为：

1)待测蛋白与酶标抗体的反应形成免疫复合物；

2)抗体修饰的磁性微纳粒子与上述免疫复合物的反应，形成双抗体夹心复合物；

3)在磁场中对双抗体夹心复合物洗涤，去除多余酶标抗体。

所述的检测方法中，酶标抗体中的酶是辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。

所述的检测方法中，辣根过氧化酶对应的底物体系为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)或其衍生物过氧化氢发光体系，在425nm时探测其光信号；

碱性磷酸酶对应的底物体系是1，2-二氧杂环丁烷类底物体系，在470nm时探测其光信号。

所述的检测方法中，步骤1和步骤2的反应均于37℃恒温中进行，步骤1的反应时间是10～25分钟，步骤2的反应时间是3～8分钟。

所述的检测方法中，磁性微纳粒子为铁磁性超顺磁材料中的一种或几种组合而成。磁性微纳粒子的粒径在10nm～3000nm。

所述的检测方法中，待测蛋白的体积是30～60μL，酶标抗体的体积是30～60μL，所需生物功能化的磁性微纳粒子的体积是10～50μL。

所述的检测方法中，对双抗体夹心复合物洗涤的缓冲液组成为：8-10mM的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH＝7.4，体积百分含量为0.02-0.05％的吐温-20(Tween-20)。

本发明提供的检测方法需要的样品量小于公知技术，对脑钠肽检测的相关系数R＝0.978，需要的样本量大大减少，线性相关性较高。本发明不仅操作简单，所用试剂量少，成本低廉，适合心肌标志物类、内分泌激素类、肿瘤标志物类等蛋白的快速检测。本发明采用磁性微纳技术与化学发光免疫分析技术相结合，提供了一种通用性强、成本相对较低的痕量蛋白快速检测平台，具有重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明实施例的检测标准曲线。

具体实施方式

本发明包括两步反应和一步洗涤。

第一步反应为待测蛋白与酶标抗体的反应，该反应于37℃恒温中形成免疫复合物，孵育时间为10～25min，优选15min。其中所需待测蛋白的体积是30～60μL，优选50μL，所需酶标抗体的体积是30～60μL，优选50μL。

第二步反应为抗体修饰的磁性微纳粒子与上述免疫复合物的反应，形成双抗体夹心复合物。该反应在37℃恒温中孵育时间需要3～8min，优选5min。所需生物功能化的磁性微纳粒子的体积是10～50μL，优选30μL。

一步洗涤为在磁场中用缓冲液(8-10mM PBS，pH＝7.4，0.02-0.05％Tween-20)对该双抗体夹心复合物洗涤3～5次，去除多余酶标抗体。

本发明的酶标抗体中的酶可以是辣根过氧化酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)中的一种，其中辣根过氧化酶对应的底物体系为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)或其衍生物过氧化氢发光体系。碱性磷酸酶对应的底物体系是1，2-二氧杂环丁烷类(AMPPD)底物体系。

加入底物进行测定时，根据测定的发光信号进行定量分析，发光强度与待测蛋白浓度成比例，利用公知的化学发光检测仪可定量检测待测蛋白。

对于辣根过氧化酶及底物发光体系，在425nm时探测其光信号。对于碱性磷酸酶及底物发光体系，在470nm时探测其光信号。上述两步反应均于37℃孵育，第一步反应所需要的孵育时间是10～25min，第二反应孵育时间需要3～8min。

本发明的磁性微纳粒子由铁磁性超顺磁材料中的一种或几种组合而成。其粒径在10nm～3000nm。

本发明所用的待测蛋白的体积是30～60μL，酶标抗体的体积是30～60μL，所需生物功能化的磁性微纳粒子的体积是10～50μL。

下面结合具体实施例对本发明进行描述：

实施例1

取50μL待测BNP标准品溶液与50μL辣根过氧化酶标记BNP抗体溶液(原液浓度1.2mg/mL，按1∶10000稀释)混合，置于37℃孵育15分钟(min)，然后加入30μL表面修饰BNP抗体的生物功能化的磁粒子，孵育5min，形成免疫夹心复合物，然后置于磁分离器上，用缓冲液(10mMPBS，pH＝7.4，0.05％Tween-20)除去多余酶标抗体。加入50μL鲁米诺溶液，然后加入50μL的H₂O₂溶液，测其光强，所测光强与浓度线性相关，测得的标准曲线如图1，其检测的线性范围为20～1000pg/mL，相关系数R²＝0.9567。获得了较好的检测结果，在临床检测方面具有良好的应用前景。

以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它同性相关试剂等方法均在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种基于化学发光的痕量蛋白快速检测方法，主要步骤为：

1)待测蛋白与酶标抗体的反应形成免疫复合物；

2)抗体修饰的磁性微纳粒子与上述免疫复合物反应，形成双抗体夹心复合物；

3)在磁场中对双抗体夹心复合物洗涤，去除多余酶标抗体。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述酶标抗体中的酶是辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述辣根过氧化酶对应的底物体系为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)或其衍生物过氧化氢发光体系，在425nm时探测其光信号；

4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述步骤1和步骤2的反应均于37℃恒温中进行，步骤1的反应时间是10～25分钟，步骤2的反应时间是3～8分钟。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述磁性微纳粒子为铁磁性超顺磁材料中的一种或几种组合而成。

6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其中，所述磁性微纳粒子的粒径在10nm～3000nm。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述待测蛋白的体积是30～60μL，酶标抗体的体积是30～60μL，所需生物功能化的磁性微纳粒子的体积是10～50μL。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述对双抗体夹心复合物洗涤的缓冲液组成为：8-10mM的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，体积百分含量为0.02-0.05％的吐温-20。