CN107247135A

CN107247135A - 一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN107247135A
Application number: CN201710685239.0A
Authority: CN
Inventors: 胡雪婷; 常燕; 曹晶; 刘丽青; 杜爱铭; 徐兵
Original assignee: Taiyuan Rui Sheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Taiyuan Rui Sheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2017-10-13

Abstract

本发明公开了一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：偶联有磺胺二甲基嘧啶抗原或抗体的磁颗粒、吖啶酯标记物、磺胺二甲基嘧啶系列标准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。与现有检测磺胺二甲基嘧啶的技术相比，本试剂盒具有灵敏度高，信噪比高，快速检测的优点。其分析灵敏度可达0.020 μg/L。

Description

一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

磺胺二甲基嘧啶，又名4-氨基苯磺酰胺，其结构为：

磺胺二甲基嘧啶——一种磺胺类药物，是通过人工合成的氨苯磺胺衍生物。其主要残留于动物源性食品中，如：肝、肾、肌肉、水产品、牛奶等。磺胺二甲基嘧啶一旦被摄入体内，代谢所需时间较长。一般情况下，人们使用的动物源性食品数量较少，大多数不会由于残留而引起急性毒性的作用。但如果经常食用含有此类药物的动物源性食品就可能造成慢性中毒，损害人体健康。如影响机体的泌尿、引起过敏反应、抑制造血系统，甚至导致癌症的发生。另外，人体内长期存在磺胺二甲基嘧啶会导致许多细菌对磺胺类药物产生抗药性。因此，食品中磺胺类药物的残留量已经受到各国重视，英、美等国家对磺胺类药物在肉类及乳制品中的允许残留量限制为100 μg/kg；欧盟第675/92号令中规定，在肉类及牛奶中磺胺的最大残留量不得超过100 μg/kg；日本要求的最高残限制量更为严格，单个磺胺残留限制量为20 μg/kg，最大残留总量不得超过100 μg/kg；而我国对磺胺类药物在肉类及乳制品中的允许残留量限制为100 μg/kg。

目前，检测磺胺二甲基嘧啶的方法有高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法、荧光偏振免疫分析方法、酶联免疫吸附法、胶体金法、化学发光法等。其中，液相色谱分析法缺乏高灵敏的检测器，仪器操作繁琐，前处理复杂，耗时。酶联免疫方法，采用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记物，其酶标记物易失活，显色底物见光易分解，灵敏度低，对结构类似的化合物具有一定的交叉反应，造成测试结果不准确。

CN 200310117065.6（2003.12）采用酶联免疫法对磺胺二甲基嘧啶进行检测，采用碱性磷酸酶标记，其灵敏度低，操作过程繁琐。CN 201935918 U（2010.8）采用胶体金法检测蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶的残留量，其试剂盒最后检测结果是以肉眼可见的颜色进行表征，误差较大，并且操作繁琐，流程较多，更易出现误差。

CN 106771132 A（2016.11）公开了一种化学发光检测磺胺二甲基嘧啶试剂盒，该试剂盒采用辣根过氧化物酶标记磺胺二甲基嘧啶半抗原，采用辣根过氧化物酶的缺点主要是酶促受环境影响大：如消毒液、酸碱度、离子都会对其造成影响，影响测定结果。而本公司开发的一种磺胺二甲基嘧啶化学发光试剂盒，采用吖啶酯作为标记物，具有检测稳定、测量快速、灵敏度高的优点。

化学发光方法较其他方法的优点在于检测的简单性。

该体系采用磁分离体系，吖啶酯标记的化学发光技术进行检测的优点是：吖啶酯作为发光剂不需催化剂的存在，在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光；吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度，反应迅速；背景低、信噪比高，是一类有效的化学发光标记物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定、检测速度快、具有较高灵敏度和特异性的免疫磁微粒化学发光检测方法，为食品中检测磺胺二甲基嘧啶提供便利。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

在反应杯中加入一定量的待测样本，然后加入磁颗粒偶联悬浮液和吖啶酯标记物，混匀，于37℃孵育数分钟，最后分离、洗涤，加入化学发光预激发液A和激发液B，测定相应的发光强度（RLU），对照磺胺二甲基嘧啶检测标准曲线，获得待测样中的磺胺二甲基嘧啶的浓度。

