CN104849469A - 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为基于化学发光免疫分析法检测中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)含量的试剂盒。采用双抗体夹心免疫分析方法,利用化学发光磁性微球免疫技术,包被抗-NGAL抗体的磁性微球将和反应杯中的标准品/样本中的NGAL抗原特异结合,然后再与吖啶盐标记的另一株抗-NGAL抗体反应形成免疫复合物,经预激发液(Pre-Trigger)和激发液(Trigger)的酸碱化学反应,即可测量化学发光反应的相对光单位(RLU/s);标准品/样本中NGAL抗原的含量和光学系统所测量出的相对光单位(RLU/s)成正比关系,通过标准曲线拟合,从而对可对尿液标本中NGAL含量进行测定;具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。
Description
技术领域
本发明是一种检测NGAL含量的试剂盒及其制备方法,涉及双抗体夹心吖啶酯标记管式化学发光免疫分析法(Chemiluminesent Immunoassay,CLIA)检测人尿液中NGAL抗原浓度水平的试剂盒的制备工艺。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是由各种原因引起的肾功能在短时间(几小时至几天)内突然下降而出现的临床综合征,是威胁重症患者生命的常见疾病。重症监护病房中约50%的患者可合并此症。目前,寻找特异、敏感、稳定的早期诊断标志物,从而达到早诊断、早防治AKI,成为降低重症患者病死率的关键。传统的诊断指标(如尿素氮、血肌酐等)受诸多因素影响,敏感性和特异性均无法满足临床早期诊断的需求。研究表明,中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)不但可以作为早期诊断急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的生物学标志,同时还能反应肾脏的损伤程度,因此NGAL是诊断AKI最有效的生物学标志之一。
NGAL是脂钙蛋白超家族中的一员,在1993年于中性粒细胞内的过氧化物酶颗粒中被发现,其分子量为25kDa的分泌蛋白,在包括肾小管在内的一些组织器官的中性粒细胞和上皮细胞中表达。其在炎症、恶性肿瘤、心脏病、糖尿病等发生与发展等过程中有着紧密关联。肾功能异常时,会引起肾小管上皮细胞的损伤,并且分泌大量的NGAL,释放到尿液和血浆中。
在AKI患者中,尿液NGAL可在2h增加15倍,4h的时候增加25倍,相比之下血清肌酐在48h的时候才有明显增加。所以血清肌酐诊断标准的传统方法指导临床就错过了关键的“治疗最佳窗口期”。而NGAL水平可在肾损伤的2h内升高,因此NGAL被作为早期肾损伤生物标志物。
目前市场中检测NGAL的方法有胶体金法、免疫增强比浊法、胶乳免疫比浊法、酶联免疫检测法。其中胶体金法,灵敏度较低,易出现假阳性,其结果易受主观因素的影响;免疫增强比浊法、胶乳免疫比浊法特异性较差,易受脂血的影响;酶联免疫检测法灵敏度低,主要是定性检测。本发明是采用化学发光免疫分析法检测NGAL含量。
化学发光免疫测定(CLIA)技术是继酶免技术(EIA)、放免技术(RIA)、荧光免疫技术(FIA)和时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)之后发展的一项新兴测定技术。根据发光物 质(原理)的不同,可以分为直接化学发光免疫分析和化学发光酶免疫分析、以及电化学发光几大类型。其中直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用,直接参与发光反应,它们在化学结构上有产生发光的特有基团,可直接标记抗原或抗体,而且采用纳米磁性微珠分离。如用吖啶酯直接标记抗体(抗原),与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物,这时只需加入氧化剂(H2O2)和NaOH使成碱性环境,吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。CLIA特异性强、敏感性高,可检测到10-15mol/L的抗原量。快速,一般几十分钟或1~3小时内完成;操作简便,可进行固相和均相分析;试验重复性好,试剂易标准化和商品化,且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害,是一种非常优秀的检测分析方法。目前已用于多种药物、激素、病原微生物及其代谢产物、抗体及其他生物活性物质的测定,并在临床尤其是大型医院有着较为广泛的应用。纳米磁性微珠分离是目前世界上最先进的分离手段,直接发光法不易受到检测样品中其他物质干扰,是目前世界技术最领先的发光模式。所以采用化学发光免疫分析法测定NGAL浓度。
