CN106970227A - 一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少、灵敏度高、特异性强、高重复性等优点。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
结直肠癌，又称大肠癌，是常见的恶性消化道肿瘤之一，危害着全球人类的健康。在男性恶性肿瘤中发病率位居第三位，在女性中位居第二位。流行病学和生物学研究发现，无论在大肠癌的发病率还是病理发展过程中，均存在着性别差异。研究证明，性激素，特别是雌激素可能是其中的一个重要的调节因素。具有相似分期和病理类型的男性大肠癌病人和女性大肠癌病人，其肿瘤的发生和进展却有明显不同。而且，改变体内的激素微环境水平，可以减缓或促进肿瘤的发生及进展，有许多研究论证了这个观点，尤其是来自雌激素替代疗法等方面的临床研究，而雌激素在体内主要依靠雌激素受体结合发挥生物作用的。雌激素是由芳香化酶催化雄激素转化而来的，影响其靶组织(生殖系统、脑与心血管系统等)的生长、分化和功能。近年来的研究发现，雌激素在大肠癌的发生中起一种保护性作用。雌激素替代治疗可以减少妇女发生大肠癌的风险，并且可以减少女性大肠癌患者的死亡率。大肠癌的发生发展与雌激素有关。雌激素主要是通过雌激素受体发挥生物学作用的。雌激素受体属于核受体超家族成员，是一类配体调节的转录因子，通过与不同配体和反应元件结合，调节一系列靶基因转录，进而发挥生物学作用。
目前，大肠癌的筛查包括侵入性和非侵入性两种主要手段。目前，侵入性检查主要指肠镜检查，虽然肠镜可以明显的提高大肠癌的检测率，但是，这种检测方法因为高成本，高风险，操作麻烦而限制了它从而不能成为大肠癌的普查方法，而非侵入性的生物分子标志具有方便容易以及经济等优点，因此他们在大肠癌的普查中具有很大的优势及潜力。生物标志物是生物体内状态的提示物，因此，生物分子标志物拥有评估正常生物过程、病理过程以及体内对药物治疗的反应。而作为检测大肠癌的生物标志最关键的一点就是它必须是大肠癌早期的反应指标，这样才能早期发现早期治疗大肠癌。所以大肠癌检测方法必须要有很高的灵敏度和特异度，而假阳性率和假阴性率都要相对很低，以至于不会让正常人群免去做肠镜的痛苦。
中国专利申请CN102747151A公开了一种检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒及检测方法，它包括红细胞裂解液、核酸提取液、PCR扩增反应液，酶纯化液。中国专利申请CN102329875A公开了一种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRMPCR预混液和Nuclease-freedH2O。
目前，有许多非侵入性大肠癌的检测方法，其中FOBT是目前最常用的方法。但是，这种方法在筛查普通人群时灵敏度和特异度方面欠缺。因此，研究出一种灵敏度和特异度高的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，更好的提高大肠癌检出率，以及判断被诊断患大肠癌的患者的预后和治疗有效性是必要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少、灵敏度高、特异性强、高重复性等优点。
本发明的技术方案是：
本发明提供了一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。
所述雌激素受体标准品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、45ng/mL、90ng/mL、200ng/mL的标准液，即得。
所述雌激素受体质控品的制备包括以下步骤：雌激素受体质控品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为60ng/mL、120ng/mL的溶液，即得。
所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。
所述发光底物液Ⅰ的制备方法为：用双蒸水和硝酸配制成浓度为0.1M的稀硝酸溶液，加入过氧化氢，使过氧化氢的浓度为0.08M。
所述发光底物液Ⅱ的制备方法为：用双蒸水和氢氧化钠配制成浓度为0.2M的氢氧化钠溶液，加入TritonX-100，使TritonX-100的质量浓度为2％。
所述抗试剂的制备包括以下步骤：
(1)取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；
(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；
(3)将步骤(2)所得溶液B加入到步骤(1)所得溶液A中，吖啶酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为15～25∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；
(4)将步骤(3)所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。
所述磁珠免疫复合物的制备包括以下步骤：
取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤3～5次，加入40μL生物素化雌激素受体单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为120r/min，8～20min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为10～25min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；
其中，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。
其中，上述磁珠免疫复合物的制备中，所述生物素化雌激素受体单克隆抗体的制备包括以下步骤：
A取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液Ⅰ；
B将生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力搅拌反应，反应时间为12h，滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲，收集滤液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，得活性生物素酯粗品，将上述活性生物素酯粗品用热异丙醇溶解，置于冰浴中，放置时间为3h，过滤收集结晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；
C向步骤A所得溶液Ⅰ中加入步骤B所得活性生物素酯，活性生物素酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为8～15∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；
