CN101949945B - 以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，包括偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液；游离甲状腺素系列校准品；辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液；发光底物A液和B液和浓缩洗液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明的优点在于采用磁微粒化学发光法结合了磁微粒固相偶联技术，无磁场存在时，磁性微粒悬浮在液体中，抗原抗体反应类似于均相反应；磁性微粒在外加磁场的作用下方便分离，洗涤快速，做为免疫学载体，可提高检测的精密性、稳定性。本试剂盒组成简单，操作方便，结果稳定可靠，相对市面上的酶联免疫试剂盒和板式化学发光试剂盒，反应时间仅为其1/8-1/4的时间。

Description

以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床免疫检测技术，尤其是涉及一种以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法。

背景技术

甲状腺素(T4)是由甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌的甲状腺激素，其结构由一个酪氨酸残基和一个酚环组成，与三碘甲腺原氨酸(T3)的区别仅在于多一个碘原子。正常人平均每日的T4分泌量为90±9μg，约为甲状腺内贮存量的1％。T4进入血液循环后约99.96％与结合蛋白结合，其中约60％与TBG结合，30％与TBPA结合，其余与白蛋白结合。结合T4与游离T4之间呈可逆的平衡状态。结合状态的甲状腺素不能发挥其生理功能，而只有游离T4方能进入靶细胞与T4受体结合并发挥其生理功能。甲状腺外T4的循环总量为900μg，半衰期为7天。T4是具有生物活性的甲状腺激素，能促进糖、脂肪、蛋白质代谢，产生能量和热，并促进生长发育。近年来有人认为T4是T3的前激素，是其储备形式。血清中总的T4称为总T4(TT4)，游离部分的T4称为游离T4(fT4)。

由于fT4的测定不受血清结合蛋白含量的影响，因此是反映甲状腺功能的灵敏指标。检测血清中呈游离状态的甲状腺素，最能直接反映甲状腺功能状态，并且不受血中甲状腺素结合球蛋白浓度和结合力改变及其它含碘杂质的影响，其敏感性和特异性均明显超过总T4。

各种原因所致的甲低病例中，fT4均显著低于正常范围。但妊娠36周以后fT4呈正常生理性降低；而亚急性甲状腺炎和慢性淋巴性甲状腺炎早期、甲状腺素不敏感综合症以及大量服用甲状腺激素后fT4亦增高。非甲状腺疾病在病情严重时总T4降低，但fT4不降低。对孕妇等常合并有TBG变化的甲亢病人，fT4的测定尤为重要。脐带血fT4的测定，是早期诊断新生儿甲低的一个可靠性指标。

甲状腺素为小分子物质，免疫分析采用竞争法测定，在测定游离甲状腺素时，酶标记抗原会和待测物一样与血清中的蛋白结合，使参与免疫反映的标记物减少，从而导致测定结果错误。游离甲状腺素的测定，关键在于尽可能避免标记物与蛋白的结合。酶联免疫分析法测定游离激素的主要方法有：(1)包被抗T4抗体，标记T4抗原法，如上文所述酶标记抗原会和待测物一样与血清中的蛋白结合，特别是当血清中结合蛋白异常时，往往导致测定结果的错误；(2)包被T4抗体，标记T4的抗原类似物(一般为T3)，虽然较方法(1)有较大的进步，但仍然有其弊端，特别是在类似物结合蛋白浓度异常时，往往导致错误的结果；(3)包被抗原类似物(T3)，标记抗T4抗体法，将抗原类似物连接在固相载体上，进一步减少了与血清中结合蛋白的结合，降低了干扰，测定结果较方法(2)更为准确可靠。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用包被抗原类似物的衍生物的方法快速、灵敏、准确的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，本发明还提供该试剂盒的制备方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，包括偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液；游离甲状腺素系列校准品；辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液；发光底物A液和B液和浓缩洗液。

所述游离甲状腺素系列校准品以去甲状腺素血清或分析缓冲液为校准品基质，加入甲状腺素纯品配制而成。

所述抗甲状腺素抗体为鼠抗甲状腺素单克隆抗体。

所述发光底物A液由luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、pH 9.4的Tris-Hcl缓冲液0.2M组成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、二乙烯三胺五乙酸0.5mM、维生素C 0.12mM、pH 6.5的乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M组成。