本发明人利用单位及合作团队共同研制的具有自主知识产权的全自动化学发光免疫分析仪Caris200,测定NGAL含量的试剂盒,应用于人尿液NGAL含量的检测,从而辅助AKI早期诊断及预后监测等医疗需求。
本发明的试剂盒作为国内首个适用于Caris200的配套的定量测定NGAL的试剂盒,并利用管式吖啶酯标记的化学发光法,其性能已达到并对照同类ABBOOT(雅培)公司进口的NGAL检测试剂盒,具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。
NGAL检测范围为0~40000ng/ml,范围较广,市面上采用有胶体金法、免疫增强比浊法、胶乳免疫比浊法、酶联免疫检测法的试剂盒的都无法达到检测要求,所以在检测时需将样本稀释再检测。
发明内容
本发明采用于全自动化学发光免疫分析仪Caris 200检测NGAL含量试剂盒(以下简称NGAL-CLIA试剂盒)。该试剂盒采用双抗体夹心免疫分析方法,利用化学发光磁性微球免疫技术,包被抗-NGAL抗体的磁性微球将和反应杯中的标准品/样本中的NGAL特异结合,然后再与吖啶酯盐标记的另一株抗-NGAL抗体反应形成免疫复合物,经预激发液(Pre-Trigger)和激发液(Trigger)的酸碱化学反应,即可测量化学发光反应的相对光单位(RLU/s);标准品/样本中NGAL的含量和光学系统所测量出的相对光单位(RLU/s)成正比关系,通过标准曲线拟合,从而对可对尿液标本中NGAL含量进行定量测定。
为了实现本发明,发明人采用了以下技术方案:
1、筛选确认试剂反应实现所需的核心原料:
为了实现本发明,需要对试剂盒所使用的原料进行筛选,从而确定最佳的核心原料,这一筛选过程包括校准品配制基质、配对抗体、包被磁性微球、吖啶酯盐及其相应浓度和配方等。
2、确定试剂盒的组分及其制备工艺,包括:分析缓冲液配方、磁性微球包被工艺、抗体标记工艺等。
本发明提供的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)检测试剂盒,包括:
1)M试剂:1瓶(100测试装:7.0mL)M3106抗体包被的磁性微球,贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中。防腐剂:0.01%~0.08%ProClin 300。
2)R1试剂:1瓶(100测试装:6.0mL)分析缓冲液,贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中。防腐剂:0.01%~0.08%ProClin 300。
3)R2试剂:1瓶(100测试装:7.0mL)吖啶酯盐标记的M3107抗体,贮存于含有0.1%~0.2%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中。防腐剂:0.01%~0.08%ProClin 300。
4)预激发液:1.0%~1.8%(w/v)过氧化氢。
5)激发液:0.30N~0.40N氢氧化钠。
6)洗涤液:含0.03%~0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲溶液。
7)NGAL校准品:校准品1:0ng/ml;校准品2:10ng/ml;校准品3:100ng/ml;校准品4:500ng/ml;校准品5:1000ng/ml;校准品6:1500ng/ml。即六个浓度的NGAL抗原分别贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中。防腐剂:0.02%-0.06%ProClin 300。