D将步骤C所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。
其中，上述磁珠免疫复合物的制备中，所述链霉亲和素磁珠的制备包括以下步骤：
a.配制pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min，将1mg的链霉亲和素溶于1mL上述磷酸盐缓冲液中，得链霉亲和素溶液，取200μL上述链霉亲和素溶液装于EP管中；
b.取2.5mL氨基化磁性微球，加入2mL戊二醛，室温震荡反应，反应时间为5h，进行磁分离，用水清洗除去多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在2.5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，得磁性微球液；
c.将步骤b所得磁性微球液加入到步骤a装有200μL链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养5h，磁分离，得固体物，将所得固体物分散在5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，使浓度至10mg/mL，得链霉亲和素磁珠。
其中，上述链霉亲和素磁珠的制备中，所述步骤b中氨基化磁性微球的制备包括以下步骤：
Ⅰ取0.05g四氧化三铁磁性纳米微球，加入2mL蒸馏水和10mL乙醇，磁力搅拌，加热升温至75℃，加入25μL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，反应5h后，降温至60℃，加入30μL氨水，30min后加入20μL正硅酸乙酯，反应2h后，降至室温，用乙醇和水进行洗涤，磁分离，得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球；
Ⅱ向步骤Ⅰ所得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球中，加入10mL乙醇和2mL水，超声，超声时间为1min，磁力搅拌，搅拌30分钟后，加入100μL氨水，继续搅拌，搅拌15分钟后，加入50μL氨丙基三甲氧基硅烷，反应5h后，用乙醇与水洗涤，磁分离，直至PH试纸检测到上清液为中性，得固体物，向所得固体物中加入pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，使浓度至20mg/mL，得氨基化磁性微球。
另外，本发明还提供了所述用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1将待测样本进行预处理，取上清液，25℃平衡10分钟；
S2在每一平底试管中加入25μL雌激素受体校准品、雌激素受体质控品或待测样本，37℃温育10分钟，加入25μL磁珠免疫复合物，混匀后，37℃温育10分钟；
S3将平底试管在磁分离器上静置，静置时间为3分钟，去上清液，将平底试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍打3次，使孔中的液体完全除去，每一平底试管中加入200μL浓缩洗涤液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置，静置时间为3分钟，去上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干拍打3次，重复两次；
S4向平底试管中加入抗试剂，抗试剂的加入量为每平底试管50μL，混匀后置37℃孵育15分钟；
S5重复步骤S3的操作；
S6向平底试管中加入发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅰ的加入量为每平底试管50μL，1S后加入发光底物溶液Ⅱ，发光底物溶液Ⅱ的加入量为每平底试管50μL；
S7用化学发光仪检测每管的发光值，根据各标准溶液发光值绘制标准曲线，即可得出待测样本中雌激素受体的浓度。
本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒的原理是：采用双抗体夹心法。本发明以链霉亲和素磁珠作为固相载体，通过链亲和素-生物素的亲和作用，将生物素标记的雌激素受体单克隆抗体偶联在链霉亲和素磁珠表面，制备得到磁珠免疫复合物。抗试剂由雌激素受体单克隆抗体和吖啶酯制备而成，在本发明抗试剂的制备中，用吖啶酯标记雌激素受体单克隆抗体的反应，吖啶酯有一个N-羟基琥珀酰亚胺酰酯标记基团，通过一个空间二碳臂与吖啶酯母体相连。在碱性条件下，该N-羟基琥珀酰亚胺酰酯标记基团被置换下来，使吖啶酯通过共价键与被标记的雌激素受体单克隆抗体的氨基结合。利用连接于固相载体链霉亲和素磁珠上的生物素标记的雌激素受体单克隆抗体，以及抗试剂(吖啶酯标记雌激素受体单克隆抗体)分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-抗体夹心复合物。由于反应系统中固相抗体和吖啶酯标记的抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的吖啶酯作用于加入的底物后的发光值，即可确定待测抗原含量。
与现有技术相比，本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有以下优势：
(1)本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒的检测方法准确、可靠，操作简单。
(2)本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒检测时间短、用量少。
(3)本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒灵敏度高、特异性强、高重复性。
(4)本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒适用血液、胸腔积液、痰液、唾液、精液、尿液、腹水等多种标本类型。
(5)在使用本发明试剂盒进行检测时，不需要用离心的方式对检测体系中多余的杂质进行分离，只需在外加磁场的作用下即可达到快速分离杂质和固相抗体-抗原-抗体复合物的目的，使复合物从复杂的环境中高效分离出来，达到分离特异性抗原的目的，本发明试剂盒在进行检测时，形成的固相抗体-抗原-抗体夹心复合物，该复合物能够在磁场作用下发生移动，能够减少环境对检测的干扰因素。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明所用四氧化三铁磁性纳米微球可购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号109514。雌激素受体可购自上海康朗生物科技有限公司，货号KL-P143。雌激素受体单克隆抗体可购自上海亨代劳生物仪器有限公司，货号LT001。链霉亲和素可购自上海嵘崴达实业有限公司，货号21122。
实施例1、本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒的组成与制备
本发明所述的试剂盒包括以下组分：