所述浓缩洗液由0.1M磷酸盐缓冲液和1％Tween-20组成。

本发明以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

第一步，偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液的制备。

三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的制备：将5mg三碘甲状腺原氨酸溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入2ml 45％的明胶溶液，震荡混匀，然后加入1.5mg碳二亚胺，随后将0.5ml 50mg/ml碳二亚胺溶液加入，反应于室温振荡条件下；在0.05MPH7.4磷酸盐缓冲液中充分透析，透析完毕加入等比例甘油，储存于-20℃备用；

偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液的制备：取磁性微粒，用0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液清洗；将浓度25％的戊二醛按体积比1∶10溶解到含有上述带有磁性微粒的磷酸盐缓冲溶液中，室温振荡反应后，用0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液清洗，去除多余的戊二醛；按照100ul 0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液/3mg磁微粒的比例加入0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液，按照5-20ul/3mg磁微粒之比例加入上述三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物，室温振荡反应；用pH7.4-7.6，含1％牛血清白蛋白(W/V)，0.01％-0.02％的叠氮钠的磷酸盐缓冲液洗涤3-5次，每次室温振荡5-15分钟；用pH 7.4-7.6，含1％牛血清白蛋白(W/V)，0.01％-0.02％的叠氮钠的磷酸盐缓冲液将甲状腺素牛血清白蛋白衍生物的磁微粒混悬液稀释至0.5-1mg/ml的工作液；

第二步，游离甲状腺素系列校准品的制备

用去甲状腺素人血清稀释甲状腺素高值抗原溶液，配制标定后的系列浓度为0pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L；

第三步，辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液的制备

采用过碘酸钠法将抗甲状腺素抗体与辣根过氧化物酶共价偶联在一起，制备成辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体，使用时用缓冲液稀释至工作浓度配制而成；

第四步，发光底物A液和发光底物B液的配制

发光底物A液：由luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、pH 9.4的Tris-Hcl缓冲液0.2M配制而成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、二乙烯三胺五乙酸0.5mM、维生素C 0.12mM、pH 6.5的乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M配制而成。

第五步，浓缩洗液的制备

浓缩洗液由0.1M磷酸盐缓冲液和1％Tween-20配制而成。

本发明的优点在于采用的磁微粒化学发光法结合了磁微粒固相偶联技术，在酶联免疫分析的基础上结合化学发光信号放大技术，是利用辣根过氧化物酶催化发光底物，则发光底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子，利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成比例关系，由此可以建立校准曲线并计算出样品中待测物质的含量。磁性微粒是由超顺磁性纳米粒子，包括磁性金属如Fe、Co、Ni或其金属氧化物等，与高分子或无机材料等形成的一种胶态液体复合物，可通过表面的功能基团进行各种表面的功能化修饰；在外加磁场的作用下通过吸附、清洗、解吸等操作快速移动和分离，具有磁性分离简便、亲和吸附高特异性以及巨大表面积等优点。本发明检测试剂盒反应时间仅需15分钟，分析总耗时不超过30分钟，方便快速，既适用于半自动大通量检测，也适用于全自动检测系统使用。

具体实施方式

本发明所述的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，包括偶联有甲状腺素的类似物的衍生物的磁微粒混悬液，所述磁微粒上偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物；以去甲状腺素血清或分析缓冲液为校准品基质，加入甲状腺素纯品配制而成的游离甲状腺素系列校准品；辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液，抗甲状腺素抗体为鼠抗甲状腺素单克隆抗体；由luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、pH 9.4的Tris-Hcl缓冲液0.2M组成的发光底物A液和由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、二乙烯三胺五乙酸0.5mM、维生素C 0.12mM、pH 6.5的乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M组成的发光底物B液；以及由0.1M磷酸盐缓冲液，1％Tween-20组成的浓缩洗液。