本发明中的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

本发明中的吖啶酯标记物包含：吖啶酯标记的是磺胺二甲基嘧啶抗原或抗体，其中吖啶酯溶液的浓度范围为2-85 mmol/L，其优选浓度为6.5 mmol/L。

本发明中缓冲液是pH 4.5-6.5，浓度为0.1 mol/L，经过0.22 μm滤器过滤的MES缓冲液。

本发明中所述的磺胺二甲基嘧啶系列校准品浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L，其缓冲液是含有0.5-5.0% BSA和0.1-0.5% PC300的Tris-HCl。

本发明中的化学发光预激发液A为：H₂O₂和HNO₃的混合液，其中H₂O₂的质量分数为0.05-5% mol/L，HNO₃浓度为0.05-2.5 mol/L。

本发明中的化学发光激发液B为：Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的浓度为0.05-2.0 mol/L，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。

本发明中的清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.05-0.50 mol/L的NaCl及0.01-0.25% Tween-20。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的试剂盒稳定、检测快、灵敏度高和特异性好。

具体实施方式

下面将对本发明中的技术方案进行清楚、详细的阐述。实例中实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：试剂盒1的组建及其具体组分的制备

1. 试剂盒的组建

一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：

吖啶酯标记的磺胺二甲基嘧啶抗原；

羧基磁珠偶联磺胺二甲基嘧啶抗体；

化学发光预激发液A和化学发光激发液B；

磺胺二甲基嘧啶系列标准品溶液，标准品浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L，其缓冲液是含有0.5-5.0% BSA 和0.1-0.5% PC300的Tris-HCl；

清洗液，具体为pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含浓度为0.15 mol/L的NaCl及0.05% Tween-20。

2. 磁珠偶联抗体的制备

（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入一定量0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清液，洗涤3次，再加入一定量MES（pH值为6.0）缓冲液，涡旋。

（2）加入15 μL（15 μg）磺胺二甲基嘧啶抗体，涡旋，旋转反应管，室温孵育30 min。

（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2 h。

（4）去上清液，加入一定量的清洗缓冲液（TBS+0.05%Tween-20），洗涤3次。

（5）用含1%BSA的缓冲液进行封闭，反复封闭4次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。

3. MES缓冲液的配制（0.1 mol/L）

取19.52 g的MES固体，溶于500 mL的去离子水中，用1 mol/L的NaOH调节到pH为6.0；把调好的溶液转移到1 L的容量瓶中，定容。

4. 偶联试剂EDC的配制（浓度为10 mg/mL）

取1 g的EDC于50 mL的烧杯中，加入预冷的MES缓冲液，搅拌，待其溶解转移至100 mL的容量瓶中，定容。

5. TBS-T缓冲液的配制（浓度为25 mmol/L）

称量3.05 g的Tris，8.775 g的NaCl至500 mL的烧杯中，加入1mL的0.05% Tween-20，磁力搅拌的条件下用6 mol/L的HCl调节pH为 7.2，移至1000 mL的容量瓶中，定容。

6. 吖啶酯标记抗原的制备

（1）将一定量的磺胺二甲基嘧啶置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 9.5、浓度为0.1mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

（2）称取1.7 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺DMF中，配成6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。

（3）将透析后的抗原溶液置于500 μL离心管内，加入一定量6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗原的摩尔比值为10:1，加入200 μL标记缓冲液，室温反应45min，加入10 g/L 赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。

（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ag与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。

（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。

（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1%BSA（体积）后分装冰冻保存。

7. 透析缓冲液的制备（pH 为9.5、浓度为0.1mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃）

A液（0.1 mol/L，Na₂CO₃）：取10.62 g的Na₂CO₃加蒸馏水至1 L，

B液（0.1 mol/L，NaHCO₃）：取8.4 g的NaHCO₃加蒸馏水至1 L，

取A液3 mL ，B液7 mL混合，即A液：B液=3:7的比例混合。

8. 化学发光激发液A、B的制备

（1）化学发光预激发液A由H₂O₂和HNO₃组成。其中，H₂O₂质量分数为1.5%，HNO₃浓度为0.1mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。

（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100浓度为0.1 mol/L，NaOH浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。