(1)雌激素受体标准品；(2)雌激素受体质控品；(3)浓缩洗涤液；(4)发光底物溶液Ⅰ；(5)发光底物溶液Ⅱ；(6)抗试剂和(7)磁珠免疫复合物。
本发明试剂盒中各试剂的制备包括以下步骤：
(1)雌激素受体标准品的制备：
制备方法：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、45ng/mL、90ng/mL、200ng/mL的标准液，即得。
(2)雌激素受体质控品的制备：
制备方法：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为60ng/mL、120ng/mL的溶液，即得。
(3)浓缩洗涤液的制备：
制备方法：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。
(4)发光底物液Ⅰ的制备：
制备方法：用双蒸水和硝酸配制成浓度为0.1M的稀硝酸溶液，加入过氧化氢，使过氧化氢的浓度为0.08M。
(5)发光底物液Ⅱ的制备：
制备方法：用双蒸水和氢氧化钠配制成浓度为0.2M的氢氧化钠溶液，加入TritonX-100，使TritonX-100的质量浓度为2％。
(6)抗试剂的制备：
制备方法：
(1)取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；
(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；
(3)将步骤(2)所得溶液B加入到步骤(1)所得溶液A中，吖啶酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为15～25∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；
(4)将步骤(3)所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。
(7)磁珠免疫复合物的制备：
①氨基化磁性微球的制备：
Ⅰ取0.05g四氧化三铁磁性纳米微球，加入2mL蒸馏水和10mL乙醇，磁力搅拌，加热升温至75℃，加入25μL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，反应5h后，降温至60℃，加入30μL氨水，30min后加入20μL正硅酸乙酯，反应2h后，降至室温，用乙醇和水进行洗涤，磁分离，得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球；
Ⅱ向步骤Ⅰ所得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球中，加入10mL乙醇和2mL水，超声，超声时间为1min，磁力搅拌，搅拌30分钟后，加入100μL氨水，继续搅拌，搅拌15分钟后，加入50μL氨丙基三甲氧基硅烷，反应5h后，用乙醇与水洗涤，磁分离，直至PH试纸检测到上清液为中性，得固体物，向所得固体物中加入pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，使浓度至20mg/mL，得氨基化磁性微球。
②链霉亲和素磁珠的制备：
a.配制pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min，将1mg的链霉亲和素溶于1mL上述磷酸盐缓冲液中，得链霉亲和素溶液，取200μL上述链霉亲和素溶液装于EP管中；
b.取2.5mL氨基化磁性微球，加入2mL戊二醛，室温震荡反应，反应时间为5h，进行磁分离，用水清洗除去多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在2.5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，得磁性微球液；
c.将步骤b所得磁性微球液加入到步骤a装有200μL链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养5h，磁分离，得固体物，将所得固体物分散在5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，使浓度至10mg/mL，得链霉亲和素磁珠。
③生物素化雌激素受体单克隆抗体的制备：
A取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液Ⅰ；
B将生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力搅拌反应，反应时间为12h，滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲，收集滤液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，得活性生物素酯粗品，将上述活性生物素酯粗品用热异丙醇溶解，置于冰浴中，放置时间为3h，过滤收集结晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；
C向步骤A所得溶液Ⅰ中加入步骤B所得活性生物素酯，活性生物素酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为8～15∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；
D将步骤C所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。
④磁珠免疫复合物的制备：
取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤3～5次，加入40μL生物素化雌激素受体单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为120r/min，8～20min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为10～25min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；
其中，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。
实施例2、采用本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒进行雌激素受体检测
S1将待测样本进行预处理，取上清液，25℃平衡10分钟；
S2在每一平底试管中加入25μL雌激素受体校准品、雌激素受体质控品或待测样本，37℃温育10分钟，加入25μL磁珠免疫复合物，混匀后，37℃温育10分钟；
S3将平底试管在磁分离器上静置，静置时间为3分钟，去上清液，将平底试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍打3次，使孔中的液体完全除去，每一平底试管中加入200μL浓缩洗涤液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置，静置时间为3分钟，去上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干拍打3次，重复两次；