8)NGAL质控品:C1:20ng/ml,C2:200ng/ml,C3:1200ng/ml,贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中。防腐剂:0.02%~0.06%ProClin 300。
9)样本稀释液:含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液。防腐剂:0.02%~0.06%ProClin 300。
根据本发明另一个优选的实施方案,根据反应CV以及发光值,选择JSR Corporation的MS300/Carboxyl磁性微球,规格为:100mg/mL。
根据本发明另一个优选的实施方案,选择苏州工业园区亚科化学试剂有限公司的吖啶酯盐(NSP-DMAE-NHS),货号:Y0266,规格:10mg/管,含量/规格:≥97%。
根据本发明另一个优选的实施方案,试剂盒中的M试剂制造使用工艺为每1mg磁性微球包被20~50μgM3106抗体,R2试剂的制造使用工艺为吖啶酯盐与抗体M3107质量比为 30:1~60:1。
本发明的试剂盒适用于全自动化学发光免疫分析仪Caris 200。
利用本发明的试剂盒进行检测,具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽、无放射性污染的特点,非常适用于临床检测。
附图说明
图1NGAL-CLIA试剂盒检测剂量-反应标准曲线图。
图2NGAL-CLIA试剂盒反应模式选择图(一步法/两步法)。
图3NGAL-CLIA试剂盒稳定性。
图4NGAL-CLIA试剂盒反应线性及HOOK效应。
图5NGAL-CLIA试剂盒检测健康者尿液浓度分布图(n=476)。
图6NGAL-CLIA试剂盒检测130例尿液样本的ROC曲线。
图7NGALCLIA试剂盒检测130例尿液标本NGAL含量图。
图8NGAL-CLIA试剂盒与国外试剂检测尿液样本的相关性图。
具体实施方式
实施例1NGAL抗体包被磁性微球的制备方法
1、抗体的预处理:
(1)将0.1mg抗体(NGAL包被抗体)加入超滤离心管(50kDa)中,8000r/min离心5-6min。将离心浓缩后的抗体加入200uL Binding Buffer,8000-9000r/min离心5-6min,弃掉滤液,再加入200uL Binding Buffer,按上述方法离心,此步骤重复5-6次。
(2)将几次离心后的离心管取出,弃掉滤液,把离心柱反转,2000-3000r/min离心1min,收集滤液,整个过程收集抗体大约200μL。
2、磁性微球的处理:
(1)用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微球,取4.0mg悬浮液到微量厚壁反应瓶中;
(2)将微量厚壁反应瓶置于磁分离架上约1分钟,小心移去上清;
(3)加入1mL Binding Buffer,用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微球;
(4)重复步骤(2)、(3)5次;
(5)将微量厚壁反应瓶置于磁分离架上约1分钟,小心移去上清;
(6)加入10.0μL Coupling Reagent-1和16.0μL Coupling Reagent-2,用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微球;
(7)用磁性微球混合器旋转30分钟;
(8)将微量厚壁反应瓶置于磁分离架上约1分钟,小心移去上清;
(9)加入1mL Binding Buffer,用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微球;
(10)重复步骤(8)、(9)5次;
(11)将微量厚壁反应瓶置于磁分离架上约1分钟,小心移去上清;
(12)加入已经预处理后的抗体,用Binding Buffer稀释至50mg/mL并用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微球;
(13)用磁性微球混合器,旋转包被16~20小时;
(14)将微量厚壁反应瓶置于磁分离架上约1分钟,小心移去上清;
(15)加入1mL TBST Buffer,用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微球;