实施例2：试剂盒2的组建及其组分的制备

1. 试剂盒的组建

吖啶酯标记的磺胺二甲基嘧啶抗体；

羧基磁珠偶联磺胺二甲基嘧啶抗原；

化学发光预激发液A和化学发光激发液B；

2. 磁珠偶联抗原的制备

（1）取1mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入一定量0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清液，洗涤3次，再加入一定量MES（pH值为5.0）缓冲液，涡旋。

（2）加入18 μL（18 μg）的磺胺二甲基嘧啶抗原，涡旋，旋转反应管，室温孵育30min。

（3）加入10 μL 浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2 h。

（4）去上清液，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。

3. 吖啶酯标记抗体的制备

（1）将一定量的磺胺二甲基嘧啶抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH值为10.1、浓度为0.1 mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

（3）将透析后的抗体溶液置于500 μL离心管内，加入一定量6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗体的摩尔比值为7.4:1，加入200 μL标记缓冲液，室温下反应45 min，加入10 g/L 赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。

（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 值为6.3、浓度为0.1mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。

（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280nm吸光度值。

实施例3：试剂盒的检测

1. 样本前处理

（1）牛奶检测样本溶液的获得：取新鲜牛奶150 μL于500 μL离心管中，4℃离心10 min（3000 r/min），弃去上层脂肪。移取离心后的牛奶样本25 μL于干净的玻璃试管中，加入950μL浓度为 0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。

（2）取蜂蜜1 g加入25 mL离心管中，加入2 mL 0.5 mol/L盐酸溶液，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解，于55-75℃的热水中温热数分钟，加入5 mL浓度为 0.2 mol/L的氢氧化钠，调节pH值范围为4.0-6.0，振荡混匀。加入8 mL乙酸乙酯，上下翻转振荡5 min后，离心10min（3000 r/min）。取上层有机溶剂5 mL与干净的玻璃管中，于空气中吹干，滴加0.5 mL浓度为0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，混匀，待检。

2. 反应过程

（1）将待测样本100 μL、偶联磁微粒混悬液150 μL、吖啶酯标记物150 μL，依次加入反应管中，振荡混匀，37℃孵育15 min。

（2）分离、洗涤5次。

（3）将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒分散均匀。

（4）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度（RLU），样本中磺胺二甲基嘧啶的含量与其发光强度成一定比例关系。

实施例4：试剂盒的性能指标

（1）试剂盒的灵敏度

对零标准溶液进行20次重复测试，取零标准溶液测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的灵敏度。本试剂盒对磺胺二甲基嘧啶的灵敏度为0.020 μg/L。

（2）试剂盒的特异性

与磺胺二甲基嘧啶结构或功能相似的竞争药物：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹恶琳、磺胺吡啶。按试剂盒步骤操作，分别加入：磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹恶琳、磺胺吡啶，制作抑制曲线，根据线性方程计算各药物的50%抑制浓度。交叉反应率即为抗体对磺胺二甲基嘧啶的IC₅₀与抗体对磺胺二甲基嘧啶竞争物的IC₅₀之比的百分数。结果显示：试剂盒对磺胺二甲基嘧啶具有较高的特异性，对与磺胺二甲基嘧啶结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：偶联有磺胺二甲基嘧啶抗体的磁微粒混悬液、吖啶酯标记的磺胺二甲基嘧啶抗原、磺胺二甲基嘧啶系列标准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。

2.根据权利要求1所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

3.根据权利要求1所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，吖啶酯标记的是磺胺二甲基嘧啶抗原。

4.根据权利要求1所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与磺胺二甲基嘧啶抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记磺胺二甲基嘧啶抗体。

5.根据权利要求1所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光预激发液A由H₂O₂和HNO₃的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。

6.根据权利要求1所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品是以含有0.5-5.0% BSA和0.1-0.5% PC300的Tris-HCl缓冲液为基质，加入磺胺二甲基嘧啶纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。

7.一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：偶联有磺胺二甲基嘧啶抗原的磁微粒混悬液、吖啶酯标记的是磺胺二甲基嘧啶抗体、胺二甲基嘧啶系列标准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。

8.根据权利要求7所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，吖啶酯标记的是磺胺二甲基嘧啶抗体。

9.根据权利要求7所述的一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与磺胺二甲基嘧啶抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记磺胺二甲基嘧啶抗原。