S4向平底试管中加入抗试剂，抗试剂的加入量为每平底试管50μL，混匀后置37℃孵育15分钟；
S5重复步骤S3的操作；
S6向平底试管中加入发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅰ的加入量为每平底试管50μL，1S后加入发光底物溶液Ⅱ，发光底物溶液Ⅱ的加入量为每平底试管50μL；
S7用化学发光仪检测每管的发光值，根据各标准溶液发光值绘制标准曲线，即可得出待测样本中雌激素受体的浓度。
对比例1、试剂盒的组成与制备
对比例1试剂盒的组成和制备与实施例1试剂盒的组成和制备基本相同，区别在于，所述磁珠免疫复合物由链霉亲和素磁珠和生物素化雌激素受体单克隆抗体制备而成，其中，所述链霉亲和素磁珠未经表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米微球，而直接氨基化后制得的氨基化磁性微球与链霉亲和素制备而成。
试验例一、用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒的稳定性
1、加速破坏稳定性
为了考核试剂盒的加速破坏稳定性，分别对放置4℃、37℃保存10天的实施例1制备的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒进行性能测试，测试试剂盒的性能指标。加速破坏稳定性结果如表1所示。
表1：试剂盒加速破坏稳定性结果
依据加速破坏试验推算试剂盒有效期的经验方法，37℃下加速破坏10天，相当于有效期1年半，可以满足试剂盒一年的有效期要求。由表1可以看出，本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒在4℃、37℃保存10天后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。
2、冻融稳定性
为模拟试剂盒在运输过程中，低温环境下试剂盒各组分反复冻融对试剂盒稳定性的影响，将实施例1制备的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒在-20℃的低温下冷冻过夜，然后在室温下复溶，然后再置于-20℃的低温下冷冻过夜，如此反复冻融5次。结果如表2所示。
表2：试剂盒冻融稳定性结果
由表2可以看出，本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒经反复冻融5次后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。这说明，本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有较好的冻融稳定性。
3、模拟运输稳定性
为模拟试剂盒在运输过程中，车辆的颠簸以及高温环境对试剂盒稳定性的影响，将实施例1制备的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒固定在微量振荡器上，放置于37℃恒温箱振荡7天。结果如表3所示。
表3：试剂盒模拟运输稳定性结果
由表3可以看出，本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒放置于37℃恒温箱振荡7天后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。
试验例二、对比例1制备的试剂盒和本发明实施例1制备的试剂盒对雌激素受体进行检测的结果比较
使用对比例1制备的试剂盒和实施例1制备的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，对样本进行检测，检测的方法参考实施例2具体的步骤。
分别采用对比例1制备的试剂盒和实施例1制备的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，同时对大肠癌患者血清样本100份(雌激素受体阳性率为100％)进行检测，结果如表4所示。
表4：检测结果比较
由表4可以看出，使用对比例1制备的试剂盒对血清中雌激素受体检测的灵敏度降低，批内和批间精密性降低。这说明，本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒可显著提高检测灵敏度和检测精密性。
试验例三、试剂盒对雌激素受体特异性检测
特异性是用试剂盒测定雌激素受体的类似物或者交叉反应物，本发明实施例1制备的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒设计的特异性能为测定1000ng/mL的雄激素受体、500ng/mL的糖皮质激素受体、500ng/mL的盐皮质激素受体。检测结果如表5所示。
表5：雌激素受体特异性检测结果
| 交叉品 | 交叉品浓度 | 检测结果 |
| 雄激素受体 | 1000ng/mL | 0.12pg/mL |
| 糖皮质激素受体 | 500ng/mL | 0.04pg/mL |
| 盐皮质激素受体 | 500ng/mL | 0.02pg/mL |
由表5可以看出，本发明用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒对雌激素受体的特异性高，特异性满足要求。
Claims (10)
1.一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。
2.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述雌激素受体标准品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、45ng/mL、90ng/mL、200ng/mL的标准液，即得。
3.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述雌激素受体质控品的制备包括以下步骤：用含有体积分数为5％BSA、体积分数为0.1％硫柳汞的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液，将雌激素受体配制成浓度分别为60ng/mL、120ng/mL的溶液，即得。
4.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％；所述发光底物液Ⅰ的制备方法为：用双蒸水和硝酸配制成浓度为0.1M的稀硝酸溶液，加入过氧化氢，使过氧化氢的浓度为0.08M；所述发光底物液Ⅱ的制备方法为用双蒸水和氢氧化钠配制成浓度为0.2M的氢氧化钠溶液，加入TritonX-100，使TritonX-100的质量浓度为2％。
5.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂的制备包括以下步骤：
(1)取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；