(16)重复步骤(14)、(15)5次;
(17)将微量厚壁反应瓶置于磁分离架上约1分钟,小心移去上清;
(18)将包被抗体的磁性微球用M试剂稀释液稀释至终浓度,存放于2-8℃。
实施例2吖啶酯标记NGAL抗体的制备方法
1、抗体的预处理:
(1)将0.13mg抗体加入超滤离心管(50kDa)中,8000r/min离心5~6min进行浓缩。将浓缩后的抗体加入200uL PB Buffer,8000~9000r/min离心5~6min,弃掉滤液,再加入200uL PB Buffer,按上述方法离心,此步骤重复5-6次。
(2)将几次离心后的离心管取出,弃掉滤液,把离心柱反转,2000~3000r/min离心1min,收集滤液,整个过程收集抗体大约200μL。
抗体的标记:用预处理后的抗体与吖啶酯盐按50:1质量比充分混匀,震荡16-20小时即可。然后经纯化仪进行纯化所得。将标记吖啶酯盐的抗体用R2稀释液稀释至终浓度,存放于2~8℃。
实施例3试剂盒的使用方法
1.装载试剂
1.1M试剂为黄褐色磁性微球悬浮液,出现沉淀属于正常现象。首次将NGAL定量测定试剂装载到Caris200系统上前,需对M试剂瓶进行翻转混匀。
1.2如果目测磁性微球依然附着于瓶壁上,则需要继续翻转,直至磁性微球重新悬浮为止。如果长时间没有悬浮,则该试剂不能使用。
1.3将NGAL试剂按仪器要求装载于Caris200上,确保检测所需试剂全部上机。确保所有试剂瓶盖已经去除。
2.计算所需样本量
2.1首次进行NGAL检测时,需要先浆样本进行1:10稀释,然后在样品杯中加入已稀释后的175μL样本,每增加一次检测需要向同一样本杯中加入25μL的样本。
2.2如果上机时间>3小时,为防止样本蒸发对检测造成不良影响,应适当增加样本量。
3.装载样本
将样本杯移入样本架中,按仪器要求装载样本并输入正确的样本信息。
4.运行仪器
按下仪器开始键,仪器将自动执行以下操作:
4.1移动样本到指定的位置;
4.2加载反应管;
4.3吸取和转移样本入反应管;
4.4移动反应管到指定位置,将M试剂和R1试剂加入反应管;
4.5混匀、孵育、洗涤反应混合物;
4.6添加R2试剂入反应管;
4.7混合、孵育和洗涤反应混合物;
4.8添加预激发液和激发液;
4.9测试化学发光的发光量;
4.10吸出反应管中液体倒入废液袋,卸载反应管至固体垃圾箱;
4.11计算结果。
实施例4反应体系的建立与优化
反应模式的优化:以M3106作为包被抗体,M3107作为检测抗体,对标准品进行测定,分别使用一步法和两步法,两者的区别为,一步法将包被抗体标准品和检测抗体同时加入反应孔中,37℃共同孵育25min后洗涤4次,加入预激发液上机检测的同时加入激发液,测发光强度;两步法则先加入包被抗体和标准品37℃孵育15min,洗涤2次后加入检测抗体,孵育10min,洗涤2次后加入预激发液上机检测的同时加入激发液,测发光强度。以抗原浓度的对数为横坐标,以荧光值对数为纵坐标,绘制工作曲线(如图1所示)。比较试验结果示于图2,可见当使用两步法时该配对抗体可以获取良好线性的工作曲线,其工作曲线方程为y=3493.0x+92092,r2=0.9964。
包被浓度及标记比例的优化:使用不同浓度的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)包被抗体(编号:M3106)包被磁性微球,包被浓度为10.0μg/mg、15.0μg/mg、25.0μg/mg、40.0μg/mg。使用不同标记比例(Mab:AE;M:M)的吖啶酯盐(NSP-DMAE-NHS)(货号:Y0266)标记NGAL标记抗体(编号:M3107),标记浓度分别为:15:1、30:1、50:1、100:1、150:1。使用NGAL标准品作为检测样本,反应完成后测量RLU值。选择本底低,线性相关系数好的为最佳包被浓度和标记比例。从表1可以看出:(1)随着包被浓度的上升,RLU值有明显上升,但是本底变化不大,所以灵敏度有所提高。在达到40μg/mg后,与25μg/mg包被差别不明显,说明25μg/mg包被浓度已接近饱和。因此我们选择25μg/mg为最佳包被浓度;(2)随着标记比例的提高,整体RLU值下降,当标记比例为50:1时,本底低、灵敏度好、线性相关系数(r)高。因此,选择每1mg磁性微球包被25ug抗体为最佳包被浓度,吖啶酯与抗体质量比为50:1为最佳标记比例。