本发明以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

第一步，偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液的制备

三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的制备：将5mg三碘甲状腺原氨酸溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入2ml 45％的明胶溶液，震荡混匀，然后加入1.5mg碳二亚胺，随后将0.5ml 50mg/ml碳二亚胺溶液(溶于0.05M醋酸-醋酸钠溶液)分3次加入，每次间隔1小时，最后一次加入碳二亚胺溶液后继续反应2小时；在0.05M PH7.4磷酸盐缓冲液中充分透析，透析完毕加入等比例甘油，储存于-20℃备用；

偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液的制备：取磁性微粒，用0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液清洗3～5次；将浓度25％的戊二醛按体积比1∶10溶解到含有上述带有磁性微粒的磷酸盐缓冲溶液中，室温振荡反应15～60分钟；用0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液清洗两次，去除多余的戊二醛；按照100ul 0.02MPH7.6磷酸盐缓冲溶液/3mg磁微粒的比例加入0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液，按照5-20ul/3mg磁微粒之比例加入上述三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物，室温振荡反应1～3小时；用pH7.4-7.6，含1％牛血清白蛋白(W/V)，0.01％-0.02％的叠氮钠的磷酸盐缓冲液洗涤3～5次，每次室温振荡5-15分钟；用pH 7.4-7.6，含1％牛血清白蛋白(W/V)，0.01％-0.02％的叠氮钠的磷酸盐缓冲液将甲状腺素牛血清白蛋白衍生物的磁微粒混悬液稀释至0.5～1mg/ml的工作液；

第二步，游离甲状腺素系列校准品的制备

用去甲状腺素人血清稀释甲状腺素高值抗原溶液，配制标定后的系列浓度为0pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L；

第三步，辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液的制备

采用过碘酸钠法将抗甲状腺素抗体与辣根过氧化物酶共价偶联在一起，制备成辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体，使用时用缓冲液稀释至工作浓度配制而成；具体方法为：

称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1.2ml三蒸水中，加入新鲜配制的0.05mol/L过碘酸钠溶液0.5ml，室温振荡30分钟；然后用醋酸-醋酸钠缓冲液于4℃透析过夜，加入1mg鼠抗甲状腺素单克隆抗体，室温振荡反应3小时；用4mg/ml的硼氢化钠0.2ml进行还原；经0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液透析过夜后，离心去除沉淀，上清液即为酶标记物，等比例加入甘油，储存于-20℃备用；辣根过氧化酶标记的抗甲状腺素抗体工作溶液是用含1％牛血清白蛋白的0.05M Tris-HCl缓冲液稀释配制而成，稀释比例为1∶10000-1∶20000；

第四步，发光底物A液和发光底物B液的配制

发光底物A液：由luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、pH 9.4的Tris-Hcl缓冲液0.2M配制而成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、二乙烯三胺五乙酸0.5mM、维生素C 0.12mM、pH 6.5的乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M配制而成。

第五步，浓缩洗液的制备

浓缩洗液由0.1M磷酸盐缓冲液和1％Tween-20配制而成。

本发明试剂盒的使用操作程序如下：

一、实验准备：

1.取1瓶浓缩洗液按标签上标识的稀释要求稀释备用。

2.将恒温箱或恒温水浴锅温度调至37℃，待温度稳定后使用。

3.将磁微粒混悬液充分混匀至无肉眼可见沉淀。

二、实验操作：

1.取出一定量的反应容器，编号。前6孔依次加入50μl校准品，其余孔依次加入50μl样本。

2.摇匀磁微粒混悬液，每孔分别加入20μl。

3.每孔分别加入酶结合物100μl。

4.将反应容器内溶液混合均匀，37℃温育15分钟。

5.使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液洗涤5次。

6.将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。

7.每孔加入发光底物A和发光底物B各50μl，混匀后避光室温反应5分钟。

8.化学发光检测仪检测发光强度。

三、本发明试剂盒在用于游离甲状腺素测定时的性能指标可达到如下状态：

分析灵敏度——最低检出量低于2.5pmol/L；

校准曲线范围——0-100pmol/L；

精密性——分析内精密度平均4.40％(n＝10)，分析间精密度5.58％(n＝3)，远高于国家标准，表明本试剂盒在检测实验中具有良好的重复性；

稳定性——将试剂盒放置于37℃环境下考查加速稳定性10天，试剂盒性能无明显改变。

实验表明，使用本试剂盒检测游离甲状腺素具有如下优点：

1.检测速度快，稳定、无放射性污染等，在没有磁场存在的情况下，磁性微粒悬浮在液体中，使得抗原抗体反应类似于均相反应；磁性微粒在外加磁场的作用下可方便地分离，洗涤快速。。