(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；
(3)将步骤(2)所得溶液B加入到步骤(1)所得溶液A中，吖啶酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为15～25∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；
(4)将步骤(3)所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。
6.如权利要求1所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠免疫复合物的制备包括以下步骤：
取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤3～5次，加入40μL生物素化雌激素受体单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为120r/min，8～20min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为10～25min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；
其中，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使Tween-20的体积分数为5％。
7.如权利要求6所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化雌激素受体单克隆抗体的制备包括以下步骤：
A取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液Ⅰ；
B将生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力搅拌反应，反应时间为12h，滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲，收集滤液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，得活性生物素酯粗品，将上述活性生物素酯粗品用热异丙醇溶解，置于冰浴中，放置时间为3h，过滤收集结晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；
C向步骤A所得溶液Ⅰ中加入步骤B所得活性生物素酯，活性生物素酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为8～15∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；
D将步骤C所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置-25℃保存，即得。
8.如权利要求6所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠的制备包括以下步骤：
a.配制pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min，将1mg的链霉亲和素溶于1mL上述磷酸盐缓冲液中，得链霉亲和素溶液，取200μL上述链霉亲和素溶液装于EP管中；
b.取2.5mL氨基化磁性微球，加入2mL戊二醛，室温震荡反应，反应时间为5h，进行磁分离，用水清洗除去多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在2.5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，得磁性微球液；
c.将步骤b所得磁性微球液加入到步骤a装有200μL链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养5h，磁分离，得固体物，将所得固体物分散在5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，使浓度至10mg/mL，得链霉亲和素磁珠。
9.如权利要求8所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述步骤b中氨基化磁性微球的制备包括以下步骤：
Ⅰ取0.05g四氧化三铁磁性纳米微球，加入2mL蒸馏水和10mL乙醇，磁力搅拌，加热升温至75℃，加入25μL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，反应5h后，降温至60℃，加入30μL氨水，30min后加入20μL正硅酸乙酯，反应2h后，降至室温，用乙醇和水进行洗涤，磁分离，得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球；
Ⅱ向步骤Ⅰ所得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球中，加入10mL乙醇和2mL水，超声，超声时间为1min，磁力搅拌，搅拌30分钟后，加入100μL氨水，继续搅拌，搅拌15分钟后，加入50μL氨丙基三甲氧基硅烷，反应5h后，用乙醇与水洗涤，磁分离，直至PH试纸检测到上清液为中性，得固体物，向所得固体物中加入pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，使浓度至20mg/mL，得氨基化磁性微球。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将待测样本进行预处理，取上清液，25℃平衡10分钟；
S2在每一平底试管中加入25μL雌激素受体校准品、雌激素受体质控品或待测样本，37℃温育10分钟，加入25μL磁珠免疫复合物，混匀后，37℃温育10分钟；
S3将平底试管在磁分离器上静置，静置时间为3分钟，去上清液，将平底试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍打3次，使孔中的液体完全除去，每一平底试管中加入200μL浓缩洗涤液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置，静置时间为3分钟，去上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干拍打3次，重复两次；
S4向平底试管中加入抗试剂，抗试剂的加入量为每平底试管50μL，混匀后置37℃孵育15分钟；
S5重复步骤S3的操作；
S6向平底试管中加入发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅰ的加入量为每平底试管50μL，1S后加入发光底物溶液Ⅱ，发光底物溶液Ⅱ的加入量为每平底试管50μL；
S7用化学发光仪检测每管的发光值，根据各标准溶液发光值绘制标准曲线，即可得出待测样本中雌激素受体的浓度。
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