表1最佳包被浓度和标记比例的确定
实施例5试剂盒稳定性实验
将试剂盒的各组分(MP:磁性微球包被抗体,AE:吖啶酯标记抗体,STD:标准品)放于37℃7天,检测工作曲线的相关性。如图3所示,与4℃对照相比较,各组分放置37℃7天后整体曲线相关系数变化不大,与对照组无差异;各组分分别于对照相比,曲线相关性变化基本无差异。试剂盒在加速破坏实验中稳定性能能良好。初步设定该试剂盒在4℃条件下可以稳定储存12个月。
实施例6试剂盒的实验室性能
对实施例1的试剂盒进行实验室性能分析,结果如下:
1)最低检测量:2.5ng/ml。
2)准确性
用样本稀释液将NGAL抗原稀释成10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml六个浓度,测定其回收率在89.60%-107.8%之间。取高、中、低浓度(1200ng/ml、200ng/ml、20ng/ml)三分NGAL抗原,用样本稀释液成2-,4-,8-,测其回收率,回收率在85.45%-115.69%之间。
3)剂量-反应曲线的线性
将NGAL抗原稀释成一系列浓度进行测定,结果如图4所示,在1600ng/ml时出现HOOK效应。故该检测试剂的线性范围为10~1500ng/ml。
4)精密度(CV%)
将NGAL抗原用5%BSA稀释液成(20ng/ml、200ng/ml、1200ng/ml)3个浓度。在一日内每份样本重复检测20次,结果显示批内变异系数(CV)为1.23-4.56%,在三个独立日内每份样本检测10次,结果显示批间变异系数为2.34-4.12%。
5)特异性
用本方法检测尿样本中NGAL浓度时的交叉反应物酸性糖蛋白,a-1-微球蛋白,肝细胞生长因子,基质金属蛋白酶,计算交叉反应率,结果分别为0.034%、0.053%、0.065%和0.098%,无交叉反应。
实施例7试剂盒尿液检测cut-off值的建立
476例正常人样本,用于测定正常参考范围,年龄范围18-78岁,平均年龄51.52±16.22岁。130例临床患者尿液,其中45例临床诊断为急性肾损伤患者,年龄范围27-70岁,平均年龄52.2±16.27岁;慢性肾损伤53例,年龄范围20-62岁,平均年龄50.80±14.72岁;对照组42例,年龄20-60岁,平均年龄48.41±10.90岁。用试剂盒在Caris200上进行检测。采用百分位法结合ROC曲线法,设定cut-off值。结果检测的最低值为2.5ng/ml,最高值为217.82ng/ml,平均浓度(Mean)为75.74ng/ml,标准差(SD)37.97ng/ml。从表2-1、2-2及图5结果可以看出,95%样本的浓度值在142.36ng/ml以下,均值加2倍标准差等于151.68ng/ml,而当浓度值在152.55ng/ml以下时,包含了97.5%的标本。130例样本结果绘制ROC曲线,从图6可以得出取正确诊断指数=灵敏度-(1-特异度)=Sensitivity-(1-Specificity),AUC>0.994时其检测浓度为152.34。综合其他人的研究及临床现行参考值,建议设定本试剂检测时的NGAL尿液正常参考值范围为0-155ng/ml。
表2-1正常人尿液样本的年龄统计分析(n=476)
表2-2正常人尿液NGAL水平检测结果统计分析(n=476)
实施例8试剂盒临床标本检测分析
130例临床患者尿液检测结果如图7和表3所示:45例急性肾衰竭患者尿液NGAL浓度为320.15±137.53ng/ml;53例慢性肾脏疾病患者尿液NGAL浓度为130.60±55.73ng/ml;40例对照尿液NGAL浓度为30.22±12.19ng/ml。急性肾衰竭患者尿液NGAL浓度明显高于慢性肾脏疾病患者和对照组P=0.003<0.05,有显著差异。慢性肾脏疾病患者尿液NGAL与对照组比较有差异P=0.012<0.05,差异显著。说明NGAL在急性肾损伤与非急性肾损伤方面特异性较高。
表3 130例尿液标本NGAL含量统计分析
实施例9试剂盒同国外试剂盒临床尿液样本测值比较