2.磁性微粒做为免疫学载体，可明显提高检测的精密性、稳定性。磁性微粒的粒径达到纳米级，使得包被固相接近于液相状态，相对微孔板式，减少了包被，封闭等多个影响精密性的操作步骤，分析精密性和稳定性得到极大的提升。

3.本试剂盒组成简单，操作方便，结果稳定可靠，相对市面上的酶联免疫试剂盒和板式化学发光试剂盒，反应时间仅为其1/8-1/4的时间，但试剂性能和操作简便性却不输于这些试剂盒。

Claims (5)

1.一种以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，其特征在于：它包括：偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液；游离甲状腺素系列校准品；辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液；发光底物A液和B液和浓缩洗液；所述发光底物A液由luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、pH9.4的Tris-Hcl缓冲液0.2M组成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、二乙烯三胺五乙酸0.5mM、维生素C0.12mM、pH6.5的乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M组成。

2.根据权利要求1所述的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，其特征在于：所述游离甲状腺素系列校准品以去甲状腺素血清或分析缓冲液为

准品基质，加入甲状腺素纯品配制而成。

3.根据权利要求1所述的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，其特征在于：所述抗甲状腺素抗体为鼠抗甲状腺素单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗液由0.1M磷酸盐缓冲液和1％吐温-20组成。

5.根据权利要求1所述的以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液的制备

三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的制备：将5mg三碘甲状腺原氨酸溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入2ml45％的明胶溶液，震荡混匀，然后加入1.5mg碳二亚胺，随后将0.5ml50mg/ml碳二亚胺溶液加入，反应于室温振荡条件下；在0.05MPH7.4磷酸盐缓冲液中充分透析，透析完毕加入等比例甘油，储存于-20℃备用；

偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液的制备：取磁性微粒，用0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液清洗；将浓度25％的戊二醛按体积比1∶10解到含有上述带有磁性微粒的磷酸盐缓冲溶液中，室温振荡反应后，用0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液清洗，去除多余的戊二醛；按照100ul0.02MPH7.6磷酸盐缓冲溶液/3mg磁微粒的比例加入0.02M PH7.6磷酸盐缓冲溶液，按照5-20ul/3mg磁微粒之比例加入上述三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物，室温振荡反应；用pH7.4-7.6，含1％牛血清白蛋白，0.01％-0.02％的叠氮钠的磷酸盐缓冲液洗涤3-5次，每次室温振荡5-15分钟；用pH7.4-7.6，含1％牛血清白蛋白，0.01％-0.02％的叠氮钠的磷酸盐缓冲液将偶联有三碘甲状腺原氨酸-明胶复合物的磁微粒混悬液稀释至0.5-1mg/ml的工作液；

第二步，游离甲状腺素系列校准品的制备

用去甲状腺素人血清稀释甲状腺素高值抗原溶液，配制标定后的系列浓度为0pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L；

第三步，辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体溶液的制备

采用过碘酸钠法将抗甲状腺素抗体与辣根过氧化物酶共价偶联在一起，制备成辣根过氧化物酶标记的抗甲状腺素抗体，使用时用缓冲液稀释至工作浓度配制而成；

第四步，发光底物A液和发光底物B液的配制

发光底物A液：由luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、pH9.4的Tris-Hcl缓冲液0.2M配制而成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、二乙烯三胺五乙酸0.5mM、维生素C0.12mM、pH6.5的乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M配制而成；

第五步，浓缩洗液的制备

浓缩洗液由0.1M磷酸盐缓冲液和1％吐温-20配制而成。