为了评估这种新检测试剂在临床应用的可行性,我们采取实施例1试剂盒与临床使用的雅培化学发光微粒子免疫检测法检测NGAL的试剂同时对130例临床尿液样本进行检测。这130例样本属于非正态分布,将其进行配对非参数秩和检验和一致性评测,结果如下:Z=-1.532,P=0.125>0.05,表明两试剂在检测NGAL上无统计学差异。用四格表4计算2种检测方法的一致性,阳性符合率100%,阴性符合率93.24%,粗一致性96.15%,一致性检验 结果显示量检测结果的Kappa值为0.922。相关性分析如图8所示,x轴表示雅培NGAL-CMIA法检测得到的NGAL浓度,y轴表示NGAL-CLIA法检测得到的NGAL浓度。可见,两种方法有良好的相关性,相关方程为y=0.983x+102,相关系数为0.9980。表明两种检测方法的一致性相当可靠,具有很好的临床检测性能相仿性。
表4两种检测方法的一致性评测
注:CMIA的cut-off值为137ng/ml,CLIA的cut-off值为155ng/ml。N=a+b+c+d。
Claims (5)
1.一种检测NGAL含量试剂盒及其制备方法,其特征在于试剂盒包括:1)M1试剂、R1试剂、R2试剂、激发液、预激发液、NGAL校准品、NGAL质控品、洗涤液和样本稀释液,和2)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管的外包盒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征还在于试剂盒中的试剂分别由以下成分组成:
1)M试剂:1瓶(100测试装:7.0mL)M3106抗体包被的磁性微球,贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中;0.01%~0.08%ProClin 300。
2)R1试剂:1瓶(100测试装:6.0mL)分析缓冲液,贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中;0.01%~0.08%ProClin 300。
3)R2试剂:1瓶(100测试装:7.0mL)吖啶酯盐标记的M3107抗体,贮存于含有0.1%~0.2%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中;0.01%~0.08%ProClin 300。
4)预激发液:1.0%~1.8%(w/v)过氧化氢。
5)激发液:0.30N~0.40N氢氧化钠。
6)洗涤液:含0.03%~0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲溶液。
7)NGAL校准品:校准品1:0ng/ml、校准品2:10ng/ml、校准品3:100ng/ml、校准品4:500ng/ml、校准品5:1000ng/ml、校准品6:1500ng/ml,即六个浓度的NGAL抗原分别贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中;0.02%-0.06%ProClin 300。
8)NGAL质控品:C1:20ng/ml,C2:200ng/ml,C3:1200ng/ml,贮存于含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液中;0.02%~0.06%ProClin 300。
9)样本稀释液:含有0.5%~3%BSA稳定剂的0.1M Tris缓冲液;0.02%~0.06%ProClin300。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征还在于该试剂盒适用于全自动化学发光免疫分析仪Caris 200。
4.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征还在于M试剂中使用的磁性微球为JSR Corporation的MS300/Carboxy,规格为100mg/mL,且试剂中每1mg磁性微球包被20~50μgM3106抗体。
5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征还在于R2试剂中使用吖啶酯盐为苏州工业园区亚科化学试剂有限公司的NSP-DMAE-NHS,货号为Y0266,规格为10mg/管,含量/规格为≥97%;且试剂中吖啶酯盐与抗体M3107质量比为30:1~60:1。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150819 |